Il-Bijomarkatur Dijanjostiku Għall-Mard Dijabetiku tal-Kliewi: Espressjoni MicroRNAs

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

PARTI Ⅰ: Profiling tal-Espressjoni tal-MicroRNA fil-Mard tal-Kliewi Dijabetiċi

HIROKIISHII, SHOHEI KANEKO, KATSUNORI YANAl, AKINORI AOMATSU, KEIJ HIRAl, SUSUMU OOKAWARA, & YOSHIYUKI MORISHITA

INTRODUZZJONI

Il-prevalenza tal-mard tal-kliewi dijabetiku (DKD) qed tikber malajr madwar id-dinja u hija relatata ma’ piżijiet ekonomiċi u soċjali sostanzjali minħabba li hija l-kawża ewlenija ta’ mard tal-kliewi fl-aħħar stadju u hija assoċjata mal-iżvilupp ta’ kumplikazzjonijiet vaskulari varji.¹. Biex ittejjeb il-pronjosi tad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku), id-dijanjosi bikrija tagħha u l-aġenti ta 'trattament speċifiċi huma meħtieġa. Madankollu, it-tnejn ma ġewx stabbiliti.

Id-dijanjosi definittiva ta 'DKD (mard tal-kliewi dijabetiku) teħtieġ l-analiżi istoloġika ta' bijopsiji renali. Madankollu, il-bijopsija renali hija invażiva, huwa diffiċli li jinkisbu kampjuni dijanjostiċi, u mhix xierqa għal proċeduri ripetuti. Għalhekk, diversi molekuli tas-serum jew tal-awrina, bħall-kollaġen IV, il-propeptide terminali COOH tal-kollaġen VI, u r-riċettur tal-fattur tan-nekrożi tat-tumur 1 minn 2, ġew ivvalutati għall-użu bħala markaturi dijanjostiċi tad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku),^2-4 iżda ħadd għadu ma ġie stabbilit għal użu kliniku.^5-7

Rigward it-trattament tad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku), diversi mediċini, bħal imblokkaturi tas-sistema renin-angiotensin, inibitur 2 tal-kotransporter tas-sodju-glukożju, u analogi tal-peptide-1 simili għall-glucagon, intwerew li għandhom effetti protettivi fid-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku),^8-10 imma ħadd mhu ideali. Għalhekk, hemm ħtieġa urġenti għall-identifikazzjoni ta 'bijomarkaturi dijanjostiċi u aġenti terapewtiċi għal DKD(mard tal-kliewi dijabetiku).

ħxejjex tad-dragun cistanche

MicroRNAs(miRNAs) ġibdu l-attenzjoni bħala bijomarkaturi speċifiċi għall-mard u miri terapewtiċi għal diversi mard, bħall-kanċer u diversi mard infjammatorju.^11,12miRNAs(MicroRNAs) huma RNAs żgħar, mhux kodifikanti ta' madwar 22 nukleotide fit-tul li jaġixxu bħala regolaturi ta' wara t-traskrizzjoni tal-ġeni fil-mira u l-proteini derivati ​​tagħhom billi jinduċu degradazzjoni ta' RNAmiR messaġġier u/jew ripressjoni translazzjonali.^13,14 NAs are thought to be responsible for the regulation of >60 fil-mija tal-livelli kollha ta' espressjoni tal-proteini, u b'hekk għandhom rwoli ċentrali u diversi fi proċessi patofiżjoloġiċi f'diversi mard¹⁵.

Studji preċedenti wrew li diversi miRNAs(MicroRNAs)huma involuti fil-patoġenesi tad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku), u konsegwentement, jistgħu jirrappreżentaw bijomarkaturi utli ta' jew miri terapewtiċi għal DKD(mard tal-kliewi dijabetiku).^16.17 Madankollu, aktar studji biex jinvestigaw ir-rwoli regolatorji tal-miRNAs(MicroRNAs)f'DKD(mard tal-kliewi dijabetiku)huma meħtieġa u dawn il-miRNAs(MicroRNAs)jistgħu jiġu żviluppati bħala bijomarkaturi dijanjostiċi u aġenti terapewtiċi għad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku). Għalhekk, fl-istudju preżenti, investigajna l-miRNAs(MicroRNAs)involuti fid-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku)u ddeterminaw il-potenzjal tagħhom bħala bijomarkaturi speċifiċi jew aġenti terapewtiċi għad-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku).

