AstrattGħalkemm ix-xjuħija hija l-akbar fattur ta’ riskju għal mard kroniku uman (kanċer, dijabetiku, kardjovaskulari u newrodeġenerattiv), ftit interventi huma magħrufa minbarra r-restrizzjoni kalorika u numru żgħir ta’ mediċini (b’effetti sekondarji sostanzjali) li jindirizzaw direttament ix-xjuħija. Għalhekk, hemm ħtieġa urġenti għal għażliet ġodda li ġeneralment jistgħu jdewmu l-proċessi tat-tixjiħ u jipprevjenu mard relatat mal-età. It-tixjiħ ċellulari huwa l-bażi tal-proċessi tat-tixjiħ. Il-ħajja kronoloġika (CLS) tal-ħmira Saccharomyces cerevisiae hija s-sistema mudell stabbilita sew għall-investigazzjoni tal-interventi tat-tixjiħ ċellulari post-mitotiku tal-bniedem. CLS huwa definit bħala n-numru ta' ġranet li ċ-ċelloli jibqgħu vijabbli f'fażi stazzjonarja. Aħna żviluppajna metodu kwantitattiv ġdid, irħis u veloċi għall-kejl tas-CLS f'kulturi taċ-ċelluli inkubati flimkien ma' diversi aġenti kimiċi u kontrolli fuq 96-pjanċi tal-bir. Il-protokoll PICLS tagħna b'(1) l-użu ta 'jodur tal-propidju għal qari ta' sopravivenza taċ-ċelluli bbażat fuq fluworexxenti f'qarrej tal-mikroplate u (2) kejl tal-għadd totali taċ-ċelluli permezz ta 'assorbiment OD600nm mill-istess pjanċa jipprovdi kapaċità reali ta' produzzjoni għolja. Skont il-loġistika, numri kbar ta 'pjanċi jistgħu jiġu pproċessati b'mod parallel sabiex l-iskrinjar ta' eluf ta 'komposti jsir fattibbli fi żmien qasir. Il-metodu ġie vvalidat billi tkejjel l-effett tar-rapamicin u r-restrizzjoni tal-kaloriji fuq il-ħmira CLS. Aħna utilizzajna dan l-approċċ għall-iskrinjar tal-aġenti kimiċi. Aħna skoprejna l-potenzjal kontra t-tixjiħ/newroprotettiv ta' 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) u nissuġġerixxu l-użu tiegħu individwalment jew flimkien ma' interventi oħra kontra t-tixjiħ.

Glycoside ta 'cistanche jista' wkoll iżid l-attività ta 'SOD fit-tessuti tal-qalb u tal-fwied, u jnaqqas b'mod sinifikanti l-kontenut ta' lipofuscin u MDA f'kull tessut, li jneħħi b'mod effettiv diversi radikali reattivi ta 'ossiġnu (OH-, H₂O₂, eċċ.) u jipproteġi kontra ħsara fid-DNA kkawżata. minn OH-radikali. Cistanche phenylethanoid glycosides għandhom kapaċità qawwija ta 'scavenging ta' radikali ħielsa, kapaċità ta 'tnaqqis ogħla minn vitamina C, itejbu l-attività ta' SOD fis-sospensjoni ta 'l-isperma, inaqqsu l-kontenut ta' MDA, u għandhom ċertu effett protettiv fuq il-funzjoni tal-membrana ta 'l-isperma. Cistanche polysaccharides jistgħu jtejbu l-attività ta 'SOD u GSH-Px fl-eritroċiti u tessuti tal-pulmun ta' ġrieden senescent sperimentali kkawżati minn D-galactose, kif ukoll inaqqsu l-kontenut ta 'MDA u kollaġen fil-pulmun u fil-plażma, u jżidu l-kontenut ta' elastin, għandhom effett tajjeb għat-tħaffir fuq DPPH, itawwal iż-żmien ta 'ipoksja fil-ġrieden senescent, itejjeb l-attività ta' SOD fis-serum, u jdewwem id-deġenerazzjoni fiżjoloġika tal-pulmun fi ġrieden senescent b'mod sperimentali B'deġenerazzjoni morfoloġika ċellulari, esperimenti wrew li Cistanche għandu l-abbiltà antiossidant tajba u għandu l-potenzjal li jkun mediċina biex jipprevjeni u jikkura mard tal-ġilda li qed tixjieħ. Fl-istess ħin, echinacoside f'Cistanche għandu kapaċità sinifikanti li jneħħi r-radikali ħielsa DPPH u għandu l-abbiltà li jneħħi speċijiet ta 'ossiġnu reattiv u jipprevjeni d-degradazzjoni tal-kollaġen indotta minn radikali ħielsa, u għandu wkoll effett tajjeb ta' tiswija fuq il-ħsara ta 'anjoni radikali ħielsa tat-timina.

