Parti I.: Organoids tal-kliewi ġġenerati minn ċelluli proġenituri eritrodi ta' pazjenti b'mard tal-kliewi poliċistiċi dominanti awtosomali

għal aktar information:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice, &et al.

Introduzzjoni

Poliċistiku dominanti awtosomalimard tal-kliewi(ADPKD) hija l-aktar kawża ġenetika frekwenti ta' mard kroniku tal-kliewi (CKD) mad-dinja kollha, u hija waħda mill-aktar disturbi monoġeniċi li jintirtu prevalenti, li taffettwa popolazzjoni stmata għal 1: 400-1000 [1]. ADPKD (poliċistiku dominanti awtosomatikumard tal-kliewi) huwa kkawżat minn mutazzjonijiet fil- ġeni PKD1 (tip 1 poliċistiċi tal- kliewi) u PKD2 (mard poliċistiku tal- kliewi tat- tip 2), il- kodifikazzjoni għall- poliċistin- 1(PC1) u l- polycystin- 2 (PC2), rispettivament, li jirriżultaw f' tibdil fis- cilia u formazzjoni ta ' ċisti. Iż-żewġ proteini jimmodulaw bosta mogħdijiet molekulari kif ukoll morfoġenesi tat-tessuti u funzjoni. Madankollu, il-mekkaniżmi molekulari eżatti sottostanti għaċ-ċistioġenesi għadhom mhux ċari. Ġie aċċettat sew li mutazzjoni ġerminali segwita minn mutazzjoni somatiċi (it-tieni hit)fl-allel normali hija meħtieġa għal cystogenesis [2,3]. Barra minn hekk, abbażi ta' riżultati minn mudelli ortologi tal-ġrieden, intwera li huwa meħtieġ insult renali addizzjonali (it-tielet hit) għal tkabbir rapidu u sever taċ-ċisti fil-kliewi maturi [4,5]. Jidher li fil-bnedmin, il-biċċa l-kbira tat-tieni hits iseħħu waqt l-iżvilupp renali, li jwassal għal formazzjoni u tkabbir ċistika anke in utero. Għalhekk, is- severità u r- rata ta ' progressjoni tal- mard tal- kliewi li jirriżulta minn mutazzjonijiet poliċistiċi poliċistiċi pkD1 (mard poliċistiku tat- tip 1) u PKD2 (mard poliċistiku tal- kliewi tat- tip 2) jistgħu jiġu influwenzati minn diversi fatturi, inkluż il- ħin ta ' l- inattivazzjoni tal- ġeni, l- istadju ta ' żvilupp tal- kliewi, l- influwenza ambjentali, il- preżenza ta ' leżjonijiet renali konkomitanti, u d- diversità tal- mutazzjonijiet ġenetiċi.

Għalkemm kien hemm data innumerabbli dwar il-mekkaniżmi patofiżjoloġiċi tal-ADPKD (poliċistiku dominanti awtosomalimard tal-kliewi) miġbura minn studji li jużaw mudelli ta' ġrieden ortologi u mhuxortoġi, huma disponibbli biss numru żgħir ta' studji li jiffukaw fuq mudelli ċellulari umani ta' cystoġenesi [6]. Fl-2007, Takahashi et al.[Z ipproprogramma mill-ġdid b'suċċess ċelloli somatiċi f'ċelloli staminali pluripotenti bi proprjetajiet embrijoniċi, u semmiehom "ċelloli staminali pluripotenti indotti" (iPSCs). Minn dak iż-żmien 'l hawn, ħafna sorsi ta' ċelloli somatiċi ġew ipprogrammati mill-ġdid f'iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) jew minn tessuti tal-annimali jew tal-bniedem (hiPSCs)[Z], bi fibroblasts adulti li jirrappreżentaw is-sors ewlieni ta' dawn tal-aħħar. Fl-2013, Freedman et al.[8] indotti hiPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) mill-fibroblasts tal-ADPKD (poliċistiku dominanti awtosomalimard tal-kliewi) pazjenti u sabu espressjoni ċiliari mnaqqsa ta ' polycystin- 2, li tappoġġja l- użu ta ' dawn iċ- ċelloli biex jinvestigaw il- patofijoloġija tal- marda poliċistika (PKD). Aktar reċentement, Chen et al irrapporta fl-2016 li kienu kisbu ċelloli hiPS minn ċelloli proġenituri eritroidi [9].

