Studju dwar l-effett ta 'acteoside (ingredjent attiv f'Cistanche DesertIcola) fuq NAFLD billi tinduċi l-awtofagija

Astratt:

 

Objettiv:Biex tesplora l-funzjoni li tinduċi l-awtofagija ta 'l-acteoside ta' ingredjent attiv (ACT) f'Cistanche Deserticola u l-effett tagħha fuq mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku (NAFLD).

MetodiBiex tieħu echinacoside u taġixxi bħala oġġetti ta 'riċerka, 1 0 0 μmol / L ACT u echinacoside (ECH) ġew ikkombinati ma' inibitur ta 'l-autofija-lisosoma bleomycin A1 għal trattament ta' intervent. L-immunoblotting tal-proteina ntuża biex jinstab il-livell ta 'espressjoni relattiva ta' proteina tal-markatur awtofagija mikrotubuli Assoċjat Proteina 1 Katina ħafifa 3 (LC 3- ii). Iċ-ċelloli HepG2 ġew intervjeni b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'ACT in vitro, u l-vijabbiltà taċ-ċellula ġiet osservata bl-użu tal-metodu tal-melħ tat-tetrazolium. Fl-intervent vitro taċ-ċelloli HepG2 b'konċentrazzjonijiet differenti ta' ACT flimkien ma 'balofloxacin A1, u skoperta ta' LC 3- II livelli ta 'espressjoni tal-proteina bl-użu tat-teknoloġija tal-immunoblotting tal-proteini. Mudell NAFLD mibni in vitro b'intervent ta 'mediċina intuża biex tebgħa l-qtar tal-lipidi bl-użu ta' metodu ta 'tebgħa ta' żejt aħmar u jindividwa livelli ta 'trigliċeridi intraċellulari. Osserva l-lokalizzazzjoni ta 'proteina LC3 u qtar tal-lipidi permezz ta' teknoloġija immunofluworexxenza. Ir-riżultati tal-att jista 'jikkaġuna b'mod sinifikanti l-awtofagija fiċ-ċelloli Hepg2, u l-livell ta' espressjoni ta 'lc 3- ii tal-proteina huwa miżjud b'mod sinifikanti meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll (trattat bl-ACT waħdu) (1.36 ± ± {0. 11, {0. 28 ± 0 {{{{{0}}} 2, rispettivament), b'importanza statistika (P0.05). 50 μmol / L ATT indotta b'mod sinifikanti l-awtofagija fiċ-ċelloli HepG2, u l-livell ta 'espressjoni ta' LC 3- II tal-proteina żdied b'mod sinifikanti (1.83 ± 0.53, 0.35 ± 0.18, rispettivament). Il-livell Tg taċ-ċelloli Hepg2 fil-grupp ta 'intervent ACT (19.11 ± 1.68) kien sinifikament inqas minn dak fil-grupp ta' mudell taċ-ċelluli in vitro NAFLD (34.15 ± 1.90), u d-differenzi kienu statistikament sinifikanti (p<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Keywords:Mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku;Cistanche DesertIcola;Acteoside; Awtofagija

 

TCM Herb Cistanche għat-trattament ta 'mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku (NAFLD)

Ikklikkja l-istampa biex tikseb aktar dettalji

 

Fl-aħħar ftit deċennji, xaħam mhux alkoħolikumard tal-fwied(NAFLD) sar l-iktar komuniMard tal-fwied kroniku, bi prevalenza globali ta 'madwar 25% tal-popolazzjoni adulta, u hija meqjusa relatata mill-qrib mas-sindromu metaboliku [1]. Għalkemm il-probabbiltà ta 'kumplikazzjonijiet relatati mal-fwied f'pazjenti NAFLD hija inqas minn 10%, NAFLD huwa fattur ta' riskju għal mard relatat mal-fwied bħal ċirrożi u kanċer primarju tal-fwied, li jimponi piż ekonomiku enormi fuq il-pazjenti [{2-5]. Minkejja l-attenzjoni dejjem tiżdied mogħtija lin-NAFLD, NAFLD bħala marda kronika importanti ma rċevietx biżżejjed attenzjoni. Għalhekk, aktar fehim fil-fond tal-patoġenesi ta 'NAFLD u t-tfittxija għal strateġiji ta' trattament effettivi saru problemi urġenti li għandhom jiġu solvuti [{6-7].

