L-effett protettiv tal-quercetin fuq iċ-ċelloli endoteljali midruba minn ipoksja u riossiġenazzjoni

Għal aktar informazzjoni ikkuntattjatina.xiang@wecistanche.com

Sfond: Il-marda tal-bastimenti żgħar ċerebrali (CSVD) hija grupp ta 'sindromi kliniċi li jkopru l-proċessi patoloġiċi kollha ta' bastimenti żgħar fil-moħħ, li jistgħu jikkawżaw puplesija u dimenzja serja. Madankollu, peress li l-patoġenesi ta 'CSVD mhix ċara, għalhekk it-trattament huwa limitat. Disfunzjoni taċ-ċelluli endoteljali hija aktar kmieni mis-sintomi kliniċi, bħal pressjoni għolja u lewkożi. Għalhekk, it-trattament taċ-ċelloli endoteljali huwa mistenni li jkun avvanz ġdid.Quercetin, flavonoid preżenti f'varjetà ta 'pjanti, għandu l-funzjoni ta' anti-infjammazzjoni u anti-ossidazzjoni. Dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-effett protettiv tal-quercetin fuq il-ħsara taċ-ċelluli endoteljali u jipprovdi teorija bażika għal applikazzjoni sussegwenti fil-klinika.

Metodi: Ċelloli endoteljali mikrovaskulari tal-moħħ tal-bniedem (HBMECs) ġew ikkultivati ​​in vitro, u l-mudell ta 'ħsara taċ-ċelloli endoteljali ġie stabbilit permezz ta' ipoksja u riossiġenazzjoni (H/R). L-effetti protettivi tal-quercetin fuq HBMECs ġew studjati mill-perspettivi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli, il-migrazzjoni taċ-ċelluli, l-anġjoġenesi u l-apoptożi. Sabiex jiġi studjat aktar il-mekkaniżmu tal-quercetin,stress ossidattivu stress reticulum endoplasmic ġew analizzati. Barra minn hekk, ġiet studjata wkoll l-integrità tal-barriera tad-demm-moħħ (BBB).

Riżultati: Quercetinjista 'jippromwovi l-vijabbiltà, il-migrazzjoni u l-anġjoġenesi ta' HBMECs, u jinibixxi l-apoptożi. Barra minn hekk, quercetin jista 'wkoll jattiva l-mogħdija ta' sinjalazzjoni Keap1/Nrf2, tnaqqas l-espressjoni tal-proteina ATF6/GRP78. Studju ulterjuri wera li quercetin jista 'jżid l-espressjoni ta' Claudin-5 u Zonula occludens-1.

Konklużjonijiet: L-esperimenti tagħna juru li quercetin jista 'jipproteġi l-HBMECs minn H/R, li fih il-promozzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli, il-migrazzjoni taċ-ċelluli u l-anġjoġenesi, inaqqas il-ħsara potenzjali tal-membrana mitokondrijali u jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli. Dan jista 'jkun relatat mal-antiossidazzjoni tiegħu u l-inibizzjoni tal-istress tar-retikulu endoplasmiku. Fl-istess ħin, quercetin jista 'jżid il-livell ta' BBB connexin, li jissuġġerixxi li quercetin jista 'jżomm l-integrità BBB.

Kliem ewlieni: mard tal-bastimenti żgħar ċerebrali, ċelloli endoteljali, quercetin, stress ossidattiv, stress tar-retikulu endoplasmiku, barriera demm-moħħ

INTRODUZZJONI

Mard taċ-ċerebrali tal-bastimenti żgħar(CSVD) huwa terminu umbrella li jinkludi l-proċessi patoloġiċi kollha li jinvolvu l-bastimenti żgħar fil-moħħ u jirreferi għal grupp ta’ sindromi kliniċi, ta’ immaġini u patoloġiċi b’diversi etjoloġiji li fihom l-arterioli intrakranjali għal venules (dijametru).<400 μm）（wardlaw="" et="" al,2013;="" wardlaw="" et="" al,2019).="" the="" most="" common="" symptoms="" include="" mainly="" new-onset="" subcortical="" small="" infarcts,="" lacunar="" foci="" of="" vascular="" origin,="" cerebral="" white="" matter="" hyperintensities,="" microbleeds,="" cerebral="" atrophy,="" and="" enlarged="" perivascular="" spaces="" (wardlaw="" et="" al,2013).="" with="" the="" progression="" of="" the="" disease,="" subclinical="" and="" early-stage="" patients="" can="" have="" emotional="" abnormalities,="" gait,="" memory,="" disorientation,="" and="" even="" stroke="" and="" dementia="" and="" other="" serious="" consequences.="" up="" to="" 25%="" of="" stroke="" and="" 45%="" of="" dementia="" are="" caused="" by="" csvd(cannistraro="" et="" al,2019),="" which="" brings="" a="" heavy="" socioeconomic="" burden="" and="" is="" a="" major="" problem="" that="" needs="" to="" be="" addressed="" by="" slow="" disease="" and="" health="" strategies.="" scholar="" has="" used="" dynamic="" contrast="" enhanced-mri="" technique="" to="" find="" that="" blood-brain="" barrier(bbb)leakage="" is="" more="" prevalent="" in="" csvd="" patients(zhang="" et="" al,2017).="" extravasation="" of="" blood="" components="" may="" lead="" to="" local="" vascular="" changes="" and="" diffuse="" brain="" tissue="" damage.="" the="" bbb="" is="" a="" junction="" of="" endothelial="" cells,="" pericytes,="" and="" astrocyte="" tight="" junctions(keaney="" and="" campbell,="" 2015).in="" addition,="" more="" and="" more="" scholars="" also="" believe="" that="" endothelial="" dysfunction="" plays="" a="" key="" role="" in="" the="" early="" development="" of="" csvd="" (hainsworth="" et="" al,2015).="" therefore,="" protecting="" endothelial="" cells="" may="" be="" a="" potential="" therapeutic="" strategy="" for="">

