Assemblaġġ tat-Traskriptome U Skoperta tal-Ġene Ta' Zokk Imlaħħam ta' Cistanche Deserticola-Ⅰ
Sep 06, 2024
Sfondi
Cistanche deserticola hija pjanta parassitika kompletament mhux fotosintetika b'valur mediċinali kbir u hija prinċipalment imqassma fid-deżert tal-Majjistral taċ-Ċina. Iz-zokk imnixxef imlaħħam tiegħu huwa toniku kruċjali fihmediċina tradizzjonali Ċiniżabi rwoli li prinċipalment itejbu l-funzjoni sesswali maskili u jsaħħu l-immunità, iżda ftit studji mekkanistiċi saru parzjalment minħabba n-nuqqas ta 'riżorsi ġenomiċi u transcriptomic.
NATURALI CISTANCHE TUBULOSA MEDIĊINA TRADIZZJONALI ĊINIŻA PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Riżultati
F'dan l-istudju, wettaqna sekwenzar fil-fond tat-traskriptome fiz-zokk imlaħħam ta 'C. deserticola, u madwar 80 miljun qari ġew iġġenerati bl-użu ta' sekwenzar ta 'par ta' Illumina fuq il-pjattaforma HiSeq2000. Bl-użu tat-trinity assembler, ksibna 95,787 sekwenza ta 'traskrizzjoni b'tulijiet ta' traskrizzjoni li jvarjaw minn 200bp sa 15,698bp, li għandhom tul medju ta '950 bażi u tul N50 ta' 1,519 bażi. 63,957 traskrizzjonijiet ġew identifikati bħala espressi b'mod attiv b'FPKM Akbar minn jew ugwali għal 0.5, li fihom 30,098 traskrizzjonijiet ġew annotati b'deskrizzjonijiet tal-ġeni jew termini tal-ontoloġija tal-ġeni b'analiżi ta' xebh ta' sekwenza kontra diversi databases pubbliċi (Uniprot, NR, u Nt f'NCBI, u KEGG) . Barra minn hekk, identifikajna ġeni ta' enzimi ewlenin involuti fil-bijosintesi ta' lignin u phenylethanoid glycosides (PhGs) li huma magħrufa li huma l-ingredjenti attivi primarji. Erba 'ġeni phenylalanine ammonja-lyase (PAL), l-ewwel enzima ewlenija fil-bijosintesi tal-lignin u PhG ġew identifikati abbażi ta' tqabbil tas-sekwenza u analiżi filoġenetika. Żewġ mogħdijiet ta 'bijosintesi ta' PhGs ġew proposti wkoll għall-ewwel darba.
Konklużjonijiet
B'kollox, lestejna analiżi globali tat-transcriptome tar-zokk imlaħħam ta 'C. deserticola bl-użu tat-teknoloġija RNA-seq. Ġew identifikati kollezzjoni ta 'ġeni ta' enzimi relatati mal-bijosintesi tal-lignin u phenylethanoid glycosides mit-traskrizzjonijiet immuntati u annotati, u l-familja tal-ġeni ta 'PAL kienet imbassra wkoll. Id-dejta tas-sekwenza minn dan l-istudju se tipprovdi riżors ta 'valur għat-twettiq ta' riċerka futura dwar il-bijosintesi tal-phenylethanoid glycosides u studji ġenomiċi funzjonali f'din l-impjant mediċinali importanti.
Introduzzjoni
C. deserticola hija ġeneru dinji ta 'pjanti perenni tad-deżert mill-familja Orobanchaceae u hija speċi kompletament mhux fotosintetika u ġeneralment tikber pjanta oloparassitika taħt l-art. Huwa parasitizzat fuq l-għeruq tal-psammophyte Haloxylon ammodendron (Chenopodiaceae), li prinċipalment jgħix deżerti u semi-deżerti minħabba t-tolleranza għolja tiegħu għan-nixfa u s-salinità. C. deserticola juri reżistenza qawwija għal kundizzjonijiet ambjentali ħorox u huwa prinċipalment imqassam fil-Majjistral taċ-Ċina, speċjalment fil-Mongolja ta 'ġewwa, Gansu u Xinjiang. Huwa meqjus bħala speċi selvaġġa fil-periklu f'dawn l-aħħar snin minħabba żieda fil-konsum mill-bnedmin. C. deserticola li spiss jissejjaħ ġinseng tad-deżert huwa komunement magħruf bħala deżert-broomrape u z-zokk imnixxef imlaħħam intuża b'mod estensiv bħala toniku tradizzjonalment importanti fiċ-Ċina u l-Ġappun għal ħafna snin. Inizjalment kien irreġistrat fi Shen Nong Ben Cao Jing (Dizzjunarju taċ-Ċiniż Materia Medica, 1977) madwar 1800 sena ilu u kien meqjus bħala wieħed mis-sorsi ewlenin tal-Ħwawar mediċinali Ċiniżi Cistanche.
CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-FUNZJONI SESSWALI PHGS75% ECH 30% ACT 12%
L-estratti ta 'C. deserticola jippossjedu firxa wiesgħa ta' funzjonijiet mediċinali, speċjalment għall-użu fit-titjib tal-funzjoni sesswali, it-tonifikazzjoni tal-kliewi, il-protezzjoni tal-fwied, l-attività aperijent, it-titjib tal-memorja, l-immunomodulazzjoni, l-attività antiossidativa, l-attività anti-infjammatorja, l-antivirali, eċċ. komponenti bijoattivi ewlenin ta 'C. deserticola huma Phenylethanoid glycosides (PheGs, PhGs). Sal-lum, aktar minn 20 phenylethanoid glycosides ġew iżolati miz-zokk sukkulenti ta 'C.deserticola. Fosthom,acteoside u echinacosidehuma żewġ komponenti ewlenin b'attivitajiet farmakoloġiċi sinifikanti u huma dokumentati bħala l-istandards ta 'kwalità ta' C. deserticola fil-farmakopea Ċiniża (edizzjonijiet 2005 u 2010). Tliet komponenti kimiċi tal-PhGs huma aċidu organiku, saccharide, u phenylethanoid, madankollu, id-dettalji dwar il-mogħdijiet bijosintetiċi tal-phenylethanoid għadhom mifhuma ħażin f'C.deserticola.
Minkejja l-importanza kummerċjali u mediċinali ta 'C.deserticola, id-dejta ġenomika u traskriptomika ta' din l-ispeċi hija limitata ħafna. M'hemm l-ebda ESTs disponibbli fid-database NCBI u l-informazzjoni kompluta dwar il-ġenoma għal din l-ispeċi għadha mhux disponibbli ħlief għas-sekwenza tal-ġenoma tal-kloroplast. Id-dejta traskrittomika limitata tfixkel l-istudju tal-mekkaniżmi bijosintetiċi PhG. It-teknoloġija RNA-seq tista' tiġġenera sekwenzi tal-partijiet espressi tal-ġenoma fil-mira u tidentifika ġeni [18] bl-użu tal-pjattaformi tat-teknoloġija NGS (bħal Applied Biosystems SOLiD, Illumina HiSeq, u Roche 454). Qed isir dejjem aktar popolari fl-assemblaġġ tat-traskriptome de novo, peress li huwa approċċ kost-effettiv u b'saħħtu b'riżoluzzjoni għolja u firxa dinamika wiesgħa, speċjalment peress li għandu vantaġġ li jesplora traskrizzjonijiet b'abbundanza baxxa. Minħabba d-diversi vantaġġi, RNA-seq huwa speċifikament attraenti għal organiżmi mhux mudell b'riżorsi ġenetiċi limitati. Madankollu, m'hemm l-ebda riċerka dettaljata dwar C. deserticola transcriptome minn RNA-seq.
F'dan l-istudju, aħna globalment sekwenzajna t-traskriptome taz-zokk għal C. deserticola bl-użu tal-pjattaforma Illumina Hiseq2000 u ksibna dejta mhux ipproċessata ta '7.9G. Permezz tal-assemblaġġ u l-annotazzjoni, imminaw il-ġeni involuti fil-bijosintesi ta 'PhG u l-ġeni responsabbli għall-bijosintesi tal-lignin kollu. L-analiżi RNA-seq tagħna ġġenerat l-ewwel transcriptome ta 'kunsens C. deserticola u pprovdiet għarfien ġdid għal fehim komprensiv tal-valur mediċinali ta' C. deserticola. Barra minn hekk, il-metodu deskritt hawn jista 'jiġi applikat b'mod wiesa' għat-traskriptomi tal-profil biex jiffaċilita l-iskoperta ta 'ġeni involuti f'mogħdijiet ta' bijosintesi ta 'komponenti mediċinali speċifiċi f'impjant mediċinali ieħor b'riżorsi ġenomiċi limitati ħafna.
