Immunità Soċjali fin-Naħal tal-Għasel: Royal Jelly Bħala Vettura fit-Trasferiment ta' Frammenti ta' Patoġenu Batterjali Bejn Nestmates

ASTRATT

L-immunità soċjali hija ġabra ta 'karatteristiċi ta' mġieba u fiżjoloġiċi li jippermettu lill-membri tal-kolonja jipproteġu lil xulxin mill-patoġeni u tinkludi t-trasferiment orali ta 'komposti immunoloġiċi bejn il-bejtiet. Fin-naħal tal-għasel, il-ġelatina rjali hija sekrezzjoni glandulari prodotta minn subsett ta 'ħaddiema li tiġi mitmugħa lir-reġina u l-larva żgħar, u li fiha ħafna komposti antimikrobiċi. Forma relatata ta 'immunità soċjali, transġenerazzjonali immune priming (TGIP), tippermetti lir-rġejjen jittrasferixxu frammenti ta' patoġenu fil-bajd li qed jiżviluppaw tagħhom, fejn huma rikonoxxuti mis-sistema immunitarja tal-embrijun u jinduċu reżistenza ogħla ta 'patoġenu fil-frieħ il-ġdid. Dawn il-frammenti tal-patoġeni huma ttrasportati minn vitellogenin (Vg), proteina prekursur tal-isfar tal-bajd li tintuża wkoll mill-infermiera biex tisintetizza l-ġelatina rjali.

Għalhekk, il-ġelatina rjali tista’ sservi bħala vettura biex tittrasporta frammenti ta’ patoġeni minn ħaddiema għal sħabi tal-bejta oħra. Biex tinvestiga dan, reċentement urejna li l-batterji inġeriti huma ttrasportati lejn il-glandoli li jipproduċu l-ġelatina tal-infermiera, u hawnhekk, nuru li frammenti ta 'patoġenu huma inkorporati fir-royal jelly. Barra minn hekk, nuru li l-konsum ta' ċelluli patoġeniċi jinduċi livelli ogħla ta' peptide antimikrobiku misjub fir-royal jelly, defensin-1.

L-amministrazzjoni orali ta 'komposti immuni tista' taffettwa b'mod sinifikanti l-funzjoni immuni tal-bniedem. Dawn il-komposti jistgħu jtejbu l-immunità billi jsaħħu jew jimmodulaw is-sistema immunitarja tal-ġisem. L-immunità hija r-reżistenza tal-ġisem għall-mard, inklużi mekkaniżmi ta 'difiża bħal ċelluli immuni u antikorpi. Il-komposti ta 'immunizzazzjoni orali jistgħu jattivaw l-attività taċ-ċelloli immuni, iżidu l-produzzjoni ta' antikorpi fil-ġisem, u jinibixxu l-proliferazzjoni ta 'batterji u viruses patoġeniċi, u b'hekk itejbu l-immunità u jnaqqsu r-riskju ta' infezzjoni. Barra minn hekk, l-amministrazzjoni orali ta 'komposti immuni tista' tnaqqas l-infjammazzjoni u tnaqqas l-uġigħ u l-iskumdità assoċjati mal-marda, u b'hekk ittejjeb il-kwalità tal-ħajja. Għalhekk, hemm relazzjoni qawwija bejn l-amministrazzjoni orali ta 'komposti immuni u l-immunità. Minn dan, nistgħu naraw li għandna bżonn nagħtu attenzjoni għat-titjib tal-immunità tagħna. Cistanche jista 'jtejjeb l-immunità. Il-polisakkaridi fil-laħam jistgħu jirregolaw ir-rispons immuni tas-sistema immuni tal-bniedem, itejbu l-abbiltà tal-istress taċ-ċelloli immuni, u jtejbu l-isterilizzazzjoni tal-effett taċ-ċelloli immuni.

Ikklikkja benefiċċji għas-saħħa ta 'cistanche

KELMI EWLENIN:

Naħal tal-għasel, Immunità soċjali, Royal jelly, foulbrood Amerikan.

