Tubuloside B Minn Cistanche Salsa Isalva Iċ-Ċelloli Newronali PC12 Minn 1-Methyl-4-phenylpyridinium Ion Induced Apoptosis and Ossidative Stress

Introduzzjoni

Patoloġikament, il-marda ta' Parkinson sporadika (PD) hija tipikament ikkaratterizzata minn telf ta' newroni katekolaminerġiċi, partikolarment newroni dopaminerġiċi tas-substance nigra pars compacta (SNc), u l-preżenza ta' intraneurona karatteristika| inklużjonijiet imsejħa korpi Lewy fir-reġjuni tal-moħħ affettwati. Minkejja varjetà ta 'fatturi li ġew implikati fil-patoġenesi tal-PD, il-mekkaniżmi involuti fil-bidu u l-progressjoni tal-PD għadhom inċerti, Anki jekk il-kawża tal-PD tibqa' mwieġba, bosta linji ta 'evidenza jissuġġerixxu bil-qawwa l-involviment ta' stress ossidattiv, li finalment iwasslu għal mewt newronali jew apoptożi mill-ġenerazzjoni eċċessiva ta 'radikali ħielsa. Il-fatt li s-sistema dopaminerġika nigral tista 'tipproduċi livelli għoljin ta' radikali ħielsa u għandha livelli relattivament baxxi ta 'sistema ta' difiża ossidattiva tkompli tappoġġja din l-ipoteżi. Kemm studji in vivo kif ukoll in vitro wrew newrotossiċità medjata mill-istress ossidattiv ta 'MPP ＋, metabolit attiv ta' l-metil-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) fuq newroni dopaminerġiċi. L-involviment ta 'radikali ħielsa prodotti b'mod eċċessiv minn stress ossidattiv bħala l-kawża immedjata ta' disturbi newrodeġenerattivi bħall-PD jissuġġerixxi rwol ċentrali għall-antiossidanti. Tubuloside B (Fig. l) kien wieħed mill-komposti ta 'phenyletha noid iżolati miż-zkuk ta' Salsa Cistanche. Studji preċedenti kienu sabu ħafna phenylethanoids inkluż tubuloside B wrew attività qawwija ta ' scavenging radikali ħielsa.

Meta wieħed iqis dawn is-sejbiet, aħna investigajna fl-istudju preżenti l-effett tat-tubu]nside B fuq in-newrotossiċità indotta minn MPP+-in vitro, bl-użu tal-linja taċ-ċelluli tan-nervituri simpatetiċi pheochromocytoma PC12 li ntużat b'suċċess matul is-snin biex tistudja l-funzjoni newronali.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦALL-PREVENTJONI TAL-MARDA TA' PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materjali u metodi

Materjali

Tubuloside B minn Cistanche Salsa ġie ġentilment fornut minn Dr Li Lei (Dipartiment tal-Prodotti Naturali, Iskola tax-Xjenzi Farmaċewtiċi, Università ta 'Peking, Beijing, iċ-Ċina). Il-purità tal-kompost kienet aktar minn 98% bl-analiżi HPLC. Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM), serum taż-żiemel u serum tal-għoġol tal-fetu nxtraw minn GIBCO BRL, 1-methyl~-phenylpyridi onium ion (MPP+ ), poly-L-lysine, 3-(4,{ {8}}dimetil thiazole-2 -il)-2,5- bromur tad-difeniltetrazoliju (MTT), jodur tal-propidju (PI), RNase A, proteinase K, u 2; 7'-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA) inxtraw minn Sigma.

Kultura taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli PCI2 inżammu f'DMEM supplimentat b'10% serum taż-żwiemel, 5% serum tal-għoġol tal-fetu, 100U/ml peniċillina u 100ug/ml streptomycin. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'inkubatur umidifikat effermat b'95% arja u 5% CO2 f'37 grad. L-esperimenti kollha twettqu 24-48 sigħat wara li nżergħu ċ-ċelloli. Iċ-ċelloli nħasdu b'mod regolari permezz ta' trypsinization 0.25 % meta ċ-ċelloli resqin lejn l-istadju subkonfluwenti u miksijin fi fliexken tal-kultura ta' 25 ċm maqsuma f'1: 8.

Analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet iddeterminata bl-użu ta 'assaġġ MTT modifikat kif deskritt qabel [10], Fil-qosor, ċelluli PC12 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi ta' bir f'densità ta 'I × 104 ċelluli għal kull bir. Il-kulturi tkabbru għal 48 siegħa, u mbagħad il-mezz inbidel għal dak li kien fih diversi konċentrazzjonijiet ta 'burnside B jew MPP＋. Wara l-inkubazzjoni sa 48 siegħa u 72 siegħa, soluzzjoni MTr (5 mg/ml f'DMEM) ġiet miżjuda mal-pjanċi 96-bjar, u ċ-ċelloli tħallew jinkubaw għal 4h f'37 grad. Wara li tneħħa l-medju, iċ-ċellula u l-kristalli taż-żebgħa kienu għalf solubbli billi żżid 200μL ta 'DMSO, u l-assorbiment tkejjel f'570nm (540 nm bħala referenza) b'qarrej tal-mikroplate mudell 550 (Bio-Rad). Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet analizzata wkoll bl-użu tal-metodu ta' esklużjoni trypan blue. Iċ-ċelloli ġew miġbura, bil-mod pellet, u mtebbgħin b'soluzzjoni ta '0.6% ta' trypan blue għal 3 xita. Il-perċentwal ta 'ċelluli mhux ikkuluriti ġie sussegwentement evalwat f'għaxar oqsma tal-mikroskopju magħżula b'mod każwali. Bħala mediċina pożittiva, intuża 100 ng／ml fattur ta 'tkabbir epidermali (EGF).

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAL ATTIVITÀ TA' TKAFAR RADICAL B'XEJN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Sejbien ta' apoptożi permezz ta' ċitometrija tal-fluss

Ċelloli apoptotiċi ġew skoperti permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' propidium iodide (PI) [11]. Fil-qosor, madwar 1 × 106 ċelluli inkubati b'sustanzi tat-test inħasdu biċ-ċentrifugazzjoni u ġew maħsula darba b'PBS. Iċ-ċelloli ġew iffissati b'70 % etanol għal 24 siegħa fi grad - 20 u maħsula darba b'PBS. Iċ-ċelloli mbagħad ġew sospiżi mill-ġdid fi 300μL ta 'PBS li kien fih 0.5 mg/ml RNaseA u 0.5 mg/ml PI. Wara aktar inkubazzjoni għal 30 min fid-dlam, saret ċitometrija tal-fluss b'FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, il-Ġermanja).

Analiżi tal-frammentazzjoni tad-DNA bl-elettroforeżi

Aħna applikajna l-protokoll ta 'Moore [12] li iżolat biss DNA frammentat u l-esperimenti ġew normalizzati bl-użu ta' numru ugwali ta 'kulturi minn kull grupp tat-test. Fil-qosor, 3 × 106 newroni minn kull wieħed mill-kampjuni ttrattati ġew maħsula fis-soluzzjoni bilanċjata tal-melħ ta' Hank (1000g għal 10 min), u l-gerbub iffurmati fil-qiegħ tat-tubu ġew omoġenizzati b'1 ml lysis buffer (10 mM Tris f'pH 7.4. 5 mM EDTA, 1% Triton X-100) għal 20 min fuq is-silġ. Wara ċ-ċentrifugazzjoni fi 11,000 g għal 20 xita f'4 gradi, supernatanti li fihom DNA frammentat tneħħew u ddiġeriti b'20 mg/ml RNase A f'37 grad għal siegħa, u 0.1 mg/ml proteinase K f'56 grad għal siegħa addizzjonali. Id-DNA frammentat ġie estratt bl-użu ta' fenol u kloroform, u ċentrifugat f'1O,000g għal xita 1 f'4 C. Il-fażi milwiema ġiet trasferita f'tubu Eppendorf ġdid, imħallat ma' 2 volumi ta' etanol kiesaħ bis-silġ u mbagħad imqiegħed f'20 grad għal mill-inqas siegħa biex jippreċipita DNA. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'15,000g għal 20 min f'4 gradi, is-supernatanti tneħħew, u gerbub tad-DNA ġew maħsula b'80 % etanol darba (15,000 g għal 15 min f'4 gradi), imnixxfa bl-arja, u maħlula f'20μL buffer TE f'pH 7.6. Il-kampjun kollu ġie mbagħad elettroforesizzat fuq ġel agarose ta' 1.5% għal siegħa f'85 V. Il-ġell ġie eżaminat u fotografat minn Sistema ta' Dokumentazzjoni tal-Ġel tal-Prodotti Ultra Violet (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA).

