Il-Kostruzzjoni Ta' Vaċċin Rikombinanti Lactobacillus Casei Tal-PEDV U r-Risposti Immuni tiegħu fil-ġrieden
Sep 06, 2023
Astratt
Sfond: Id-dijarea epidemika tal-ħnieżer (PED) hija marda intestinali li tittieħed ikkawżata mill-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer (PEDV) ikkaratterizzata minn rimettar, dijarea, anoreksja u deidrazzjoni, li kkawżaw telf ekonomiku kbir madwar id-dinja. Fil-preżent, l-immunità tal-vaċċin għadha l-aktar metodu effettiv biex tikkontrolla t-tixrid tal-PEDs. F'dan l-istudju, bnejna razza ġdida ta' L. casei-OMP16-PEDVS rikombinanti li tesprimi l-proteina PEDVS ta' PEDV u proteina OMP16 tar-razza Brucella abortus. Biex tkun taf l-immunoġeniċità tal-vaċċin rikombinanti L. casei-OMP16-PEDVS kandidat, tqabbel ma' BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS, u proteina rikombinanti BL21-PEDVS.
Riżultati: Ir-riżultati wrew li nistgħu niskopru livelli ogħla ta' IgG, antikorp newtralizzanti, IL-4, IL-10, u INF- fis-serum u IgA fil-ħmieġ ta' L. casei-OMP16- Ġrieden immunizzati PEDVS, li indika li l-vaċċin kandidat L. casei-OMP16-PEDVS jista 'jikkaġuna livelli ogħla ta' immunità umorali, immunità ċellulari, u immunità mukuża.
Konklużjoni: Għalhekk, L. casei-OMP16-PEDVS huwa vaċċin kandidat promettenti għall-profilassi tal-infezzjoni PEDV.
Kliem ewlieni: PEDV, vaċċin kontra Lactobacillus casei, proteina PEDV S, OMP16, Reazzjonijiet immuni
benefiċċji cistanche għall-irġiel isaħħu s-sistema immuni
Introduzzjoni
Dijarea epidemika tal-ħnieżer (PED) hija kkawżata mill-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer (PEDV) b'sintomi li jinkludu dijarea, rimettar, anoressija, deidrazzjoni, u telf ta 'piż fil-qżieqeż [1, 2]. Ħnieżer ta 'kull età jistgħu jiġu infettati b'sintomi differenti u r-rata ta' mortalità fil-ħnienes hija sa 100% [3], li wassal għal telf ekonomiku kbir madwar id-dinja kollha. Biex tikkontrolla t-tixrid tal-PEDV, il-biċċa l-kbira tat-tipi ta 'vaċċini huma mibnija, bħal vaċċin inattivat adjuvanted bl-idrossidu tal-aluminju, Virus ta' Gastroenterite Trasmissibbli bivalenti inattiv ivvutat (TGEV), u vaċċin PEDV, u vaċċin PEDV attenwat [4]. Għalkemm dawn il-vaċċini għandhom rwol importanti fil-kontroll tal-PEDs, kollha għandhom id-difetti tagħhom. Vaċċini inattivati ma jistgħux jattivaw risponsi immuni ċellulari, vaċċin attenwat mhuwiex sikur ħafna, u ma jistgħux jinduċu produzzjoni suffiċjenti ta 'antikorpi IgA speċifiċi għall-virus ta' risponsi immuni mukosali. Għalhekk, huwa meħtieġ u urġenti li jiġi żviluppat vaċċin ġdid biex jikkontrolla l-PEDs.
Lactobacillus casei ħafna drabi jitqies bħala tip ta' sistema ta' vettur sigura għal twassil immirat ta' antiġeni fl-immunizzazzjoni orali, b'effetti ta' benefiċċju fuq is-saħħa tal-bnedmin u l-annimali [5]. Sadanittant, jista 'jintuża bħala sistema ta' kunsinna biex tirregola r-rispons taċ-ċelluli T-helper u tistimula s-sekrezzjoni ta 'IgAs speċifiċi għall-immunità mukosali [6]. Min-naħa l-oħra, il-vaċċin rikombinanti Lactobacillus casei huwa aktar faċli biex jingħata, inqas ċans ta 'reazzjoni ta' sensittività eċċessiva, u huwa aktar kosteffettiv meta mqabbel ma 'vaċċini tradizzjonali. Ibbażat fuq ir-rapporti, vaċċini rikombinanti Lactobacillus casei intużaw b'suċċess fil-prevenzjoni u l-kontroll tal-papillomavirus uman, Streptococcus pneumonia, u Escherichia coli [7-9]. Hemm ukoll xi tentattivi simili biex jitfasslu vaċċini PED. Ir-riċerkaturi sabu li razza Lactococcus lactis rikombinanti li tesprimi ġene varjant tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer S1 jista' jinduċi livelli għoljin ta' IL-4 u IFN- fil-ġrieden immunizzati [10]. Vaċċin kontra l-PEDV ibbażat fuq Lactobacillus casei li jesprimi l-peptide Co1 li jindirizza ċ-ċelluli microfold magħqud mal-antiġen COE tal-PEDV jista’ wkoll jinduċi rispons immuni effettiv [11]. Biex tittejjeb l-effettività tal-vaċċin PEDV. F'dan l-istudju, aħna nibnu vaċċin rikombinanti ġdid ta 'Lactobacillus casei ta' PED, li jista 'jistimula risponsi immuni mukosali, umorali u ċellulari aktar b'saħħithom kontra l-infezzjoni PEDV permezz ta' amministrazzjoni orali. PEDV, membru tal-familja coronaviridae, jikkonsisti f'erba' proteini strutturali li fihom il-proteina glycosylated spike (S) ta' 150–220 kDa, il-proteina tal-membrana (M) ta' 20–30 kDa, il-proteina tal-envelope (E) ta' 7 kDa, 58 kDa proteina nukleokapsid (N) [12]. Hemmhekk, il-proteina S tista' tinqasam f'dominji S1 (1–735 amino acid) u S2 (736-l-aħħar amino acid) [13], u l-proteina S1 tinkludi r-reġjun li jgħaqqad ir-riċettur u l-epitopi prinċipali newtralizzanti [ 14]. L-adjuvant tat-tilqim jaġixxi bħala immunomodulatur u jista' jinduċi u jsaħħaħ ir-risponsi immuni kontra antiġeni ko-konsenjati. Il-proteina OMP16 tar-razza Brucella abortus ġiet ivverifikata biex tattiva ċelluli dendritiċi in vivo, tinduċi rispons immuni th1, u kienet vaċċin awto-adjuvant promettenti [15-17]. Għalhekk, il-proteina OMP16 ġiet imdaħħla fil-vaċċin rikombinanti tal-każ Lacto bacillus fl-istudju tagħna. S'issa, ftit studji dwar il-vaċċin rikombinanti Lactobacillus casei ta' PEDV ġew irrappurtati. Għalhekk, dan l-istudju għandu l-għan li jibni vaċċin orali kandidat ġdid għal Lactobacillus casei, li jista 'jipprovdi immunità umorali aħjar, immunità ċellulari, u immunità mukuża biex jipprevjeni t-tixrid tal-PED.