Matul dawn l-aħħar ftit snin, kien hemm avvanzi sinifikanti fil-ġenerazzjoni ta' organoids tridimensjonali mill-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) [Z,10-12]. PrimarjiKliewiorganoids epiteljali tubulari jistgħu jiġu derivati mit-tessut tal-kliewi, kif ukoll mill-awrina, u dawn l-organoids huma għodda importanti għall-immudellar personalizzat tal-mard, kif muri minn Schutgens et al. [13]. Fi studji sussegwenti, Freedman et al.[14] setgħu jiġġenerawKliewiorganoids derivati minn linja ta' ċelloli hiPS disponibbli kummerċjalment, li jistabbilixxu protokoll biex jiġġeneraw it-tipi ta' ċelloli preżenti fil-massa meta-nefrika li jagħtu lok għall-istrutturi kollha tan-nefrnu. Imbagħad, billi tħabbat il-PKD1 (poliċistiku tat-tip 1Kliewimard) jew ġeni PKD2 (mard poliċistiku tal- kliewi tat- tip 2), dawn l- investigaturi osservaw formazzjoni ta ' cyst minnKliewitubuli. Fid-dawl ta' dawn it-teknoloġiji avvanzati u innovattivi kollha, aħna kellna l-għan li niksbu l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) miċ-ċelloli proġenituri eritroli li jiċċirkolaw tal-ADPKD (poliċistiku dominanti awtosomali-mard tal-kliewi)pazjenti u ttestja l- iżvilupp ta ' organoids tal- kliewi in vitro biex jirkupraw il- passi involuti fl- organoġenesi, jippruvaw jevokaw xi avvenimenti patofiżjoloġiċi relatati ma ' cystoġenesi bikrija.

Ikklikkja biex cistanche effetti sekondarji u benefiċċju għall-kliewi

Metodi Għażla tal-pazjent

Kampjuni tad-demm inġabru minn żewġ pazjenti nisa mhux relatati (PT1 u PT2) iddijanjostikati klinikament b'ADPKD (Mard tal-kliewi poliċistiċi dominanti awtosomali)(PT1:66 snin, eGFR 43.8 mL/min għal kull 1.73 m2 u PT2:56 snin, eGFR 60.2 mL/min għal kull 1.73 m2), segwit fil-Marda Poliċistika tal-Kliewi. Klinika Outpatient tad-Diviżjoni tan-Nefroloġija tal-Università Federali ta 'Sao Paulo (UNIFESP) u kampjun ieħor inġabar minn mara waħda b'saħħitha, li serviet bħala kontroll biex tistabbilizza u tinnormalizza t-teknika. Id-dijanjosi tal-ADPKD (Mard poliċistiku poliċistiku dominanti awtosomali) kienet ibbażata fuq storja pożittiva tal-familja u fuq il-preżenza ta' ċisti renali, skont il-kriterji dijanjostiċi ultrasonografiċi minn Pei et al.[15]. (Il-pedigrees tal-familja huma ppreżentati f'S1A Fig). Iż- żewġ pazjenti kellhom kliewi ċistika u fwied (Magnetic Resonance Images huma ppreżentati f' S1B Fig). L-istudju ġie rivedut u approvat mill-Kumitat Konsultattiv tal-Etika tal-Università (CEP UNIFESP, "Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo", Nr.1199.-0079-10/2018). Wara intervista biex jispjegaw l-iskop tal-istudju, kemm il-pazjenti kif ukoll il-kontroll b'saħħtu ffirmaw il-formola ta 'kunsens infurmat.