INTRODUZZJONI

Il-ġelatina rjali ilha affaxxinat lill-bijoloġisti minħabba r-rwol ewlieni li għandha fl-iżvilupp tal-kasta tan-naħal tal-għasel. Din is-sekrezzjoni glandulari hija prodotta minn subsett tal-kasta tal-ħaddiema magħrufa bħala infermiera u mitmugħa lir-reġina tul l-iżvilupp tagħha u l-ħajja adulta, filwaqt li larvi destinati għall-ħaddiema jiġu mitmugħa ġelatina rjali għall-ewwel 3 ijiem ta’ ħajjithom qabel ma jinqalbu għal aktar. dieta bbażata fuq il-polline (Johansson, 1955; Haydak, 1970; Townsend u Lucas, 1940). Hekk kif avvanzat il-metodi tal-kimika analitika, ix-xjentisti bdew jistudjaw il-komponenti nutrittivi tal-ġelatina rjali u sabu li kien fih ħafna komposti li joqtlu l-patoġeni li jipproteġu lir-reġina u l-larva żgħar mill-mard (Blum et al., 1959; Fontana et al., 2004; Fujiwara). et al., 1990; Okamoto et al., 2003; Romanelli et al., 2011; Sugiyama et al., 2012; Vucevic et al., 2007). It-trasferiment ta 'komposti anti-patoġeniċi bejn il-bejtiet huwa forma ta' immunità soċjali, ġabra ta 'karatteristiċi ta' mġieba u fiżjoloġiċi li jgħinu lill-membri tal-kolonja jipproteġu lil xulxin mill-patoġeni (Cremer et al., 2007).

Forma relatata ta’ immunità soċjali, transġenerazzjonali immune priming (TGIP), ukoll ġabet ħafna attenzjoni f’dawn l-aħħar snin (Sadd et al., 2005; Moret, 2006; Freitak et al., 2009, 2014; Zanchi et al., 2011; López et al., 2014; Knorr et al., 2015; Salmela et al., 2015). Hawnhekk, insetti nisa li jgħixu minn attakk ta 'patoġenu jistgħu jittrasferixxu frammenti ta' patoġenu għall-bajd tagħhom u jipproduċu frieħ li huma aktar reżistenti għall-mard. Dawn il-frammenti tal-patoġeni fihom mudelli molekulari assoċjati mal-patoġenu, komponenti strutturali misjuba fil-ħitan taċ-ċelluli taċ-ċelloli mikrobjali, li jikkawżaw rispons immuni fil-frieħ li qed jiżviluppaw. Filwaqt li t-TGIP intwera fin-naħal tal-għasel, l-istudji bbażaw fuq l-injezzjoni ta’ irġejjen b’inoculum u dan ippreżenta problema: kif reġina tiġi mlaqqma b’patoġeni f’kundizzjonijiet naturali peress li hija titma’ esklussivament bil-ġelatina rjali u m’għandha l-ebda opportunità li tikkonsma potenzjalment nektar ikkontaminat u polline miġbura mill-forgers tagħha? Skoperta kbira mill-grupp tagħna tat ħjiel għal mogħdija possibbli ġdida. Ir-reġin jittrasferixxu frammenti ta 'patoġenu fil-bajd tagħhom billi jużaw vitellogenin (Vg) (Salmela et al., 2015), proteina prekursur tal-isfar tal-bajd li tintuża wkoll mill-infermiera biex jissintetizzaw il-ġelatina rjali (Amdam et al., 2003).

Għalhekk, in-naħal tal-għasel jistgħu jużaw il-ġelatina rjali bħala vettura għat-trasferiment ta 'frammenti ta' patoġenu bejn l-infermiera u l-irġejjen, u larvi bħala parti minn mogħdija immuni fil-livell tal-kolonja. Fl-ewwel pass biex niċċaraw din il-mogħdija, urejna li infermiera li inbelgħu batterji setgħu jittrasferixxuha mill-musrana tan-nofs tagħhom għall-glandoli tagħhom li jipproduċu l-ġelatina, u li t-twaqqigħ tal-espressjoni vg impedixxa dan il-proċess (Harwood et al., 2019). Issa, infittxu li niddeterminaw jekk l-infermiera li jibilgħu patoġeni batteriċi jistgħux jinkorporawhom fil-ġelatina rjali tagħhom u jekk l-inġestjoni ta 'patoġeni żżidx ukoll il-konċentrazzjoni ta' komponenti antimikrobiċi oħra fil-ġelatina rjali.