Studji riċenti wrew li l-awtofagija ċellulari għandha rwol importanti fil-fiżjoloġija u l-patoloġija tal-fwied [8]. Disfunzjoni ta 'awtofagija jew disregolamentazzjoni hija assoċjata ma' varjetà ta 'mard tal-fwied bħalMard tal-fwied relatat mal-alkoħol[9], Nafld [10], steatohepatitis mhux alkoħolika [11], u karċinoma epatoċellulari [12]. Il-karatteristiċi patoloġiċi ta 'NAFLD huma deposizzjoni eċċessiva ta' trigliċeridi (TG) u qtar ta 'lipidi newtrali oħra (LD) fl-epatokiti taħt stimulazzjoni mhux alkoħolika. Għall-fwied, iż-żewġ mogħdijiet ewlenin li jirregolaw il-kataboliżmu ta 'dawn l-LDs huma l-lipolisi u l-awtofagija.
Il-mogħdija tal-lipolisi hija rregolata minn lipasi newtrali ċitoplasmiċi, bħal lipase sensittiva għall-ormoni u lipase Adipose TG. Fil-passaġġ lipoautofagija korrispondenti, l-LDs jistgħu jittieħdu b'mod selettiv billi tirrekluta direttament il-proteini relatati mal-awtofagija biex jiffurmaw awtofagoġomi, u mbagħad l-LDS inkapsulati minn awtofagoġomi jiġu kkonsenjati aktar lil lisosomi u dekomposti minn lipase aċiduża fil-lisosomi. Għalhekk, l-attivazzjoni tal-lipoautofagija fl-epatokiti saret strateġija effettiva għall-prevenzjoni u t-trattament tan-NAFLD.
Cistanche DesertIcola hija mediċina tal-ħxejjex prezzjuża Ċiniża li ntużat ħafna fil-prattika klinika fil-formuli tradizzjonali tal-mediċina Ċiniża. Fl-istess ħin, ilu jintuża bħala suppliment tal-ikel tas-saħħa. Cistanche DesertIcola fih varjetà ta 'ingredjenti bijoattivi, li l-iktar importanti minnhom huwa Cistanche DesertIcola feniletanol glycosides. Bħala rappreżentanti ta 'glycosides feniletanojdi, echinacoside (ECH) u verbascoside (ACT) ġew irrappurtati li għandhom ħafna attivitajiet bijoloġiċi importanti, bħalma huma l-protezzjoni anti-ossidanti, newroprotettivi, immunomodulatorji, u tal-fwied [13]. F'termini ta 'protezzjoni tal-fwied, studji sabu li l-ECH jista' jipproteġi l-fwied billi jnaqqas il-medjaturi infjammatorji, jinibixxi l-fattur ta 'tkabbir li jittrasforma, u jnaqqas il-livell ta' espressjoni ta 'ġeni relatati mal-fibrożi tal-fwied. L-ACT għandu effett protettiv sinifikanti fuq il-ħsara fil-fwied kimiku u mid-droga, bħal alkoħol, tetrachloride tal-karbonju, u lipopolysaccharide. L-ACT inaqqas l-istress ossidattiv ikkawżat minn kimiċi tossiċi, ineħħi l-ossiġnu reattiv akkumulat fil-fwied, u jnaqqas il-konċentrazzjoni ta 'malondialdehyde. Fl-istess ħin, iżid b'mod sinifikanti l-attività ta 'superoxide dismutase tal-fwied u naqqas il-kontenut ta' glutatijon, u jtejjeb b'mod sinifikanti l-ħsara istopatoloġika tal-fwied u l-apoptożi. Madankollu, m'hemm l-ebda rapport ta 'letteratura rilevanti dwar jekk il-glukożidi feniletanojdi ta' Cistanche DesertIcola humiex involuti fil-proċess ta 'awtofagija fl-eżerċizzju ta' protezzjoni tal-fwied. Abbażi ta 'dan, dan l-istudju uża metodi ta' bijoloġija taċ-ċelloli konvenzjonali u mudell ta 'ċelloli in vitro biex jesplora preliminarjament l-effett li jinduċi l-awtofagija ta' glukożidi ta 'cistanche deserticola feniletanojdi u esplora l-funzjonijiet farmakoloġiċi possibbli tiegħu, bil-għan li jipprovdi bażi xjentifika għall-iżvilupp tal-mediċina futura.