Kejl tal-formazzjoni intraċellulari ta' ROS

Il-formazzjoni ta’ perossidi intraċellulari ġiet skoperta b’mikroskopju tal-laser tal-iskannjar konfokali bl-użu ta’ kompost mhux fluworexxenti, 2"7"-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) [13], li huwa de-esterifikat fi ħdan iċ-ċelloli minn esterases endoġeni għall-ijonizzat ħieles. aċidu, 2;7"-dichlorofluorescein. 2",7-Dichlorofluorescein huwa kapaċi li jiġi ossidizzat għal 2"7"-dichlorofluorescein fluworexxenti (DCF) minn idroantiossidanti. Iċ-ċelloli ġew inkubati b'10 μM DCFH-DA għal 30 min f'37 grad. Il-kulturi ġew maħsula darbtejn bis-soluzzjoni tal-melħ ibbilanċjat ta 'Hank u nħadmu immaġni fl-istess mezz. L-immaġini saret bl-użu ta 'mikroskopju tal-laser tal-iskannjar konfokali, DCF kien eċċitati f'488 nm u l-filtru tal-emissjoni kien filtru ta' barriera 510nm, Biex jipprovdi paragun validu, intużaw l-istess parametri ta 'akkwist għall-osservazzjonijiet kollha. L-aħjar pożizzjoni vertikali fin-nofs taċ-ċelloli ġiet issettjata, u mbagħad il-qasam ġie skennjat malajr. Minħabba li l-illuminazzjoni fil-wavelength ta 'eċitazzjoni ta' 488 nm ikkawżat fluworexxenza miżjuda minħabba l-ossidazzjoni ta 'din iż-żebgħa, kull qasam kien espost għal Iight għall-istess ħin. Il-valuri tal-linja bażi minn ċelluli mhux stimulati ntużaw bħala valuri ta’ kontroll biex jitqabblu ma’ ċelloli trattati MPP＋ fil-preżenza jew in-nuqqas ta’tubuloside B. Wara l-iskannjar, l-intensità medja tal-fluworexxenza relattiva f'15-20 korpi taċ-ċelluli newronali għal kull qasam tal-mikroskopju ġiet kwantifikata f'erba' kulturi separati għal kull kundizzjoni ta' trattament.

Analiżi statistika

Il-valuri kollha miksuba ġew espressi bħala mezzi ± SD. Is-sinifikat statistiku tad-differenzi bejn il-gruppi kien determinat mit-test t ta' Student; Valuri p ikkalkulati ta' inqas minn 0.05 tqiesu statistikament sinifikanti.