Il-fehim tal-mogħdijiet immuni fin-naħal tal-għasel huwa importanti mhux biss għall-qasam tal-bijoloġija tal-organiżmi iżda wkoll għas-sigurtà tal-ikel tal-bniedem. In-naħal tal-għasel huma l-pollinatur ewlieni tal-insetti fl-agrikoltura, u jżidu mill-inqas $15-il biljun fis-sena mal-valur tal-uċuħ tar-raba’ fl-Istati Uniti biss (stqarrija għall-istampa tal-USDA, 6 ta’ April 2020).

Madankollu, it-telf annwali għoli ta’ kolonji jkompli jolqot lil dawk li jrabbu n-naħal Amerikani (Dipartiment tal-Agrikoltura tal-Istati Uniti, 2019), minħabba stress multipli bħall-espożizzjoni għall-pestiċidi u n-nutrizzjoni ħażina. Iżda l-pesti tan-naħal u l-patoġeni huma wkoll kontributuri ewlenin u ħafna drabi jinstabu f'kolonji li tilfu (Dipartiment tal-Agrikoltura tal-Istati Uniti, 2019). Dawn il-patoġeni jinkludu numru kbir ta 'batterji, fungus, u viruses, li ħafna minnhom m'għandhomx trattamenti farmakoloġiċi. Il-fehim ta’ kif l-immunità soċjali timmedja l-infezzjonijiet tal-patoġeni jista’ jippermetti korsijiet ta’ trattament aktar komprensivi u jgħin biex jitnaqqas il-piż tal-mard li jikkontribwixxi għat-telf tal-kolonji.

Huwa importanti li wieħed jifhem kif il-mekkaniżmi tal-immunità soċjali Riċevuti fit-12 ta' Ġunju 2020; Aċċettati fis-17 ta' Frar 2021 jikkumplimentaw id-difiżi immunoloġiċi preżenti fin-naħal individwali.

In-naħal tal-għasel għandhom diversi saffi ta 'difiża, li jibdew b'ostakli strutturali bħal rita li ma tagħmilx ilma li jimblokka d-dħul tal-patoġenu (Moret u Moreau, 2012). Il-patoġeni li jinbelgħu se jispiċċaw fin-nofs imsaren, l-organu responsabbli mid-diġestjoni u l-assorbiment, u hawnhekk jiffaċċjaw barriera fiżika oħra, il-matriċi peritrofika (Brandt et al., 1978; Lehane, 1997; Hegedus et al., 2009). Din hija sustanza kitinoża li toħroġ miċ-ċelluli epiteljali tan-nofs tal-musrana li jaġixxu bħala għarbiel biex jimblokka partiċelli kbar bħal ċelluli patoġeniċi milli jiġu assorbiti.

Jekk il-patoġeni jiksru dawn l-ostakli fiżiċi, jiġu skoperti minn riċetturi ta 'rikonoxximent tal-mudell tal-patoġeni li jattivaw diversi risponsi immuni ċellulari u umorali. Id-difiżi ċellulari jistgħu jinkludu fagoċitosi mill-emoċiti (Evans u Spivak, 2010; Marringa et al., 2014; Lavine and Strand, 2002), filwaqt li r-reazzjonijiet umorali jistgħu jinkludu l-produzzjoni ta’ melanin biex jinkapsulaw partiċelli barranin (González-Santoyo u Córdoba-Aguilar, 2012) u l-produzzjoni ta’ peptidi antimikrobiċi (AMPs) li joqtlu direttament il-patoġeni (Bulet u Stöcklin, 2005; Bulet et al., 1999; Evans et al., 2006). Ir-rispons tal-melanizzazzjoni jiġi indott meta l-protease tas-serina tal-velenu tan-naħal (Bi-VSP) jattiva l-kaskata tal-fenolossidasi li twassal għall-produzzjoni ta 'melanin (Choo et al., 2010). AMPs, bħal lysozyme u defensin-1, huma indotti wara l-attivazzjoni tal-mogħdijiet ta' Toll jew ta' defiċjenza immuni (IMD) (De Gregorio et al., 2002).