Ċiniż herb cistanche plant-Antitumor
materjali u metodi
Razez batterjali, viruses, kundizzjonijiet tal-kultura, plasmidi, u primers
Trab Cistanche
Ir-razez batterjali, plasmidi u primers użati f'dan l-istudju huma elenkati fit-Tabella 1. Ir-razza ta 'referenza standard ta' Lactobacillus casei ATCC 393 ġiet ikkultivata f'brodu de Man Rogosa u Sharpe (MRS) f'37 grad [18]. Il-BL21 (DE3) u DH5 ġew ikkultivati f'mezz Luria-Bertani (LB) f'37 grad [19]. Ir-razez rikombinanti Lactobacil lus casei, BL21 (DE3), u DH5 ġew ikkultivati fil-medium korrispondenti b'antibijotiċi xierqa, rispettivament. Brucella abortus tkabbar f'Tryptic Soy Broth (TSB) jew medju Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) f'37 grad. Iċ-ċelloli Vero infettati b'razez PEDV ġew ikkultivati f'DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) supplimentati b'10 ug/mL trypsin (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. Il-plażmidi pVE5523 u pET28a (+) kienu vettori ta' espressjoni ta' Lactobacillus casei u Escherichia coli, rispettivament.
Tabella 1 Karatteristiċi ta 'razez batterjali, plasmidi, u primers użati f'dan l-istudju
Il-kostruzzjoni ta 'razez rikombinanti Lactobacillus casei u BL21
Il-plażmidi tal-espressjoni rikombinanti nbnew ibbażati fuq il-plażmidi u l-primers fit-Tabella 1. Għall-ewwel, is-sekwenza parzjali tal-ġene PEDV S (493–708 amino acid), is-sekwenza parzjali tal-ġene PEDV S (493–708 amino acid), u s-sekwenza parzjali tal-ġene Brucella abortus OMP16 (26-168 aċidu amminiku) ġew amplifikati bl-użu ta 'pari primer PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2, u OMP16-F/R, rispettivament. Sussegwentement, il-metodu ta 'estensjoni ta' sovrapożizzjoni intuża fil-frammenti OMP16 u PEDVS biex jinbena framment ġdid OMP16-PEDVS b'linker polypeptide (GGGGGSGGGGGGGGGS) imwaħħal fin-nofs. Imbagħad, il-frammenti PEDVS ġew imdaħħla fil-plasmid pET28a b'enzimi ta' restrizzjoni EcoRI/XbaI biex jiġġeneraw plasmid rikombinanti pET28a-PEDVS, u l-frammenti ġodda OMP16-PEDVS ġew imdaħħla fil-plasmidi pET28a u pVE5523 b'EcoRI/XbaI u SalI/Eco enżimi ta' restrizzjoni biex jiġġeneraw plasmid rikombinanti pET28a-OMP16-PEDVS u pVE5523-OMP16-PEDVS, rispettivament. Il-plażmidi rikombinanti (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS, u pVE5523-OMP{16-PEDVS) ġew trasformati f'BL21 (DE3) jew Lactobacillus casei ATCC393 permezz ta' trasformazzjoni jew elettroporazzjoni bbażata fuq il-karta rrappurtata [21].