L- espansjoni taċ- ċelluli proġenituri eritrodi iżolati minn kampjuni tad- demm sħiħ inġabret f' tubu vacutainer li fih l- EDTA (bħala antikoagulant) f' temperatura tal- kamra. Iċ-ċelloli tal-proġenitur eritroid (EP) imbagħad ġew separati permezz ta' metodu RosetteSep(15216; Teknoloġiji taċ-Ċelloli Staminali), li neħħew ċelloli mhux mixtieqa, bħal RBCs maturi u plejtlits filwaqt li żammew il-popolazzjoni EP mixtieqa. Minħabba l-konċentrazzjoni baxxa ta' EPs fid-demm sħiħ, iċ-ċelloli ġew estiżi u kkoltivati f'mezz ta' kultura speċifiku li fih ċitokini u supplimenti (medja X-Vivo, Lonza). Iċ-ċelloli tal-EP kienu identifikati permezz ta' ċitometrija tal-fluss bl-użu tar-riċettur tat-transferrin (CD71) u tal-glikopirronina A(Gly A) bħala markaturi ttikkettjati b'GFP (S2 Fig).

Programmar mill-ġdid taċ-ċelloli proġenituri eritrodi

Ċelloli EPA estiżi nġabru u ġew infettati bl-użu ta 'iPSC Episomali Epi5 (ċelloli staminali pluripotenti indotti) Kit ta' Reprogramma (Thermo Fisher) li fih taħlita ottimizzata ta 'ħames fatturi ta' programmar mill-ġdid (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, u Klf4). It-transfection (elettroporazzjoni) saret b'vetturi episomali (mingħajr virus, mingħajr integrazzjoni) minn kit tal-fattur Lonza Nucleo. Wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew indurati f'mezz ta 'kultura speċifiku għar-ReproTeSR għall-ipprogrammar mill-ġdid (Teknoloġiji taċ-Ċelloli Staminali) taħt kundizzjonijiet standard ta' kultura taċ-ċelloli (37C,95% CO, u 5% O,).

Karyotyping

Biex jiġi vverifikat jekk il-proċess ta' programmar mill-ġdid ippriservax l-integrità kromosomali, l-analiżi tal-karjotip twettqet fid-Dipartiment Ġenetiku ta'UNIFESP.Ċelloli ġewx ittrattati b'100 μl ta' colchicine(0.08ug/ml) f'5 ml ta' midjum tal-kultura taċ-ċelloli tal-iPs biex jinduċi l-arrest taċ-ċiklu taċ-ċelloli, li kien segwit biż-żieda ta' soluzzjoni ta' KCl ipotika ta' 0.075 M biex tinduċi nefħa nukleari; iċ-ċelloli mbagħad ġew imwaħħla b'taħlita ta' metanol u aċidu aċetiku (3:1). Il-kromożomi tal-metafażi nħasdu, u t-tbajja' Wright intużaw għall-analiżi ċitoġena tal-G-bands (S3 Fig).

Karatterizzazzjoni tal-kolonji tal-kolonji iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti)

Iċ-ċelloli tal-PE ġew ipprogrammati mill-ġdid minn vetturi episomali ffurmati kolonji tipiċi tal-iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti) u ppreżentaw karjotip normali (S3 Fig). Il-karatteristiċi tal-kolonja tal-iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti) tqabblu ma' dawk ta' kontroll stabbilit derivat miċ-ċellula tal-linja H9 (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, disponibbli mill-Istitut tar-Riċerka Wicell, l-Istati Uniti)(Fig 1B). Peress li l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) ippreżentaw morfoloġija tipika, il-markaturi tal-pluripotenza ġew identifikati permezz ta 'immunofluworexxenza. Iċ- ċelloli kienu ffissati b' 4% paraformaldeid għal 30min f' temperatura ambjentali. Wara l-iffissar, il-kampjuni nħaslu bil-PBS tliet darbiet, imblukkati f'5% PSA u 0.3% Triton-X-100/IONSYSS, u inkubati matul il-lejl b'antikorpi primarji (Signaling taċ-Ċelloli, Ma, EUA), jiġifieri, OCT4(1:400 dilwizzjoni) bħala test tal-pluripotenza. L-għada, ġiet ippreparata slide ġdida, maħsula fil-PBS, u inkubata b'antikorp sekondarju Alexa Fluor (1:200 dilwizzjoni, Sinjalar taċ-Ċelloli), u DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) ġiet miżjuda għall-identifikazzjoni nukleari.