Ikklikkja biex Ara l-Prodotti Kontra x-Xjuħija

【Għal aktar informazzjoni: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】

Kliem ewlieniSaccharomyces cerevisiae · It-tul tal-ħajja kronoloġiku · Skrinjar kimiku · Kompost kontra t-tixjiħ · 2,5-anhydro-D-mannitol

Introduzzjoni

The growing fraction of the elderly (>65 sena) fost il-popolazzjoni totali (minn ~ 10 fil-mija madwar id-dinja (aktar minn 20 fil-mija fil-pajjiżi tal-ewwel dinja) fl-2020 għal estrapolati 16 fil-mija fl-2050), kif ukoll iż-żieda fl-istennija tal-ħajja tagħhom (b'~ 10 snin mill-1960 fil-pajjiżi tal-ewwel dinja). ), tiffaċċja lid-dinja bi problemi dejjem aktar diffiċli [1, 2]. Minbarra li ġeneralment tnaqqas l-attività tal-ħajja, it-tixjiħ jibqa’ l-akbar fattur ta’ riskju għall-iżvilupp ta’ mard kroniku li, sussegwentement, jikkomprometti l-ħajja tal-bniedem indipendenti u finalment iwassal għall-mewt [3–7]. L-approċċi mediċi attwali biex jipprevjenu patoloġiji relatati mal-età huma rakkomandazzjonijiet għal stil ta 'ħajja b'saħħtu, inkluż eżerċizzju u dieta. Madankollu, dawn l-interventi waħedhom mhumiex biżżejjed biex jipprevjenu l-bidu ta’ mard relatat mal-età.

It-tixjiħ huwa kkaratterizzat minn telf progressiv ta 'integrità fiżjoloġika, effiċjenza fil-funzjonijiet ċellulari, u sinjalazzjoni metabolika [8]. Sforzi li qed jiżdiedu huma diretti biex jifhmu proċessi ta 'tixjiħ ċellulari li jaffettwaw in-netwerk ta' interazzjonijiet tal-ġeni u l-proteini interkonnessi ħafna u funzjonalment żejda [8, 9]. Minkejja l-kumplessità tat-tixjiħ, riċerka reċenti f'sistemi ta 'mudelli differenti, inklużi l-mammiferi, wriet li t-tixjiħ ittardjat u żieda fil-medda tas-saħħa huma fattibbli permezz ta' interventi kontra t-tixjiħ bħall-applikazzjoni tal-amministrazzjoni tad-droga rapamycin u r-restrizzjoni tal-kaloriji (glukożju) [10-15]. Għalhekk, l-espansjoni tar-repertorju ta 'komposti kontra t-tixjiħ li jistgħu jiġu utilizzati bħala terapewtiċi geroprotecting u t-tnaqqis tal-effetti sekondarji mhux mixtieqa tagħhom hija waħda mill-istrateġiji promettenti li jistgħu jdewmu t-tixjiħ u jtawlu l-medda tas-saħħa.

Riċerka reċenti wriet li l-mekkaniżmi molekulari osservati fit-tixjiħ tal-bniedem huma kkonservati f'organiżmi differenti, inkluża l-ħmira b'ċellula waħda [8, 10, 16, 17]. Il-ħmira li tibgħat Saccharomyces cerevisiae hija waħda mill-organiżmi mudell l-aktar studjati biex jinkixfu l-proċessi bijoloġiċi involuti fit-tixjiħ ċellulari. Il-benefiċċji tal-istudju tat-tixjiħ fil-ħmira jinkludu żmien qasir ta 'ġenerazzjoni, ħajja trattabbli, u l-amenabilità tagħha għal analiżi ta' prestazzjoni għolja. Għalhekk, dan l-organiżmu sar għodda qawwija għall-identifikazzjoni ta 'interventi kontra t-tixjiħ. Il-ħmira hija komunement użata biex tistudja t-tixjiħ b'żewġ modi distinti: ħajja replikativa (RLS) u ħajja kronoloġika (CLS) [18]. L-RLS ikejjel in-numru ta' drabi li ċellula individwali taqsam, mudell ta' tixjiħ għal ċelloli mitotiċi bħal ċelloli staminali. Is-CLS ikejjel it-tul ta 'żmien li ċellula li ma tiddividix tibqa' vijabbli fil-fażi stazzjonarja, mudell ta 'tixjiħ għal ċelluli post-mitotiċi bħal newroni. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli tal-ħmira li qed tixjieħ taħt kundizzjonijiet ta 'fażi stazzjonarja mċaħħda minn nutrijenti tonqos, u eventwalment imutu.