benefiċċji ta' zokk ta' cistanche

MATERJAL U METODI

Mudell tal-annimali.Il-ġrieden kienu miżmuma f'kamra b'temperatura u umdità kkontrollati taħt kundizzjonijiet ta 'mikroiżolatur antivirali u mingħajr antikorpi. Ġrieden maskili db/db(C57BLKS/J lar - plus Leprdb/ plus Leprdb)u l-ġrieden normali tagħhom littermate m/m (C57BLKS/J Iar-m plus /m plus )inxtraw mill-Istitut għar-Riproduzzjoni tal-Annimali (Ibaraki, il-Ġappun) . Ġrieden maskili AKITA (ġrieden C57BL/6-Ins2Akita/J) u s-sħab normali tagħhom (C57BL/6J) inkisbu minn Japan SLC, Inc. (Tokyo, Ġappun).

Iskemija renali u riperfużjoni saru kif deskritt qabel.¹⁸ Fil-qosor, ġrieden maskili C57BL/6J (Tokyo Laboratory Animals Science, Tokyo, Japan) ġew anestetizzati b'isoflurane u l-pediklu tal-kliewi tal-lemin ġie identifikat, ligated, u saret nefrectomija tal-lemin. Il-pediklu tal-kliewi tax-xellug ġie mbagħad identifikat u kklampjat b'klipp mikrovaskulari mhux trawmatiku għal 45 min. Il-klampi tneħħew wara li l-perjodu ta 'iskemija kien intemm u riperfużjoni b'suċċess ġiet ikkonfermata viżwalment. Ġrieden imħaddma b'mod falz għaddew mill-istess proċedura kirurġika, mingħajr ikklampjar tal-pedikulu renali. L-annimali ġew sagrifikati 24 siegħa wara riperfużjoni.

Twettqet ostruzzjoni ureterika unilaterali kif irrappurtat qabel.¹⁹Fil-qosor, ġrieden maskili C57BL/6J (Tokyo Laboratory Animals Science) ġew anestetizzati bl-użu ta 'isoflurane, u mbagħad l-ureter tax-xellug ġie espost permezz ta' inċiżjoni addominali tal-linja tan-nofs, kompletament ligated b'4-0 ħarir f'żewġ punti, u maqsum bejn dawn. Il-grupp imħaddem sham ma għadda minn ligation. Il-ġrieden ġew sagrifikati u l-kliewi tax-xellug tagħhom inġabru 7 ijiem wara l-kirurġija.

Ġrieden aċċellerati tas-senescence maskili (SAMP1/YitFcsJ) u ġrieden ta 'kontroll (SAMR/YitFcsJ) inxtraw minn SLC Japan.²⁰Dawn il-ġrieden ġew sagrifikati fl-età ta '48 ġimgħa. Ġrieden HIGA maskili (HIGA/NscSlc) u ġrieden BALB/cCrSlc, li ntgħażlu bħala r-razza ta 'kontroll minħabba l-konċentrazzjonijiet baxxi tagħhom ta' IgA fis-serum, inkisbu mill-Ġappun SLC.

Inġabru l-kliewi u d-demm, inkiseb is-serum, u l-maġġoranza tat-tessuti nħażnu fi -80 grad. Il-kliewi tax-xellug intużaw għall-analiżi istoloġika u l-kliewi tal-lemin intużaw għall-mRNA u l-miRNA(MicroRNAs)kwantifikazzjoni. Għal analiżi bijokimiċi, ġrieden ġew trasferiti għal gaġeġ metaboliċi individwali għall-ġbir ta' 24-h kampjuni tal-awrina. Il-konċentrazzjonijiet tal-albumina urinarja u tal-krejatinina tkejlu bl-użu ta 'LBIS Mouse Urinary Albumin Assay Kit (S-type) (Fujifilm Wako, Shibayagi, Gunma, Japan) u Lab-Assay Creatinine Kit (Fujifilm Wako, Osaka, Japan), rispettivament.