Minkejja armament robust kontra l-patoġenu, in-naħal tal-għasel jippossjedu inqas ġeni relatati mal-immunità minn speċi tan-naħal solitarji (Evans et al., 2006; Claudianos et al., 2006), grazzi l-aktar għall-evoluzzjoni tal-immunità soċjali. Il-ġelatina rjali fiha ħafna mill-enżimi u l-peptidi li għadna kif ġew diskussi, inklużi l-Bi-VSP, il-lysozyme u d-defensin-1, kif ukoll il-glucose oxidase, li jipproduċi hydrogen peroxide li joqtol ukoll il-patoġeni (Fontana et al., 2004; Fujiwara). et al., 1990; Romanelli et al., 2011; Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012). Dan l-ikel imsaħħaħ huwa partikolarment importanti għall-membri tal-kolonji l-aktar vulnerabbli, il-larva żgħar, li d-difiżi immuni tagħhom għadhom qed jiżviluppaw. Pereżempju, larvi żgħar għandhom livelli aktar baxxi ta’ pro-phenoloxidase (Chan and Foster, 2008; Chan et al., 2009) (importanti fil-kaskata tal-melanizzazzjoni) u AMPs (Chan and Foster, 2008), u l-musrana tan-nofs u l-imsaren tagħhom li għadhom qed jimmaturaw. matriċi peritrofika tħalli l-epitelju midgut tagħhom vulnerabbli għall-ksur (Yue et al., 2008; Garcia-Gonzalez and Genersch, 2013; Riessberger-Gallé et al., 2016).

Bħala riżultat, il-larva huma suxxettibbli għal xi mard li huwa pjuttost innokwa għall-adulti. Dan jinkludi foulbrood Amerikan, ikkawżat mill-larva Paenibacillus tal-batterji Gram-pożittivi li jiffurmaw ispori (Genersch, 2010; Hansen u Brødsgaard, 1999). L-infezzjoni tal-foulbrood Amerikana mhix biss letali għall-kolonji iżda wkoll għalja għal dawk li jrabbu n-naħal minħabba li l-ispori huma reżiljenti u jibqgħu vijabbli għal snin sħaħ, li jfisser li dawk li jrabbu n-naħal huma sfurzati jeqirdu l-doqqajs infettati. Għalhekk, il-larva għandhom jibbenefikaw minn ikel supplimentat b'komposti li joqtlu l-patoġeni, jew b'partiċelli patoġeniċi li jistgħu jqanqlu l-immunità.

F'dan l-istudju, l-għan tagħna kien doppju: l-ewwel, li niddeterminaw jekk infermiera li jikkunsmaw ċelluli veġetattivi tal-foulbrood Amerikani jistgħux jinkorporaw frammenti ta 'patoġenu fil-ġelatina rjali tagħhom, u t-tieni, biex niżguraw jekk dan jinduċix livelli ogħla ta' proteini immuni misjuba fir-ġelatina rjali. Għal dan il-għan, aħna mitmugħa infermiera b'ċelluli tal-larva P. ittikkettjati b'mod fluworexxenti u maqtula bis-sħana u eżaminajna l-ġelatina rjali li pproduċew minn hemm 'il quddiem. Aħna użajna mikroskopija fluworexxenti biex nikkonfermaw il-preżenza ta 'frammenti taċ-ċelluli tal-batterja fil-ġelatina rjali, u spettrometrija tal-massa biex tqabbel il-profil proteomiku tal-ġelatina rjali minn kolonji kkontestati u ta' kontroll. B'mod partikolari, ittestjajna l-ipoteżi li l-ġelatina rjali minn kolonji kkontestati tkun ogħla fil-proteini immuni glucose oxidase, Bi-VSP, lysozyme, u defensin-1.

MATERJALI U METODI

Kultivazzjoni ta' batterji patoġeniċi

Ċelloli veġetattivi ta 'P. larvae nkisbu mill-ġbir tal-kultura tal-Università ta' Göteburg u kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet normali ta 'tkabbir ta' batterji. Fil-qosor, iċ-ċelloli ġew sospiżi f'brodu MYPG u miżmuma f'temperatura ta '37 grad matul il-lejl f'inkubatur li tħawwad, qabel ma ġew miksija fuq agar MYPG u jitħallew jinkubaw għal ġimgħa f'temperatura ta' 37 grad. Wara dan, iċ-ċelloli veġetattivi ġew maħsuda u sospiżi f'1 × phosphate-buffered saline (PBS), qabel ma nqatlu bis-sħana f'awtoklavi. Iċ-ċelloli tal-batterja mhux vijabbli li rriżultaw imbagħad ġew konjugati ma' żebgħa fluworexxenti bl-użu ta' pHrodo™ Red Phagocytosis Particle Labeling Kit (Invitrogen #a10026) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Ladarba miżbugħin, iċ-ċelloli P. larvae ġew sospiżi f'1 × PBS għal konċentrazzjoni ta '10 mg ml-1 u maħżuna fi gradi 4 sakemm lesti għall-użu.

