L-Effetti tal-Ectoine li jbajdu l-ġilda permezz tas-soppressjoni tal-melanogenesis stimulata mill-MSH u l-attivazzjoni tal-mogħdijiet antiossidanti Nrf2 f'keratinoċiti irradjati bl-UVA

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

You-Cheng Hseu 1,2,3,4, Xuan-Zao Chen 1, Yugandhar Vudhya Gowrisankar 1,Hung-Rong Yen 3,4,5,6, Jing-Yuan Chuang 7 u Hsin-Ling Yang 8,*

Astratt:Il-produzzjoni ta' speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) indotta mill-irradjazzjoni ultravjola A (UVA) timmedja eċċessivamelanoġenesifiċ-ċelloli tal-ġilda li jwasslu għal pigmentazzjoni. Aħna wrejna l-effetti depigmentanti u anti-melanoġeniċi ta 'Ectoine, osmolite batterjali naturali, f'keratinoċiti UVA-irradiatedhuman (HaCaT), u l-mekkaniżmi molekulari sottostanti ġew spjegati. Iċ-ċelloli HaCaT ġew ittrattati minn qabel b'konċentrazzjonijiet baxxi ta 'Ectoine (0.5-1.5 µM) u ttestjati għal diversi parametri depigmentanti u anti-melanoġeniċi. Dan it-trattament minn qabel irregola b'mod sinifikanti l-ġenerazzjoni ta 'ROS, il-produzzjoni ta' l-ormon li jistimula l-melanocyte (-MSH), u l-espressjoni ta 'proopiomelanocortin (POMC) f'ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA. Ukoll,antiossidanteme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H dehydrogenase [quinone 1] (NQO-1), u -glutamate-cysteine ​​ligase subunit katalitiku (-GCLC) espressjonijiet tal-proteini kienu medjat permezz tat-traslokazzjoni nukleari tal-fattur nukleari erythroid2-fattur 2 relatat (Nrf2) li l-knockdown tiegħu tabilħaqq imfixkel dan l-effett li jfisser l-importanza tal-passaġġ Nrf2. Ectoine kien qed jimmedja l-attivazzjoni ta 'Nrf2 permezz tal-mogħdijiet p38, protein kinase B (magħrufa wkoll bħala AKT), protein kinase C (PKC), u casein kinase II protein kinase (CKII). Il-medju kondizzjonat miksub miċ-ċelloli HaCaT ittrattati minn qabel u rradjati bl-UVA irregolawtyrosinase, proteina relatata mat-tyrosinase-1 u -2 (TRP{-1/-2), protein kinase cyclic AMP (c-AMP), proteina li tgħaqqad l-element tar-rispons c-AMP (CREB ), u espressjonijiet ta' fattur ta' traskrizzjoni assoċjati mal-mikroftalmja (MITF) li jwasslu għal ċelluli B16F10 tal-melanoma li jinibixxu s-sintesi tal-melanin. Interessanti, dan l-effett anti-melanoġeniku fiċ-ċelloli B16F10 stimulati minn -MSH kien osservabbli biss f'konċentrazzjonijiet ta' 50–400 µM ta' Ectoine, li jfisser ir-rwol ewlieni li kellu l-ġilda keratinocytesin ittrattata b'Ectoine (0.5–1 µM).jbajdueffetti. Aħna kkonkludejna li Ectoine jista 'jintuża bħala aġent kożmetiku topiku effettiv b'effikaċja depigmentanti u anti-melanoġenika.

Kliem ewlieni:Ektoina; keratinoċiti;melanoġenesi; tyrosinase; -MSH; Nrf2

Cistanche għandu effett kontra l-ossidazzjoni.

1. Introduzzjoni

L-esponiment tal-ġilda tal-bniedem għar-radjazzjoni UVA jikkawża l-ġenerazzjoni ta 'ROS u wkoll il-produzzjoni żejda ta' melaninin fiċ-ċelloli tal-ġilda. Il-produzzjoni mhux ikkontrollata ta 'ROS tista' twassal għal kundizzjonijiet ta 'melanoma wkoll. Mostskin jbajdu l-aġenti huma mmirati u jippruvaw jimminimizzaw l-melanoġenesiproċess permezz ta 'l-inibizzjoni ta' -MSH utyrosinaseproduzzjonijiet [1]. Ħafna mill-kremi għat-tħaffif tat-ton tal-ġilda huma komposti minn hydroquinone [2] jew hydrocortisone [3], li huma magħrufa li jnaqqsu l-formazzjoni ta 'melanin butare assoċjati wkoll ma' effetti sekondarji severi. Per eżempju, akne, ġilda titqaxxar u ħakk, kulur blu u iswed tal-ġilda, ochronosis, irritazzjoni tal-ġilda ħruq u tingiż, u anke infjammazzjoni.Madankollu, ġildajbajduaġenti minn sorsi naturali, pereżempju, Kojic acid (derivattiv fungali miksub mill-ispeċi Penicillium u Aspergillus) huwa rrappurtat ukoll li jikkawża 'dermatite tal-kuntatt' f'individwi li għandhom ġilda sensittiva. F'dawn l-individwi, aktar minn 1 fil-mija ta 'aċidu kojic jista' jikkawża effetti sekondarji severi ipersensittivi [4,5]. Għalhekk, ġilda biss ftit derivati ​​naturalijbajduprodotti (oleosin, estratt tal-licorice, aċidu askorbiku, proteina tas-sojja, N-acetyl glucosamine, eċċ.) bħalissa qed jintużaw fl-industrija tal-kosmetiċi [6]. Madankollu, il-prodotti għall-kura tal-ġilda li huma prinċipalment immirati lejn il-proprjetajiet tad-depigmentazzjoni xi drabi naqsu milli jiffokaw fuq li jikkontrobattu l-effetti ħżiena maħluqa mill-eċċess medjat tal-produzzjoni ta' ROS indotta mill-irradjazzjoni UVA.melanoġenesifiċ-ċelloli tal-ġilda.