Pazjenti u suġġetti b'saħħithom.Irreklutajna pazjenti b'mard kroniku tal-kliewi li għaddew minn bijopsija renali fl-Università Medika Saitama Jichi bejn Mejju 2016 u Mejju 2019. Ħamsa u għoxrin pazjent ġew reklutati fid-DKD(mard tal-kliewi dijabetiku)grupp u tqabblu ma’ pazjenti li kellhom mard tal-kliewi minbarra DKD (n=50 pazjenti; nefropatija IgA 17, nefropatija membranuża 9, sindromu nefrotiku ta’ bidla minima 6, nefrosklerożi 4, nefrite interstizjali 3, IgG4-assoċjata nefropatija 3, lupus nefrite 2, u mard renali ieħor 6) u kienu mqabbla għall-karatteristiċi tal-linja bażi tagħhom. Kull każ ġie rivedut minn diversi patoloġisti b'esperjenza biex jiġi żgurat li l-kampjuni tal-bijopsija wrew bidliet patoloġiċi xierqa għall-kategorija tal-marda u ma wrewx bidliet sinifikanti karatteristiċi ta 'mard ieħor. DKD(mard tal-kliewi dijabetiku)ġie djanjostikat bl-użu tas-sejbiet karatteristiċi ta 'żieda fil-matriċi mesanġjali, glomerulosclerosis nodulari, tħaxxin diffuż tal-membrana tal-kantina glomerulari, u hyalnosis konkomitanti ta' arterioli afferenti u efferenti.²¹ Id-dijabete mellitus ġiet iddijanjostikata bl-użu tal-critee tal-Assoċjazzjoni Amerikana tad-Dijabete.²² Il-metodu tal-Mard (MDRD), modifikat għall-Ġappuniżi (ml/min/jsegwi: popolazzjoni, eGFR, bħala;1x kreatinina fis-serum1.73m²）=0.881×186.3×età-0.2{{9 }}3×(×0.742 għan-nisa).^23,24

Analiżi Microarray.L-analiżi tal-miRNA(MicroRNAs)espressjoni twettqet minn Hokkaido System Science (Hokkaido, il-Ġappun). Id-dettalji tal-analiżi tal-microarray ġew deskritti band'oħra.²⁵Fil-qosor, l-RNA kien defosforilazzjoni u mbagħad ingħaqad ma' Cy3-pCp bl-użu ta' miRNA(MicroRNAs)Tlesti Reaġent tat-Tikkettar u Hyb Kit (Agilent Technologies, CA, USA) u miRNA(MicroRNAs)Spike-in Kit (Teknoloġiji Agilent). Il-miRNA(MicroRNAs)Ir-Reaġent tat-Tikkettar Tlesti u l-Kit Hyb intużaw biex ibridizzaw is-cRNAs. Wara l-ibridizzazzjoni, ir-raġġi tal-mikroar inħaslu bl-użu ta’ Gene Expression Wash Pack (Teknoloġiji Agilent) u skennjati bi Skaner Agilent Microarray. L-intensitajiet tas-sinjali ġew evalwati b'Agilent Feature Extraction ver.12. 0.3.1.L-analiżi tal-espressjoni tal-mRNA saret ukoll minn Hokkaido System Science. L-RNA kien ittikkettat Cy3-bl-użu ta' Low-Input Quick-Amp Labeling Kit, One-Color (Agilent Technologies). Il-kampjuni tal-cRNA ttikkettjati ġew ibridizzati għal miRNA tal-Ġurdien(MicroRNAs)Microarray 8×60K rel.21.0(Teknoloġiji Agilent) f'65 grad għal 17-il siegħa bl-użu ta' Kit ta' Ibridizzazzjoni tal-Espressjoni tal-Ġene (Teknoloġiji Agilent). Wara l-ibridizzazzjoni, il-mikroarrays ġew maħsula b'komponenti tal-Pakkett tal-Buffers tal-Ħasil ​​tal-Espressjoni tal-Gene (Agilent Technologies) u skennjati bi Skaner Agilent Microarray. L-intensitajiet tas-sinjali ġew evalwati bl-użu ta 'Agilent Feature Extraction ver.12.0.3.1. In-normalizzazzjoni nkisbet bl-użu tal-metodu ta' shift 90th percentile, metodu użat komunement għal microarray, kif deskritt qabel.²⁶ The results were analyzed using GeneSpring software v12.1(Agilent Technologies). Statistical analysis was carried out using one-way ANOVA with a post hoc Tukey honestly significant difference test. Fold changes with a cut-off value>4 u valur P<0.05 were="" considered="" to="" indicate="" statistically="" significant="" differences.="" the="" genespring="" single="" experiment="" analysis="" (sea)bioinformatics="" tool="" was="" used="" for="" computational="" analysis="" to="" identify="" potential="" curated="" canonical="" pathways="" that="" were="" enriched="" in="" the="" transcript="" list="" showing="" a="" significant="" gene="" expression="" difference="" between="" the="" control="" mice,db/db="" mice,db/db="">(MicroRNAs)-181b-5p-mimic-PEI-NPs, u ġrieden db/db flimkien ma' control-miRNA(MicroRNAs)-Gruppi PEI-NPs bl-użu tad-database WikiPathways Mira Predicted. FmRNAs ta 'miRNAs ġew imfittxija permezz ta' softwer Target Scan.