 

1 Materjali u Metodi

1.1 Materjali

1.1.1 Suġġetti ta 'Riċerka Ech u ACT intużaw bħala suġġetti ta' riċerka.

1.1.2 Materjali taċ-ċelloli Hepg2 ġew mixtrija minn Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (numru tal-lott: B21209) u ACT (numru tal-lott: B20715, purità HPLC ikbar minn jew daqs 98%) ġew mixtrija minn Shanghai Yuanye Company bijoloġiku, DMEM Yuanye Medju Għoli tal-Glukosju Għoli (Numru tal-Batch u trypsin inxtraw minn Hyclone Company, USA, Fetal Bovine Serum (numru tal-lott: 04-002-1 a) inxtrat mill-BI Company, Iżrael, Penicillin / Streptomycin (Numru tal-Lott: SV30010.01) inxtrat minn Hyclone Company, MTT (Numru tal-Batch (Numru tal-Batch: M8180 Beijing, iċ-Ċina, TG (numru tal-lott: BC0625) Kit ta 'skoperta nxtrat minn Solebao Company, Beijing, iċ-Ċina, Żejt Red O (numru tal-lott: O 0625-100 g), dimetil sulfoxide (numru tal-lott (numru tal-lott: BCBZ1685) inxtraw minn Sigma-Aldrich, USA; L-inibitur ta 'l-awtofagija-lisosoma Bafilomycin A1 (BAFA1, numru tal-lott: TLRL-BAF1) inxtrat minn Invitrogen, l-Istati Uniti; L-attivatur tal-awtofagija rapamycin (numru tal-lott: S17098) inxtrat minn Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., iċ-Ċina; Proteina marbuta mal-mikrotubuli 1 Katina tad-Dawl 3 (LC3, Numru tal-Lott: L7543, Speċi: Rabbit, Proporzjon ta 'Dilwizzjoni: 1: {1 000) u -Actin (numru tal-lott: ZRB1312, Speċi: Rabbit, Proporzjon ta' Diluzzjoni: 1: {{{{{{{{5 000) l-antikorpi ġew mixtrija minn Sigma-Aldrich, usa; Antikorp sekondarju tat-tikketta tal-perossidażi horseradish (numru tal-lott: 4010-05, Speċi: Anti-fenek tal-mogħża, Proporzjon ta 'Dilwizzjoni: 1: {1 000) inxtrat minn Southern Biotech, USA Company, Alexa Fluor Fluorescent Antikorp sekondarju bit-tikketta (43328, Wavength: 546. 1: 1000) inxtrat mill-Kumpanija Sigma-Aldrich, l-Istati Uniti, u Bodipy 493/501 (numru tal-lott: D3922) inxtrat minn Invitrogen Company, USA.

 

1.2 Metodi

1.2.1 Kultura taċ-Ċelluli

Iċ-ċelloli HepG2 ġew ikkultivati ​​fil-mezz tal-glukosju għoli ta 'Dulbecco Eagle li fih 10% serum tal-ifrat tal-fetu, 100 U / mL peniċillina u 100 ug / ml streptomycin f'37 grad, 5% inkubatur tad-dijossidu tal-karbonju. Meta l-konfluwenza taċ-ċellula laħqet 85%, saru subkultura, plating, intervent u operazzjonijiet oħra.

 

1.2.2 Sejbien tal-Immunoblotting tal-Proteina

1.2.2.1 Att u Trattament ECH

LC 3- ⅱ livell ta 'espressjoni tal-proteina fiċ-ċelloli Hepg2 Bafa1, bħala inibitur tal-pompa tal-protoni, jista' jikkawża LC 3- ⅱ ⅱ proteina biex tiġbor fi kwantitajiet kbar fiċ-ċelloli, u b'hekk tamplifika l-abilità ta 'induzzjoni ta' l-awtofagija. Għalhekk, l-użu kkombinat ta 'BAFA1 jista' jintuża bħala sistema ta 'monitoraġġ ta' l-awtofagija biex tevalwa l-abilità ta 'induzzjoni ta' awtofagija. Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew trasferiti għal platti tal-kultura taċ-ċelluli 3.5 cm għall-kultura ta' matul il-lejl. 100 μmol / L ACT, ECH u BAFA1 intużaw għall-intervent għal 12 siegħa. Iċ-ċelloli ġew maħsula b'soluzzjoni ta 'buffer tal-fosfat imkessaħ minn qabel (PBS) u immedjatament lised fil-buffer tal-lisi tal-proteina RIPA għal 10 min. Is-supernatant ġie ċċentrifugat u l-konċentrazzjoni totali tal-proteina ġiet iddeterminata bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-konċentrazzjoni tal-proteina tal-aċidu bikinchoninic. Wara l-kwantifikazzjoni bil-bafer tad-dodecyl sulfate tas-sodju, il-kampjun ġie msaħħan f'95 grad għal 10 min biex jinatura l-proteina. Imbagħad 30 μl tal-kampjun ittieħdu bil-mikropipetta u elettroforesed fuq ġel tal-polyacrylamide.
Wara l-elettroforeżi, il-proteina ġiet trasferita mill-ġel għal membrana tan-nitroċelluloża, imblukkata b'1 0% ħalib matul il-lejl, inkubata b'anticorp primarju speċifiku f'temperatura tal-kamra għal 1 h, maħsula b'buffer tal-fosfat li fih 0.5% Triton, u inkubat b'anticorpi sekondarju speċifiku f'temperatura tal-kamra għal 1 h. Il-metodu ECL intuża għall-iżvilupp tal-kulur. Huma ġew stabbiliti bħala grupp ta 'kontroll vojt, rapamycin, grupp ECH, grupp ACT, rapamycin + BAFA1 Group, ECH + BAFA1 Group u ACT + BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Konċentrazzjonijiet differenti ta 'ACT intervjenew il-livell ta' espressjoni ta 'lc 3- ⅱ proteina fiċ-ċelloli Hepg2