L-ectoine huwa 'estremolite naturali' prodott minn diversi speċi ta' mikro-organiżmi kundizzjonijiet ta' stress [7,8]. Dan il-kompost kien iżolat l-ewwel mill-ispeċi Ectothiorhodospira ta 'batterji li qed jgħixu fid-deżert Eġizzjan. Il-kaskata tal-ġeni tal-operon ect (ectA, ectB, ectC, jew ectD) huma involuti fil-produzzjoni ta 'dan il-kompost. L-ectoine huwa indikat kimikament bħala aċidu 1,4,5,6-tetrahydro-2-metil-4-pyrimidinecarboxylic [9]. Bħala li jgħaqqad l-umdità, Ectoine helpsin, ir-ristrutturar tal-membrana taċ-ċelluli tal-ġilda [10], protezzjoni mill-ħsara mill-UV u t-tniġġis [11,12], moisturizing tal-ġilda [13], dewmien tat-tixjiħ prematur tal-ġilda [14], eċċ. Barra minn hekk għar-roli protettivi tal-ġilda, Ectoine intwera li huwa utli fit-trattament tad-dermatite atopika [15], Alzheimer [16], kif ukoll l-inibizzjoni tar-replikazzjoni tal-HIV [17], radju u kimoterapija [18], u ċirrożi tal-fwied [17] 19]. L-ectoine huwa spekulat li juri l-proprjetajiet tad-depigmentazzjoni u li jbajdu l-ġilda mingħajr ma jikkawża effetti sekondarji mhux mixtieqa [20]. B'kuntrast, il-mekkaniżmi molekulari li jirriżultaw minn Ectoine mhumiex magħrufa. Għalhekk, l-għan ta 'dan l-istudju kien li jiddefinixxi l-mekkaniżmi depigmentanti u anti-melanoġeniċi medjati mill-Ectoine suscitati f'keratinoċiti umani irradjati bl-UVA (HaCaT) bħala s-sistema tal-mudell ċellulari. L-effett ta 'sekrezzjonijiet indotti mill-Ectoine ta' aġenti li jipproteġu l-ġilda miċ-ċelluli HaCaT sal-mezz tal-kultura (medju kondizzjonat) ġie ttestjat ukoll bl-użu ta 'ċellula ta' melanoma tipika (B16F10) ukoll.

2. Materjali u Metodi

2.1. Reaġenti u Antikorpi

Ectoine (Nru tal-prodott: 81619, purità akbar minn jew ugwali għal 95 fil-mija) inxtara minn Sigma-Aldrich (Taufkichen, il-Ġermanja). Serum bovin tal-fetu (FBS), penicillin/streptomycin, Eagle'smedium modifikat ta 'Dulbecco (DMEM) u l-glutamina nxtraw minn Invitrogen/Gibco BRL (Carlsbad, CA, USA). l-DOPA, melanin, 3-4,5-dimetil-2-il{-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT), u -MSH ġew akkwistati minn Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, l-Istati Uniti). N-acetylcysteine ​​(NAC) u20,70-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH{2-DA) ġew akkwistati minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L-inibituri farmakoloġiċi kollha meħtieġa għal JNK (SP600125), ERK1/2 (PD98059), p38 (SB203580), PKC (GF109203X), u CKII nkisbu minn Calbiochem (La Jolla, CA, USA) Inkiseb inibitur PI3K/AKT (LY294002) minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). L-antikorpi kollha għal POMC, CREB, -actin,tyrosinase, Nrf2, p-CREB, NQO-1, PKC, proteina assoċjata mal-ECH bħal Kelch-1 (Keap-1), uTRP-1, TRP-2 nkisbu minn Santa Cruz Biotechnology Inc. (Heidelberg, il-Ġermanja). Antikorpi kontra -GCLC u HO-1 ġew akkwistati minn Gene Tex Inc. (San Antonio, TX, USA). Aħna ksibna antikorpi kontra c-AMP protein kinase u CKII minn Abcam (Cambridge, MA, USA). Histones, MITF, p-p38, p38, p-AKT, u AKT inkisbu minn Cell Signal Technology (Beverly, MA, USA). Reaġenti ta 'skoperta ta' kimiluminixxenza mtejba (ECL) inkisbu minn Millipore, (Billerica, MA, USA). Ir-reaġenti l-oħra kollha (fil-grad HPLC) jew inxtraw minn Sigma-Aldrich jew Merck & Co.,Inc. (Darmstadt, il-Ġermanja).