Analiżi ta 'espressjoni ta' proteina minn Western blot
L-espressjoni tal-proteini tar-razez BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS, u L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS kienu misjuba abbażi tal-metodu rrappurtat b'xi modifika [21-23]. Ir-razez rikombinanti BL21-pET28a-PEDVS u BL21-pET28a OMP16-PEDVS ġew ikkultivati f'brodu LB u IPTG intuża għall-ħsad għal pET28a-PEDVS u pET28a-OMP{{22} } Proteini PEDVS. Il-vettur vojt intuża bħala kontroll negattiv. Wara l-liżi taċ-ċelluli u ċ-ċentrifugazzjoni, inġabru s-supernatant u s-sediment. Imbagħad, il-proteini fil-mira ġew ippurifikati bl-użu tal-kolonna tal-kromatografija tal-affinità tan-nikil ibbażata fuq l-istudju preċedenti [24]. Sadanittant, is-supernatant kulturali tar-razza rikombinanti ta 'L. casei pVE5523-OMP{16-PEDVS inħasad ukoll permezz ta' ċentrifugazzjoni f'9000 × g għal 10 min f'4 gradi. Wara dan, il-kampjuni bil-buffer tat-tagħbija tas-sodium dodecyl sulfate (SDS) ġew mgħollija 10 minuti. Il-proteini ġew separati minn 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electro-phoresis (SDS-PAGE) u mbagħad trasferiti f'membrani PVDF (Millipore, Mississauga, ON, Kanada). Mem branes ġew imblukkati b'5% ħalib xkumat għal sagħtejn f'37 grad u mbagħad inkubati b'anti-korp monoklonali murina ta 'proteina S matul il-lejl f'4 gradi u mogħoż konjugat HRP kontra l-ġurdien IgG (ABclonal, Wuhan, Ċina) għal 2 sigħat f' 37 grad. Il-meded tal-proteini ġew viżwalizzati bl-użu ta 'Clarity™ Western ECL Blotting Substrate (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Tilqim u ġbir ta' kampjuni
L-immunoġeniċità tal-vaċċin rikombinanti Lactobacillus casei ġiet evalwata bl-użu ta 'ġrieden BALB/c femminili ta' sitt ġimgħat mingħajr patoġeni speċifiċi (SPF) [10, 18], li nxtraw miċ-ċentru tal-annimali tal-Università Agrikola ta 'Shandong. Total ta' 50 ġrieden ġew maqsuma b'mod każwali f'5 gruppi b'10 ġrieden f'kull grupp. Il-ġrieden ġew immuni b'vaċċin rikombinanti ta' Lactobacillus casei u proteina purifikata (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freund's complete's adjuvant), rispettivament. Il-protokoll ta' tilqim twettaq ibbażat fuq Tabella 2 u ngħatat immunizzazzjoni booster wara 13-il jum. Għall-istudju seroloġiku, is-serum inġabar f'0, 14, u 28 jum wara l-immunizzazzjoni (dpi) permezz ta' ippanċjar fil-vini tad-denb u maħżun f'-20 grad sakemm jintuża. L-ippurgar inġabar ġurnata qabel it-tilqim u kull ħin ta' spinta. Għall-iskoperta ta 'IgA, il-ħmieġ ġew dilwiti (w/v) b'0.05 M sodium EDTA fi proporzjonijiet ta' 1:4 eżatt wara l-ġbir u inkubati għal 14-il siegħa f'4 gradi wara taħlit xieraq. Is-supernatant inġabar b'ċentrifugazzjoni ta' 12,000xg u ppreservat f'-20 grad sakemm jintuża. Fi 28 dpi; tliet ġrieden minn kull grupp ġew sagrifikati u l-imsaren ġiet ipproċessata għall-iskoperta ta 'IgA skond l-awtur deskritt qabel [10, 18, 23].
Analiżi ta' determinazzjoni ta' livelli ta' antikorpi
Il-livelli ta 'IgG fis-serum u IgA fil-ħmieġ tkejlu bil-metodi ELISA b'xi modifiki [18, 23]. Il-metodi kienu kif ġej: Pjanċi tal-mikrotiter tal-polistirene ġew miksija matul il-lejl f'4 gradi b'100 μL 10 ug/mL proteina PEDVS, proteina OMP16-PEDVS, jew 100 μL razza L. casei-OMP16-PEDVS rikombinanti . Wara l-imblukkar b'5% ħalib xkumat, il-kampjuni miġbura ġew dilwiti serjament f'PBS, miżjuda fi tliet kopji, u inkubati f'37 grad għal siegħa. Imbagħad, antikorp IgG jew IgA tal-mogħoż konjugat bl-HRP (Invi trogen, USA) ġie miżjud ma 'kull bir (1:5000) u inkubat għal siegħa f'37 grad. Il-pjanċi tal-mikrotiter tal-polistirene ġew maħsula 5 darbiet matul kull pass. Fl-aħħar, 100 μL ta 'substrat TMB (tetramethylbenzidine u H2O2) ġew miżjuda ma' kull bir u 50 μL ta 'soluzzjoni ta' waqfien ġew miżjuda wara 10 minuti. Il-valuri OD f'630 nm ġew imkejla permezz ta 'qarrej tal-pjanċa multimode (EnVision).
Assaġġ tan-newtralizzazzjoni tal-virus
It-titri tal-antikorpi newtralizzanti tal-PEDV fis-serum ġew eżaminati skont il-metodi b'xi modifiki [25, 26]. Fil-qosor, is-serum murina kien inattivat bis-sħana (56 grad għal 30 min) u mbagħad serjali darbtejn dilwit fi pjanċi 96 bir (Corning, USA) bi triplikati ta 'kull kampjun. Imbagħad, volum ugwali ta '200 TCID50 / 50 μL razez PEDV ġew miżjuda ma' pjanċi ta '96 bir u inkubati għal siegħa f'37 grad. It-taħlita ġiet miżjuda ma 'pjanċi ġodda ta' 96 bir miksija b'monosaffi taċ-ċelluli Vero u inkubata għal siegħa f'37 grad. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula u inkubati fil-mezz ta 'manutenzjoni f'37 grad f'5% CO2. Wara jumejn, l-effett ċitopatiku (CPE) ġie osservat bl-użu ta 'mikroskopju invertit, u l-konċentrazzjoni tad-daqs newtrali ġiet definita bħala l-inqas konċentrazzjoni ta' antikorpi fis-serum.