Quercetinhuwa flavonoid preżenti f'diversi pjanti, bħal Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc għandu attivitajiet antiossidanti u anti-infjammatorji qawwija u jista 'jeżerċita effetti protettivi f'diversi kundizzjonijiet patoloġiċi inklużi mard kardjovaskulari, disturbi metaboliċi, mard newrodeġenerattiv, dijabete, kanċer, u obeżità (Dok-Go et al,2003; Comalada et al,2005; Cho et al,2006). It-trattament minn qabel bil-quercetin żied b'mod sinifikanti l-livelli ta 'espressjoni ta' enzimi antiossidanti endoġeni fin-newroni piramidali ta 'l-ippocampal CA1 ta' annimali midruba bl-iskemija, u wera effetti antiossidanti u newroprotettivi qawwija (Chen et al, 2017). Studji reċenti sabu wkoll li quercetin għandha effetti newroprotettivi kontra l-ħsara iskemika filwaqt li żżomm l-integrità BBB (Jin et al, 2019). Madankollu, l-effett tiegħu fuq iċ-ċelloli endoteljali mikrovaskulari tal-moħħ (BMECs) taħt l-ipoksja u l-ħsara tar-riossiġenazzjoni (H/R) huwa studjat ħażin, u l-proteina fil-mira tal-BMECs li jipproteġu quercetin ma ġietx irrappurtata.

Fl-istudju tagħna, esplorajna l-effett protettiv ta 'quercetin fuq ċelluli endoteljali mikrovaskulari tal-moħħ tal-bniedem (HBMECs) imweġġa' minn H / R fil-kultura. Fl-istess ħin, aħna studjaw aktar il-mekkaniżmu possibbli tal-effett protettiv tiegħu, sabiex nipprovdu bażi aktar teoretika għall-promozzjoni klinika tal-quercetin u nipprovdu ideat ġodda għat-trattament ta 'CSVD.

MATERJALI U METODI

Midja, Reaġenti, u Antikorpi

Quercetin(purity>98 fil-mija) ġie akkwistat minn Best Biological Technology Co, Ltd.(Chengdu, China). L-HBMECs inxtraw minn Qingqi Biotechnology Development Co., Ltd (Shanghai, iċ-Ċina). Serum bovin tal-fetu (FBS) inkiseb mill-Industriji Bijoloġiċi (Kibbutz Beit Haemek, Iżrael). Peniċillina/streptomycin u Dulbecco modifikat ajkla medju (DMEM) kienu mixtrija minn Hyclone(GA, l-Istati Uniti). Kit tat-test tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (JC-1), kit tat-test tal-proteina BCA, 2,7-dichloride-hydro fluorescein diacetate (DCFH-DA), u NP40 lisat inxtraw minn Beyotime Biotechnology (Shanghai, iċ-Ċina). Il-preparazzjoni tal-fosfati u l-inibitur sħiħ tal-protease nxtraw minn Roche (Shanghai, iċ-Ċina). Apoptosis Kit inxtara minn BD Biosciences (Sparks, MD, l-Istati Uniti). Malondialdehyde (MDA), Superoxide dismutase (SOD), molekula ta' adeżjoni taċ-ċelluli interċellulari-1 (ICAM-1), molekula ta' adeżjoni taċ-ċelluli vaskulari-1 (VCAM{{1{0}}} )assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi (ELISA) kien (Cambridge, Abcam mixtrija kumpanija dfrom1"一Renju Unit). Antikorpi kontra l-fattur Nukleari E2-fattur 2(Nrf2), Kelch Like ECH Associated Protein 1 (Keap1), Fattur ta 'traskrizzjoni attivant 6 (ATF6), proteina regolata bil-Glukożju 78 (GRP78), Zonula occludens 1 (ZO-1), Claudin-5, GAPDH inxtara minn Cell Signaling Technology (Danvers, l-Istati Uniti). IgG kontra l-fenek konjugat ta’ Horseradish peroxidase (HRP) inkiseb mill-kumpanija Jackson (Pennsylvania, l-Istati Uniti). Kit ta’ tqassim rapidu SDS-PAGE u soluzzjoni kromoġenika ECL inxtraw minn EpiZyme Biotechnology (Shanghai, Ċina). Mudell ta’ Kultura taċ-Ċelluli u Korriment HBMECs kienu kkultivati ​​f'DMEM li kien fih 10 fil-mija FBS u 1 fil-mija penicillin-streptomycin, f'37Cincubator b'5 fil-mija CO2. Biex tikkawża endotel ħsara taċ-ċelluli ial, HBMECs ġew ittrattati bi 12-il siegħa ipoksja segwiti minn 8 sigħat ta 'ossiġenazzjoni mill-ġdid, u l-proċeduri speċifiċi kienu kif ġej (Warpsinski et al.,2020): HBMECs ġew inkubati l-ewwel bil-medju mingħajr serum f'inkubatur ta' ipoksja (1 fil-mija). O,5 fil-mija CO.94 fil-mija N) għal 12-il siegħa, u mbagħad il-mezz inbidel għal medju normali li fih 10 fil-mija FBS, filwaqt li kienu inkubati f'inkubatur normoxia (95 fil-mija O2,5 fil-mija CO2) għal 8 sigħat. Trattament Quercetin 2 mg Quercetin ġie maħlul fi 331μL DMSO biex tifforma soluzzjoni stokk b'konċentrazzjoni ta '1 mmol/L u maħżuna fi grad ta' -20 grad. Is-soluzzjoni tax-xogħol ġiet dilwita għal 0.1,0.5,1,2,5,10umol/L b'DMEM, li fiha l-persentaġġ ta 'DMSO kien taħt 0.1 fil-mija. Ladarba ċ-ċelluli kienu aderenti, ġiet miżjuda quercetin bil-medium ħieles mis-serum, u l-pjanċi tqiegħdu sussegwentement fl-inkubatur tal-ipoksja. Wara 12-il siegħa, iċ-ċelluli tneħħew, mibdula għal quercetin b'medja tas-serum, u mqiegħda f'inkubatur normoxia għal 8 sigħat.