In-naħal u l-esperiment tal-għalf

In-naħal tal-għasel Ewropew imgħammrin b'mod naturali, Apis mellifera Linnaeus 1758, inżammu f'kaxxi standard tad-doqqajs Langstroth fl-Università ta 'Ħelsinki fil-kampus ta' Vikki fil-Finlandja. Dawn il-doqqajs standard Langstroth servew bħala donaturi għal kolonji iżgħar mingħajr irġejjen miżmuma f'doqqajs ta 'tgħammir żgħir. Biex jiġu stabbiliti dawn il-kolonji iżgħar mingħajr irġejjen, taqsima ta 'moxt ta' brood li kien fiha 1-larva ta 'ġurnata ta' kejl ta '12 ċm × 12 ċm ġiet imneħħija mid-doqqajs tad-donatur u ttrasferita f'kaxxa Nuc ta' tgħammir żgħir. Bejn wieħed u ieħor 100–200 infermier ġew trasferiti wkoll mill-istess doqqajs donatur u mqiegħda fil-kaxxa Nuc tat-tgħammir. L-infermiera ġew identifikati bħala dawk l-individwi li dehru jidħlu fiċ-ċelluli tad-dar u jitimgħu l-larva fid-doqqajs tad-donaturi.

B'kollox, ġew stabbiliti N{{0}} kolonji żgħar mingħajr irġejjen, kull waħda minn doqqajs donatur separat. Il-kolonji saru mingħajr irġejjen biex jistimulaw lill-infermiera biex jipproduċu aktar ġelatina rjali biex jagħmlu reġina ġdida (Sahinler u Kaftanoglu, 1997). L-infermiera u l-larva żgħar ġew issiġillati fil-kaxxi tat-tgħammir tal-mini Nuc għal 3 ijiem u pprovduti b'soluzzjoni ta '30 fil-mija ta' sukrożju f'siringe-feeder sospiż mis-saqaf. N=3 kolonji rċevew dieta ta' kontroll, filwaqt li N=3 kellhom larva ta' P. ittikkettati b'mod fluworexxenti miżjuda mas-sukrożju tagħhom għal konċentrazzjoni finali ta' patoġenu ta' 0.6 mg ml-1. Dieti ta 'kontroll u patoġenu mwaħħlin mill-ġdid ġew mimlija b'ikel frisk kuljum. Wara t-3 ijiem, il-ġelatina rjali ddepożitata ġdida kienet maħsuda mill-pettijiet tal-brood tal-ħaddiema ta 'kull kolonja, u maqsuma f'wieħed minn żewġ flussi tax-xogħol: mikroskopija tal-fluworexxenza jew analiżi tal-proteomika.

Mikroskopija tal-fluworexxenza

Royal jelly minn kull moxt ġiet trasferita f'tubi ta' reazzjoni ta' 200 µl. Biex nistmaw il-volum ta 'ġelatina miksuba minn kull doqqajs, imlejna minn qabel 30 tubu ta' reazzjoni b'volumi dejjem jiżdiedu ta 'ilma li jvarjaw minn 1 sa 30 µl u kellna żewġ osservaturi b'mod indipendenti u bl-addoċċ jevalwaw liema volum ta' ilma qabbel mal-volum tal-ġelatina rjali. Fis-6 każijiet kollha, kull kampjun tal-ġelatina rjali rċieva l-istess stima tal-volum miż-żewġ osservaturi. Sussegwentement, kull kampjun tal-ġelatina rjali ġie dilwit b'1 × PBS (pH 7.4) għal konċentrazzjoni finali ta '10 fil-mija bil-volum u vortexed. Il-kampjuni ġew imbagħad applikati għal emoċitometru u eżaminati taħt mikroskopju fluworexxenti Leica DM6000. Fuq l-emoċitometru, il-kamp viżiv huwa maqsum indaqs f'9 sezzjonijiet, u għamilna osservazzjonijiet fuq 5 sezzjonijiet b'kollox: l-4 sezzjonijiet tal-kantunieri u s-sezzjoni taċ-ċentru. Dan ippermettilna nikkalkulaw il-konċentrazzjoni ta 'partiċelli fluworexxenti għal kull mikrolitru ta' ġelatina rjali (C), bl-użu tal-formula li ġejja:

fejn P huwa n-numru totali ta' partiċelli fluworexxenti pożittivi osservati f'kull kampjun, S huwa n-numru totali ta' kwadri osservati fuq l-emoċitometru (N{{0}}), V huwa l-volum ta' kull kwadru osservat fuq l-emoċitometru (0.1 µl) u D huwa l-fattur ta' dilwizzjoni tar-royal jelly (10x dilwizzjoni). Il-kampjuni kollha ġew osservati taħt settings identiċi tal-mikroskopju.

Il-kamera ġiet issettjata f'riżoluzzjoni ta' {{0}}bit (Waters, 2009), li tagħti valur ta' intensità ta' luminożità li jvarja minn 0 sa 65,535. Biex nidentifikaw sinjali ta 'fluworexxenza pożittivi fil-kampjuni tad-dieta tal-patoġeni tagħna, l-ewwel kellna nistabbilixxu livell bażi ta' storbju fl-isfond, li fuqu stajna niddeterminaw jekk sinjal kienx fluworexxenza reali jew sempliċiment artifact. Biex tagħmel dan, aħna eżaminajna l-valuri ta 'intensità minn kull immaġni tal-kampjuni tad-dieta ta' kontroll tagħna, u f'kull wieħed, aħna naqqas il-valur ta 'intensità minima mill-valur ta' intensità massima biex tikseb firxa ta 'ħoss fl-isfond (Waters, 2009). Imbagħad qabbilna l-immaġini kollha tal-kampjun tad-dieta ta 'kontroll tagħna biex niksbu devjazzjoni medja u standard tal-firxa tal-ħoss fl-isfond. Minn hemm 'il quddiem, qiesna kwalunkwe sinjal li osservajna fil-kampjuni tad-dieta tal-patoġeni tagħna bħala sinjal ta' fluworexxenza pożittiv 'il fuq mill-istorbju fl-isfond jekk kien mill-inqas 3 devjazzjonijiet standard (P Inqas minn jew ugwali għal 0.01) 'il fuq mill-medda ta' intensità medja fl-isfond. Il-medda medja (sd) tal-intensità tal-isfond kienet 329±27

Kontrolli pożittivi u negattivi addizzjonali

Biex tikkonferma li l-batterji ttikkettjati jistgħu jiffluworexxew fil-ġelatina rjali, ġabarna kampjuni tal-ġelatina rjali minn reġjuni multipli Ewropej u tal-Amerika ta’ Fuq (l-Awstrija, in-Norveġja, l-Arizona, u l-Illinois, l-Istati Uniti), iddilwejthom għal 10 fil-mija fil-buffer tal-PBS, u miżjud batterji ttikkettjati (1 fil-mija bil-volum) direttament mal-kampjuni. Aħna użajna buffer PBS f'pH standard 7.4 (kif użat hawn fuq), jew f'pH imnaqqas 4. 0 li jaqbel mal-aċidità tal-ġelatina rjali biex jiddeterminaw jekk l-aċidità tal-ambjent taffettwax il-livell ta 'fluworexxenza, kif iddikjarat mill- manifattur tal-kit tat-tikkettar. Barra minn hekk, wettaqna wkoll kontroll negattiv addizzjonali (pH 4.0 PBS, l-ebda batterja ttikkettjata) biex nikkonferma li l-osservazzjonijiet tal-fluworexxenza ma kinux dovuti għal artifacts tal-mikroskopija jew awtofluworexxenza ta 'komponenti materjali. Sibna li l-kampjuni tal-ġelatina rjali mir-reġjuni ġeografiċi kollha wrew fluworexxenza meta ġew miżjuda batterji ttikkettjati, irrispettivament mill-pH tal-buffer użat (Fig. S1). Dan ix-xogħol ta 'mikroskopija sar fuq Zeiss AxioZoom V16 bl-użu ta' kamera monokroma Axiocam HRm.