CLS kien tradizzjonalment imkejjel bl-istima tal-għadd tal-unità li jiffurmaw il-kolonji (CFUs) fuq il-pjanċa tal-agar [18]. Ċelloli tal-ħmira fi flixkun b'medja totali (Aktar minn jew ugwali għal 20 ml) huma esposti għal kompost kimiku wieħed. F'punti ta 'żmien differenti (eż., wara 2, 5, u 8 ijiem), alikwoti żgħar tal-kultura ta' tixjiħ kronoloġiku mill-fask huma dilwiti serjali, miksija fuq pjanċi agar nutrijenti, u inkubati għal 2-3 ijiem għall-formazzjoni tal-kolonji u l-għadd. Il-frazzjoni tas-sopravivenza tiddetermina mill-CFU għal kull punt ta 'età kronoloġiku relattiv għall-jum 1 (meqjusa 100 fil-mija sopravivenza taċ-ċelluli). L-approċċ CFU huwa kwantitattiv iżda assoċjat ma 'ħafna aspetti negattivi. Jeħtieġ dilwizzjonijiet serjali multipli, passi tal-kisi, u perjodi ta 'inkubazzjoni biex jidhru l-kolonji. L-għadd tal-kolonji jsir jew bi strumenti manwali jew għaljin. Barra minn hekk, dan il-metodu mhuwiex adattat u jiswa wisq għal skrining ta’ produzzjoni għolja (HTS) ta’ eluf ta’ komposti minħabba li jeħtieġ ammonti sostanzjali tad-drogi ttestjati, kulturi ta’ flixkun ta’ volum kbir u ħafna pjanċi tal-agar. Sfortunatament, il-metodu CFU u l-varjanti reċenti kollha għall-kejl tas-CLS huma dipendenti b'mod kritiku fuq il-kapaċità taċ-ċelloli post-mitotiċi li jerġgħu jidħlu fil-fażi mitotika. Fil-prinċipju, din il-metodoloġija ma tistax tiddistingwi ħmira f'arrest mitotiku minn ċelluli mejta.

L-avvanzi tekniċi attwali fil-metodi derivati ​​minn CFU jkejlu s-sopravivenza u t-tkabbir taċ-ċelluli bbażati fuq it-tkabbir tal-ħmira tal-fażi stazzjonarja esposta għad-droga f'kultura b'ħafna nutrijenti jew f'medja likwidu jew permezz ta 'spotting assay fuq pjanċa tal-agar [17, 19-21] . Wara 24 siegħa, it-tkabbir ta 'ċelluli ta' età f'medju likwidu huwa mkejjel bl-assorbiment f'OD600nm, filwaqt li fl-assaġġ ta 'spotting, it-tkabbir ta' kultura ta 'età spotted fuq medium agar huwa identifikat viżwalment wara 48 siegħa. It-titjib loġistiku jinkludi l-użu ta' 96-pjanċi tal-bjar li jippermettu skrinjar limitat tar-razza kimiċi jew tat-tħassir tal-ġenomu kollu. Għal razez tat-tħassir tal-ħmira mmarkati flimkien, hija meħtieġa ċitometrija tal-fluss biex tikkwantifika l-vijabbiltà tar-razza individwali [22].

Il-jodur tal-propidju (PI) huwa żebgħa fluworexxenti li jidħol biss fiċ-ċelloli mejta u, għalhekk, huwa markatur qawwi għall-kwantifikazzjoni diretta tal-vijabbiltà taċ-ċelluli [23-25]. Preċedentement, studji użaw approċċ ibbażat fuq PI għall-kejl tas-CLS u l-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli billi janalizzaw l-immaġini miksuba minn counter taċ-ċelluli fluworexxenti, transilluminatur UV, jew ċitometrija tal-fluss [26, 27]. Madankollu, l-ipproċessar ta 'kampjuni multipli, l-immaġini, u r-rekwiżiti tas-softwer għall-analiżi tad-dejta huma għaljin u jieħdu ħafna ħin, li xekklu dawn il-metodi f'applikazzjonijiet reali b'rendiment għoli. L-introduzzjoni ta' żebgħat alternattivi bħal SYTOX aħdar hija ta' valur limitat f'ambjent ta' produzzjoni għolja minħabba l-ispejjeż projbittivi [26].