Fig 1. Ġenerazzjoni u karatterizzazzjoni tal-iPSCs(ċelloli staminali pluripotenti indotti). l-iPSCs ġew ipprogrammati mill-ġdid minn ċelloli proġenituri eritrodi estiżi (EP) minn kontroll b'saħħtu (HC) u żewġ pazjenti differenti tal-ADPKD (PT1 u PT2).

A. Ġenerazzjoni skematika gradwali ta' organoids tal-kliewi B. Similarità ta' iPSC (a. immaġni tipika ta' iPSC miċ-ċelloli embrijoniċi H9 kummerċjali. b. iPSC minn ċelloli eritrolidi proġenituri mill-kontroll b'saħħtu)

C. Morfoloġija tal-kolonji iPSC D. Karatterizzazzjoni tal-pluripotenza tal-iPSC osservata taħt mikroskopju tal-fluworexxenza diġitali maqluba EVOS.

It-tikkettar tal-antikorpi OCT4 intuża bħala markatur tal-pluripotenza biex jikkaratterizza n-natura tal-pluripotenza tal-kolonji HC, PT1 u PT2.

Nuklei taċ-ċelloli ġew ittikkettjati b'DAPI (scale bar għal Fig 1B: 200 μm; scale bar għal Fig 1C: 1000 μm; scale bar HC / PT2 għal Fig 1D: 1000 μm; scale bar PT1 għal Fig 1D: 200μm).

Il-kapaċità tal-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) biex jiddifferenzjaw fit-tliet saffi ġerminali

l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) tkabbru fi pjanċi b'6 bir miksija bil-Matrigel (1:10, Bijoxjenzi BD, NY,EUA)fil-mezz tal-kultura mTeSR1 (Teknoloġiji taċ-Ċelloli Staminali, BC, il-Kanada). Biex jiġi evitat li l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) jiddifferenzjaw, il-kolonji ġew passaġġ manwalment minn frammentazzjoni mekkanika b'ponta tal-pipet taħt mikroskopju, jew ġew iddissoċjati minn diġestjoni enżimatika bl-użu ta' Ċellula Ġentili (Teknoloġiji tal-Ħajja)(S4 Fig). Bl-użu ta' dawn il-metodi, l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) inżammu għal 22 pas-sages serjali biex jiġi żgurat li ċ-ċelloli inkorporaw kif suppost il-fatturi ta' programmar mill-ġdid. L-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) imbagħad ġew stimulati biex jiddifferenzjaw fit-tliet saffi ġerminali bl-użu ta 'kit ta' Differenzjazzjoni steMdiff Trilineage (Stem Cell Technologies). Wara ħamest ijiem, iċ-ċelloli nħasdu għall-analiżi ta' markaturi speċifiċi għall-età tal-linja tal-mesoderm u l-endoderm, u wara sebat ijiem ġew analizzati għall-ectoderm, skont il-protokoll ta' Differenzjazzjoni steMdiff Trilineage (S5 Fig).

Karatterizzazzjoni molekulari tat-tliet linji ġerminali kollha permezz ta' qRT-PCR

RNA totali minn kulturi tat-tliet saffi tal-mikrobi ġiet estratta bl-użu ta 'kit GE RNA Spin Mini (GE Healthcare, USA), u mbagħad ikkonvertita f'cDNA bl-użu ta' Kit ta 'Traskrizzjoni Reverse ta' Kapaċità Għolja (Bijosistemi Applikati, l-Istati Uniti) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. PCR (gRT-PCR) kwantitattiv f'ħin reali sar bl-użu ta' kit SYBR Green PCR (Applied Biosystems, USA) skont il-livelli ta' espressjoni tal-protokoll tal-manifattur.mRNA ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu 2^Ct. Hydroxymethylbilane synthase (HMBS) u glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) intużaw bħala kontrolli interni, u l-espressjoni ta' OCT4 intużat bħala kontroll kwantitattiv. L- espressjoni ta ' SOX17 intużat biex tidentifika d- differenzazzjoni fl- endoderm, is- CXCR4 intuża biex jidentifika d- differenzazzjoni fil- mesoderm, u PAX6 intuża biex jidentifika d- differenzazzjoni fl- ectoderm (S6 Fig). Is-sekwenzi kollha tal-primer huma speċifikati fit-Tabella S1, u l-kurva tal-effiċjenza ġiet evalwata għal kull par primer.