Tabella 2 Il-protokoll immuni tal-ġrieden BALB/c
Sejbien taċ-ċitokini
Biex tiskopri s-sekrezzjoni taċ-ċitokini, inkisbu supernatanti mill-ġrieden tal-laboratorju (0, 14, u 28 jum). Il-livelli ta' IL-4, IL-10, u IFN- mnixxiet ġew determinati bl-użu ta' kits ELISA kummerċjali (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) skont ir-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur, rispettivament. Cytokine ġie kkwantifikat mill-kurvi standard differenti ppreparati minn reaġenti standard ipprovduti mill-kits rispettivament u l-valur tad-densità ottika (OD) ġie skopert f'450 nm minn kull pjanċa bl-użu ta 'qarrej tal-pjanċa multimode (EnVision) [23, 27].
Analiżi statistika
Id-dejta kollha nkisbet minn mill-inqas tliet esperimenti indipendenti, u r-riżultati ġew ippreżentati bħala l-medja ± devjazzjoni standard (SD). L-analiżi statistika twettqet bl-użu ta' żewġ denbu t-testijiet u analiżi one-way fi Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., USA). Id-differenza sinifikanti kienet definita bħala ∗ p < 0.05, u l-gradi varji ta 'differenza sinifikanti ġew indikati bħala ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ u p < 0.001, rispettivament.
Riżultati
Il-verifika ta' razez rikombinanti ta' Lactobacillus casei u BL21
Biex tivverifika l-plażmidi rikombinanti mibnija, il-plażmidi ta' espressjoni rikombinanti pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS, u pVE5523-OMP{16-PEDVS ġew diġeriti bl-użu ta' enzimi ta' restrizzjoni NcoI/XhoI, u l- Ir-riżultati tad-diġestjoni tal-enżimi ġew murija fil-Fig. 1. Id-daqsijiet tal-meded fil-mira fl-elettroforetogrammi kienu l-istess bħar-riżultati mistennija u r-riżultati tas-sekwenzjar indikaw li l-plasmidi tal-espressjoni rikombinanti ma juru l-ebda mutazzjoni. Dawn ir-riżultati indikaw il-kostruzzjoni b'suċċess ta' plasmidi rikombinanti pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, u pVE5523-OMP16-PEDVS. Ir-riżultati tal-western blot wrew li l-proteini rikombinanti pET28a-OMP16-PEDVS u pET28a-PEDVS kienu espressi fis-supernatant ta' BL21-pET28a OMP16-PEDVS u BL21- razez pET28a-PEDVS, rispettivament. Il-proteina pVE5523-OMP{16-PEDVS ġiet ivverifikata wkoll fis-supernatant kulturali tar-razza L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. Il-meded speċifiċi minn Fig. 2 wrew li l-proteini rikombinanti pET28a-OMP16- PEDVS, pVE{5523-OMP{16-PEDVS, u pET28a-PEDVS kienu kollha maħsuda b'suċċess (Fig. 2).
Fig. 1 Ir-riżultati tad-diġestjoni tal-enżimi ta' plasmidi rikombinanti. A: Ir-riżultati tad-diġestjoni tal-enżimi tal-plażmidu pVE5523-OMP16-PEDVS. M: Marker tas-sellum tad-DNA D8000; 1: Plasmid pVE5523-OMP16-PEDVS. B: Ir-riżultati tad-diġestjoni tal-enżimi tal-plasmid pet28a-OMP16-PEDVS u pET28a-PEDVS. M: Marker tas-sellum tad-DNA D8000; 1: pet28a-OMP16-PEDVS plasmid; 2: Plasmid pET28a-PEDVS
Il-livelli tal-antikorpi IgG fis-serum tal-ġrieden immunizzati b'vaċċini kandidati
Biex tiġi evalwata l-immunoġeniċità speċifika tal-kandidati tal-vaċċin iġġenerat, il-ġrieden BALB/c ġew magħżula u maqsuma f'5 gruppi. Imbagħad, il-livelli ta 'IgG fis-serum u IgA fil-ħmieġ ġew imkejla b'kits ELISA kummerċjali. Ir-riżultati wrew li ma kien hemm l-ebda differenzi sostanzjali fil-livelli ta 'IgG fost il-gruppi mlaqqma u kważi l-ebda antikorp IgG ma nstab fil-ġrieden kollha qabel l-immunizzazzjoni. Madankollu, sussegwentement instabu differenzi sostanzjali wara l-ewwel tilqim u l-livelli ta’ antikorpi IgG fis-serum fi 28 jum kienu ogħla minn dawk f’14-il jum. Fost ġrieden ta' 5 gruppi, il-ġrieden immunizzati b'L. casei-OMP16- PEDVS u BL21-OMP16-PEDVS-F wrew immunoġeniċità simili u l-ogħla. Għalhekk, L. casei-OMP16- PEDVS u BL21-OMP{16-PEDVS-F jistgħu jipproduċu l-ogħla immunoġeniċità, segwiti minn BL{21-OMP{16- PEDVS u BL21-PEDVS (Fig. 3).