Il-fażi ta 'tkabbir logaritmiku taċ-ċelloli HepG2 ġew trasferiti għal platti tal-kultura taċ-ċelloli ta' 3.5 cm għall-kultura matul il-lejl, u 25, 50, u 100 μmol / L ACT flimkien ma 'BAFA1 intużaw għal trattament ta' intervent għal 12 h, u l-livell ta 'espressjoni ta' LC {3- ⅱ proteina ġie skopert mill-immunoblotting tal-proteina. Il-grupp ta 'kontroll (grupp CON, kontroll vojt), grupp ta' ġuħ (grupp STA, ċelloli ta 'trattament tal-ġuħ Hepg2), 25, 50, u 100 μmol / L ACT, u BAFA1 flimkien ma' 25, 50, u 100 μmol / L ACT ġew stabbiliti.

1.2.3 Metodu MTT Biex tiskopri r-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelloli Hepg2 trattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' ACT għal 24 u 48 h
Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew imlaqqma fi pjanċa tal-bir 96- b'densità ta' inokulazzjoni moderata u kkultivata f'inkubatur għal 12 siegħa. 2 0, 40, 60, 80, u 100 μmol / L ACT ġew miżjuda għal 24 u 48 h. Soluzzjoni MTT ta '0.5 mg / ml ġiet miżjuda f'ambjent skur u inkubata f'inkubatur. Wara 4 h, is-supernatant ġie mormi, 100 μl ta 'dimetil sulfoxide ġew miżjuda ma' kull bir, u ċ-ċelloli ġew imħawwda f'shaker ta 'temperatura kostanti f'37 grad għal 10 min. Il-valur tad-densità ottika (OD) f'tul ta 'mewġa ta' 490 nm ġie skopert minn markatur ta 'enzima, u r-rata ta' sopravivenza taċ-ċellula ġiet ikkalkulata.

 

1.2.4 Kostruzzjoni in vitro tal-mudell taċ-ċellula NAFLD

Ċertu piż ta 'aċidu palmitiku (PA) ġie miżun u kompletament maħlul f'ċertu volum ta' isopropanol biex iħejji soluzzjoni ta 'ħażniet ta' 100 mmol / L PA, li mbagħad ġiet maqsuma u maħżuna fi friġġ -20 grad għal użu aktar tard. Is-soluzzjoni tal-istokk tal-PA ġiet dilwita għal 100 μmol / L bl-użu ta 'mezz ta' kultura komplet, u 1% albumina fis-serum bovin mingħajr aċidu xaħmi. Iċ-ċelloli ġew inkubati f'37 grad għal 3 h biex tipprepara s-soluzzjoni ta 'induzzjoni. Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew trasferiti għal dixx tal-kultura taċ-ċelluli ta' 3.5 cm b'densità xierqa għall-kultura matul il-lejl, u mbagħad is-soluzzjoni ta 'induzzjoni ppreparata ntużat għall-intervent.