Immunofluworexxenza għas-saffi differenti tar-raħs

l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) ġew indotti biex jiddifferenzjaw fuq il-coverslips fi pjanċi ta' sitt bir. Wara d-differenzjazzjoni, il-coverslips tneħħew mill-bjar oriġinali u ġew trasferiti għal pjanċa ġdida, fejn iċ-ċelloli ġew iffissati b'4% paraformaldeid u mbagħad maħsula bil-PBS, kif deskritt hawn fuq. Antikorpi primarji kontra OCT4(1:400; Sinjalar taċ-Ċelloli), CXCR4 (1;100; Sinjalar taċ-Ċelloli), PAX6 (1:100; Thermo Fisher), u SOX17 (1:100; Intużaw Sistemi R&D).. Il-fluworexxenza ġiet ivvalutata bl-użu ta' antikorp sekondarju Alexa Fluor (1:200; Sinjalar taċ-Ċelloli).

Differenzjazzjoni tal-organoid tal-kliewi mill-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti)

Renalorganoids ġew iġġenerati wara l-protokoll deskritt minn Cruz et al. [6] b'xi adattamenti. Fil- qosor, 50,000 iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) mill- HCand żewġ pazjenti ADPKD (Mard tal- kliewi poliċistiku dominanti awtosomali) intużaw biex jipproduċu sospensjonijiet ta 'ċelloli singoli b' soluzzjoni ta' distakkament ta 'Accutase (Teknoloġiji taċ-Ċelloli Staminali). Ċelloli singoli ġew supplimentati b'inibitur ta '10uM Rho-kinase (Y27632, Stem Cell Technologies jew Stemgent). Wara 16-il siegħa, il-mezz ta 'kultura ġie sostitwit b'1 mL ta' mTeSR1 + 2.5% Matrigel + 10 μuM Y27632. Wara 20h, il-mezz ġie sostitwit b'1mL ofmTeSRI biss;14 h aktar tard, il-mezz tal-kultura ġie sostitwit, u ċ-ċelloli ġew indotti b'6 uM CHIR99021 (AT104; Ċellula Staminali jew inibitur Stemgent GSK-3b / agonist tal-passaġġ Wnt)+RPMI Avvanzat (Thermo Fisher)+ Glutamax (Teknoloġiji tal-Ħajja)+ 10 ug/ ml antibijotiku (Ampicillin; 1:1000; Gibco). Fl-aħħarnett, 36 siegħa wara, il-mezz tal-kultura ġie sostitwit b'midjum DRB li fih RPMI Avvanzat (Thermo Fischer)+ Glutamax (Thermo Fischer)+ B27 Suppliment (17504-044; Teknoloġiji tal-Ħajja)+ antibijotiku. Il-midjum DRB inbidel kull tlett ijiem għal 28 jum. Dan il-perjodu (28 jum) kien biżżejjed biex l-organoids ikunu viżibbli bil-mikroskopija.

Karatterizzazzjoni molekulari ta' organoids permezz ta' RT-PCR

L-espressjoni tal-ġeni semikwantitattiva ġiet evalwata permezz ta' RT-PCR matul il-proċess embrijoniku b'RNA totali tiġi ppurifikata mill-istrutturi taċ-ċelloli ffurmati fil-jiem 0(iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti)) u f'14,21, 28, u 35 jum wara induzzjoni ta' divrenzjar. L- espressjoni ta ' WT1 (kilwa li qed tiżviluppa), AQP1 (tubu prossimali), u ECAD (markatur ta ' l- epitelju taċ- ċisti) kienet evalwata. IL-GAPDH intuża bħala kontroll intern. L-espressjoni ta' OCT4 intużat bħala standard kwantitattiv.