cistanche suppliment benefiċċji-żieda l-immunità
Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity
【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Il-livelli tal-antikorpi IgA fil-ħmieġ tal-ġrieden immunizzati b'vaċċini kandidati
Biex tiġi evalwata l-immunoġeniċità speċifika tal-kandidati ġenerati tal-vaċċin, ġew evalwati wkoll il-livelli ta 'antikorpi IgA fil-ħmieġ tal-ġrieden. Ir-riżultati wrew li ma kien hemm l-ebda antikorp speċjali anti-PEDVS IgA kien jeżisti qabel l-immunizzazzjoni. Madankollu, ammonti kbar ta' antikorp IgA fil-ħmieġ ta' L. casei-OMP16-PEDVS ġrieden immunizzati BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS, u ġrieden tal-grupp BL21-PEDVS fi 14-il jum wara l-immunizzazzjoni. Fi 28 jum wara l-immunizzazzjoni, il-livelli tal-antikorpi IgA tal-ġrieden immunizzati L. casei-OMP16-PEDVS laħqu l-ogħla massimu tagħhom. Sadanittant, il-livelli tal-antikorpi IgA fit-tliet gruppi l-oħra ma ppreżentawx żieda ovvja. Għalhekk, il-vaċċin kandidat L. casei OMP16-PEDVS jista' jistimula livelli ogħla ta' antikorpi fil-ġrieden immunizzati meta mqabbel ma' BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS, u ġrieden immunizzati BL21- PEDVS (Fig. 4).
Fig. 2 Il-verifika ta 'proteini ta' espressjoni rikombinanti. M: markatur tal-proteini; 1: il-forma ta' proteina sekretorja rikombinanti L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS razza; 2: il-proteina purifikata mir-razza BL21- pET28a-OMP16-PEDVS; 3: il-proteina purifikata mir-razza BL21-pET28a-PEDVS
Il-livelli ta' antikorpi newtralizzanti tas-serum fil-ġrieden immunizzati
Biex jiġi evalwat l-effett protettiv tal-vaċċini kandidati ta' L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , u BL21-PEDVS fil-ġrieden, ġew imkejla l-livelli ta' antikorpi newtralizzanti. Ir-riżultati wrew li l-ebda antikorp newtralizzanti ma ġie skopert qabel it-tilqim. Antikorp newtralizzanti ġie skopert fi 14-il jum wara l-immunizzazzjoni u żdied f'14-il jum wara l-immunizzazzjoni booster. Ir-rispons tal-antikorpi fil-ġrieden li rċevew L. casei-OMP16-PEDVS kellu attività newtralizzanti kontra l-PEDV aktar b'saħħitha minn dik fil-ġrieden mogħtija mill-ħalq b'BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS, u BL21-PEDVS. Għalhekk, il-vaċċin kandidat L. casei OMP16-PEDVS jista' jistimula l-ogħla livell ta' antikorpi newtralizzanti, segwit minn BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS, u BL21-PEDVS (Fig. 5).
Livelli taċ-ċitokini
Biex tqabbel il-livell ta' rispons immuni ċellulari ta' L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, u ġrieden immunizzati BL21-PEDVS, IL- 4, IL-10, u IFN- ġew determinati, rispettivament. Ir-riżultati wrew li l-livelli taċ-ċitokini IL-4, IL{-10, u IFN- fis-serum tal-ġrieden kienu kollha baxxi ħafna u ma kellhom l-ebda differenza sinifikanti qabel l-immunizzazzjoni. Billi, bidliet simili ġew osservati fir-riżultati ta' IL-4, IL-10, u IFN- . Fi 14-il jum wara l-immunizzazzjoni, il-livell ta' IL-4, IL-10, u IFN- fi ġrieden L. casei-OMP16-PEDVS im immunizzati kienu ogħla minn BL21- Ġrieden immunizzati OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS, u BL21-PEDVS. Fi 14-il jum wara l-immunizzazzjoni booster, ġew skoperti livell ogħla ta' IL-4, IL{-10, u IFN fil-ġrieden immunizzati L. casei-OMP16- PEDVS meta mqabbla ma' dak ta' fi ġrieden oħra. tliet gruppi. Għalhekk, il-vaċċin kandidat L. casei-OMP16-PEDVS jista' jistimula l-ogħla livelli ta' IL{-4, IL{-10, u IFN-, segwit minn BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS, u BL21-PEDVS (Fig. 6).
Fig. 3 Il-livelli ta' antikorpi IgG ta' vaċċini kandidati fis-serum ta' ġrieden immunizzati. Is-serum inġabar fil-jiem 0, 14, u 28 jum qabel jew wara l-immunizzazzjoni eżaminati permezz ta' kits ELISA kummerċjali, u mkejla f'assorbiment ta' 450 nm. Bars jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti indipendenti. * p < 0.05, ** p < 0.01, u **** p < 0.0001 jirrappreżentaw gradi li qed jiżdiedu ta’ differenzi sinifikanti, rispettivament, u ns tfisser l-ebda differenza sinifikanti
Diskussjoni