2.2. Kultura taċ-Ċelloli

Ksibna ċelluli immortalizzati tal-keratinoċiti tal-ġilda umana HaCaT u melanoma murina B16F10 kemm mis-Servizzi tal-Linja taċ-Ċelluli (CLS, Eppelheim, il-Ġermanja) kif ukoll mill-Kollezzjoni tal-Kultura tat-Tip Amerikana (ATCC, VA, USA). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija FBS attivat bis-sħana, 1 fil-mija streptomycin/penicillin, u 2 mM L-glutamine f'inkubatur umidifikat supplimentat b'5 fil-mija CO2 f'37 ◦C.

2.3. Trattamenti taċ-ċelluli u Irradjazzjoni UVA

Qabel l-irradjazzjoni UVA, iċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel b'Ectoine (0.5–1.5 µM għal 24 siegħa) jew vettura (PBS). Wara l-inkubazzjoni, ċelluli maħsula bil-PBS ġew esposti għal radjazzjoni UVA 3 J/cm2 (għal 27 min, λmax,365 nm, l-ebda emissjonijiet li jistgħu jinstabu taħt 320 nm) bl-użu tal-UV CROSS-LINKER CL-508 (UVItec, Cambridge, UK) [21].

2.4. Assaġġ ROS intraċellulari

Iċ-ċelloli HaCaT ġew miżrugħa f'densità ta '1.5 × 105 f'kamra 8-well Lab Teck li fiha DMEM supplimentat b'10 fil-mija FBS u tkabbru għal 80 fil-mija konfluwenza. Dawn iċ-ċelloli l-ewwel ġew ittrattati b'1.5 µM Ectoine, segwiti minn espożizzjoni għal irradjazzjoni UVA ta' 3 J/cm2 għall-ammont ta' żmien preskritt. Iċ-ċelloli ġew maħsula b'PBS u ntuża l-metodu DCFH2-DA biex tiddetermina l-produzzjoni intraċellulari ta' ROS bl-użu tas-softwer tas-soluzzjoni Olympus Software għal kull kundizzjoni [21].

2.5. Kwantifikazzjoni tal-melanina

Fi pjanċa 6-bir, iċ-ċelluli tal-melanoma murina B16F10 ġew miżrugħa f'densità ta' 2.5 × 105 ċelluli/bir. Ġew ittrattati minn qabel b'100, 200, u 400 µM ta' Ectoine għal 2 sigħat fl-assenza jew fil-preżenza ta' -MSH (1 µM). Il-protokoll użat għall-kwantifikazzjoni tal-melanin segwa metodu deskritt qabel [21]. Aħna kejlu l-kontenut ta 'melanin mal-qarrej tal-mikroplate ELISA b'tul ta' mewġ ta 'assorbiment ta' 470 nm.

cistanche jinibixxi l-melanin.

2.7. Western Blot

Iċ-ċelloli HaCaT (1 × 106 ċelluli/dixx ta’ 10 ċm) jew B16F10 (1 × 106 ċelluli/dixx ta’ 10 ċm) ġew ittrattati minn qabel b’konċentrazzjonijiet varji ta’ Ectoine (0.5, 1, u 1.5 µM) jew -MSH (1 µM) segwit minn irradjazzjoni fin-nuqqas jew il-preżenza ta' UVA għall-ammont ta' żmien preskritt. Ċelloli maħsula PBS ġew maħsuda, il-kontenut ta 'proteina (nukleari u ċitosolika) ġie iżolat wara t-trattament. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew soġġetti għall-metodu Western blot użat qabel għad-determinazzjoni ta 'espressjonijiet ta' diversi proteini nukleari u ċitosoliċi [21].

2.8. Estrazzjoni RNA u RT-PCR

Ectoine trattat minn qabel (1.5 µM, 24 h) ċelluli HaCaT ġew soġġetti għar-reaġent TRIzol (Invitrogen, Carlsbad) għall-iżolament ta 'RNA totali minn dawn iċ-ċelloli. 1 µg ta’ RNA totali u r-reaġenti fornuti mill-kit taq tal-platinu RT-PCR SuperScript-III (Invitrogen, Carlsbad) intużaw fl-esperiment tal-PCR bl-istrument Bio-Rad iCycler PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, L-Istati Uniti).Il-primers forward u reverse għal Nrf2 użati kienu: F: 50-AAACCAGTGGATCTGCCAAC-30,R-50-GCAATGAAGACTGGGCTCTC-30. Il-primers forward u reverse għal GAPDH użati kienu:F: 50-GCATCCTGGGCTACACTGA-30, R: 50-CCACCACCCTGTTGCTGTA-30. Fl-aħħar ta 'l-esperiment, il-prodott PCR ġie analizzat bl-użu ta' ġel agarose 1 fil-mija. Imbagħad, ġie viżwalizzat bi tbajja ta' ethidiumbromide. Bħala kontroll intern, użajna GAPDH [22].

2.9. Assaġġ ta' immunofluworexxenza

Iċ-ċelloli HaCaT ġew ikkultivati ​​f'densità ta '1 × 104cells/well f'suppliment DMEM b'10 fil-mija FBS f'kamra 8-well Lab Tek (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Aħna ttrattati minn qabel iċ-ċelloli b'1.5 µM Ectoine għaż-żmien indikat segwit minn irradjazzjoni fin-nuqqas jew il-preżenza ta 'UVA. Iċ-ċelloli ġew soġġetti għal analiżi ta 'immunofluworexxenza, li juża metodu deskritt qabel [21].