Riżultati

Il-kisba ta' iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) minn proġenituri eritrodi(EPs)

Il- protokoll użat biex jinkisbu organoids tal- kliewi mill- proġenituri eritroid huwa miġbur fil- qosor. L-espansjoni tal-EPs irriżultat f'1x10°ċelloli wara madwar 20 jum (S2A Fig), u madwar xahrejn wara, l-EPs ġew identifikati bl-espressjoni tagħhom tal-markaturi CD71 u Gly A. L-effiċjenza tal-metodu ta 'separazzjoni żvelat espressjoni;88% taċ-ċelloli kienu pożittivi għal CD71, u 57,4% kienu Gly A pożittivi (S2BFig).

Wara li vverifikaw li ċ-ċelloli kienu EPs, ġew trasfettati b'fatturi ta 'programmar mill-ġdid (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, u klf4) u mbagħad inżammu f'mezz speċifiku għall-ipprogrammar mill-ġdid (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) għal madwar ħamest ijiem. l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) żviluppaw karatteristiċi ċellulari tipiċi billi ffurmaw kolonji b'morfoloġija distinta minn dik ta' ċelloli mhux ipprogrammati mill-ġdid preżenti fl-istess kultura taċ-ċelloli. Iċ-ċelloli ġew immonitorjati sakemm osservajna kolonji tipiċi bħal iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti) li kienu simili għall-kolonji tal-kolonji tal-linja taċ-ċelloli H9 kummerċjali (Eig 1B).iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti) ġew rikonoxxuti wkoll mid-daqs relattivament akbar tagħhom, pakketti taċ-ċelloli stretti, forma omoġenja definita sew, u truf regolari. L-identifikazzjoni kienet iffaċilitata mill-grad baxx ta' tkabbir żejjed tal-kolonji minn ċelloli differenzjati f'mezz ta' programmar mill-ġdid mingħajr alimentatriċi (Eig 1C). Ma nstabu l-ebda differenzi li jistgħu jiġu osservati fost il-kolonji tal-iPSC mill-pazjenti tal-HC u tal-ADPKD (Mard poliċistiku poliċistiku dominanti awtosomali) (PTl u PT2) f'termini ta' morfoloġija tal-kolonja u markaturi tal-pluripotenza, kif muri fil-Fig 1D.

l-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) kienu aktar ikkaratterizzati mill-kapaċità tagħhom li jiddifferenzjaw fit-tliet saffi tal-mikrobi. Immaġini tipiċi tal-progressjoni tal-iżvilupp tas-saff tal-mikrobi fiċ-ċelloli mill-HC huma murija f'S5 Fig. L-iżvilupp tat-tliet saffi ġerminali ġie vverifikat minn morfoloġija tipika (Eig 2A) u permezz ta' tikkettar immunofluworexxenza għal markaturi ta' divrenzjar, jiġifieri, FOXA2 għall-endoderm, att tal-muskoli lixx (SMA) għall-mesoderm u SOX2 għall-ekoderm (Eig2B-2D). Kontrolli negattivi għall-antikorpi huma murija fi S7 Fig. Fig 2E juri l-livelli ta' espressjoni tal-ġeni ta' markaturi speċifiċi tal-endoderm (SOX17), tal-mesoderm (CXCR4), u tal-ektoderm (PAX6), kif skoperti mill-RT-PCR.

Fi 2. Karatterizzazzjoni tat-tliet saffi tal-mikrobi. Pazjenti b' saħħithom (HC) u ADPKD1 (PT1 u PT2).

A. Morfoloġija tipika tat-tliet saffi tar-raħs. Is- saffi tar- raħs kienu kkaratterizzati minn tbajja ' immunofluworexxenza bl- użu ta ' antikorpi speċifiċi. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (α SMA) u D. Ectoderm (SOX2). Nuklei taċ-ċelloli kienu mtebbgħin bid-DAPI. L-aħħar kolonni juru immaġini magħqudin.