Għalhekk, huma meħtieġa metodi ġodda biex jikkwantifikaw il-vijabbiltà taċ-ċellula anzjana biex jiġu evitati l-limitazzjonijiet assoċjati mal-metodoloġiji eżistenti. F'dan ix-xogħol, niddeskrivu PICLS, metodu ta 'kejl CLS ibbażat fuq PI li huwa indipendenti mit-tkabbir. L-approċċ il-ġdid tagħna jiddependi fuq l-inkubazzjoni taċ-ċelloli tal-ħmira b'diversi komposti tat-test jew kundizzjonijiet differenti tal-midja tat-test fi 96-pjanċi tal-bir. Aħna nużaw PI biex nikkwantifikaw is-sopravivenza taċ-ċelluli. Qari veloċi u effiċjenti (fi żmien ~ 15-il minuta) huwa pprovdut minn qarrej tal-mikroplate, apparat bi prezz baxx faċilment disponibbli fil-biċċa l-kbira tal-laboratorji. Din il-metodoloġija rħisa hija adattata tajjeb għal screening fuq skala kbira tal-aġenti kimiċi biex jiġu identifikati komposti kontra t-tixjiħ peress li ħafna komposti, kontrolli jew dilwizzjonijiet differenti jistgħu jitqiegħdu b'mod konvenjenti fuq pjanċa waħda u numri kbar ta 'pjanċi jistgħu jiġu pproċessati b'mod parallel. Barra minn hekk, aħna vvalidajna l-metodu tagħna billi ddeterminajna l-estensjoni ta 'CLS tal-ħmira bl-użu ta' interventi magħrufa kontra t-tixjiħ bħall-amministrazzjoni ta 'rapamicin u r-restrizzjoni tal-kaloriji. Skrin ta' malajr ta' kimiċi disponibbli fil-laboratorju tagħna żvelat bla mistenni 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) li jestendu l-ħajja tal-ħmira. Aħna kkonfermajna wkoll l-attività kontra t-tixjiħ tas-2,5-AM b'metodi tradizzjonali ta' tkabbir. Analogi oħra taz-zokkor ittestjati ma taw l-ebda effett simili.

Riżultati

Żvilupp ta' metodu għall-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli bl-użu tal-kejl tal-fluworexxenza tal-jodur tal-propidju fil-qarrej tal-mikroplate

Il-protokoll il-ġdid tagħna jibda bl-esponiment taċ-ċelluli tal-ħmira tat-tip selvaġġ jew il-mutanti tagħhom imqiegħda f'midja b'ħafna nutrijenti fi 96-pjanċi tal-bir flimkien ma 'konċentrazzjoni speċifika ta' komposti kimiċi ta 'interess. Aħna nużaw PI bħala markatur għall-mewt taċ-ċelluli peress li din iż-żebgħa fluworexxenti tidħol biss fiċ-ċelloli li ma jibqgħux ħajjin [23-25]. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-kultura tal-fażi stazzjonarja hija kkwantifikata wara numru speċifikat ta 'jiem billi taqra l-fluworexxenza PI fil-qarrej tal-mikroplate li, min-naħa tagħha, tipprovdi spreadsheet li tinqara elettronikament għall-analiżi tad-dejta.

Bħala l-ewwel validazzjoni, nuru li l-ħidma b'ammonti żgħar fil-bjar tal-mikroplate tagħti riżultati simili għal approċċi bbażati fuq il-kuvette u li l-qarrej tal-mikroplate huwa sensittiv biżżejjed biex jaqbad id-dejta tas-sopravivenza taċ-ċelluli. Għalhekk, analizzajna t-tbajja 'PI taċ-ċelloli tal-ħmira. Ċelloli tal-ħmira tkabbru fil-garafina tal-ħġieġ u mgħollija għal 15-il minuta f'100 grad. Ċelloli ħajjin u mejta ġew maħsula u inkubati f'1 × PBS (salina buffered bil-fosfat) mingħajr u b'PI (5 µg/ml) għal 15-il minuta. Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew maħsula u sospiżi mill-ġdid f'PBS. Iċ-ċelloli ġew viżwalizzati permezz ta 'mikroskopija u l-intensità tal-fluworexxenza ġiet imkejla mill-qarrej tal-mikroplate (Fig. S1 Supplimentari). Wara konferma li PI huwa markatur adattat għall-mewt taċ-ċelluli, saret analiżi sussegwenti għall-iżvilupp tal-metodu. Ċelloli mejta mtebbgħin PI ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS sat-48 OD600nm finali mkejla fil-cuvette bl-użu ta 'spettrofotometru. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew dilwiti serjali f'PBS (OD600nm 48 sa 0.05) u ttrasferiti għal pjanċa sewda 96- (costar 3603). Biex wieħed jinnota, mikropjanċi suwed huma erba 'darbiet aktar għaljin minn pjanċi ċari u anqas faċilment disponibbli, iżda użajnahom peress li huma aktar adattati għall-qari tal-fluworexxenza minħabba l-awtofluworexxenza li jnaddfu li joriġinaw mill-kampjuni u l-uċuħ tal-mikroplate. B'sistema ta 'immaġini GelDoc (Fig. 1A), aħna viżwalizzaw il-grad ta' inkorporazzjoni ta 'tbajja' PI fiċ-ċelloli mejta tal-ħmira f'diversi dilwizzjonijiet. Bl-użu tal-istess pjanċa, kejlna l-intensità tal-fluworexxenza PI b'qarrej tal-mikroplate f'eċitazzjoni 535 nm u emissjoni 617 nm wavelengths. Sibna korrelazzjoni lineari għolja bejn l-intensità tal-fluworexxenza PI u l-assorbiment ċellulari f'OD600nm (Fig. 1B). Dan ir-riżultat jindika li l-varjant tagħna tal-metodu bbażat fuq il-fluworexxenza PI huwa effettiv għall-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli.

