L-Istatus Kurrenti tan-Newroprotezzjoni fil-Mard Konġenitali tal-Qalb Parti 3

3.2. Evalwazzjoni Semi-Kwantitattiva tad-DNA Mitokondrijali Ectopic

Stampi ta 'tbajja' Hsp60 (il-matriċi mitokondrijali) u tbajja 'histone-H2B (il-markatur nukleari) tnaqqsu minn immaġini ta' tbajja dsDNA. Imbagħad, bl-użu tal-funzjoni "AdjustThreshold" tas-softwer lmage] (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa), l-immaġini ġew binarizzati.

Il-mitokondrija huma l-fabbriki tal-enerġija fiċ-ċelloli, responsabbli mis-sintetizza tal-ATP biex jipprovdu l-enerġija meħtieġa miċ-ċelloli. Il-matriċi mitokondrijali hija l-likwidu intern tal-mitokondrija, li fiha varjetà ta 'enzimi u joni u hija sit ewlieni għal diversi reazzjonijiet bijokimiċi tal-mitokondrija. Il-memorja hija waħda mill-abbiltajiet konjittivi l-aktar importanti tal-bnedmin. Għalkemm it-tnejn jistgħu jidhru li mhumiex relatati, huma relatati mill-qrib.

Ir-riċerka turi interazzjoni bejn il-matriċi mitokondrijali u l-memorja. Enżimi u joni fil-matriċi mitokondrijali jistgħu jaffettwaw direttament l-eċitabbiltà tan-newroni billi jirregolaw il-metaboliżmu tal-enerġija u l-istatus tal-kanal tal-joni fiċ-ċelloli newronali, u b'hekk jaffettwaw il-memorja. Barra minn hekk, hemm varjetà ta 'molekuli ta' sinjalazzjoni fil-matriċi mitokondrijali, li jistgħu jiġu trasmessi lil newroni downstream permezz tal-axons u s-sinapsi tan-newroni, li jaffettwaw l-effiċjenza tat-trasduzzjoni tas-sinjal tan-newroni, u b'hekk jaffettwaw il-formazzjoni u l-konsolidazzjoni tal-memorja.

Fl-istess ħin, l-attività tal-memorja taffettwa wkoll direttament l-istat tal-matriċi mitokondrijali. L-attivitajiet tal-memorja se jżidu l-konsum tal-enerġija tan-newroni u jippromwovu r-reazzjoni redox fil-matriċi mitokondrijali, u b'hekk jaffettwaw il-livell metaboliku tal-mitokondrija u l-bilanċ tal-joni intraċellulari, u jaffettwaw aktar l-eċitabbiltà u l-effiċjenza tat-trasduzzjoni tas-sinjal tan-newroni.

Għalhekk, iż-żamma ta 'saħħa mitokondrijali tajba hija kruċjali biex tinżamm funzjoni tajba tal-memorja. Billi żżomm drawwiet ta 'għajxien tajbin, bħal dieta regolari, eżerċizzju moderat, irqad adegwat, eċċ., Tista' tgħin biex iżżomm is-saħħa tal-matriċi mitokondrijali. Barra minn hekk, il-funzjoni tal-memorja tista 'tittejjeb ukoll permezz ta' intervent farmaċewtiku xieraq biex tippromwovi reazzjonijiet bijokimiċi u sinjalazzjoni fi ħdan il-matriċi mitokondrijali.

Fil-ħajja ta 'kuljum, nistgħu neżerċitaw il-memorja f'ħafna modi, bħall-qari, l-istudju, il-ħsieb, il-logħob, eċċ. Fl-istess ħin, għandna nagħtu attenzjoni wkoll biex inżommu saħħa tajba biex inżommu aħjar is-saħħa tal-matriċi mitokondrijali. Nemmen li permezz ta’ dawn l-isforzi, żgur li se jkollna memorja aħjar u nkampaw aħjar ma’ diversi sfidi fil-ħajja u fix-xogħol. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn intejbu l-memorja, u Cistanche deserticola jista' jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja, minħabba li Cistanche deserticola jista 'wkoll jirregola l-bilanċ ta' newrotrasmettituri, bħal żieda fil-livelli ta 'acetylcholine u fatturi ta' tkabbir. Dawn is-sustanzi huma importanti ħafna għall-memorja u t-tagħlim. Barra minn hekk, Cistanche deserticola jista 'wkoll itejjeb il-fluss tad-demm u jippromwovi l-kunsinna ta' ossiġnu, li jista 'jiżgura li l-moħħ jirċievi biżżejjed nutrijenti u enerġija, u b'hekk itejjeb il-vitalità u r-reżistenza tal-moħħ.