F'Ottubru 2010 seħħet tifqigħa fuq skala kbira ta' PED ikkawżata minn varjanti tal-PEDV, li rriżultat f'telf ekonomiku kbir fiċ-Ċina u madwar id-dinja kollha [1]. Madankollu, il-vaċċini tradizzjonali huma kollha mfassla bbażati fuq ir-razza klassika CV777 li ma tistax tipprovdi protezzjoni suffiċjenti lill-varjant PEDV [4]. Biex tikkontrolla t-tixrid tal-PEDV u jitnaqqas it-telf ekonomiku, huma mfassla wkoll vaċċini ġodda ta 'razez varjanti tal-PEDV. Fil-preżent, il-vaċċin inattivat PEDV u l-vaċċin attenwat ta 'razez varjanti PEDV huma kollha approvati mill-gvern Ċiniż u hemm kollha juru prospetti promettenti fil-kontroll tal-PED. Iżda difetti jeżistu wkoll fiż-żewġ tipi ta 'vaċċini ġodda. Il-PEDV jinfetta l-ħnieżer mill-passaġġ diġestiv u għandu tropiżmu fit-tessut intestinali. Għalhekk, l-immunità tal-mukuża hija aktar effettiva mill-immunità sistemika fil-prevenzjoni tad-dħul tal-PEDV fiċ-ċelloli epiteljali intestinali, u l-vaċċini għandhom jipprovdu protezzjoni mukosali b'mod effettiv fil-passaġġ intestinali. Għalhekk, F'dan l-istudju, aħna nibnu tip ġdid ta 'vaċċin li jista' jistimula antikorpi IgG u IgA speċifiċi kontra l-PEDV aktar b'saħħithom. Lactobacillus casei għandu proprjetajiet immuni-modulatori potenzjali bħala vettura tat-twassil tal-vaċċin u l-espressjoni ta 'komposti bijoattivi fuq il-ħajt taċ-ċelluli ta' dan il-batterju tista 'tistimula risponsi immuni xierqa [28, 29]. Huwa użat ħafna biex jesprimi diversi antiġeni eteroli ta 'papillomavirus uman, Streptococcus pneumonia, u Escherichia coli bħala vaċċini f'mudelli ta' annimali, li kollha wrew immunoġeniċità eċċellenti [7-9]. Meta mqabbel mal-vaċċin inattivat u l-vaċċin attenwat, il-vaċċin tal-vettur Lactobacillus casei jista 'wkoll jistimula livelli ogħla ta' IgA u rispons immuni ċellulari. Studji wrew li l-ewwel linja ta 'difiża ta' IgA fl-imsaren tkun aħjar minn IgG fil-protezzjoni tal-qżieqeż mill-infezzjoni PEDV [10, 30]. Għalhekk, huwa promettenti li tiżviluppa tip ta 'vaċċin vettur Lactobacillus casei ta' PED. Abbażi tar-rapporti, il-proteina S tal-PEDV tista’ tinqasam f’dominji S1 (1–735 aċidu amminiku) u S2 (736-l-aħħar aċidu amminiku) [13], u l-proteina S1 tinkludi r-reġjun li jorbot mar-riċettur u l- epitopi newtralizzanti prinċipali [14]. L-epitope newtralizzanti tal-qalba (COE) jista 'jikkaġuna antikorpi newtralizzanti qawwija kontra PEDV [31, 32]. Flimkien mal-analiżi tal-antiġeniċità, intgħażlet sekwenza parzjali tal-ġene S1 (1477-2124 bp) biex tinbena l-plasmid rikombinanti. Il-framment żgħir magħżul ġie ppruvat li mhux biss għandu ġeniċità immuni tajba iżda wkoll jikkontribwixxi għall-espressjoni mnixxija ta 'Lactobacillus casei. Min-naħa l-oħra, Pasquevich sab li l-proteina 16 tal-membrana esterna ta 'Brucella abortus tista' tattiva ċelluli dendritiċi in vivo, tinduċi rispons immuni th1, u kienet vaċċin promettenti awto-adjuvant kontra l-bruċellosi akkwiżita sistemika u orali [15]. Riċerka simili li l-proteina tal-membrana ta 'barra mhux lipida omp16 minn Brucella spp. peress li adjuvant nażali jista' jinduċi rispons immuni th1 u jimmodula r-rispons allerġiku th2 għall-proteini tal-ħalib tal-baqra kien ippruvat ukoll [16]. Għalhekk, intgħażlet sekwenza parzjali tal-ġene omp16 biex tibni plasmid rikombinanti biex ittejjeb il-funzjoni immuni fl-istudju tagħna. Biex tkun taf jekk il-vaċċin ġdid rakkomandat ta' Lactobacillus casei jistax jinduċi risponsi immuni umorali, ġew imkejla l-livelli ta' IgG, IgA u antikorpi newtralizzanti. Il-livell ta' antikorpi IgG ta' ġrieden immunizzati vaċċin rikombinanti L. casei-OMP16-PEDVS ma kellu l-ebda differenza sinifikanti mal-ġrieden immunizzati vaċċin rikombinanti BL21-OMP{16-PEDVS-F. Madankollu, l-IgA u l-livelli tal-antikorpi newtralizzanti kienu ogħla minn dak ta' f'BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S, u BL{{47} }}Ġrieden imizzati bil-vaċċin rikombinanti PEDVS. Ir-riżultati wrew li L. casei-OMP16-PEDVS jista' jinduċi risponsi immuni umorali aktar b'saħħithom, speċjalment livelli ta' antikorpi IgA. Studji wrew li l-IgA hija l-ewwel linja ta 'difiża fl-imsaren u tkun aħjar minn IgG fil-protezzjoni tal-ħnienes mill-infezzjoni PEDV [30]. Ir-riċerka vverifikat ukoll ir-riżultat li l-vaċċin rikombinanti L. casei-OMP16-PEDVS jista' jipprovdi protezzjoni immunoloġika aħjar lill-PEDV. Biex tesplora t-tip ta' rispons immuni indott minn L. casei-OMP16-PEDVS rikombinanti, il-livelli ta' IL{-4, IL{-10, u IFN- ġew skoperti biex tiġi evalwata l-attività ta' T limfoċiti. Ibbażat fuq ir-rapport, IFN- għandu rwol importanti fir-rispons immuni ċellulari ikkawżat meta l-patoġeni jinvadu l-ġisem, IL-4 għandu rwol importanti fir-rispons immuni umorali u jippromwovi t-tolleranza immuni u l-immunità mukosali [33], IL -10 għandu rwoli essenzjali fil-ġlieda kontra l-infezzjoni mikrobjali tal-mukuża u fiż-żamma tal-integrità tal-barriera tal-mukos fl-imsaren [34]. Sadanittant, ir-riżultati tal-kxif taċ-ċitokini wrew li l-ġrieden immunizzati bil-vaċċin rikombinanti L. casei-OMP{16-PEDVS jistgħu jinduċu espressjoni aktar b'saħħitha ta' IL{-4, IL{-10, u IFN- , li appoġġa r-riżultati li l-vaċċin rikombinanti L. casei-OMP16-PEDVS jista' jinduċi rispons immuni umorali aktar b'saħħtu, livell ta' antikorpi IgA, u rispons immuni ċellulari, rispettivament.