 

1.2.5 Att Intervent NAFLD Mudell taċ-Ċellula In vitro Tg Sejbien u Żejt Aħmar O Tbajja

 

1.2.5.1 Tg Sejbien

Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew trasferiti għal dixx tal-kultura taċ-ċelluli ta' 3.5 cm għall-kultura skond il-grupp ta 'kontroll vojt, grupp ta' mudell u grupp ta 'intervent ACT. Il-grupp tal-mudell ġie indott b'100 μmol / L PA ta 'soluzzjoni ta' induzzjoni, u l-grupp ta 'intervent ACT ġie indott b'100 μmol / L Soluzzjoni ta' induzzjoni ta 'PA u 50 μmol / L ACT ġie miżjud fl-istess ħin. Il-ħin tal-intervent kien ta ’24 siegħa. Neħħi bil-mod il-mezz tal-kultura l-qadim, aħsel bil-mod il-wiċċ taċ-ċellula b'PBS imkessaħ minn qabel, żid 100 μl / dixx ta 'soluzzjoni ta' lisi ta 'ripa mkessħa minn qabel, lie kompletament fuq is-silġ għal 15 min, ċentrifuga ta' 4 grad, 12 000 r / min għal 10 min għal 10 min, tiġbor is-supernatant, tieħu 10 μl għad-detezzjoni enżimatika ta 'detezzjoni ta' TG, ħu ieħor 10 μL għall-istruzzjonijiet tal-kit TG, u finalment ikkoreġi l-livell Tg għal kull mg ta 'proteina.

1.2.5.2 Żejt aħmar o tbajja '

Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew trasferiti għal dixx tal-kultura ta' 3.5 cm kopert b'kopertura sterili għall-kultura ta 'matul il-lejl. 100 μmol / L PA indottaw iċ-ċelloli biex jiffurmaw qtar tal-lipidi. Fl-istess ħin, 50 μmol / L ACT ġie miżjud għall-intervent għal 24 siegħa.
L-islajds taċ-ċelloli nġabru, maħsula 3 darbiet bi PBS imkessaħ minn qabel, iffissati b'4% formaldehyde f'temperatura tal-kamra għal 10 min, maħsula l-wiċċ taċ-ċellula bil-PBS, żiedet iż-żejt ippreparat b'soluzzjoni ta 'ħidma tar-Red O Red O, imtebba' f'temperatura tal-kamra fid-dlam għal 15 min, aspirat is-soluzzjoni tat-tbajja 'taż-żejt aħmar, maħsul is-soluzzjoni ta' tebgħa eċċessi ilma distillat, u ssiġillat, u fotografat taħt mikroskopju.

 

1.2.6 Osservazzjoni ta 'immunofluworexxenza ta' awtofagoġomi u qtar tal-lipidi wara trattament ta 'ACT

Iċ-ċelloli HepG2 fil-fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew trasferiti għal dixx tal-kultura ta' 3.5 cm kopert b'kopertura sterili għall-kultura ta 'matul il-lejl. 1 0 0 μmol / L PA intuża biex jikkaġuna l-formazzjoni ta 'qtar tal-lipidi fiċ-ċelloli. Fl-istess ħin, ACT ġie miżjud għal trattament ta 'intervent għal 24 siegħa. L-islajds taċ-ċelloli nġabru, maħsula 3 darbiet bi PBS imkessaħ minn qabel, iffissati f'temperatura tal-kamra għal 10 min b'4% formaldehyde, permeabilizzati f'temperatura tal-kamra għal 15 min b'filtra ta 'permeabilizzazzjoni li fiha 0.1% saponin, imblukkat f'temperatura tal-kamra għal 1 h bis-serum tal-mogħoż, inkubat f'temperatura tal-kamra għal 1 h b'l-LC 3- speċifika ta' l-anti-antibili. u miżjud ma 'antikorpi sekondarji speċifiċi bit-tikketta fluworexxenti, inkubati f'temperatura tal-kamra u' l bogħod mid-dawl għal 1 siegħa. Wara l-inkubazzjoni tal-antikorpi, is-slajds ġew maħsula 3 darbiet bil-PBS, ikkontrollati b'sonda speċifika għall-qtar tal-lipidi 493/503 f'temperatura tal-kamra għal 10 min, maħsul b'PBS, u ssiġillati b'mezz ta 'siġillar anti-fading, imnixxef bl-arja fid-dlam, osservat b'mikroskopju konfokali tal-laser, u rreġistrat. Il-grupp ta 'kontroll vojt, il-grupp ta' trattament ta 'rapamycin u l-grupp ta' intervent ACT ġew stabbiliti.

 

1.3 Analiżi statistika

SPSS25. 0 Softwer statistiku ntuża għall-analiżi tad-dejta. Id-dejta kwantitattiva ġiet espressa bħala x ± s. Ġiet użata analiżi one-way tal-varjanza u test LSD-T. P<0.05 was considered statistically significant.