Tabella I.Lista ta' miRNAs(MicroRNAs)espress b'mod differenzjali fil-kliewi tal-ġrieden AKITA permezz ta' analiżi ta' microarray

Traskrizzjoni inversa-PCR kwantitattiva f'ħin reali.Id-dettalji tal-assaġġi kwantitattivi ta' traskrizzjoni inversa-PCR (qRT-PCR) f'ħin reali biex jitkejlu mRNA u miRNA(MicroRNAs)espressjoni fil-kliewi tal-ġrieden ġew deskritti qabel.²⁷Biex tkejjel il-miRNA(MicroRNAs)espressjoni, kampjuni tal-kliewi ġew omoġenizzati bl-użu ta ' omoġenizzatur tal-ħġieġ u shredder kolonna filtru (QIA shredder kolonna; Qiagen, Hilden, il-Ġermanja), imbagħad RNA ġie estratt bl-użu ta ' miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Mikrogramma waħda ta' kull kampjun ta' RNA ġiet traskritta b'lura f'cDNA bl-użu tas-Sistema PCR miRScript (Qiagen). qRT-PCR imbagħad sar permezz ta' miScript SYBR Green PCR Kit u primers speċifiċi għal miRNA-20a-5p, miRNA-34a-5p,miRNA{{6} }b-5p,miRNA-129-1-3p, miRNA-129b-5p,miRNA-142a-3p,miRNA{{13} }a-5p, miRNA-181b-5p, miRNA-223-3p,miRNA-146a-5p, rmiRNA{{20} }p,miRNA-652-3p,miRNA-342-3p,rmiRNA-6401,u miRNA-6980-5p(miScript Primer Assays; Qiagen), skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-livelli ta' espressjoni ġew normalizzati għal dak ta' U6-snuRNA u ġew ikkalkulati bħala differenzi ta' darbiet (2-△ACT) mil-livelli ta' espressjoni ta' kontroll normali. Il-livelli ta 'espressjoni ta' U6 ma kinux statistikament differenti bejn il-gruppi kollha f'dan l-istudju.

Biex tkejjel il-miRNA(MicroRNAs)livelli fis-serum tal-bniedem u tal-ġrieden, RNA ġie ppreparat minn kampjuni ta '300 μL ta' serum bl-użu ta 'kolonna tal-Plasma NucleoSpin miRNA (Macherey-Nagel, Duren, il-Ġermanja) u Kit Serum/Plasma miRNeasy (Qiagen). Imbagħad, l-RNA iżolat ġie traskritt b'lura bl-użu ta' miScript I RT Kit (Qiagen).qRT-PCR sar permezz ta' miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen).Primers għal miRNA-20a-5p ,miRNA-34a-5p,miRNA-125b-5p,miRNA-129-1-3p,

miRNA(MicroRNAs)-142a-3p,miRNA-1129b-5p,miRNA-142a-5p,miRNA-146a{{ 7}}p,miRNA-181b-5p,miRNA-455-5p,miRNA-342-3p,n miRNA-223-3p, miRNA-652-3 p,miRNA-6401,u miRNA-6980-5p inxtraw minn Qiagen. Il-livelli ta' kull miRNA ġew normalizzati għal dawk ta' miRNA-16 bħala kontroll endoġenu. Il-livelli ta' espressjoni fis-serum ta' miRNA-16a-5p ma kinux statistikament differenti bejn il-gruppi kollha f'dan l-istudju.