Assaġġ tal-Vijabilità taċ-Ċelluli

L-effetti ta 'quercetindwar il-vijabbiltà tal-HBMECs ġew eżaminati minn Cell Counting Kit-8 skont il-manwal tal-operatur. Id-dożi sikuri ta 'quercetin għaċ-ċelluli fin-nuqqas ta' ħsara liċ-ċelloli endoteljali ġew l-ewwel evalwati, u mbagħad ġew ittestjati l-effetti protettivi tagħha fil-kundizzjoni tal-ħsara taċ-ċelluli. Ir-riżultati sperimentali kollha ġew ripetuti mill-inqas tliet darbiet.

Scratch Healing u Assay ta' Formazzjoni ta' Tubi L-esperimenti ta' migrazzjoni saru bl-użu ta' metodu ta' scratch taċ-ċelluli. Qabel it-trattament tal-quercetin, inġibdet linja perpendikolari dritta fil-qiegħ tal-pjanċa tal-kultura u ġiet ritrattata għar-reġistrazzjoni għal 0 h, u ċ-ċelloli ġew sussegwentement soġġetti għal quercetin u trattament ta 'mudellar qabel ma jieħdu ritratti għar-reġistrazzjoni. Iż-żoni ta 'quddiem u ta' wara kienu kkuntrastati darbtejn.

Il-formazzjoni tat-tubu li timita l-kapaċità anġjoġenika taċ-ċelluli, il-Matrigel (9-12mg/ml) tqiegħed fuq il-qiegħ tal-pjanċa tal-kultura, imbagħad quercetin u ċ-ċelluli trattati għall-immudellar ġew ibbanjati fuq nett, wara 8 sigħat, ittieħdu stampi. Il-ġenerazzjoni tal-fergħat tal-vini tad-demm ġiet analizzata u mqabbla bl-użu ta 'ImageJ.

Potenzjal tal-Membrana Mitokondrijali u Assaġġ tal-Apoptożi

Il-bidla potenzjali tal-membrana mitokondrijali u l-kit tal-apoptożi ntużaw biex jiskopru l-apoptożi taċ-ċelluli. L-alterazzjoni tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali ġiet skoperta billi tbajja l-HBMECs b'sonda fluworexxenti JC-1. Soluzzjoni ta' ħidma tat-tbajja' JC-1(1×) ġiet miżjuda u inkubata f'Cinubator ta' 37 grad għal 20 minuta qabel ma ġiet maħsula darbtejn b'buffer tat-tbajja' JC{-1(1×)u finalment miżjuda ma' kull bir għall-PBS . Imbagħad, l-immaġni taċ-ċelluli ta 'kontenut għoli intuża għall-analiżi.

L-HBMECs inġabru mill-{0}}pjanċi tal-bir, ċentrifugati biex tneħħi s-supernatant, sussegwentement żid 1 × soluzzjoni li torbot l-Annex V biex nefħu u ħallat iċ-ċelloli, imbagħad żid FITC Annexin V żebgħa biex inkuba fid-dlam f'temperatura tal-kamra għal 10 min, żid propidium iodide (PI) tebgħa soluzzjoni 5 min qabel il-magna, u ċitometru tal-fluss Beckman kien impjegat biex tiskopri.