Riżultati

Kif muri fil-Fig. 2, MPP + ipproduċa tnaqqis dipendenti fuq id-doża fil-vijabbiltà taċ-ċelloli PCI2. B'kuntrast, l-EGF, fattur newrotrofiku magħruf, ipproduċa protezzjoni sinifikanti tal-vijabbiltà taċ-ċelluli f'100ng/mL MPP＋ effetti ċitotossiċi indotti minnu kienu wkoll attenwati fil-preżenza ta' tubuloside B (5, 10, 50 jew 100 ug-ml{{12} }), għalkemm b'inqas qawwa mir-referenza

droga (Fig．3)． Tubuloside B f'dawn il-konċentrazzjonijiet wera effetti ċitoprotettivi b'mod dipendenti mid-doża u l-kompost waħdu ma kkawża l-ebda ċitotossiċità apparenti (dejta mhux murija). L-elettroforeżi tal-ġel tal-estratt tad-DNA miċ-ċelloli PCI 2 ittrattati b'200 µM MPP+ għal 48 siegħa wriet sellum tad-DNA. karatteristika klassika ta' apoptożi, tubuloside B, f'dożi ta' 10 u 100μ g·ml-1formazzjoni edotta tas-sadder tad-DNA (Fig. 4) . Fig.5 turi istogrammi tipiċi tal-analiżi ċitometrika tal-fluss tal-mewt taċ-ċelluli apoptotiċi indotta minn MPP＋ fiċ-ċelloli PC12 fil-preżenza jew in-nuqqas ta' tubuloside B. Il-kwantifikazzjoni tal-profil taċ-ċiklu taċ-ċelluli b'PI żvelat in-numru ta 'ċelloli b'karatteristiċi subdiploid (reġjun M1) indikattiv tal-frammentazzjoni tad-DNA apoptotika. F'ċelloli mhux ittrattati, il-frazzjoni subdiploid apoptotika kienet minima sa 5．94％tal-10000 ċellula totali (Fig．5 A)．. Wara 48 siegħa ta' espożizzjoni għal MPP＋, il-perċentwal ta' apoptożi żdied għal 43．02;j;(Fig．5 B)． Meta miżjuda mal-kultura taċ-ċelluli, tubuloside Binibit l-apoptożi indotta+-MPPb'mod li jiddependi mid-doża. F'konċentrazzjoni ta' 10 ug·ml-1il-protezzjoni minn tubuloside B ma kinitx statistikament sinifikanti, iżda f'50 u 1 00ug·ml{-1, tnaqqis ta' 45 ％ u 63％ rispettivament, ġie osservat. iżżid il-perċentwal taċ-ċelloli tas-sopravivenza (Fig. 5D, E).

Akkumulazzjoni ta 'ROS intraċellulari tista' tiġi skoperta bl-użu ta 'ċelluli DCFH-DA．PC12 ittrattati b'200 uM MPP＋ għal 48 siegħa murija fluworexxenza intensa ġewwa ċ-ċellula wara t-tebgħa b'żebgħa DCFH-DA (Fig. 6). Trattament simultanju b'tubuloside B (f'dożi ta' 10 u 100ug·ml) inibit MPP＋一 indott il-produzzjoni ta' ROS (perċentwali mnaqqsa kienu 24．52％u 55．63％, rispettivament)．

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TRATTAMENT TAL-MARDA TA' PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Diskussjoni

Il-patoġenesi tal-PD tinvolvi stress ossidattiv qawwi, livelli antiossidanti mnaqqsa, u difetti mitokondrijali. kollha magħrufa li jinduċu apoptożi f'diversi sistemi ċellulari. B'mod partikolari, ir-radikali ħielsa intwerew li jikkawżaw mewt taċ-ċelluli attiva fin-newroni[14]. L-MPTP jipproduċi sindromu qisu Parkinsonjan irriversibbli u sever li jikkawża deġenerazzjoni selettiva tan-newroni dopaminerġiċi nigrostriatali fil-bnedmin. Din in-newrotossina ntużat biex toħloq. ate mudelli ta 'annimali ta' PD[15]．MPTP huwa kkonvertit minn monoamine oxidase B għal Mpp＋, li huwa akkumulat fil-mitokondrija． fejn jinibixxi l-kumpless mitokondrijali I u dik id-diżordni mitokondrijali. funzjoni tikkawża apoptożi[16]． Għalhekk, in-newrotossiċità indotta MPP + 一 fin-newroni dopaminerġiċi ġiet użata b'mod estensiv bħala mudell etjoloġiku ta' PD għall-iskrinjar ta' aġenti newroprotettivi.