Materjali u Metodi
Ġbir ta’ materjal tal-pjanti
Iz-zokk sukkulenti frisk għal C. deserticola fl-istadju tat-tħaffir inġabar minn bażi tal-pjanti f'BayanHot City of Alxa League f'Inner Mongolia fil-majjistral taċ-Ċina. Il-permess tal-ġbir inkiseb mis-sid (HongKui CongRong Group) tal-bażi tal-pjanti. Il-kampjun tal-vawċer ġie depożitat fil-Faċilità Ġenomika Core fl-Istitut tal-Ġenomika ta 'Beijing, l-Akkademja tax-Xjenzi Ċiniża. Wara t-tindif, it-tessuti taz-zokk sukkulenti ġew maqtugħin f'biċċiet żgħar u immedjatament iffriżati fin-nitroġenu likwidu, u mbagħad maħżuna fi grad -80 sa aktar proċessar.
Estrazzjoni ta 'RNA, kostruzzjoni ta' librerija cDNA, u sekwenzar ta 'Illumina
L-RNA totali ġie estratt miż-zokk sukkulenti bl-użu tar-Reaġent TRIzol (Invitrogen Inc., California, USA) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-kampjuni li rriżultaw ġew ittrattati b'DNase I biex titneħħa kwalunkwe DNA ġenomika. L-RNAs estratti ġew ikkwantifikati bl-użu ta' bioanalizzatur Agilent 2100 (Agilent Technologies) u ċċekkjati għall-integrità bl-użu ta' elettroforeżi ta' ġel ta' agarose denaturant bi tbajja ta' ethidium bromide. Kampjuni ta' RNA bi proporzjonijiet A260/A280 bejn 1.9 u 2.1, proporzjonijiet RNA 28S:18S ogħla minn 1.0, u numri ta' integrità RNA (RINs) -8.5 intużaw f'analiżi sussegwenti.
Il-libreriji RNA-seq ġew iġġenerati bl-użu ta' Kits ta' Preparazzjoni tal-Kampjuni ta' Illumina Truseq RNA. Poly(A)+ RNA ġie iżolat mill-RNA totali bl-użu ta 'żibeġ Dynal ligo(dT)25 skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Wara l-purifikazzjoni, ġie miżjud buffer ta 'frammentazzjoni biex tkisser l-mRNA fi frammenti qosra. Il-cDNA tal-ewwel linja ġie sintetizzat bl-użu ta 'dawn il-frammenti qosra bħala mudelli, flimkien ma' SuperScript III reverse transcriptase u N6 primer hexamer każwali. Is-cDNA tat-tieni linja mbagħad ġie sintetizzat bl-użu ta’ buffer, dNTPs, RNaseH, u DNA polymerase I. Is-cDNA double-stranded li rriżulta kien soġġett għal tiswija tat-tarf bl-użu ta’ T4 DNA polymerase, DNA polymerase I framment Klenow, u T4 polynucleotide kinase, u ligated ma’ adapters li jużaw T4 DNA ligase. Frammenti ligati bl-adapter ġew purifikati bl-użu ta 'kit ta' estrazzjoni QiaQuick PCR u elużi b'buffer EB. Wara analiżi bl-użu ta 'elettroforesi tal-ġel tal-agarose, intgħażlu frammenti adattati bħala mudelli għall-amplifikazzjoni tal-PCR. Is-sekwenzjar tal-librerija cDNA li tirriżulta twettqet b'sistema Illumina HiSeq 2000.
Traskrizzjonijiet de novo assemblaġġ u kwantifikazzjoni tal-espressjoni tal-ġeni....