ELISA

Wara li ċ-ċelloli ġew ittrattati b'H/R jew quercetin, inġabar is-supernatant. ICAM-1, VCAM-1, SOD, u MDA ġew skoperti bl-użu ta' kits ELSA skont il-manwal tal-operatur.

Assaġġ ta 'Speċi ta' Ossiġenu Reattiv (ROS) Il-kapaċità tal-ġenerazzjoni ROS ġiet skoperta mis-sonda DCFH-DA, li ġiet evalwata mill-immaġni taċ-ċelluli ta 'kontenut għoli, u analizzata bil-fluworexxenza bl-użu ta' ImageJ. Western Blotting

L-HBMECs inġabru minn pjanċi tal-kultura, NP40 lysate li żżid il-preparazzjoni tal-phosphatase u inibitur tal-protease komplut intuża biex jiġi estratt proteini miċ-ċelloli. Il-kontenut ta 'proteina ġie determinat u 30ug proteina ttieħdet għal esperimenti ta' immunoblotting. Il-ġel SDS-PAGE intuża għall-elettroforeżi, imblukkat b'5 fil-mija ħalib niexef mingħajr xaħam wara elettrotrasferiment għal membrana PVDF għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Imbagħad anti-Nrf2(fenek, 1:1,000),anti-Keapl(fenek,1:1,000),anti-ATF6(fenek,1:1,000 ), anti-GRP78(fenek,1:1,000), anti-ZO-1(fenek,1:1,000), anti-Claudin-5( fenek,1:1,000) antikorpi ġew inkubati matul il-lejl f'4C. Wara l-ħasil l-għada, ġew miżjuda antikorpi sekondarji tal-Mogħoż kontra l-fniek dilwiti (IgG HRP, 1:10,000) u ġew inkubati għal siegħa. Fl-aħħarnett, l-iskoperta ġiet żviluppata wara ħasil tliet darbiet f'TBST.

Analiżi Proteomika

HBMECs ġew ittrattati b'H/R fil-preżenza ta 'quercetin (l umol/L). Sussegwentement, iċ-ċelluli ġew mibruxa bil-mod mill-pjanċa tal-kultura bi barraxa taċ-ċelluli, miġbura fi krijovjali, imqiegħda malajr f'nitroġenu likwidu, u mbagħad maħżuna fi grad-80 għal 5 min It-teknoloġija iTRAQ intużat biex tagħmel l-analiżi proteomika, il- proteini b'valur p<0.05 and="" ratio="" multiple="" changes="">1.2 jew<0.83 were="" defined="" as="" differentially="" expressed="">

Analiżi Statistika

Id-dejta kienet tajba mad-distribuzzjoni normali, u ntużat il-medja ± devjazzjoni standard biex tesprimi d-dejta. GraphPad Prism 8 intuża għall-analiżi statistika. Żewġ kampjuni indipendenti ġew analizzati bit-test t, u d-dejta tal-kejl ġiet deskritta bil-medja ± Devjazzjoni Standard (SD). It-tqabbil bejn il-gruppi sar b'analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA). valur p<0.05 indicated="" that="" the="" difference="" was="" statistically="">

RIŻULTATI

Riżultati

Effett ta 'Quercetin fuq il-Vijabilità taċ-Ċelloli

Biex nittestjaw l-effett tal-quercetin fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli, l-ewwel eżaminajna doża sikura ta’ quercetin fuq iċ-ċelloli, kif muri fil-Figura 1A, li ma kellha l-ebda impatt fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli f’0.1-10 umol/L . Sussegwentement, għat-tiftix għal doża effettiva fuq il-bażi tal-ħsara taċ-ċelluli endoteljali, urejna li quercetin f'{3}}.1-1 μmol/L jista' jippromwovi l-vijabbiltà taċ-ċelluli f'H/R-HBMECs, kif muri fil-Figura 1B. Esperimenti sussegwenti twettqu madwar din il-firxa ta 'konċentrazzjoni. Ta 'min jinnota li meta l-konċentrazzjoni tad-droga laħqet 10 μmol/L, dehret iċ-ċitotossiċità. Ħsibna li meta l-HBMECs ġew imħassra minn H/R, it-tolleranza tagħhom tonqos. Għalhekk, meta l-konċentrazzjoni tad-droga kienet kemmxejn ogħla, il-ħsara liċ-ċelloli żdiedet. Għalhekk, ċitotossiċità seħħet meta l-konċentrazzjoni tad-droga hija 10 μmol/L.