As a next step, we determined the optimal range of cell density (quantified by OD600nm) so that cell density could be directly measured in 96-well   plates instead of in cuvettes. Using the black microplates with dead yeast cells from the previous experiment, we determined the correlation of  OD600nm measurements taken from the cuvettes and from the microplate directly. We found a high linear correlation between the two series of measurements in the OD600nm range of 0.05 to 12 of the cuvette (Fig.  1C). However, the trend is no longer maintained for higher OD600nm values>12 tal-kuvette (Fig. 1D). Sussegwentement, iddeterminajna r-relazzjoni bejn l-intensità tal-fluworexxenza PI u ċ-ċellula OD600nm tal-96-pjanċa tal-bir fl-aħjar medda OD600nm 0.05-12. Aħna nosservaw korrelazzjoni lineari kważi perfetta (Fig. 1E). Għalhekk, il-protokoll tagħna jirrappreżenta metodu robust għall-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli.

Effett tat-tipi ta' mikropjanċi fuq il-kwantifikazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli bl-użu tal-kejl tal-fluworexxenza tal-jodur tal-propidju fil-qarrej tal-mikroplate

Effett tar-rapamicin fuq il-ħajja kronoloġika tal-ħmira

Rapamycin huwa wieħed mill-interventi anti-aging magħrufa sew murija li jestendu l-ħajja ta 'diversi organiżmi mudell, inklużi ħmira, nematodi, dubbien tal-frott, u ġrieden [10, 14, 15, 28-30]. Jinibixxi l-kumpless TORC1 li jħoss in-nutrijenti (mira tal-kumpless rapamycin 1). TORC1 huwa kumpless ta' proteini b'ħafna subunità kkonservat f'ċelloli ewkarjotiċi li jgħaqqad in-nutrijenti fl-ambjent mat-tkabbir u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli [19, 29, 31-34].

Aħna eżaminajna l-effett tar-rapamicin fuq il-ħajja kronoloġika (CLS) tar-razza tal-ħmira biex nivvalidaw il-protokoll żviluppat ġdid tagħna. Hawn u hawn taħt, użajna r-razza tal-ħmira prototrophic (CEN.PK113- 7D) fl-esperimenti tagħna biex nevitaw l-effetti qawwija tal-auxotrophy tal-aċidu amminiku fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli f'kultura ta 'fażi stazzjonarja [35, 36]. Iċ-ċelluli kienu qed jixjieħu b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'rapamicin fil-medju definit sintetiku (SD). It-tkabbir taċ-ċelluli kien imkejjel f'punti ta 'żmien differenti (24 siegħa, 48 siegħa, u 72 siegħa). Sibna li t-tkabbir taċ-ċelluli laħaq is-saturazzjoni madwar 24 siegħa wara l-inkubazzjoni b'5 nM jew inqas rapamycin (Fig. 4A). Madankollu, l-amministrazzjoni ta '10 nM rapamycin naqqset it-tkabbir taċ-ċelluli, u s-saturazzjoni intlaħqet biss wara 48 siegħa (Fig. 4A). Preċedentement, kienet osservata xejra simili għal ċelloli li qed jikbru bir-rapamicin f'esperiment CLS [37].

Bħala pass li jmiss, ġie mkejjel is-CLS taċ-ċelloli mkabbra f'konċentrazzjonijiet differenti ta' rapamicin. Aħna ddeterminajna s-sopravivenza taċ-ċelluli bl-użu ta 'fluworexxenza PI f'punti ta' żmien ta 'età kronoloġika differenti. Il-punt tal-ħin tat-tkabbir 72 h kien ikkunsidrat bħala jum 1. Nistgħu niddeduċu mill-graff tas-sopravivenza li konċentrazzjonijiet differenti ta 'żieda ta' rapamicin jestendu l-CLS tal-ħmira (Fig. 4B). Is-sopravivenza ta 'ċelluli ta' età supplimentati b'rapamicin (5 nM u 10 nM) f'jum 4 kienet ~ 75 fil-mija; madankollu, mingħajr rapamycin kien ~ 50 fil-mija . Fis-7 jum, is-sopravivenza ta 'ċelluli ta' età supplimentati bir-rapamicin kienet ta '70 fil-mija; madankollu, mingħajr rapamycin tnaqqset għal inqas minn 20 fil-mija . L-estensjoni tas-CLS ta 'ċelluli ta' età tista 'tiġi osservata wkoll f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi (0.62-2.5 nM) ta' rapamycin (Fig. 4B).