Biex titkejjel l-espressjoni tal-mRNA, kampjuni tal-kliewi ġew omoġenizzati bl-użu ta’ omoġenizzatur tal-ħġieġ u shredder tal-kolonna tal-filtru (kolonna tat-tqattigħ QIA; Qiagen). L-RNA ġie iżolat bl-użu ta’ kit ta’ iżolament tal-RNA totali RNeasy (Qiagen) u 1ug ta’ kull kampjun ta’ RNA ġie traskritt b’lura. bl-użu tas-sistema ta 'sinte-sis SuperscriptII First Strand (Teknoloġiji tal-Ħajja, MA, USA).qRT-PCR twettqet bl-użu ta' SYBR GreenER qPCR SuperMix (Teknoloġiji tal-Ħajja).Primers għal kollaġen tal-ġrieden Tip I Alpha 1 Chain, collagen Type IV Alpha 1 Chain kienu mixtrija minn Takara Bio (Shiga, il-Ġappun). L-espressjoni ta 'kull mRNA fil-mira kienet normalizzata għal dik ta' beta-actin bħala l-ġene ta 'referenza.

Fig 1.Mappa tas-sħana tal-miRNAs espressi b'mod differenzjali....(MicroRNAs)fil-kliewi tal-ġrieden AKITA. Il-mappa tas-sħana turi r-raggruppament ġerarkiku u l-varjazzjonijiet sistemiċi fl-espressjoni tal-miRNAs(MicroRNAs)fil-kliewi tal-ġrieden minn kull grupp (n=4 għal kull grupp). Il-miRNAs murija bl-aħmar wrew espressjoni għolja u dawk murija bl-aħdar wrew espressjoni relattivament baxxa. (Verżjoni bil-kulur tal-fifigure hija disponibbli online.)

Preparazzjoni tal-miRNA(MicroRNAs)-181b-5p jimitaw.miRNA(MicroRNAs)-181b-5p u RNA żgħir scrambled (kontroll-miRNA) ġew sintetizzati minn Ajinomoto Bio-Pharma Services (Osaka, il-Ġappun). Is-sekwenza tal-miRNA-181b{{5} }p mimika kienet 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG-GUU-3' u dik tal-kontroll-miRNA(MicroRNAs)kien 5'-GGUUCGUACGUACACUCUGUUCA-3'.

Kunsinna ta 'miRNA(MicroRNAs)-181b-5p-PEI-NPs għall-kliewi.Biex tinvestiga l-effetti tal-miRNA(MicroRNAs)-181b-5p jimita t-trattament, NPs lineari bbażati fuq PEI (in vivo jet PEI; Polyplus-transfection,llkirch-graffenstaden, Franza) intużaw, kif deskritt qabel.²⁷Fil-qosor, miRNA(MicroRNAs)-PEI-NPs （miRNA∶ 50ug, proporzjon ta 'nitroġenu （N） fil-polimeru għall-fosfat (P) fl-aċidi nuklejċi =6) ġew maħlula f'200μL ta' soluzzjoni ta 'glukożju 5 fil-mija u injettati fil-ġrieden db/db permezz vina tad-denb, skont il-protokoll tal-manifattur. Il-gruppi li ġejjin servew bħala kontrolli:(1)littermates normali (m/m),(2) ġrieden db/db mhux ittrattati, u (3)ġrieden db/db injettati b'miRNA ta' kontroll(MicroRNAs)-PEI-NPs bl-użu tal-istess protokoll. Biex jiġi vvalutat il-potenzjal terapewtiku ta' miRNA-181b-5p għal DKD(mard tal-kliewi dijabetiku), injettajna miRNA-181b-5p-PEI-NPs jew control-miRNA-PEI-NPs fi ġrieden 10-db/db ta' ġimgħa kull ġimgħa għal 10 ġimgħat.