Effett tal-Quercetin fuq il-Migrazzjoni taċ-Ċelloli u l-Anġjoġenesi

Biex teżamina l-effetti tal-quercetin fuq il-kapaċitajiet migratorji u anġjoġeniċi taċ-ċelluli endoteljali, HBMECs ġew soġġetti għal trattament H/R waqt li ingħatat quercetin. Aħna wettaqna scratch assay biex nittestjaw il-kapaċità tal-migrazzjoni taċ-ċelluli, li wera li t-trattament H/R dgħajjef il-kapaċità tal-migrazzjoni ta 'H/R-HBMECs meta mqabbel mal-kontroll, u quercetin jista' jippromwovi b'mod sinifikanti l-migrazzjoni taċ-ċelluli f'konċentrazzjoni ta '0 .1-1 μmol/L. Tubulogenesis intużat biex timita l-anġjoġenesi in vitro, u t-tul tal-fergħa tagħha jirrappreżenta l-kapaċità anġjoġenika. Ir-riżultati wrew li t-trattament H/R irriżulta f'kapaċità anġjoġenika mnaqqsa, iżda quercetin 0.1-1 μmol/L jista 'jreġġa' lura din il-ħsara, kif muri fil-Figura 2.

Effett tal-Quercetin fuq l-Apoptożi taċ-Ċelloli

Biex tittestja l-potenzjal ta 'quercetin li jinibixxi l-apoptożi taċ-ċelluli endoteljali, użajna l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali u l-apoptożi għall-evalwazzjoni. Meta ċ-ċelloli ndarbu biex jgħaddu minn avvenimenti apoptotiċi, il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali tnaqqas, il-fluworexxenza ħamra ċitoplasmika tnaqqset b'mod sinifikanti, il-fluworexxenza ħadra żdiedet, u l-Aħmar/Aħdar (R/G) ġiet finalment adottata biex tirrappreżenta l-alterazzjoni tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali, li se jonqos meta l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali jiġi kompromess. Ir-riżultati tagħna wrew li wara t-trattament H/R, il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali taċ-ċelloli naqas, kif indikat minn żieda fil-fluworexxenza ħadra. B'dożi dejjem jiżdiedu ta 'quercetin, il-fluworexxenza ħamra kienet imtejba kontinwament, li jindika li quercetin jista' jgħolli l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali b'mod dipendenti fuq id-doża (Figura 3A, C). Barra minn hekk, iċ-ċitometrija tal-fluss ġiet impjegata biex teżamina direttament l-apoptosi taċ-ċelluli. Ir-riżultati wrew li l-HBMECs urew rata elevata ta 'apoptożi wara trattament H/R, filwaqt li quercetin fi 0.1-1 umol/L wera kapaċità ċara li jinibixxi l-apoptożi (Figura 3B, D).

Effett tal-Quercetin fuq l-Adeżjoni taċ-Ċelloli

Ladarba ċ-ċelloli endoteljali jiġu mħassra, xi molekuli ta' adeżjoni, bħal ICAM{{0}} u VCAM{-1 jiġu prodotti, jassorbu sustanzi tossiċi fil-BBB, u jagħmlu ħsara lill-parenkima tal-moħħ (Hauptmann et al, 2020 ). Biex jiġi eżaminat l-effett tal-quercetin fuq l-abbiltà ta 'H/R-HBMECs li jipproduċu molekuli ta' adeżjoni, ICAM-1 u VCAM-1 ġew imkejla bl-użu ta 'ELISA. Fl-istudju tagħna, H/R irriżulta f'livelli miżjuda ta' ICAM-1 u VCAM-1, iżda ż-żieda ta' quercetin taħt il-konċentrazzjoni ta' 0.1-1 umol/L naqqset dan l-effett (Figura 4).

Quercetin Jista 'Jinibixxi Stress Ossidattiv

Quercetin huwa flavonoid b'kapaċità antiossidant qawwija, għalhekk użajna sonda DCFH-DA biex tiskopri ROS. Osservajna

żieda fil-ġenerazzjoni ta' ROS f'HBMECs esposti għal H/R, li tnaqqset b'mod notevoli permezz ta' trattament ta' quercetin fil-konċentrazzjonijiet ta' {{0}}.1-1 umol/L Sadanittant, skoprejna l-bidliet fil-livell ta' stress ossidattiv prodotti SOD u MDA b'ELISA, u r-riżultati wrew li quercetin fil-konċentrazzjoni ta '0.1-1 μmol/L kienet kapaċi tnaqqas SOD u MDA, li kienu elevati minn H/R, u b'hekk jindika li quercetin jista' jnaqqas il- ħsara ta 'HBMECs minn stress ossidattiv (Figura 5).