2.10. Analiżi Statistika

Aħna użajna l-medja ± devjazzjoni standard (medja ± SD) għar-riżultati kollha użati f'dan l-istudju. Id-dejta kollha ġiet analizzata b'analiżi tal-varjanza (ANOVA), segwita mit-test ta' Dunnett għal tqabbil għaqli f'pari u ppreżentata bħala medja ± SD ta' tlieta. jew aktar esperimenti indipendenti. Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal * p < 0.05;="" **="" p="">< 0.01;="" ***="" p="">< 0.001="" meta="" mqabbla="" ma="" 'ċelluli="" ta'="" kontroll="" mhux="" ittrattati,="" u="" #="" p="">< 0.05;="" ##="" p="">< 0.01;="" ###="" p=""><0.001 meta="" mqabbla="" maċ-ċelluli="" hacat="" esposti="" għall-uva="" jew="" ċelluli="" b16f10="" trattati="">

3. Riżultati

3.1. Ġenerazzjoni ta 'ROS Indotta mill-UVA Inibita f'Ċelloli HaCaT

L-ewwel, aħna ttestjajna għall-effetti ċitotossiċi ta 'Ectoine (Figura 1A) fuq ċelluli HaCaT irradjati bl-UVA. Id-dejta MTT tagħna indikat li meta mqabbla maċ-ċelloli ta' kontroll mhux ittrattati, Ectoine ittrattat minn qabel (0.5-1.5 µM) u 3 J/cm2 UVA esposti HaCaT ċelluli ma setgħux juru tnaqqis sinifikanti fil-cellviability (Figura 1B). Barra minn hekk, it-trattament minn qabel ta 'Ectoine attenwat il-mewt taċ-ċelluli indotta mill-UVA (3 J/cm2) b'mod dipendenti mid-doża (Figura 1B). Minbarra d-dejta tal-fluworexxenza tagħna, li indikat li, meta mqabbla maċ-ċelloli tal-kontroll, l-irradjazzjoni UVA 3 J/cm2 u t-trattamenti bl-Ectoine waħdu (1.5 µM) irregolaw b'mod sinifikanti l-livelli ta' ROS b'{19}} u 2-darbiet, rispettivament. Madankollu, fil-każ ta 'Ectoinepretreatment il-livelli ta' ROS kienu rregolati b'mod sinifikanti u nistgħu niddeduċu li Ectoine għanduantiossidanteffett kontra l-irradjazzjoni UVA. Dan jinduċi wkoll livelli bażali ta 'ROS fiċ-ċelloli HaCaT (Figura 1C, D).

3.2. Ectoine Soppressa POMC u -MSH Espressjonijiet f'Ċelloli HaCaT Irradjati bl-UVA

Il-keratinoċiti esposti għall-UVA ġew stimulati għall-POMC tagħhom medjat minn ROS-p53 u wkoll ormon smallpeptide -MSH li huwa derivat minn POMC [23]. Għalhekk, iddeterminajna l-mudelli ta 'espressjoni ta' alterazzjonijiet ta '-MSH, POMC, u proteini assoċjati oħra f'ċelluli HaCaT ittrattati minn qabel b'Ectoine u mbagħad esponejnahom għal UVA (3 J/cm2). Id-dejta tal-Western blot indikat li l-upregulationof -MSH u l-espressjonijiet POMC indotti mill-UVA kienu rregolati bi trattament minn qabel tal-Ectoine; billi, Ectoinetreatment mingħajr irradjazzjoni UVA inibixxi kompletament l-espressjonijiet -MSH u POMC ta 'ċelloli HaCaT mhux irradjati (Figura 2A). Aktar tard, aħna ttestjajna l-effett ta ''conditioned-medium' (pjanċa 10 mL/100 mm), miksub miċ-ċelloli HaCaT ittrattati minn qabel u rradjati bl-UVA, fuq il-melanoġenesitaċ-ċelluli tal-melanoma B16F10. Figura 2B turi dan il-mezz kondizzjonat downregulatedthetyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP protein kinase, p-CREB, CREB, u livelli MITF fiċ-ċelloli B16F10.

3.3. Ectoine Downregulated Melanin u Tyrosinase Espressjoni fiċ-Ċelloli B16F10 Stimulati-MSH

Iċ-ċelloli tal-melanoma B16F10 l-ewwel ġew soġġetti għall-konċentrazzjonijiet ogħla ta 'Ectoine u l-effett taċ-ċitotossiċità ġie ddeterminat bl-użu tal-assaġġ MTT. Il-Figura 3A turi li Ectoine ma kellu l-ebda impatt sinifikanti fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli B16F10 f'konċentrazzjonijiet ogħla (100-400 μM għal 72 siegħa). Madankollu, il-vijabbiltà taċ-ċelluli ma ġietx effettwata f'24 u 48 siegħa ta' trattament b'Ectoine (dejta mhux murija). Għalhekk, dawn il-konċentrazzjonijiet intużaw biex jiddeterminaw l-effett ta 'Ectoine fuq -MSH-stimulatmelanoġenesifiċ-ċelloli B16F10. Id-dejta tal-kwantifikazzjoni tal-melanin wriet li, meta mqabbla maċ-ċelloli tal-kontroll, it-trattament b'-MSH (1 μM) waħdu irregola b'mod sinifikanti l-livelli tal-melanin b'aktar minn 25 fil-mija. Madankollu, meta mqabbla mat-trattament -MSH waħdu, ċelluli esposti għal konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'Ectoine (100-400 μM f'72 siegħa) irregolaw b'mod sinifikanti u dipendenti fuq id-doża l-perċentwal tal-kontenut ta' melanin b'regolazzjoni baxxa massima ta '85 fil-mija biss (jew -15 fil-mija milli mhux ittrattat). kontroll) kien osservat f'400 μM ta 'trattament minn qabel ta' Ectoine (Figura 3B). Barra minn hekk, id-dejta Western blot tagħna wriet ukoll li -MSH stimulattyrosinase(24 h) u espressjonijiet p-CREB (2 h) kienu rregolati b'mod sinifikanti b'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'trattamenti minn qabel ta' Ectoine f'dawn iċ-ċelloli tal-melanoma (Figura 3C).