Aħna vvalidajna l-protokoll tagħna billi qabbluh direttament ma 'żewġ approċċi tradizzjonali ta' tkabbir li jkejlu s-CLS tal-ħmira. L-ewwelnett, wettaqna l-assaġġ ta 'l-outgrowth fil-mezz likwidu biex tkejjel l-effett ta' rapamicin fuq il-ħajja. Is-sopravivenza taċ-ċelluli li qed tixjieħ kronoloġiku ġiet immonitorjata f'punti ta' età differenti billi ttrasferixxi kultura 3-µl f'200μL ta' medium YPD fi pjanċa friska ta' 96-bir. It-tkabbir jikkorrispondi għan-numru ta 'ċelluli vijabbli fl-inoculum (Fig. 4C). It-tkabbir taċ-ċelluli tal-età reġistrat permezz tal-assorbiment ta 'OD600nm ġie determinat bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate. Il-frazzjoni tas-sopravivenza ġiet ikkalkolata mill-assorbiment OD600nm tal-outgrowth għal kull punt ta 'età relattiv għall-jum 1 (kkunsidrat 100 fil-mija sopravivenza taċ-ċelluli). Il-grafika tas-sopravivenza tidher fil-Fig. 4D.

Bl-istess mod, wettaqna l-outgrowth billi spotting assay fuq il-medium agar. Insibna 3-µl kultura li qed tixjieħ fuq il-pjanċa tal-agar YPD u inkubaha għal 48 siegħa. L-outgrowth ta 'ċelluli età fuq il-pjanċa agar YPD kien viżwalizzat mis-sistema ta' immaġini GelDoc (Fig. 4E). Kif mistenni, nistgħu nosservaw xejriet ta 'estensjoni tal-ħajja permezz ta' rapamycin kemm taħt analiżi tal-likwidu YPD kif ukoll tal-outgrowth tal-agar li huma paralleli lil dawk iddeterminati mal-protokoll il-ġdid tagħna.

Dawn ir-riżultati juru li l-protokoll HTS tagħna jirriproduċi li rapamycin jestendi l-ħajja ċellulari. Barra minn hekk, aħna nivvalutaw il-fattur Z biex nevalwaw il-kwalità ta 'dan il-metodu [38]. Ġeneralment, il-fatturi Z fil-medda ta' 0.5–1.0 huma indikattivi ta' analiżi HTS eċċellenti. Il-fattur Z ġie ddeterminat għal konċentrazzjonijiet differenti ta 'rapamicin bi fluworexxenza PI ta' ċelloli ta 'età (Fig. S2 Supplimentari). Il-finanzjament tagħna, fattur Z {{10}}.70 għal 5 nM rapamycin u 0.74 għal 10 nM rapamycin ipoġġi dan il-metodu HTS fil-kategorija ta 'kwalità għolja. Għalhekk, il-protokoll tagħna huwa robust biżżejjed biex jidentifika komposti potenzjali kontra t-tixjiħ.

Biex nesploraw jekk il-metodu huwiex effettiv fi sfond ġenetiku tal-ħmira differenti, ittestjajna l-effett tar-rapamicin fuq is-CLS tar-razza BY4743. Ir-razza Saccharomyces cerevisiae BY4743 hija auxotrophic għal histidine, leucine, u uracil. Ir-razza BY4743 tkabbar f'konċentrazzjonijiet differenti ta 'rapamicin fil-mezz SD supplimentat b'kostitwenti auxotrophic. Is-sopravivenza ta 'ċelluli ta' età kienet kwantifikata bl-użu ta 'fluworexxenza PI (Figura Supplimentari S3). Sibna li rapamycin żied il-vijabbiltà taċ-ċelluli BY4743 kwantitattivament b'modi simili bħal dik ta 'CEN.PK113-7D. Għalhekk, dawn ir-riżultati juru li l-metodu tagħna huwa effettiv f'razez differenti ta 'ħmira.