Quercetin Jista 'jirregola l-proteini Keap1/Nrf2 u ATF6/GRP78

Biex tesplora aktar il-mekkaniżmu protettiv ta 'quercetin fuq HBMECs, analizzajna l-livelli ta' espressjonistress ossidattivu proteini relatati mal-istress tar-retikulu endoplasmiku. Keap1/Nrf2 huwa magħruf li jirregola r-risponsi antiossidanti in vivo. Korriment ta 'stress ossidattiv iġġiegħel liċ-ċelloli endoteljali jgħaddu minn rispons ta' stress, li jirriżulta f'livelli akbar ta 'Keapl/Nrf2 (Warpsinski et al, 2020). Fl-istudju preżenti, H/R irriżulta fl-attivazzjoni ta 'mekkaniżmi ta' rispons antiossidant ċellulari u livelli miżjuda ta 'Keapl u Nrf2, li jistgħu jissaħħu aktar minn quercetin f'0.5-1 umol/L biex tissaħħaħ il-kapaċità antiossidant ta' HBMECs .ATF6/GRP78 hija waħda mill-mogħdijiet li jirregolaw l-omeostażi tar-retikulu endoplasmiku (ER). L-istress ER jista 'jaggrava l-ħsara taċ-ċelluli endoteljali (Nie et al, 2020). Fl-istudju tagħna, l-istress ER ġie attivat minn H / R, u l-livelli ta' ATF6 u GRP78 żdiedu. Quercetin f'l umol / L kien kapaċi jnaqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta 'proteini tat-tnejn, jinibixxi l-istress ER, u jipproteġi HBMECs minn korriment H / R (Figura 6).

Quercetin Jista 'jżomm l-Integrità BBB

Il-BMECs huma s-sinsla tal-istruttura tal-BBB, u l-mewt jew l-apoptożi tagħhom wara l-ħsara H/R taffettwa l-integrità u l-funzjonalità tal-BBB (Ding et al, 2019). F'dan id-dokument, il-funzjoni taċ-ċelloli endoteljali kienet riflessa mill-iskoperta ta 'bidliet fl-espressjoni. ta' proteini assoċjati ma' BBB ZO-1 u Claudin-5. Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll, l-espressjoni ta' ZO-1 u Claudin-5 kienet

naqas fil-ħsara H/R, li jindika li l-BBB kien bil-ħsara u din il-ħsara tista 'tiġi mreġġa' lura bil-quercetin fil-konċentrazzjonijiet ta' 0.5-1 μmol/L, li jindika li quercetin jista 'jżomm il-funzjoni taċ-ċelluli endoteljali (Figura 7).

Analiżi Proteomika

Biex issib il-proteini ta 'espressjoni differenzjali (DEPs) ta' HBMECs imweġġa 'H/R fil-preżenza ta' quercetin jew le, ITRAO intuża biex twettaq l-analiżi tal-proteomika. Proteini li juru ap<0.05 and="" a="" ratio="" fold="" change="">1.2 jew<0.83 were="" defined="" as="" deps.="" in="" our="" study,="" the="" differences="" in="" protein="" among="" the="" control,="" h/r,="" and="" quercetin="" groups="" were="" compared.="" the="" results="" showed="" that="" 172="" proteins="" were="" identified="" as="" deps="" between="" the="" control="" and="" h/r="" groups,="" among="" which="" 94="" were="" upregulated="" and="" 78="" were="" downregulated="" in="" the="" h/r="" group.="" there="" were="" 1,016="" proteins="" identified="" as="" deps="" between="" the="" h/r="" group="" and="" the="" quercetin="" group,="" of="" which="" 553="" were="" up-regulated="" and="" 463="" were="" down-regulated="" in="" the="" quercetin="" group,="" as="" shown="" in="" figure="" 8a.="" between="" control="" vs="" h/r="" and="" h/r="" vs="" quercetin="" group,56="" of="" the="" same="" deps="" were="" shared="" between="" the="" two="" groups.="" the="" expressions="" of="" these="" deps="" were="" analyzed="" by="" hierarchical="" clustering="" as="" shown="" in="" figure="" 8b.="" among="" these="" deps,="" the="" top="" 20="" were="" shown="" in="" table="" among="" these="" 20="" commons,="" insulin="" receptor-related="" protein="" (insrr),="" dual-specificity="" protein="" phosphatase="" 3="" (dusp3),="" annexin="" a2(anxa2),="" hemoglobin="" subunit="" alpha="" (hba1),="" phosphoglycerate="" kinase="" 1="" (pgk1),="" vitronectin="" (vtn),="" glucose-6-phosphate="" isomerase="" (gpi)="" are="" related="" to="" endothelial="">

DISKUSSJONI

Is-CSVD, bħala piż mediku u soċjoekonomiku li qed jiżdied, ġibed l-attenzjoni malajr. Iżda b'mod sorprendenti, il-patoġenesi tas-CSVD għadha oskura fil-preżent, u lanqas ma tagħmel skema ċara għat-trattament tagħha. Minħabba li l-istadji aktar tard tas-CSVD jistgħu javvanzaw għal riżultati severi bħal puplesija u dimenzja, l-immirar tal-leżjonijiet bikrija għat-trattament jista 'jdewwem b'mod effettiv il-progressjoni ta' CSVD (Cannistraro et al, 2019). Intwera li l-bidliet patoloġiċi bikrija ta 'CSVD jinsabu f'disfunzjoni taċ-ċelluli endoteljali u mediċini li jistabbilizzaw id-disfunzjoni tiegħu jistgħu jtejbu l-vulnerabbiltà tal-materja bajda ċerebrali f'leżjonijiet CSVD (Rajani et al, 2018). Minħabba r-rwol li għandhom iċ-ċelluli endoteljali fis-CSVD, aħna ddejna li ninvestigaw l-effetti protettivi tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża fuq iċ-ċelloli endoteljali bl-użu ta 'HBMECs.