3.4. Ectoine Irregola l-Espressjoni ta' Proteini HO-1, NQO-1, u -GCLC fiċ-Ċelloli HaCaT

Biex jiġi ddeterminat l-effett taż-żmien fuq it-traslokazzjoni nukleari medjata minn Ectoine ta 'Nrf2 u l-espressjoni sussegwenti downstream tal-proteini HO-1, NQO-1, u -GCLC, iċ-ċelloli HaCaT ġew esposti għal 1.5 µM Ectoine u l-proteini ċellulari ġew maħsuda. 0.5, 1, 2, 4, 8, jew 12-il siegħa wara l-Ectoinetreatment. Id-dejta tal-Western blot indikat li ħlief għall-proteina -GCLC, 1.5 µM Ectoine ikkawżat l-espressjoni massima tal-proteini HO-1, Nrf2, u NQO-1 fil-punt tal-ħin ta '4 h. -GCLC kien muri f'punt ta 'żmien 8h (Figura 5A). Id-dejta miksuba mill-kurva tal-ħin twassalna biex nittestjaw l-effett tal-konċentrazzjoni tal-Ectoine fuq l-espressjoni ta 'antiossidantproteini f'punt ta' ħin ta' 4 h. Il-Figura 5B turi li t-tliet proteini antiossidanti kollha wrew espressjoni massima f'1.5 µM ta 'konċentrazzjoni ta' Ectoine. Aktar tard, l-effetti tat-trattament minn qabel ta 'Ectoine ġew ittestjati fuq l-espressjoni tal-proporzjon Nrf2 u Keap-1 fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA. L-analiżi tad-dejta tal-Punent indikat li t-trattament minn qabel b'1.5 µM ta 'Ectoine wera żieda fil-proporzjon ta' Nrf2/Keap-1 fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA (Figura 5C). Rajna wkoll dejta konsistenti mal-espressjoni miżjuda ta 'NQO -1, HO-1, u proteini -GCLC f'ċelluli HaCaT ittrattati minn qabel bl-Ectoine li ġew irradjati bi 3 J/cm2 UVA (Figura 5D). Din id-dejta tiddeduċi li t-trattament minn qabel tal-Ectoine għandu rwol protettiv fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA.

3.5. Diversi Mogħdijiet ta' Sinjali Ġew Involuti fl-Attivazzjoni ta' Nrf2 fiċ-Ċelloli HaCaT Ittrattati bl-Ectoine

Aħna ddeterminajna l-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni involuti fit-traslokazzjoni nukleari medjata minn Ectoine ta' Nrf2. Iċ-ċelloli HaCaT ġew ittrattati minn qabel b'inibituri farmakoloġiċi ta 'mogħdijiet ta' sinjalazzjoni PI3K/AKT, ERK, p38, JNK, PKC, ROS, u CKII, segwiti minn 1.5 μM Ectoine. Id-dejta tal-Western blot ta 'Nrf2 nukleari wriet li l-mogħdijiet p38 MAPK, PI3K/AKT, PKC, u CKII kienu involuti f'dan il-mekkaniżmu (Figura 6A). Mill-informazzjoni miksuba, iddeterminajna wkoll l-effett tat-trattament minn qabel ta 'Ectoine fuq ir-rwol li għandhom dawn il-mogħdijiet fl-espressjoni ta' proteini antiossidanti. Il-Figura 6B turi li l-inibizzjoni farmakoloġika tal-mogħdijiet MAPK, p38, PI3K/AKT, CKII, u PKC irregolat 'l isfel l-espressjoni ta' NQO-1, HO-1, u -GCLCantiossidantproteini fiċ-ċelloli HaCaT. Barra minn hekk, iż-żmien meħud għall-fosforilazzjoni ta 'AKT, p38, u l-espressjoni ta' PKC u CKII waqt li kien espost għal Ectoine jindika li, ħlief għall-p-AKT, il-fosforilazzjoni ta 'p38 u l-espressjonijiet ta' PKC u CKII seħħew aktar tard. punti tal-ħin biss (wara 30 min) (Figura 6C). Fil-każ ta 'AKT, il-fosforilazzjoni ġiet osservata mill-punt ta' ħin ta '15-il minuta li laħqet il-quċċata f'30 min (Figura 6C). Fil-każ ta 'AKT, fosforilazzjoni kienet osservata mill-punt ta' żmien 15-il minuta li laħqet quċċata fi 30 min (Figura 6C). Dawn ir-riżultati kumulattivi ssuġġerew li p38, AKT, PKC, u mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni CKII attivaw l-Antiossidanti Ectoine medjat traslokazzjoni nukleari ta' Nrf2 li jwassal għall-espressjoni ta 'proteini antiossidanti.