E. L-espressjoni tal-ġeni ta' OCT4 tindika l-pluripotenza tal-iPSCs, SOX17 kien markatur għall-endoderm, is-CXCR4 kien markatur għall-mesoderm u l-PAX6 kien markatur għall-ektoderm (n = 2).

L-espressjoni OCT4 mill-iPSCs intużat bħala kontroll kwantitattiv intern. L-espressjoni OCT4 ma nqalgħetx fiċ-ċelloli tat-tliet saffi tar-raħs (skala: 200 μm).

Il-ġenerazzjoni ta' organoids tal-kliewi mill-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti)

Strutturi renali tridimensjonali ġew iġġenerati minn iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) derivati mill- HC u kemm pazjenti ADPKD (Mard poliċistiku poliċistiku dominanti awtosomali) wara passi li jirrikapitalizzaw l- iżvilupp embrijoniku. It-3 it-tagijiet juru l-passi li huma neċessarji biex jinkisbu l-istrutturi embrijoniċi rispettivi. Il-kolonji tal-iPSC (ċelloli staminali pluripotenti indotti(Eig 3A)ġew diżassoċjati b'Accutase (Fig 3B)biex jinkisbu iPSCs uniċi (ċelloli staminali pluripotenti indotti) (Fig3C). Meta wieħed iqis il-proċess embrijoniċi normali, il-kolonji jkunu mistennija jiddifferenzjaw fi blastula u mbagħad f'gastrula, iżda d-differenzjazzjoni spontanja tal-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) fil-kultura għadha sfida peress li ċ-ċelloli jgħaddu spontanjament minn apoptożi [16]. Biex jiġi evitat dan ir-riżultat mhux mixtieq, inibitur ta ' ROCK tas- sinjalar (inibitur ta ' 10μM Rho- kinase Y27632) ġie miżjud 16- il siegħa wara l- istadju ta ' ċellula waħda. L-inibizzjoni tal-passaġġ ROCK tipprevjeni liċ-ċelloli milli jiskattaw il-mogħdijiet tal-mewt, li jippermettulhom jgħixu u jaġġustaw biex jipproċedu lejn il-proċess ta 'divrenzjar. L-iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti) imbagħad kibru sakemm laħqu l-istadju tal-epiblast, li huwa kkaratterizzat mill-preżenza ta 'kavitajiet sferojdi (Fig 3D). Sussegwentement, ġie miżjud inibitur qawwi ta ' GSK- 3b / agonist tal- passaġġ Wnt (CHIR99021), li kien segwit biż- żieda ta ' midjum DRB biex jinduċi transizzjoni epiteljali- mesenchymal (Fig 3E u 3E) u finalment tranżizzjoni mesenchyme- epiteljali (Fig 3G); dawn il- passi ppermettew l- epiteljalizzazzjoni u l- formazzjoni sekwenzjali ta ' aggregati pre tubulari u infafet renali (Eig 3H), li fl- aħħar mill- aħħar ippermettew il- formazzjoni ta ' organoids tubulari renali (Fig 3D). Dawn il- passi kollha ta ' l- emboġenesi in vitro kienu simili għal ċelloli derivati kemm minn pazjenti HCand ADPKD (Mard tal- kliewi poliċistiku dominanti awtosomali).

Il-preżenza ta' strutturi tubulari kienet ivverifikata bl-espressjoni ta' markaturi speċifiċi b'immunofluworexxenza: NHE3 u AQP1 għal tubuli prossimali (Eig4A) u NPHS2 għall-glomeruli (Eig 4B). B'kuntrast ma' dan, ma nstabx it-tikkettar tal-AQP2 (Eig 4B), li jikkonferma li din il-metodoloġija ppermettiet biss l-iżvilupp tal-massa metanefrika iżda mhux tal-blanzun ureeriku. L-ECAD markatur ma nstabx fin-nuqqas ta' forskolin (Fig 4B).