Fig. 5 Il-livelli ta' antikorpi newtralizzanti ta' vaċċini kandidati fis-serum ta' ġrieden immunizzati. Is-serum inġabar fil-jiem 0, 14, u 28 jum qabel jew wara l-immunizzazzjoni u eżaminat permezz tat-test tan-newtralizzazzjoni. Bars jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti indipendenti. * p < 0.05, ** p < 0.01, u **** p < 0.0001 jirrappreżentaw gradi li qed jiżdiedu ta’ differenzi sinifikanti, rispettivament, u ns tfisser ebda sinifikanti differenza
Fig. 6 Sejbien ta' livelli ta' ċitokini mis-serum ta' ġrieden immunizzati. Is-serum inġabar fil-jiem 0, 14, u 28 jum qabel jew wara l-immunizzazzjoni u eżaminat permezz ta' kits ELISA kummerċjali. Il-valur ta' l-assorbiment kien imkejjel f'assorbenza ta' 450 nm għal IL-4 (a), IL-10 (b), u IFN- (c), rispettivament. Bars jirrappreżentaw il-medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti indipendenti. * p < {{10}}.05, ** p < 0.01, u **** p < 0.0001 jirrappreżentaw gradi dejjem jiżdiedu ta' differenzi sinifikanti, rispettivament
Konklużjoni
Fil-qosor, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS, u BL{{7 }}F'dan l-istudju nbnew vaċċini kandidati PEDVS. Sadanittant, ir-rispons immuni umorali u l-livelli ta 'rispons immuni ċellulari ta' dawn il-vaċċini kandidati fil-ġrieden ġew evalwati. Ir-riżultati wrew li l-ġrieden immunizzati b'L. casei-OMP16-PEDVS jistgħu jipproduċu livelli ogħla ta' IgG, IgA, antikorp newtralizzanti, IL-4, IL- 10, u INF- meta mqabbla ma' il-ġrieden immunizzati b'BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS, u BL21-PEDVS. Għalhekk, il-vaċċin kandidat rikombinanti L. casei OMP16-PEDVS jista' jistabbilixxi l-bażi għall-iżvilupp ta' vaċċin mukożali rikombinanti sikur, effettiv u konvenjenti għall-profilassi tal-infezzjoni PEDV.
cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni
Referenzi
1. Wang D, Fang L, S X. Dijarea epidemika tal-ħnieżer fiċ-Ċina. Virus Res. 2016; 226:7–13.
2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. Investigazzjoni immunoistokimika tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.
3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Kanzunetta CXJEID. It-tifqigħa ta 'dijarea epidemika tal-ħnieżer fil-qżieqeż li jreddgħu, iċ-Ċina. Emerġ Infetta Dis. 2012; 18(1):161–3.
4. Tong YE, Feng L, Li W. Żvilupp ta 'vaċċin attenwat bi-kombinat kontra l-virus tal-gastroenterite trasmissibbli u l-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.
5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Il-potenzjal ta 'Lactobacillus bħala trasportatur għal immunizzazzjoni orali: żvilupp u karatterizzazzjoni preliminari ta' sistemi ta 'vettur għal twassil immirat ta' antiġeni. J Bijoteknoloġija. 1996;44(1–3):183.
6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Bijoteknoloġija: L-effetti immunomodulatorji tal-batterji tal-aċidu lattiku għat-titjib tal-funzjonijiet u l-benefiċċji immuni. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.
7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. L-immunizzazzjoni orali b'vaċċin Lactobacillus casei li jesprimi l-papillomavirus uman (HPV) tip 16 E7 hija strateġija effettiva biex tinduċi limfoċiti ċitotossiċi tal-mukuża kontra HPV16 E7. Vaċċin. 2010;28(16):2810–7.
8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et al. Immunizzazzjoni fl-imnieħer tal-ġrieden b'Lactobacillus casei li jesprimu l-Proteina tal-wiċċ Pneumococcal A: induzzjoni ta 'antikorpi, depożizzjoni komplementari u protezzjoni parzjali kontra l-isfida ta' Streptococcus pneumoniae. Mikrobi jinfettaw. 2008;10(5):481–8.
9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK, et al. It-tilqim b'razez rikombinanti ta 'Lactobacillus casei li jipproduċu proteina fimbrial K99, u K88 tipproteġi l-ġrieden kontra Escherichia coli enterotossiġenika. Vaċċin. 2012;30(22): 3339–49.
10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et al. Kostruzzjoni ta 'razza lactococcus lactis rikombinanti li tesprimi ġene varjant tal-virus S1 tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer u l-analiżi tal-immunoġeniċità tagħha fil-ġrieden. Immunol virali. 2019;32(3):144–50.
11. Wang X, Wang L, Zheng D. Immunizzazzjoni orali b'vaċċin tal-virus tad-dijarea epidemika kontra l-ħnieżer (PEDV) ibbażat fuq Lactobacillus casei li jesprimi l-peptide Co1 li jindirizza ċ-ċelluli microfold imdewweb mal-antiġen COE tal-PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.
12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Analiżi tas-sekwenza tal-ġenoma tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer bejn in-nukleokapsid u l-ġeni tal-proteina spike tiżvela ORF polimorfiku. Viroloġija. 1994;198(2):466.