3.6. Effett Anti-Melanoġeniku Medjat bl-Ectoine ġie mrażżan minħabba l-Knockdown ta 'Nrf2

Ir-rwol ta 'Nrf2 fl-anti-medjazzjoni ta' Ectoinemelanoġenesiġie determinat billi n-Nrf2 sajlens fiċ-ċelloli HaCaT. Dejta mill-Western blot indikat li ċ-ċelloli knockdown Nrf2 esposti għal 1.5 μM Ectoine wrew espressjoni minima ta' NQO-1, HO-1, u -GCLCantiossidantproteini (Figura 7A). Aktar tard, ittestjajna l-effett ta 'knockdown Nrf2 fuq l-espressjoni ta' livelli -MSH f'ċelloli HaCaT irradjati UVA (3 J/cm2). Ir-riżultati tal-Western blot indikaw li biex jikkontrollaw iċ-ċelluli trasfettati b'siRNA, l-irradjazzjoni UVA kienet sinifikanti fl-upregulation tal-espressjoni ta 'livelli -MSH f'ċelloli mhux esposti għal Ectoine (Figura 7B). Madankollu, 1.5 μM Ectoine irażżan dan l-effett. Għall-każ l-ieħor, ċelluli trasfettati b'siNrf2 wrew tnaqqis fl-espressjoni ta 'livelli ta' -MSH kemm f'ċelluli mhux ittrattati kif ukoll ittrattati (Figura 7B). Simili għad-dejta -MSH, id-dejta tal-fluworexxenza tagħna indikat ukoll li l-irradjazzjoni UVA irregola b'mod sinifikanti l-produzzjoni ROS f'ċelluli siRNA ta 'kontroll mhux ittrattati bl-Ectoine (Figura 7C, D).Madankollu, dan l-effett ġie mrażżan b'mod sinifikanti meta ċ-ċelloli kienu esposti għal 1.5 µM Ectoine. Min-naħa l-oħra, ċelluli HaCaT trasfettati Nrf2 u irradjati bl-UVA wrew żieda ta 'madwar 8-darbiet fil-livelli ta' ROS meta mqabbla maċ-ċelloli trasfettati Nrf2 li ma kinux irradjati bl-UVA iżda esposti għal trattament ta 'Ectoine (Figura 7C, D). Din id-dejta kollha tfisser ir-rwol protettiv medjat mill-Ectoine li għandu Nrf2 fil-minimizzazzjoni tal-produzzjoni tal-melanin fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA. . Din id-dejta kollha tfisser ir-rwol protettiv medjat minn Ectoine li kellu Nrf2 fil-minimizzazzjoni tal-produzzjoni tal-melanin fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA.

benefiċċju cistanche: jbajdu l-ġilda

4. Diskussjoni

Ġilda varji-jbajduaġenti qed jintużaw fl-industrija tal-kosmetiċi. Ħafna minn dawn l-aġenti huma minn oriġini kimika u qed ibatu mil-limitazzjonijiet li jikkawżaw diversi effetti sekondarji inklużi l-kanċer [24-26]. Għalhekk, l-identifikazzjoni ta 'aġenti sikuri u naturali li jbajdu l-ġilda tirrappreżenta l-ħtieġa tas-siegħa. Ectoine (Figura 1A) ġie magħruf li jintuża bħala ingredjent attiv fil-kremi tal-wiċċ u aġenti kożmetiċi oħra. Dan jaġixxi bħala aġent moisturizing tal-ġilda u huwa wkoll meqjus li jdewwem it-tixjiħ prematur tal-ġilda wkoll [27]. Kważi l-aġenti kollha magħrufa li jbajdu l-ġilda jimmiraw lejn ir-regolazzjoni ta' isfeltyrosinaseattività tal-enżima fiċ-ċelloli irradjati bl-UV li tnaqqas il-melanoġenesifiċ-ċelloli tal-ġilda.Yao et al. wera l-jbajduproprjetajiet ta 'biosynthesized Ectoine u ssuġġeriet li huwa aputative aġent li jbajdu. Fl-istudju tagħhom, ittestjaw il-konċentrazzjoni għolja (500 µM) ta’ Ectoine għall-effett li jbajdu fuq il-linji taċ-ċelluli tal-melanoma tal-ġurdien (B16F0) u tal-bniedem (A2058) u kkonkludew li Ectoine huwa sikur u aġent potenzjali għall-applikazzjoni kosmetika u klinika [20]. Madankollu, f'dan l-istudju, aħna ttestjajna aktar l-effetti ta 'benefiċċju ta' konċentrazzjonijiet baxxi ta 'Ectoine (0.5-1.5 µM) fuq ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA u l-mekkaniżmi molekulari sottostanti ġew deċifrati. Fl-istudju tagħna, intwera li Ectoine, permezz tal-mogħdija Nrf2/ARE, mhux biss indotta l-espressjoni tal-espressjoni tal-ġeni antiossidanti iżda wkoll irregola l-livelli -MSH fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA permezz tat-trażżin tal-POMC. Tnaqqis fil-livelli ta '-MSH kien korrelatat mat-tnaqqis fl-attività ta' l-enzima tyrosinase li wassal għat-tnaqqis fil-produzzjoni tal-melanin. Mill-għarfien tagħna, dan huwa l-ewwel ir-rapport li kien evidenzjat mill-mekkaniżmu suscitat minn Ectoine fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA. Dan l-istudju ddelinea l-mekkaniżmi molekulari esibiti minn Ectoine fiċ-ċelloli HaCaT bħala s-sistema tal-mudell ċellulari.