Ikklikkja taf supplimenti biex tingħata spinta lill-memorja

Aħna għażilna dsDNA puncta li jvarjaw fid-daqs minn 2 sa 20 um' (ċirkolarizza 0.1-1.0)bl-użu tal-funzjoni "Analizza-Analizza Partiċelli". jekk meħtieġ, l-immaġini oriġinali ġew eżaminati għall-għadd finali. Jekk is-sinjal tal-histone H2B kien żgħir. imbagħad l-immaġini mnaqqsa wrew strutturi bħal donut.

Dawn jirrappreżentaw dsDNA cytosolic ta 'oriġini nukleari u għandhom jiġu eliminati mill-kwantità ta' dsDNA cytosolic ta 'oriġini mitokondrijali. Il-firxa tad-daqs tista 'tiġi modifikata skont it-tip ta' ċellula jew l-oriġini tal-kampjuni istoloġiċi. Figura lE turi eżempju ta 'l-għadd ta' DNA mitokondrijali ektopiku

tikek bl-użu 1B D.

Alternattivament, immaġini ta 'tbajja' Hsp60 tnaqqsu minn immaġini ta' tbajja 'dsDNA. Imbagħad, in-numru ta 'dsDNA puncta ingħadd bl-użu tal-funzjonijiet "Aġġusta-Threshold "Analizza-Analizza Partiċelli". Sussegwentement, dsDNA puncta mingħajr is-sinjal histone-H2B ġew magħduda b'osservazzjoni diretta. L-aħħar metodu huwa adattat meta l-immaġini histone-H2B juru proporzjon baxx tas-sinjal għall-ħoss.

B'kollox, dan il-metodu jista 'juri b'mod ċar DNA mitokondrijali ektopiku li joħroġ fiċ-ċitoplasma u jippermetti evalwazzjoni oġġettiva u statistika ta' tali DNA mitokondrijali ektopiku fiċ-ċelloli.

4. Diskussjoni

Fl-istudju tagħna, żviluppajna metodu li jippermetti l-għadd tad-DNA mitokondrijali ċitoplasmika. L-iskoperta ta 'DNA mitokondrijali ċitoplasmika ġiet irrappurtata bl-użu ta' tekniki ta 'immunofluworexxenza, iżda l-metodi ma kinux kwantitattivi għall-evalwazzjoni tad-DNA mitokondrijali ċitoplasmika fil-biċċa l-kbira tal-każijiet [15,25]. Fi studju ieħor, twettqet qtar PCR biex jikkwantifika d-DNA mitokondrijali li jiċċirkola [9].

reċentement, Sato et al. [26,27] ippubblika protokoll eċċellenti biex jevalwa d-DNA ċitoplasmika permezz ta 'mikroskopija immunofluworexxenti bl-użu ta' antikorpi Lamin B1 (LMNB1) bħala markatur ta 'struttura nukleari u subunità ta' ċitokromu c oxidase 4 (COX4) bħala markatur ta 'struttura mitokondrijali. Dan il-protokoll jidher utli ħafna biex jikkwantifika dsDNA ċitoplasmika ta 'oriġini nukleari.

Madankollu, meta ppruvajna COX4 jew markaturi oħra tal-membrana mitokondrijali, inklużi kemm markaturi ta 'ġewwa kif ukoll ta' barra, kien diffiċli ħafna li tiddiskrimina b'mod preċiż iċ-ċitoplasma mill-mitokondrija.

Pereżempju, jekk osservajna sinjali ċirkolari bl-użu ta 'markatur tal-membrana mitokondrijali u osservajna sinjali dsDNA fi ħdan, allura dan id-dsDNA jista' jirrappreżenta jew mitokondrialDNA ġewwa l-mitokondrija ċirkolari (normali) jew DNA mitokondrijali ċitoplasmika barra l-mitokondrija bħal donut (ektopiku). Aħna għalhekk użajna Hsp60 bħala markatur li tikkettja l-matriċi themitokondrijali biex nevalwaw id-DNA mitokondrijali ektopika fiċ-ċitoplasma.