Qari mhux ipproċessati ġġenerati mis-sekwenzjar ġew imnaddfa billi tneħħew is-sekwenzi tal-adapter (ATCTCGTATGCCGTC) bl-użu ta 'metodu intern. Imbagħad wettaqna proċess ta 'filtrazzjoni strett ta' kwalità baxxa. L-ewwelnett, bażijiet b'punteġġ ta 'kwalità phred inqas minn 20 ikunu mirquma mit-3'end tas-sekwenza, sakemm jidħlu f'bażi waħda bi kwalità ogħla (Akbar minn jew ugwali għal 20). Jekk it-tul tal-qari kien iqsar minn 50bp, ikun mormi. It-tieni nett, il-qari se jiġu ffiltrati aktar mill-kriterju li 70% tal-bażijiet f'qari wieħed għandhom punteġġi ta' kwalità għolja (Akbar minn jew ugwali għal 20). It-tielet nett, intużaw biss qari paired-end għal aktar assemblaġġ. L-assemblaġġ ta' traskrizzjoni de novo sar bl-użu ta' Trinity release_20130216 [30] li kien jikkonsisti fi tliet moduli ta' softwer suċċessivi: Inchworm, Chrysalis, u Butterfly. Il-parametri tal-assemblaġġ ġew stabbiliti kif ġej:-seqType fq-JM 300G -min_contig_length 200-CPU 20-inchworm_cpu {{21} }bflyCPU 20.
Biex tikkwantifika l-abbundanza tat-traskrizzjoni, il-qari sekwenzati tat-tarf tal-par ġew allinjati mill-ġdid mat-traskrizzjonijiet immuntati bl-użu ta 'kitba fi Trinity. Qari mappjati ntużaw għall-kwantifikazzjoni permezz ta 'softwer RSEM (RNA-Seq by Expectation Maximization). L-abbundanza tal-ġeni jew tal-isoforma kienet rappreżentata mill-framment għal kull kilobase ta 'traskrizzjoni għal kull miljun framment immappjat (FPKM), dawk it-traskrizzjonijiet b'valur FPKM ugwali għal jew akbar minn 0.05 ġew definiti kif espressi.
Annotazzjoni funzjonali tat-traskrizzjonijiet espressi
M'hemm l-ebda settijiet ta' annotazzjoni tal-ġeni ta' C. deserticola ħlief għall-ġenoma tal-kloroplast [1]. Aħna annotajna t-traskrizzjonijiet espressi billi qabbilhom ma' settijiet ta' data aġġornati ta' Genbank Nt, Genbank Nr, u TAIR10_ pep_20101214_ separatament bl-użu tal-programm BLAST (E< = 1e-20). Meanwhile, all expressed transcripts were translated into potential proteins according to ORF prediction by TransDecoder and predicated for the conserved domains based on the Pfam database.
Gene Ontology u annotazzjoni tal-mogħdija KEGG Permezz ta' allinjament ta' xebh ta' sekwenza mad-database Uniprot (l-annotazzjoni tal-Gene Ontology (GO) tat-traskrizzjonijiet kollha immuntati nkisbet bl-użu ta' fajl ta' assoċjazzjoni mniżżel minn (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/ databases/GO/goa/UNIPROT/gene_association goa_uniprot.gz GO termini raggruppament ta 'ġeni espressi twettqet bl-użu ta' skripts personalizzati, u aħna annotati ġeni fir-raba' livell. Il-kategoriji CC, BP, u MF separatament.
L-informazzjoni dwar il-mogħdija KEGG ġiet assenjata għas-sekwenzi kollha tal-proteini mbassra bl-użu tal-għodda onlajn KAAS (KEGG Automatic Annotation Server) [34]. Is-sekwenzi fil-format fasta ġew sottomessi għal talba tal-KAAS, u l-fajls li jirriżultaw tal-informazzjoni kollha tal-mogħdijiet relatati ma 'C. deserticola stem transcriptome ġew imniżżla. 13-il sett ta' data tal-ġeni ta' organiżmi tal-pjanti f'KEGG intużaw għall-annotazzjoni bl-użu tal-metodu BBH (bi-direzzjonali l-aħjar hit).