Effett tal-Glukożju fuq il-ħajja kronoloġika tal-Ħmira

Aħna vvalidajna wkoll il-metodu tagħna billi eżaminajna l-effett tar-restrizzjoni tal-kaloriji fuq il-ħajja kronoloġika tal-ħmira. Ir-restrizzjoni tal-kaloriji hija waħda mill-interventi stabbiliti biex tittardja t-tixjiħ u tittawwal it-tul tal-ħajja madwar l-organiżmu mudell, inklużi l-ħmira u ċ-ċelloli tal-mammiferi [11, 13, 16]. Biex tiddetermina l-effett tar-restrizzjoni tal-kaloriji fuq is-CLS tal-ħmira, aħna nnaqqsu l-kontenut tal-glukożju fil-medju tal-kultura. Aħna kiber iċ-ċellula fi tliet kundizzjonijiet medji SD differenti li fihom 0.25 fil-mija, 0.5 fil-mija, u 2 fil-mija glukożju. Aħna kejlu t-tkabbir taċ-ċelluli f'punti ta 'żmien differenti (24 h, 48 h, u 72 h). Il-kulturi kollha laħqu saturazzjoni tat-tkabbir wara 24 siegħa (Fig. 5A). It-tkabbir taċ-ċelluli kien aktar baxx għal 0.25 fil-mija u 0.5 fil-mija meta mqabbel ma '2 fil-mija glukożju (Fig. 5A). Aħna mkejla s-sopravivenza ta 'tixjiħ kronoloġiku għal ċelloli mkabbra taħt konċentrazzjonijiet ta' glukożju differenti bl-użu tal-metodu ta 'fluworexxenza PI (Fig. 5B). Aħna niddeduċu mill-graff tas-sopravivenza li r-restrizzjoni tal-glukożju testendi s-CLS tal-ħmira. Aħna wkoll ikkonfermajna fl-istess ħin l-estensjoni tas-CLS permezz ta 'assaġġi ta' tkabbir (Fig. 5C, D, u E), nivvalidaw aktar il-metodu l-ġdid tagħna biex niddeterminaw is-CLS tal-ħmira. L-effett tar-restrizzjoni tal-glukożju fuq l-estensjoni CLS tar-razza BY4743 intwera wkoll bil-metodu PICLS (Fig. S3 Supplimentari). Għalhekk, l-approċċ tagħna għall-kejl tas-CLS tal-ħmira jirrappreżenta metodu ġdid, veloċi u bi prezz baxx għall-iskrinjar tal-aġenti kimiċi u l-kundizzjonijiet tal-kultura biex jiġu identifikati l-interventi kontra t-tixjiħ.

L-iskrinjar tal-aġenti kimiċi bl-użu tal-metodu żviluppat ġdid identifikat 2,5-anhydrous-D-mannitol bħala kompost ġdid kontra t-tixjiħ

Wara li żviluppajna u vvalidajna l-protokoll il-ġdid, użajna dan il-metodu biex niskrinjaw mijiet ta 'aġenti kimiċi għall-identifikazzjoni ta' komposti kontra t-tixjiħ (Fig. S4 Supplimentari u Tabella Supplimentari 1). Bħala wieħed mir-riżultati sorprendenti, sibna indikazzjonijiet għall-kompost 2,5-anhydro-D-mannitol (2,5-AM) biex jestendi s-CLS tal-ħmira. Fil-Fig. 6, aħna nippreżentaw ir-riżultat ta 'esperimenti ta' segwitu dettaljati għal dan il-kompost. Aħna ttestjajna l-attività ta' kontra t-tixjiħ ta' 2,5-AM f'konċentrazzjonijiet differenti fuq il-96-pjanċa tal-bir. L-ewwelnett, iddeterminajna l-effett tas-2,5-AM fuq it-tkabbir taċ-ċelluli. Iċ-ċelloli tal-ħmira ġew inkubati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' 2,5-AM fil-medja SD. It-tkabbir taċ-ċelluli kien imkejjel f'punti ta 'żmien differenti (24 siegħa, 48 siegħa, u 72 siegħa). Sibna li t-tkabbir taċ-ċelluli laħaq l-istess livell ta 'saturazzjoni wara 24 siegħa għall-konċentrazzjonijiet ittestjati kollha ta' 2,5-AM (Fig. 6A). Imbagħad, kejlna s-sopravivenza ta' ċelloli kronoloġikament età supplimentati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' 2,5-AM bl-użu tal-metodu ta' fluworexxenza PI. Bħal qabel, il-kultura tat-tkabbir ta '72 siegħa kienet ikkunsidrata jum 1 għall-analiżi CLS. Il-grafika tas-sopravivenza hija mpinġa għal punti ta 'żmien ta' età kronoloġika differenti (Fig. 6B). Insibu li 2,5-AM jestendi s-CLS b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Is-sopravivenza ta 'ċelluli ta' età supplimentata b'2,5-AM (8 mM) f'jum 4 kienet ~ 80 fil-mija; madankollu, mingħajr 2,5- AM kien ~ 50 fil-mija . Fis-7 jum, is-sopravivenza ta '2,5-AM supplimentati ċelluli età kienet ~ 75 fil-mija; madankollu, mingħajr 2,5-AM tnaqqset għal inqas minn 20 fil-mija . L-attività ta' kontra t-tixjiħ ta' 2,5-AM ġiet ivverifikata wkoll permezz ta' analiżi ta' tkabbir (Fig. 6C, D, u E).