Quercetin huwa flavonoid preżenti f'varjetà ta 'pjanti (Nawrot-Hadzik et al, 2019). Għandu attivitajiet antiossidanti u anti-infjammatorji qawwija u jista 'jeżerċita effetti protettivi f'diversi kundizzjonijiet patoloġiċi. F'dan l-istudju, aħna wrejna li quercetin jista 'jtejjeb il-ħsara H/R, u bosta dejta sperimentali tikkonferma l-konklużjoni tagħna li quercetin jista' jippromwovi l-vijabbiltà taċ-ċelluli, il-migrazzjoni taċ-ċelluli, anġjoġenesi, iżid il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali u jinibixxi l-apoptożi.

Meta wieħed iqis li quercetin għandha attività antiossidant qawwija, aħna investigajna l-mekkaniżmu li bih quercetin jipproteġi l-HBMECs f'termini ta 'antiossidazzjoni. Il-livelli ta 'ROS jistgħu jiżdiedu b'mod sinifikanti minn stress ossidattiv (Wu et al.,2018), u l-akkumulazzjoni ta' ROS tista 'tikkawża ħafna mard, inkluż mard kardjovaskulari, disfunzjoni endoteljali u mard relatat mat-tixjiħ, u mard newrodeġenerattiv (Chen et al, 2015; Jakaria et al., 2018; Santos et al., 2018). Barra minn hekk, stress ossidattiv iseħħ fil-perossidazzjoni tal-lipidi, li jipproduċi MDA, li se jeqred il-bilanċ antiossidant ossidattiv tal-ġisem u jżid il-ħsara taċ-ċelluli endoteljali (Yang et al, 2021).

Keapl/Nrf2 huwa meqjus bħala l-aktar passaġġ importanti ta 'stress awto-anti-ossidattiv fil-preżent, u l-attivazzjoni ta' din il-mogħdija tista 'ttejjeb b'mod sinifikanti d-disfunzjoni taċ-ċelluli endoteljali. B'mod partikolari, ROS tgħin biex tippromwovi l-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar Nrf2 (Selimoglu-Buet et al, 2017). Aħna wrejna li quercetin jista 'jnaqqas il-ġenerazzjoni ta' ROS u MDA, filwaqt li jżid l-espressjoni tal-proteini Keapl u Nrf2, li jissuġġerixxi li quercetin jista 'attenwa l-ħsara taċ-ċelluli endoteljali billi jnaqqas ir-reazzjonijiet tal-istress ossidattiv permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija ta' sinjalazzjoni Keapl/Nrf2.

Mhux dan biss, stress sostnut ER jattiva r-rispons tal-proteini mhux mitwija u jibdel l-espressjoni ta 'ġeni antiossidanti, li jwassal għal apoptożi taċ-ċelluli endoteljali (Tang et al, 2019). Barra minn hekk, stress ossidattiv jista 'wkoll jikkawża t-tfixkil tat-tiwi tal-proteini fl-ER, jipprovoka stress ER, u jaggrava l-ħsara taċ-ċelluli endoteljali (Hetz, 2012). L-istress ER jista 'jiġi attivat b'dawn it-tliet mogħdijiet: ER kinase (PERK) bħal PKR, inositol li jeħtieġ l-enzima 1 (IRE1), u l-ATF attivanti -6, li jipproteġu ċ-ċelloli mill-istress ER taħt kundizzjonijiet omeostatiċi (Hetz et al ,2020). Iżda meta affettwati minn stimuli avversi esterni, dawn it-tliet mogħdijiet jattivaw ir-rispons għall-istress ER u jinduċu apoptożi taċ-ċelluli. Barra minn hekk, studji wrew li l-inibizzjoni tar-rispons għall-istress ER tista 'treġġa' lura l-disfunzjoni taċ-ċelluli endoteljali indotta minn H / R (Chen et al, 2020). Fl-istudju tagħna, quercetin jista 'jnaqqas il-kontenut elevat ta' ATF6 / GRP78 ikkawżat minn H / R, jinibixxi. ir-rispons stress reticulum endoplasmic, u jipproteġu ċelluli endoteljali.