Fig 2.Mappa tas-sħana tal-miRNAs espressi b'mod differenzjali....(MicroRNAs)fil-kliewi tal-ġrieden db/db. Il-mappa tas-sħana turi r-raggruppament ġerarkiku u l-varjazzjonijiet sistemiċi fl-espressjoni ta 'miRNAs fil-kliewi ta' kull grupp (n=4 għal kull grupp). Aħmar, espressjoni ogħla; blu, espressjoni aktar baxxa. (Verżjoni bil-kulur tal-fifigure hija disponibbli online.)

Istoloġija,Fluworexxenza, u Immunoistokimika.Wara d-dissezzjoni tal-kliewi, parti rappreżentattiva ta 'kull kilwa ġiet imwaħħla immedjatament f'4 fil-mija paraformaldehyde buffered bil-PBS u inkorporata fil-paraffin. It-taqsimiet (5 μm) intużaw għal immunostaining u tbajja perjodika ta 'aċidu Schiff (PAS). L-espansjoni tal-mesanġjali ġiet evalwata f'taqsimiet imtebbgħin bil-PAS billi kkalkola l-indiċi tal-mesanġjali (M) skont il-Protokoll tal-Mudell tal-Annimali tal-Komplikazzjonijiet tad-Dijabete (AMDCC): żona (numru ta 'pixels) ta' tbajja 'ta' PAS / żona totali (numru ta 'pixels) ta' il-glomeruli. L-MI ġie kkalkulat għal mill-inqas 20 glo-meruli għal kull grupp (3-4 glomeruli għal kull ġurdien u sitt ġrieden b'żewġ linji e għal kull grupp).(MicroRNAs);Takara Bio) intużaw biex jevalwaw id-distribuzzjoni renali ta 'miRNA injettat ġol-vini(MicroRNAs)-PEI-NPs, kif deskritt qabel.²⁷Fil-qosor, Cy3-miRNA(MicroRNAs)ġie kkumplessat b'PEI-NPs u injettat ġol-vini fi ġrieden db/db, imbagħad il-kliewi tneħħew siegħa wara. It-taqsimiet (5-μm ħxuna) ġew inkubati għal 2 sigħat f'temperatura tal-kamra b'Lotus tetragonolobus lectin ittikkettat bil-fluworexxeina (Vector Laboratories, CA, USA) u d-DAPI intuża bħala counterstain. Il-livell ta' fluworexxenza mbagħad ġie evalwat permezz ta' mikroskopija ta' fluworexxenza (BZ-X710; Keyence, Osaka, Ġappun) u BZ-X_Software analizzatur (Keyence). Għall-istudju immunokimiku, mAbs tal-ġrieden kontra kollaġen I (NB{{{{ 10}}, Novus Biologicals, CO, USA) u IV(NB120-6586, Novus Biologicals),u antikorp sekondarju poliklonali tal-mogħoż kontra HRP tal-ġrieden u tal-fniek (PI-1000, Vector Laboratories) . Il-kampjuni tat-tessuti ġew inkorporati f'Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Japan, Tokyo, Japan) u ffriżati f'nitroġenu likwidu. Sezzjonijiet tal-kriostat (5- μm ħxuna) ġew immuntati fuq slides tal-ħġieġ miksija bis-silan (Matsunami Glass Ind, Osaka, il-Ġappun).

Ibridizzazzjoni in situ.ISH għal miRNA(MicroRNAs)-125b-5p u miRNA-181b-5p twettqu bl-użu ta' sondi ta' Sejbien ta' miRCURY LNA ttikkettjati b'digoxigenin doppju (Qiagen). Sonda scrambled serviet bħala kontroll negattiv u U6 serva bħala kontroll pożittiv. Il-proċedura twettqet skond il-protokoll tal-manifattur.²⁸Fil-qosor, sezzjonijiet tal-kliewi tal-ġurdien inkorporati fil-paraffin (5-μm) ġew deparaffinizzati, maħsula f'PBS, u ttrattati bi proteinase K għal 10 minuti f'temperatura ta' 37 grad C. Il-pjastri mbagħad ġew inkubati b'sonda bit-tikketta LNA-digoxigenin (40 nM) f'kamra umda matul il-lejl fi gradi 60. Wara l-ħasil, is-sezzjonijiet ġew inkubati matul il-lejl b'antikorp antidigoxigenin konjugat ma' fosfatażi alkalina fi gradi 4. Imbagħad, il-pjastri ġew żviluppati bl-użu ta 'nitroblue tetrazolium chloride/5-brom{{9 Soluzzjoni tal-melħ }}chloro-3'-indolyphosphatase ptoluidine (Life Tech-nologies) matul il-lejl fid-dlam f'temperatura tal-kamra. Fotomikrografi imbagħad inkisbu taħt mikroskopju tad-dawl (BZ-X710; Keyence).