NATURAL CISTANCHE TUBULOSA CISTANCHE EXTRACT PHGS75% ECH 30% ACT 12%
Analiżi RT-qPCR
Wara d-diġestjoni b'DNase I, bejn wieħed u ieħor 5ug ta 'RNA totali ġew ikkonvertiti f'cDNA ta' l-ewwel linja permezz tar-reazzjoni ta 'traskrizzjoni inversa b'oligo(dT)15 primers u GoScript Reverse Transcription System (Promega). Il-prodotti cDNA mbagħad ġew dilwiti 10-darbiet b'ilma dejonizzat mingħajr nukleażi qabel l-użu bħala mudell f'PCR f'ħin reali. cDNAs speċifiċi ġew amplifikati mis-sistema GoTaq 2-Step RT-qPCR (Promega) f'volum ta' 20 ul. L-amplifikazzjoni tal-PCR twettqet fit-temperatura ta 'l-ittemprar ta' 60 grad bis-Sistema ta 'Sejbien ta' PCR Real-Time 7500 (Bijosistemi Applikati) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-abbundenzi relattivi tat-traskrizzjoni ġew ikkalkulati bil-metodu tal-limitu taċ-ċiklu komparattiv bil-ġene "comp10579_c0" bħala standard intern, bl-użu tas-softwer 7500 Manager.
Primer pairs għal RT-PCR kienu ddisinjati bbażati fuq softwer onlajn (http://primer3.ut.ee/) u huma elenkati fis-S1 Dataset.
Riżultati
Is-sekwenzjar tal-RNA u l-assemblaġġ de novo tat-traskriptome ta' zokk imlaħħam ta' C. deserticola
Zokk ta 'C. deserticola intuża b'mod estensiv bħala toniku tradizzjonalment importanti fiċ-Ċina u l-Ġappun għal ħafna snin. Biex tikseb ħarsa ġenerali globali tal-espressjoni tal-ġeni fiz-zokk imlaħħam ta 'C. deserticola, ġabarna kampjuni ta' zokk ta 'C. deserticola tal-istess bażi tal-pjanti fl-2013 u l-2014, rispettivament. RNAs totali ġew estratti u RNAs polyA + ġew ippurifikati għall-kostruzzjoni ta 'libreriji RNA-seq ta' paired-end. 79,433,734 u 86,019,176 qari par-end li jikkorrispondu għal kważi 8 biljun u 8.6 biljun bażi tas-sekwenza nkisbu bl-użu tas-sekwenzjar Illumina HiSeq 2000
pjattaforma f'kampjuni ta' 2013-sena u 2014-sena (Tabella 1). Wara li tneħħew is-sekwenzi tal-adapter u l-iffiltrar ta' qari ta' kwalità baxxa (ara d-dettalji fil-Metodi), 64,831,040 qari ta' par ta' kwalità għolja fil-kampjun ta' 2013-sena ntużaw għall-assemblaġġ de novo tat-traskriptome. Bl-użu tal-assemblatur tas-sekwenza Trinity [30], ġew iġġenerati 51,719 ġene u 95,787 sekwenza ta 'traskrizzjoni b'tulijiet ta' traskrizzjoni li jvarjaw minn 200 bp sa 15,698 bp. It-tul medju tat-traskrizzjonijiet immuntati huwa 950 bażi u t-tul N50 huwa 1,519 bażi. In-numru ta 'traskrizzjonijiet f'tulijiet differenti żvela li 57.32% tat-traskrizzjonijiet immuntati kienu madwar 500 bp jew itwal (Fig 1A). Qari ta' par ta' kwalità għolja fil-kampjun ta' 2014-sena ġew immappjati mat-traskriptome immuntat. Barra minn hekk, sibna li n-numru tat-traskrizzjoni għal kull ġene immuntat varja u 69% tal-ġeni b'isoforma waħda espressa filwaqt li 31% tal-ġeni esprimew żewġ traskrizzjonijiet jew aktar (Fig 1B).
Kwantifikazzjoni ta 'espressjoni u annotazzjoni funzjonali ta' traskrizzjonijiet immuntati....