Bħala komponent ewlieni tal-BBB, il-funzjonijiet taċ-ċelloli endoteljali jinkludu ż-żamma tal-integrità tagħhom. Disfunzjoni tal-BBB tikkawża tnixxija ta 'fluwidi, proteini, u komponenti oħra tal-plażma fit-tessuti perivaskulari, u tkompli tfixkel il-vażodilatazzjoni ċerebrali u t-trasport tan-nutrijenti (Wardlaw et al, 2019). Meta ċ-ċelluli endoteljali jiġu mħassra u l-integrità ta 'BBB se tinqered, sabiex iċ-ċelluli endoteljali li jipproteġu jistgħu jkomplu jżommu l-integrità ta' BBB.Claudin-5 huwa espress ħafna fil-BMECs u huwa involut fil-kostituzzjoni tas-sinsla ta 'ktajjen ta' junction stretti biex jirregolaw Permeabilità BBB (Yang et al, 2020). Iċ-ċelloli endoteljali huma ankrati maċ-ċitoskeletru ta 'l-actin billi jgħaqqdu proteini bħal ZO-1, li jagħmlu junctions stretti bejn iċ-ċelloli endoteljali li jżommu l-issikkar tal-BBB (Zhang et al, 2020). Fl-istudju tagħna, l-espressjoni ta 'claudin-5 u ZO-1 intużat biex tirrappreżenta l-integrità BBB. Ir-riżultati tagħna wrew li l-livelli ta’ proteina ta’ claudin-5 u ZO-1 naqsu f’HBMECs soġġetti għal korriment H/R, li jindika li l-integrità tal-BBB kienet imfixkla, u quercetin tista’ tnaqqas din il-ħsara billi tgħolli claudin{{ 9}} u livelli ta' proteina ZO 1.

Barra minn hekk, biex jinstabu l-miri potenzjali ta 'quercetin fuq HBMECs, i-TRAQ ġie ttikkettjat f'ċelloli. Wara analiżi proteomika, ġew investigati l-aqwa 20 tal-proteini komuni espressi b'mod differenzjali. Fosthom, INSRR, DUSP3,

ANXA2, HBA1, PGK1, VTN, GPI huma relatati maċ-ċelloli endoteljali. INSRR huwa meqjus bħala markatur endoteljali tat-tumur u l-espressjoni żejda tiegħu tista 'tippromwovi l-anġjoġenesi (Nowak-Sliwinska et al, 2019). ANXA2 rikombinanti jista 'jnaqqas il-permeabilità endoteljali taħt stati ta' ħsara tal-fattur iposiku u infjammatorju, li jindika li ANXA2 jista 'jkun involut fiż-żamma tal-issikkar taċ-ċelluli endoteljali (Li et al, 2019). Fit-tbajja ta 'sezzjonijiet ċervikali umani, instabet espressjoni qawwija ta' DUSP3 fiċ-ċelloli endoteljali, u esperimenti wrew ukoll li DUSP3 huwa meħtieġ għal tkabbir mikrovaskulari indott mill-fattur bażiku tat-tkabbir tal-fibroblast (Amand et al. 2014). L-espressjoni ta 'HBAl fiċ-ċelloli endoteljali intweriet li tikkontrolla t-ton u l-funzjoni vaskulari (Sangwung et al.,2017). PGK1 huwa wkoll maħsub li jnaqqas l-ateroġenesi (Zhang et al,2020). Barra minn hekk, VTN huwa meqjus bħala kritiku għall-formazzjoni ta 'trombu fl-issettjar ta' korriment vaskulari (Bowley et al, 2017). GPI huwa arrikkit fiċ-ċelloli endoteljali mikrovaskulari tat-tessut sinovjali minn pazjenti bl-artrite rewmatojde taħt ambjent iposiku u jirregola s-sekrezzjoni ta 'fattur ta' tkabbir endoteljali vaskulari minn fibroblasti sinovjali tal-artrite rewmatika biex jinduċi anġjoġenesi (Lu et al, 2017). Barra minn hekk, l-istudju ta 'differenzjali. proteini espressi relatati ma 'infertilità medjata minn varicocele urew li Nrf2 kien regolatur upstream ta' ANXA2 (Panner Selvam et al, 2021). L-inibizzjoni ta 'PGK1 tista' tattiva l-mogħdija Keapl/Nrf2 u tistimula rispons antiossidant protettiv taċ-ċelluli (Bollong et al, 2018). Iż-żewġ proteini jistgħu jkunu l-miri potenzjali ta 'quercetin permezz tal-mogħdija Keapl/Nrf2. Studju ulterjuri jista 'jivverifika r-rwol ta' dawn il-proteini fuq l-effett ta 'quercetin fuq H/R-HBMECs.

Ċertament, quercetin jista 'jeżerċita effetti protettivi fuq iċ-ċelloli endoteljali. Iżda l-miri speċifiċi ta' azzjoni għadhom jeħtieġu aktar investigazzjoni, u jekk hemmx mogħdijiet ta' azzjoni addizzjonali għadu mhux magħruf.

Bħala konklużjoni, dan l-istudju wera li quercetin żamm l-integrità tal-barriera tad-demm-moħħ billi jipproteġi ċ-ċelloli endoteljali. Fil-livell molekulari, quercetin jista 'jkollha rwol fil-protezzjoni taċ-ċelloli endoteljali billi tipproteġi kontra l-istress ossidattiv permezz tal-mogħdija Keapl/Nrf2 u jinibixxi l-istress tar-retikulu endoplasmiku permezz tal-mogħdija ATF6/GRP78. Dan l-istudju jistabbilixxi l-pedament għat-TCM biex jikkura CSVD billi jipproteġi ċ-ċelloli endoteljali.