Kif deskritt f'reviżjoni reċenti [23], hemm ħafna tipi differenti ta 'cytoplasmicdsDNA ta' oriġini nukleari, u ħafna minnhom huma pożittivi għall-markaturi tal-histone. Minħabba l-limitazzjoni tal-kombinazzjoni ta 'antikorpi użati għal tbajja tripla, użajna histone H2Bas markatur ta' histone.

Madankollu, jekk din il-limitazzjoni tiġi solvuta, H2AX jista 'jkun markatur aħjar għal dsDNA ċitoplasmika ta' oriġini nukleari. Id-dsDNA ċitoplasmiku negattiv tal-histone-H2B rari kien osservat fiċ-ċelloli HeLa ta 'kontroll użati f'dan l-istudju, iżda tali dsDNA ta' oriġini nukleari jistgħu jkunu preżenti jekk jintużaw linji jew kundizzjonijiet taċ-ċelluli oħra.

L-ibridizzazzjoni in situ tad-DNA mitokondrijali użata fid-dokument reċenti tagħna hija adattata għall-evalwazzjoni kwalitattiva, iżda jista 'jkun diffiċli li tuża l-ibridizzazzjoni in situ għal evalwazzjoni kwantitattiva [8].

L-ibridizzazzjoni in situ tesponi l-kampjun għal temperaturi għoljin, li jistgħu jirriżultaw f'deformazzjoni jew ħsejjes ta 'xi partijiet tal-kampjun. Min-naħa l-oħra, il-metodu immunoċitokimiku ppreżentat f'dan id-dokument jista 'jikseb sinjali b'ħoss fl-isfond baxx. Fil-karta riċenti tagħna, fiċ-ċelloli umani u żebrafish użati bħala mudelli tal-marda ta' Parkinson, aħna wrejna li d-DNA mitokondrijali kien nixxew fiċ-ċitoplasma, li hija tossika għall- ċelloli. Aħna osservajna wkoll li l-kwantità ta 'DNA mitokondrijali ċitosoliku żdiedet fit-tessuti tal-moħħ post-mortem ta' pazjenti bil-marda ta 'Parkinson [8].

Dawn il-linji ta' evidenza jissuġġerixxu li kwantità akbar ta' DNA mitokondrijali ektopiku li ħareġ mill-mitokondrija jista' jinduċi infjammazzjoni akuta u kronika li tirriżulta f'diversi mard, inkluż il-marda ta' Parkinson u insuffiċjenza tal-qalb; għalhekk, ir-regolazzjoni 'l fuq tad-degradazzjoni cytosolic-DNA jew l-inibizzjoni tas-sensuri tagħha jistgħu jkunu skop terapewtiku potenzjali għal dan il-mard [8,28].

Il-metodu introdott f'dan id-dokument għall-evalwazzjoni kwantitattiva tad-DNA mitokondrijali ektopika jservi bħala għodda importanti għal aktar riċerka f'dan il-qasam.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: HM u MTH ifformulaw l-ipoteżijiet, iddisinjaw il-maġġoranza tal-esperimenti, wettqu l-esperimenti, analizzaw id-dejta u kitbu l-manuskritt. NMwettaq l-esperimenti relatati maċ-ċelloli kkultivati. L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.

Finanzjament: Dan ix-xogħol kien appoġġjat minn għotjiet minn AMED (numri ta’ għotja JP21gm6110028 u JP19dm0107154 (HM)), il-Fondazzjoni tax-Xjenza ta’ Takeda (HM), JSPS KAKENHI (numri ta’ għotja JP14516799 (HM), JP 16690799 (HM), JP 16690735 (HM) u JP 16690735 (HM) ), JST (Moonshot R&D; numru tal-għotjaJPMJMS2024 (HM)), u Għotjiet fl-Għajnuna minn TBRF (numru tal-għotja TBRF-RF 21-135 (HM)).

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data: Id-dejta u l-għodod deskritti f'dan il-manuskritt huma disponibbli fuq talba.

Rikonoxximenti: Aħna nirrikonoxxu lil Shinano Kobayashi talli pparteċipa f'diskussjonijiet utli u pprovda appoġġ kontinwu. Aħna nirrikonoxxu lill-Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) talli pprovdiet fellowship postdottorat TBRF għal riċerkaturi barranin lil MH (TBRF-RF 21-135).