Biex tiġi vverifikata l-preżenza ta' markaturi speċifiċi espressi matul il-proċess ta' żvilupp proġenitur tal-kliewi, il-kampjuni kollha (HC, PT1, u PT2) inġabru f'ħames punti tal-proċess kollu ta' differenzjazzjoni: jum 0(iPSCs (ċelloli staminali pluripotenti indotti)), jiem 14,21,28, u mbagħad fil-jum 35 (7 ijiem wara l-induzzjoni taċ-ċisti). Il-kors tal-ħin tal-espressjoni tal-ġeni żvela differenzjazzjoni matul il-proċess tal-embrijoġenesi, kif muri fi Fig 5A-5C. Il-markatur tal-pluripotenza OCT4 ġie espress minn iPSCs (jum O), iżda l-livelli tiegħu tnaqqsu fuq 14-il jum, u laħqu livelli baxxi ħafna wara d-differenzjazzjoni. B' kuntrast ma ' dan, l- espressjoni tal- markaturi speċifiċi tal- mesenchyme metanephric (WT1) u tubuli prossimali (AQP1) żdiedet progressivament meta l- proċess ta ' divrenzjar inbeda sa l- 14- il jum, u laħaq plateau sal- 21 jum. Fig 5D juri l-espressjoni ta' ECAD, markatur cystogenesis, f'jum 35,i.e.7 ijiem wara induzzjoni taċ-ċisti bil-forskolin. Fin-nuqqas ta' forskolin, l-espressjoni tal-ECAD kienet baxxa ħafna, anke f'pazjenti ADPKD (Mard tal-kliewi poliċistiċi dominanti awtosomali). Madankollu, meta ġie miżjud forskolin (jum 28), iż- żewġ pazjenti wrew espressjoni miżjuda ta ' ECAD; iżda l-istess mudell ma ġiex osservat fl-organoid tal-HC li baqa' b'livelli baxxi ta' ecaDexpression anke fil-preżenza ta' forskolin.

Il- preżenza ta ' ċisti ffurmati mill- organoids stimulati bil- forskolin kienet evidenti għall- pazjenti ADPKD (Mard poliċistiku poliċistiku dominanti awtosomali), kif muri fl- Eig6. Il-pannell ta 'fuq juri immaġini tal-organoids fit-28 jum, qabel iż-żieda ta' forskolin (Eig6Aa). Eig6Ab (stampa panoramika-4X) u 6Ac(20X view-ing) juru l-organoids f'jum 35 fil-preżenza ta' forskolin li juru l-preżenza ta' strutturi simili għal ċisti f'kampjuni kemm mill-pazjenti (PT1 kif ukoll minn PT2) iżda mhux fil-kampjun tal-HC. Il-preżenza ta 'ċisti ġiet ivverifikata wkoll minn tbajja' immunofluworexxenza (Fig 6B). It- tikkettar ta ' l- ECAD ma nstabx fl- organid HC, iżda kien osservat b' mod ċar fl- organoids miż- żewġ pazjenti. Interessanti l-fatt li l-preżenza ta 'lumen taċ-ċisti tista' tiġi osservata wkoll.

Fi 3. Ġenerazzjoni ta' organoids tubulari.

Stampi ta ' kuntrast ta ' fażi tal- ġenerazzjoni ta ' organoids tubulari tal- kliewi epiteljali fi 28 jum minn iPSCs iġġenerati mill- gruppi HC, PT1, u PT2. Fl-ewwel 36 siegħa, l-iPSCs inżammu fil-kultura 3D.

Imbagħad, ġew iddissoċjati, trasformati f'ċelloli singoli, u ttrattati b'Y-27632, li ppermettew ir-riorganizzazzjoni u s-sopravivenza ċellulari, u pproduċew sferojdi tal-epiblast (d).

Imbagħad, ġew miżjuda CHIR99201 u DRB, billi attivaw il-passaġġ Wnt / β-catenin u jippermettu d-divrenzjar f'organoids tubulari (I).

Il-morfoloġija fost l-isferojdi derivati minn pazjenti ADPKD u minn donatur tal-HC hija simili. (Skala għal a u f: 1000μm; skala għal b, c d, e, g, h u i: 200μm).

IKKLIKKJA HAWN BIEX PARTIII.