Tabella II.Lista ta' miRNAs(MicroRNAs)espress b'mod differenzjali fil-kliewi tal-ġrieden db/db permezz ta' analiżi ta' microarray

Approvazzjoni ta' studju.L-istudju sar skont il-prinċipji tad-Dikjarazzjoni ta' Ħelsinki u ġie approvat mill-Kumitat tal-Etika tal-Università Medika ta' Jichi (numru tal-approvazzjoni 17-023, 11 ta' Ottubru 2017). Inkiseb kunsens infurmat bil-miktub mill-parteċipanti kollha. L-esperimenti fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Università Medika ta 'Jichi u saru skont il-linji gwida dwar l-Użu u l-Kura tal-Annimali Sperimentali mill-Gwida tal-Università Medika ta' Jichi għall-Annimali tal-Laboratorju.

Statistika.Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta' softwer JMP (verżjoni 13.0.0; SAS Institute Inc, Cary, NC, USA). Ir-riżultati huma espressi bħala mezzi ± SDs. Il-mezzi tqabblu bl-użu ta 'analiżi one-way tal-varjanza, u jekk kien hemm differenzi statistikament sinifikanti, it-test ta' Tukey sar post hoc biex iqabbel il-mezzi ta 'żewġ gruppi differenti. Għal varjabbli kategoriċi, id-differenzi ġew analizzati bl-użu tat-test chi-square. Twettqet rigressjoni loġistika u ġew ikkalkulati AUCs.P<0.05 was="" considered="" to="" represent="" statistical="">

Agħfas HAWN GĦALL-PARTI Ⅱ & Ⅲ

Abbrevjazzjonijiet:BMI= indiċi tal-massa tal-ġisem; DAPI=4,6-diamidino-2-phenylindole; FITC= fluworexxeina isothiocyanate; DKD=mard tal-kliewi dijabetiku; eGFR= rata ta' fltrazzjoni glomerulari stmata;Lipoproteina ta' densità għolja HDL; HIGA= immunoglobulina A għolja; IRI= korriment ta' iskemija-riperfużjoni;LDL= lipoproteina ta' densità baxxa; ns= mhux sinifikanti; PEI-NPs= nanopartiċelli tal-polyethylenimine;RNU6=U6 Nukleari Żgħar 1; SAMP=maws aċċelerat bis-senescence; Kontroll SAMR=għall-maws aċċellerat mis-senescence; Proporzjon UACR= ta' albumina għall-krejatinina; UUO=ostruzzjoni ureteral unilaterali

cistanche plant

Nota: Il-ċistanche tal-ħaxix mediċinali tradizzjonali Ċiniża (magħrufa wkoll bħala l-"ħaxix tad-dragun" u "ġinseng tad-deżert"), tikber biss fid-deżerti niexfa u sħan. Bħala waħda mid-disa 'ħwawar immortali, Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) kontenut b'ingredjenti effettivi sinjuri bħal echinacoside, acteoside, glikosidi feniletanojdi totali, flavonoids, polysaccharides, eċċ. Dawn l-ingredjenti effettivi għamlu cistanche prezzjuż. ħaxix nutrittiv u materjal ta 'l-ikel għall-immunità tan-nies, organi interni, u ċelluli tal-moħħ u newroni, eċċ. L-istudji farmakoloġiċi moderni kkonfermaw l-effetti li ġejjin ta' cistanche (benefiċċji ta 'cistanche): itejbu l-immunità; ittejjeb il-funzjoni sesswali u l-funzjoni tal-kliewi; kontra l-għeja; kontra t-tixjiħ; ittejjeb il-memorja; kontra l-marda ta' Parkinson; marda ta' kontra l-Alzheimer; antiossidazzjoni; faċilità-stitikezza; anti-infjammatorji; jippromwovu t-tkabbir tal-għadam, jbajdu l-ġilda; jipproteġi l-fwied; eċċ.

x'inhu cistanche