Kunflitti ta' Interess: L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.

Referenzi

1. Li, XD; Wu, J.; Gao, D.; Wang, H.; Sun, L.; Chen, ZJ Rwoli pivotali tas-sinjalar cGAS-cGAMP fid-difiża antivirali u l-effetti immuneadjuvanti. Xjenza 2013, 341, 1390–1394. [CrossRef] [PubMed]

2. Ansari, MA; Dutta, S.; Veettil, MV; Dutta, D.; Iqbal, J.; Kumar, B.; Roy, A.; Chikoti, L.; Singh, VV; Chandran, B. Ir-rikonoxximent tal-herpesvirusgenome indotta aċetilazzjoni ta 'IFI16 nukleari hija essenzjali għat-traslokazzjoni ċitoplasmika tagħha, inflammasome u risponsi IFN. PLoS Pathog. 2015, 11, e1005019. [CrossRef] [PubMed]

3. Orzalli, MH; Broekema, NM; Diner, BA; Hancks, DC; Elde, NC; Cristea, IM; Knipe, stabilizationof IFI16 medjat minn DM cGAS jippromwovi sinjalazzjoni intrinsika waqt infezzjoni tal-virus herpes simplex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2015, 112, E1773–E1781.[CrossRef] [PubMed]

4. Woodward, JJ; Iavarone, AT; Portnoy, DA c-di-AMP imnixxi minn Listeria monocytogenes intraċellulari jattiva rispons Iinterferon tat-tip ospitanti. Xjenza 2010, 328, 1703–1705. [CrossRef] [PubMed]

5. Dou, Z.; Ghosh, K.; Vizioli, MG; Zhu, J.; Sen, P.; Wangensteen, KJ; Simithy, J.; Lan, Y.; Lin, Y.; Zhou, Z.; et al. Cytoplasmicchromatin iqajjem infjammazzjoni fis-senescence u l-kanċer. Natura 2017, 550, 402–406. [CrossRef]

6. Takahashi, A.; Loo, T.; Okada, R.; Kamachi, F.; Watanabe, Y.; Wakita, M.; Watanabe, S.; Kawamoto, S.; Miyata, K.; Barbier, GN; et al.Downregulation ta 'DNases ċitoplasmiċi hija implikata fl-akkumulazzjoni tad-DNA ċitoplasmika u SASP f'ċelloli senescent. Nat.Commun. 2018, 9, 1249. [CrossRef]

7. McArthur, K.; Whitehead, LW; Huddleston, JM; Li, L.; Padman, BS; Oorschot, V.; Geoghegan, ND; Chappaz, S.; Davidson, S.;Chin, HS; et al. Il-makropori BAK/BAX jiffaċilitaw il-ħernja mitokondrijali u l-effluss tal-mtDNA waqt l-apoptożi. Xjenza 2018,359, eaao6047. [CrossRef]

8. Matsui, H.; Ito, J.; Matsui, N.; Uechi, T.; Onodera, O.; Kakita, A. Cytosolic dsDNA ta 'oriġini mitokondrijali jinduċi ċitotossiċità u newrodeġenerazzjoni f'mudelli ċellulari u zebrafish tal-marda ta' Parkinson. Nat. Komun. 2021, 12, 3101. [CrossRef]

9. Sliter, DA; Martinez, J.; Hao, L.; Chen, X.; Sun, N.; Tara, D.; Fischer, TD; Burman, JL; Li, Y.; Zhang, Z.; et al. Parkin u PINK1 itaffu l-infjammazzjoni kkaġunata minn STING. Natura 2018, 561, 258–262. [CrossRef]

10. Hou, Y.; Wei, Y.; Lautrup, S.; Yang, B.; Wang, Y.; Cordonnier, S.; Mattson, MP; Croteau, DL; Is-supplimentazzjoni ta 'Bohr, VA NAD(+) tnaqqas in-newroinfjammazzjoni u s-senescence taċ-ċelluli f'mudell ta' ġrieden transġeniċi tal-marda ta 'Alzheimer permezz ta' cGAS-STING. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 2021, 118, e2011226118.

For more information:1950477648nn@gmail.com