2,5-AM hija molekula taz-zokkor li tista' tidħol fil-mogħdija tal-glikolisi. Jiġi idrolizzat biss fi stadji glikolitiċi upstream li jikkawżaw akkumulazzjoni ta' 2,5-AM-1,6-bisfosfat (2,5-AMBP) mhux metabolizzat fiċ-ċelloli [39–41 ]. Biex nittestjaw jekk 2,5-AM f'konċentrazzjonijiet simili għall-esperiment CLS ġiex ipproċessat minn enzimi tal-glikolisi, eżaminajna s-sensittività dejjem tikber tar-razza tat-tħassir tal-ġene SNF1. SNF1 huwa sensor tal-enerġija ċellulari u proteina kinase attivata bl-AMP (AMPK) konservata ħafna fl-ewkarjoti [42, 43]. Ċelloli tal-ħmira li m'għandhomx attività AMPK huma assoċjati ma 'fenotip ta' tkabbir ipersensittiv fil-preżenza ta 'intermedji glikolitiċi mhux metabolizzati [44]. Aħna kejlu t-tkabbir tar-razza tat-tħassir snf1Δ b'konċentrazzjonijiet differenti ta' 2,5-AM. Sibna li 2,5-AM jinibixxi t-tkabbir tar-razza tat-tħassir snf1Δ meta mqabbel mar-razza tat-tip selvaġġ (Fig. S5 Supplimentari). Dan il-fenotip tat-tkabbir osservat jindika li 2,5-AM jgħaddi minn glikolisi u jiġi idrolizzat f'intermedji glikolitiċi mhux metabolizzati.

2,5-AM huwa analog tal-fruttożju tal-parti taz-zokkor [39]. Biex niċċaraw jekk zokkor ieħor jinfluwenzax ukoll is-CLS, eżaminajna l-effett tal-fruttożju, mannitol u maltożju fuq it-tixjiħ tal-ħmira. Inkludejna wkoll is-sorbitol li huwa zokkor mhux metabolizzat irrappurtat li jżid is-CLS taċ-ċelloli tal-ħmira billi jżid l-osmolarità tal-mezz tal-kultura [20, 45]. L-ewwelnett, ittestjajna l-effett tal-fruttożju, mannitol, maltożju u sorbitol fuq it-tkabbir taċ-ċelluli. Iċ-ċelloli tal-ħmira ġew inkubati b'diversi konċentrazzjonijiet ta' fruttożju, mannitol, maltożju, u sorbitol simili għal 2,5-AM fil-medja SD. Bħal 2, 5-AM, fruttożju, mannitol, maltożju, u ċelluli inkubati sorbitol laħqu saturazzjoni tat-tkabbir wara 24 siegħa (Fig. 7A). Sussegwentement, kejlna s-sopravivenza ta' ċelloli kronoloġikament età fl-1 jum, jum 7, jum 14, u jum 21. B'differenza 2,5-AM, fruttożju, mannitol, maltożju, u supplimentazzjoni sorbitol ma estendietx il-ħajja tal- ħmira (Fig. 7B, C, D, E, u Fig. Supplimentari S6). B'mod notevoli, 2,5-AM testendi l-ħajja anke fl-istadju tard tat-tixjiħ kronoloġiku. Ċelloli età supplimentati b'2,5-AM (8 mM) jgħixu (~65 fil-mija) fil-jum 21. Madankollu, is-sopravivenza ta 'ċelluli età mingħajr supplimenti ta' 2,5-AM kienet inqas minn 10 fil-mija.

Ħafna għas-sorpriża tagħna, sibna li sorbitol f'konċentrazzjonijiet baxxi ttestjati ma jistax iżid is-CLS (Fig. 7B, C, D, E, u Supplimentari Fig. S6). Aħna ipoteżijna li konċentrazzjonijiet ogħla ta 'sorbitol jistgħu jkunu meħtieġa biex iżidu s-CLS. Aħna ttestjajna firxa ta 'konċentrazzjonijiet ogħla inkluż 1 M sorbitol, il-konċentrazzjoni li qabel kienet irrappurtata li taffettwa s-CLS (18 fil-mija ekwivalenti għal 1 M) [20, 45]. B'mod konsistenti ma 'rapporti preċedenti, insibu wkoll li konċentrazzjonijiet ta' sorbitol għoljin ħafna (bejn 0.5 u 1 M) iżidu l-CLS tal-ħmira (Figura Supplimentari S7), apparentement billi tiżdied l-osmolarità tal-medju. Interessanti, iż-żieda tas-CLS b'2,5-AM f'konċentrazzjoni baxxa ħafna (2 mM) tissuġġerixxi li l-mekkaniżmu tagħha ta 'attività kontra t-tixjiħ huwa distint minn dak osmotiku. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-attività kontra t-tixjiħ ta' 2,5-AM hija speċifika għal dan il-kompost taz-zokkor u mhux osservata għal bosta kimiċi oħra strutturati bl-istess mod.

【Għal aktar informazzjoni: david.deng@wecistanche.com / WhatApp:86 13632399501】