L-ewwel iddeterminajna l-konċentrazzjonijiet sub-letali ta 'Ectoine kif ukoll l-effett tar-radjazzjoni UVA fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli HaCaT. Id-dejta MTT tagħna indikat li konċentrazzjonijiet baxxi ta 'Ectoine (0.5-1.5 µM) ma kellhom l-ebda effett sinifikanti fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli HaCaT (Figura 1B). It-trattament minn qabel ta 'l-ectoine żied il-vijabbiltà ta' ċelluli HaCaT irradjati bl-UVA ta '3 J/cm2 (Figura 1B). Fuq il-bażi ta' dawn l-osservazzjonijiet, aħna nkomplu b'aktar esperimenti bl-użu ta' 1.5 µM ta' trattament minn qabel ta' Ectoine u irradjazzjoni UVA f'dożaġġi ta' 3 J/cm2.

Il-produzzjoni ta 'ROS indotta mill-irradjazzjoni UVA fil-keratinoċiti tal-ġilda hija fatt magħruf [28]. Għalhekk, aħna ttestjajna wkoll għal kwalunkwe effett ta 'benefiċċju mit-trattament minn qabel ta' Ectoine fil-produzzjoni ta 'ROS indotta mir-radjazzjoni UVA fiċ-ċelloli HaCaT. Id-dejta tal-intensità tal-fluworexxenza DCF tagħna indikat li t-trattament minn qabel b'1.5 µM ta 'Ectoine irregola b'mod sinifikanti l-inkeratinoċiti tal-produzzjoni ROS indotti mir-radjazzjoni UVA. Kien ukoll osservabbli li 1.5 µM ta 'Ectoine jistgħu jikkawżaw żieda fil-livell bażali fil-livelli ta' theROS fiċ-ċelloli HaCaT li ntwerew li huma statistikament sinifikanti (Figura 1D, E).

Rousseau et al. irrapporta li l-POMC huwa mnixxi minn keratinoċiti epidermali umani andmelanocytes u stimulatmelanoġenesi[29]. Billi nżommu dan fid-dawl, aħna wkoll ittestjajna l-effett tal-irradjazzjoni UVA u t-trattamenti minn qabel tal-Ectoine fuq il-proteini assoċjati mal-melanoġenesi fiċ-ċelloli HaCaT. Id-dejta tagħna tal-Western blot indikat li t-tnaqqis dipendenti fuq id-doża tal-espressjoni tal-proteini -MSH u POMC fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA kien ikkawżat mit-trattament minn qabel minn Ectoine. Għall-kuntrarju, it-trattament minn qabel tal-Ectoine għandu effett differenzjali fuq il-mudell tal-espressjoni ta 'melanoġenesi-proteini assoċjati. Notevolment, kważi l-proteini kollha ttestjati (Tyrosinase, TRP-1, TRP-2, c-AMP proteinkinase, CREB, u MITF) wrew espressjonijiet imnaqqsa b'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'Ectoinepre-trattament f'ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA (Figura 2A, B). Din id-dejta tfisser il-fatt li Ectoinepossess proprjetajiet anti-melanoġeniċi fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA.

L-effikaċja anti-melanoġenika ta 'Ectoine ġiet ittestjata aktar fiċ-ċelloli B16F10, linja taċ-ċelluli tal-melanoma magħrufa sew użata f'melanoġenesistudji [30]. Waħda mill-osservazzjonijiet notevoli fl-istudju tagħna kienet li, b'kuntrast maċ-ċelluli HaCaT, konċentrazzjonijiet għoljin ta 'Ectoine (100-400 µM) kienu meħtieġa biex irażżnu s-sintesi tal-melanin fiċ-ċelloli B16F10 stimulati mill-MSH (Figura 3B). Il-blotdata tal-Punent tagħna indikat li l-espressjoni ta 'Ectoine skont id-doża rregolattyrosinaseu p-CREBproteins f'ċelluli B16F10 stimulati minn -MSH, li jwasslu għall-effett imsemmi qabel (Figura 3C). Għalhekk, ittestjaw ukoll jekk dawn il-konċentrazzjonijiet għoljin ta 'Ectoine jistgħux jaffettwaw il-vijabbiltà taċ-ċelloli B16F10. MTTresults tagħna indikaw li konċentrazzjonijiet għoljin ta 'Ectoine (100-400 µM) ma kellhom l-ebda effett fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli B16F10 (Figura 3A). Dawn ir-riżultati juru li l-keratinoċiti għandhom rwol ewlieni fl-anti-medjati mill-Ectoine.melanoġenesiu effetti depigmentanti.