L-abbundanza tal-ġeni jew tat-traskrizzjoni ġiet ikkwantifikata bl-użu tal-pakkett RSEM, li fih il-qari sekwenzati ġew allinjati mill-ġdid mal-ġeni immuntati jew is-sekwenzi tat-traskrizzjonijiet bl-użu ta 'Bowtie, u dawk il-qari mapep ġew użati għall-kwantifikazzjoni. Ġie kkalkulat il-valur FPKM għal kull ġene jew traskrizzjoni, u finalment, identifikajna 63,957 u 52,857 traskrizzjonijiet espressi b'mod attiv (valur FPKM akbar minn jew ugwali għal 0.5) f'kampjuni ta' zokk imlaħħam ta' C. deserticola f'2{{17} }13 u 2014, rispettivament. 44,776 traskrizzjoni (70.01% fil-kampjun ta' 2013-sena, 84.71% fil-kampjun ta' 2014-sena) kienu espressi b'mod komuni fiż-żewġ repliki, u l-korrelazzjoni (koeffiċjent ta' korrelazzjoni Pearson: 0.91979) tad-dejta tal-espressjoni tagħhom kienet murija f'S1 Fig. Id-dejta mhux ipproċessata tas-sekwenzjar kienet ttellgħet fid-database tal-NCBI SRA (numri ta 'adeżjoni: SRX857402 u SRX858938). Aħna użajna ġeni espressi identifikati fil-kampjun ta' 2013-sena għal aktar analiżi. L-informazzjoni dwar l-annotazzjoni funzjonali għat-traskrizzjonijiet kollha espressi nkisbet bl-użu ta 'żewġ metodi. L-ewwelnett, it-traskrizzjonijiet kollha espressi ġew allinjati ma 'nukleotidi magħrufa (GenBank nt) u databases tas-sekwenza tal-peptidi (GenBank nr u Arabidopsis peptide) separatament mill-algoritmu BLAST. Minn 63,957 traskrizzjonijiet espressi,
29,220 (45.7%) ġew annotati u wrew omoloġija għal sekwenzi fi kwalunkwe mit-tliet databases tas-suġġetti b'cutoff tal-valur E 1e-20. Sadanittant, ir-reġjuni ta 'kodifikazzjoni kandidati għas-sekwenzi kollha ta' traskrizzjoni espressi kienu mbassra bl-użu ta 'softwer TransDecoder, u l-itwal ORFs għal kull traskrizzjoni ntużaw għat-tfittxija tad-dominju Pfam. Bħala riżultat, 21,358 (33.4%) traskrizzjonijiet ġew annotati bbażati fuq id-database Pfam. B'mod ġenerali, 30,098 (47.1%) traskrizzjonijiet kienu mqabbla b'mod sinifikanti ma 'ġeni magħrufa fid-databases pubbliċi billi tgħaqqad iż-żewġ metodi ta' hawn fuq. Il-lista sħiħa tat-traskrizzjonijiet espressi b'annotazzjoni tal-funzjoni ġiet murija f'dejta supplimentari (S2 Dataset).
Stħarrejna l-aqwa 20 traskrizzjonijiet espressi ħafna (Tabella 2) li jikkorrispondu għal 18.99% tal-qari kollha tas-sekwenzjar, u sibna li ħafna minnhom huma ġeni li jirrispondu għal abijotiċi.
stimolu tal-istress. Dehydrin (DHNs), klassi ta 'proteini ta' stress idrofiliċi u termostabbli b'numru għoli ta 'aċidi amminiċi ċċarġjati li jappartjenu għall-familja tal-Grupp II Late Embryogenesis Abundant (LEA), huwa l-aktar ġene espress ħafna. Tliet traskrizzjonijiet differenti tad-Dehyrin (comp28713_c0_seq1/2/4) ġew skoperti bħala espressi ħafna fi zkuk imlaħħam li jistgħu jkunu involuti fil-protezzjoni taċ-ċelloli mill-ħsara kkawżata mill-istress tan-nixfa. Ġeni oħra relatati mal-istress bħal proteina ta 'xokk tas-sħana, proteina relatata mal-patoġenu u metallothionein instabu wkoll espressi ħafna, li jistgħu jkunu relatati mal-ambjent ta' sopravivenza sever tiegħu. Barra minn hekk, xi ġeni kostituttivi inklużi ġene RNA ribosomali 26S (comp22329_c2_seq1), proteina ripressata/assoċjata mar-rqad mal-auxina (comp20999_c{0_seq1), Il-fattur ta' ADP-ribosylation (comp20499_ c0_seq1) kien ukoll traskritt ħafna.
CISTANCHE TUBULOSA NATURALI GĦAT-TITJIB TAL-IMMUNITÀ PHGS75% ECH 30% ACT 12%