13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Eteroġeneità fil-ġeni tal-proteini spike ta 'viruses tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer iżolati fil-Korea. Virus Res. 2010;149(2): 175–82.
14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. Ir-reġjun tal-proteini spike (aa 636789) tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer huwa essenzjali għall-induzzjoni ta 'antikorpi newtralizzanti. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.
15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. Il-parti tal-proteina tal-proteina tal-membrana ta 'barra ta' Brucella abortus 16 hija mudell molekulari ġdid assoċjat mal-patoġenu batterjali li jattiva ċelluli dendritiċi in vivo, jinduċi rispons immuni Th1, u huwa vaċċin promettenti awto-adjuvanting kontra bruċellosi akkwiżita sistemika u orali. J Immunol. 2010;184(9):5200.
16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et al. Proteina tal-membrana ta' barra mhux likwidata Omp16 (U-Omp16) minn Brucella spp. bħala adjuvant nażali jinduċi rispons immuni Th1 u jimmodula r-rispons allerġiku Th2 għall-proteini tal-ħalib tal-baqra. PLoS Wieħed. 2013;8(7):e69438.
17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et al. Immunità: L-immunizzazzjoni bil-proteina tal-membrana esterna tal-ispeċi Brucella rikombinanti Omp16 jew Omp19 f'adjuvant tinduċi ċelluli CD4+ u CD8+ T speċifiċi kif ukoll protezzjoni sistemika u orali kontra l-infezzjoni ta' Brucella abortus. Infetta Immun. 2009;77(1):436–45.
18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et al. Vaċċin Lactobacillus rikombinanti orali li jimmira għaċ-ċelloli tal-mikrofold intestinali u ċ-ċelloli dendritiċi biex iwassal l-epitopu newtralizzanti tal-qalba tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer. Fabbriki taċ-Ċelloli tal-Mikrobi. 2018;17(1):20.
19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. L-espressjoni eterologa u l-karatterizzazzjoni bijokimika ta 'nitrat assimilatorju u nitrit reductase tiżvela adattament u potenzjal ta' Bacillus megaterium NCT -2 f'ħamrija ta 'salinizzazzjoni sekondarja. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.
20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et al. Caerin1.1 irażżan it-tkabbir tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer in vitro permezz ta 'rbit dirett mal-virus. Viruses. 2018;10:9.
21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Bijoteknoloġija: karatterizzazzjoni ta 'pMC11, plasmid b'oriġini doppja ta' replikazzjoni iżolata minn Lactobacillus casei MCJ u kostruzzjoni ta 'vettori shuttle ma' kull replicon. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.
22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et al. Kunsinna orali ta 'Probijotiċi li jesprimu peptidi li jimmiraw iċ-ċelluli dendritiċi mdewba mal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer COE Antigen: Strateġija ta' Vaċċin promettenti kontra l-PEDV. Viruses. 2017;9(11):312.
23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. Il-kostruzzjoni ta 'Lactobacillus casei rikombinanti li jesprimi proteina BVDV E2 u r-rispons immuni tiegħu fil-ġrieden. J Bijoteknoloġija. 2018;270:51–60.
24. Noi NV, Chung YCJB, Tagħmir B. Ottimizzazzjoni ta 'espressjoni u purifikazzjoni ta' dominju S1 rikombinanti tal-proteina spike tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer (PEDV-S1) f'Escherichia coli. Bijoteknoloġija Bijoteknoloġija Tagħmir. 2017;31(2):1–11.
25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et al. Id-dominji tat-twaħħil taċ-ċelluli tal-proteina spike tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer huma miri ewlenin ta 'antikorpi newtralizzanti. J Virol. 2017;91(12):1–16.
26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et al. L-għoti orali ta' mikrosferi miksija mgħobbija b'PEDV qanqal immunità speċifika għal PEDV fil-ħnienes miftuma. Vaċċin. 2019;09(014):161–6.
27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Effetti tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer fuq ċelluli dendritiċi derivati minn monoċiti porċini u ċelluli dendritiċi intestinali. Vet Microbiol. 2016;106:149–58.
28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Attività immunomodulatorja u anti-infjammatorja indotta minn amministrazzjoni orali ta' razza probijotika ta' lactobacillus casei. Infjammazzjoni. 2006;4(1):31–41.
29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Protezzjoni kontra t-tossina tat-tetnu wara amministrazzjoni intragastrika ta’ żewġ batterji tal-aċidu lattiku rikombinanti: impatt tal-vijabbiltà tar-razza u persistenza in vivo. Vaċċin. 2002;20(27–28):3304–9.
30. Kanzunetta DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Effikaċja orali tar-razza DR13 tal-virus tad-dijarea epidemika tal-majjali attenwata taċ-ċelluli Vero. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.
31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et al. Dominju S1 tal-proteina spike tal-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer bħala antiġen tal-vaċċin. Virol J. 2016;13:1.
32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et al. Ċelloli: Identifikazzjoni tar-reġjun tal-epitopi kapaċi li jinduċi antikorpi newtralizzanti kontra l-virus tad-dijarea epidemika tal-ħnieżer. Ċellula Mol. 2002;14(2): 295–9.
33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et al. Kontribuzzjonijiet differenzjali ta 'B7-1 u B7-2 għall-iżvilupp ta' konġuntivite allerġika sperimentali murina. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.
34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et al. IL-22 irażżan l-infezzjoni tal-koronavirus enteriċi tal-ħnieżer u r-rotavirus billi jattiva l-mogħdija tas-sinjali STAT3. Antivir Res. 2017;142:68–75.