Ir-rwol tal-fattur ta 'traskrizzjoni Nrf2 fil-metaboliżmu taċ-ċelluli tal-ġilda kien iddokumentat tajjeb [31]. Għalhekk, ittestjajna aktar il-mekkaniżmi li għandhom il-passaġġ Nrf2/Keap-1 fl-effetti medjati mill-Ectoine fil-keratinoċiti. Il-Figura 4A turi li l-proporzjon ta' Nrf2/Keap-1 b'effett massimu kien osservat f'konċentrazzjoni ta' Ectoine ta' 1.5 µM. Ġie osservat ukoll li 1.5 µM Ectoine iffavorixxi t-traslokazzjoni nukleari tal-proteina Nrf2 bl-espressjoni massima ta 'Nrf2 mill-frazzjoni tal-proteina nukleari osservata fil-punt ta' ħin ta '2 h (Figura 4B). (Figura 4D).

F'melanoċiti u keratinoċiti umani, Marrot et al. u oħrajn spjegaw l-importanza tal-mogħdija difensiva Nrf2 fir-risponsi għall-istress foto-ossidattiv [32]. Aħna wkoll studjajna l-effett tal-espressjoni tal-proteina antiossidanti medjata minn Ectoine fiċ-ċelloli HaCaT. Id-dejta tal-kurva tal-ħin tagħna indikat li l-espressjoni medjata mill-Ectoine tat-tliet proteini anti-ossidanti kollha (HO-1, NQO-1, -GCLC), u Nrf2 intwerew li jesprimu b'mod bifażiku maż-żmien dejjem jiżdied ({{ 8}}.5-12 h) b'effett osservabbli kien notedat 4 h punt ta 'żmien (Figura 5A). Minn dan, kurva ta 'konċentrazzjoni li tkejjel l-effett ta' Ectoineconcentration fuqantiossidantl-espressjoni tal-proteina ġiet ukoll determinata f'punt ta' ħin ta' 4h. Figura 5B turi li meta mqabbla maċ-ċelloli mhux ittrattati, it-trattament b'Ectoine żied l-espressjoni tal-proteini HO-1, NQO-1, -GCLC b'mod dipendenti fuq id-doża. Aħna tkejjel ukoll kif il-konċentrazzjoni ta 'Ectoine uriet effetti protettivi fiċ-ċelloli HaCaT li kienu esposti għar-radjazzjoni UVA. Id-dejta tal-Western blot wriet li Ectoine żiedet b'mod dipendenti fuq id-doża l-espressjoni ta 'proteini anti-ossidanti b'regolazzjoni drammatika fil-proporzjon Nrf2/Keap-1 ukoll (Figura 5C, D). Dawn ir-riżultati indikaw li Ectoinepretreatment (1.5 µM, 4 h) għandu l-effett potenzjali li jinduċi espressjoni ta 'proteini antiossidanti f'HaCaTcells li jistgħu jikkontrobattu l-effetti ħżiena maħluqa mill-espożizzjoni UVA.

antiossidant cistanche

5. Konklużjonijiet

Mid-dejta ta’ hawn fuq, aħna kkonkludejna li konċentrazzjonijiet baxxi ta’ Ectoine ({0}}.5–1.5 µM) setgħu jirregolaw b’mod negattiv il-produzzjoni ta’ -MSH u melanin permezz tas-soppressjoni ta’ POMC utyrosinasemogħdija fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA, li tindika l-anti-melanoġenesieffikaċja. Barra minn hekk, Ectoine kien involut ukoll fis-soppressjoni tal-produzzjoni intraċellulari ta 'ROS fiċ-ċelloli HaCaT. B'differenza taċ-ċelluli HaCaT, konċentrazzjonijiet għoljin ta' Ectoine (50–400 µM) setgħu juru effett simili fiċ-ċelluli tal-melanoma B16F10 li wrew il-fatt li l-keratinoċiti jista' jkollhom rwol ewlieni fl-anti-medjazzjoni ta' Ectoine.melanoġenesiu ġilda-jbajdueffetti fiċ-ċelloli tal-ġilda. L-aktar importanti, Ectoine medja effetti ta 'benefiċċju permezz tal-attivazzjoni tal-passaġġ Nrf2, li jinduċi l-espressjoni ta'antiossidantproteini HO-1, NQO-1, u -GCLC. AKT intwera li huwa l-ewwel mogħdija ta 'sinjalazzjoni li tibda l-attivazzjoni ta' Nrf2 segwita mill-mogħdijiet l-oħra (p38, PKC, u CKII). Fl-aħħarnett, is-sajlenser ta 'Nrf2 direttament ipprovda evidenza li Nrf2 għandu rwol ewlieni fir-regolamentazzjoni ta' ROS intraċellulari kif ukoll il-produzzjoni -MSH. Aħna kkonkludejna li l-mekkaniżmu ewlieni li jbajdu l-Ectoine għandu jkun irraġunat mill-inibizzjoni tal-mogħdija ROS-p53/POMC- -MSH fiċ-ċelloli HaCaT irradjati bl-UVA. Għalhekk, Ectoine jew id-derivattivi tiegħu jistgħu jkunu ingredjent attiv fil-moisturizers u l-lozjonijiet. li jintużaw bħala ġilda potenzjali u bbażata fuq naturalijbajduaġenti fl-industrija tal-kosmetiċi.

Suppliment antiossidant ta' cistanche