Fl-istudju preżenti, urejna li l-mewt taċ-ċelloli MPP+-indotta permezz ta' stress ossidattiv fiċ-ċelloli PC12 tnaqqset minn tubuloside B. Barra minn hekk, urejna li tubuloside B ipproteġi wkoll b'mod dipendenti mid-doża kontra l-MPP{{ 3}}sellum tad-DNA indott u apoptożi, kif imkejla bl-użu ta 'elettroforesi tal-ġel tad-DNA u analiżi ċitometrika tal-fluss. Barra minn hekk, trattament simultanju b'konċentrazzjonijiet ogħla ta 'tubuloside B inibixxi l-produzzjoni ta' ROS indotta minn MPP. Għalhekk, tubuloside B wera effetti newro-protettivi b'mod multifunzjonali. Diversi mekkaniżmi, separatament jew f'assoċjazzjoni, jistgħu jkunu involuti fl-azzjonijiet ta 'tubuloside B. L-effett antiossidant huwa mekkaniżmu possibbli għal newroprotezzjoni medjata minn tubuloside B. Xiong Q sabet li tubuloside B wera attività qawwija ta' tneħħija tar-radikali ħielsa fuq ir-radikali 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl u xanthine]xanthine oxidase ġġenerat ir-radikal anjoniku superossidu.

Diversi phenylethanoids ġew irrappurtati reċentement li jippossjedu proprjetajiet ta 'scavenging radikali ħielsa u jipproteġu korrimenti tossiċi kkaġunati mill-istress ossidattiv. ROS prodott minn MPP + bħal perossidu ta 'l-idroġenu, anjoni superossidu, u radical hydroxyl faċilment jagħmlu ħsara lill-molekuli bijoloġiċi, li fl-aħħar mill-aħħar jistgħu jwasslu għal mewt taċ-ċelluli apoptotiċi jew nekrotiċi. Għalhekk, tubuloside B jista 'jkollu effetti diretti ta' scavenging kontra ROS. Filwaqt li d-dejta tagħna ma tistabbilixxix is-sit eżatt li fih tubuloside B jaġixxi biex irażżan l-akkumulazzjoni ta 'ROS, jissuġġerixxu li l-mekkaniżmu newroprotettiv jinvolvi l-istimulazzjoni ta' mogħdijiet antiossidanti. Studju ta 'l-istruttura molekulari ta' tubuloside B jindika wkoll li jippossjedi kapaċità qawwija għaltneħħija tar-radikali ħielsa(komunikazzjoni personali).

Mekkaniżmi oħra jistgħu jkunu pertinenti wkoll. Per eżempju, tubuloside B jista 'jkollu l-kapaċità li jikkontrobattu t-tossiċità ta' MPP＋ billi jinibixxi l-ftuħ ta 'pori ta' transizzjoni tal-permeabilità mitokondrijali u disfunzjoni. Barra minn hekk, għandu jiġi kkunsidrat ukoll jekk tubuloside B għandux effett dirett li jippromwovi t-tkabbir fuq iċ-ċelloli newronali. Il-mekkaniżmu eżatt tal-azzjoni newroprotettiva ta' tubuloside B għadu mhux ċar. Studji addizzjonali huma meħtieġa biex jiċċaraw l-istampa sħiħa tal-effett newroprotettiv tiegħu.

B'mod konklużiv, tubuloside B minnEstratt tas-salsa ta' Cistanchegħandu effetti protettivi evidenti fuq l-apoptosi indotta mill-MPP+-u stress ossidattiv. L-effetti newroprotettivi tiegħu kontra MPP ＋ tossiċità jistgħu jkunu importanti u jissuġġerixxu li jista 'jkollu potenzjal terapewtiku fil-prevenzjoni u t-trattament tal-PD.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TRATTAMENT TAL-MARDA TA' PARKINSON PHGS75% ECH 30% ACT 12%