Preparazzjoni tal-kampjun għall-analiżi tal-proteomika

Il-kampjuni tal-ġelatina rjali ġew dilwiti biż-żieda ta' 150 µl 8 mol l-1 urea u ssebbati f'banju ta' l-ilma. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet aġġustata għal 2.1 mg ml-1 bl-użu tal-assaġġ Bradford b'volum finali ta' 100 µl. Ir-rabtiet taċ-ċisteine ​​tnaqqsu b'45 mmol l-1 dithiothreitol (# D0632, Sigma-Aldrich) għal 20 min fi 37 grad u alkilati b'0.1 mol l-1 iodoacetamide (#57670 Fluka, Sigma-Aldrich) f'temperatura tal-kamra. Il-kampjuni ġew diġeriti billi żiedu 0.75 µg trypsin (Sequencing Grade Modified Trypsin, V5111, Promega) matul il-lejl f'37 grad. Wara d-diġestjoni, il-peptidi ġew ippurifikati b'kolonni mikro spin C18 (Apparat ta 'Harvard) skond il-protokoll tal-manifattur. Il-peptidi mnixxfa ġew rikostitwiti f'buffer A (30 µl 0.1 fil-mija aċidu trifluworoaċetiku f'1 fil-mija aċetonitrile).

Kromatografija likwida akkoppjata ma' spettrometrija tal-massa tandem (LC-MS/MS)

L-analiżi twettqet fuq kromatografu likwidu EASY-nLC1{{10}}00 (Thermo Fisher Scientific) imqabbad ma' spettrometru tal-massa ibridu Velos Pro-Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific) b'sors ta' joni nanoelettrospray ( Thermo Fisher Xjentifiku). Il-kampjuni LC-MS/MS ġew isseparati bl-użu ta' sett ta' żewġ kolonni li jikkonsisti f'kolonna ta' nassa C18-Pepmap ta' 2 ċm (Thermo Fisher Scientific), segwita minn kolonna analitika ta' 15 ċm C18-Pepmap ( Thermo Fisher Xjentifiku). Il-gradjent ta 'separazzjoni lineari kien jikkonsisti f'5 fil-mija buffer B (0.1 fil-mija aċidu trifluoroacetic f'98 fil-mija aċetonitrile) għal 5 min, 35 fil-mija buffer B għal 60 min, 80 fil-mija buffer B għal 5 min u 100 fil-mija buffer B għal 10 min f'fluss rata ta '0.3 µl min-1. Għal kull ġirja LC-MS/MS, 6 ul tal-kampjun ġew injettati u analizzati. Ġiet akkwistata skan MS sħiħa b'riżoluzzjoni ta' 60,000 fil-medda tal-massa normali fl-analizzatur tal-orbitrap u segwita b'CID-MS2 top 20 joni prekursuri l-aktar intensi fi ħdan in-nassa tal-jone (enerġija 35). Id-dejta ġiet akkwistata bl-użu tas-softwer LTQ Tune.

Identifikazzjoni tal-proteini

F'approċċ ta 'proteomics shotgun, il-proteini huma diġeriti enżimatikament f'peptidi iżgħar, u dawn il-peptidi huma mbagħad imqabbla ma' proteini f'ġenoma annotat. Xi wħud minn dawn is-sekwenzi tal-peptidi jistgħu jinqasmu minn diversi proteini, filwaqt li xi wħud huma uniċi għal proteina waħda fil-proteome. L-analiżi tagħna tat total ta '496 hits ta' proteina li fihom mill-inqas 1 peptide spectrum match (PSM) u 1 peptide uniku.

Biex neskludu aktar il-pożittivi foloz, ikkunsidrajna biss proteini b'mill-inqas 2 peptidi uniċi bħala hits ta' proteini affidabbli, kif sar fi studji oħra dwar il-proteomika tal-ġelatina rjali (Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), u parzjalment minħabba li l-varjazzjoni sperimentali fil-passi tal-preparazzjoni tal-kampjuni taffettwa l-aktar l-inqas proteini abbundanti f'kampjuni spettrometriċi tal-massa (Zhang et al., 2010). Proteini ġew annotati għall-ġenoma tan-naħal tal-għasel Amel_4.5, u użajna UniProt u GenBank biex nikkonfermaw l-identitajiet u l-funzjonijiet tagħhom. Imbagħad qabbilna l-abbundanza ta' 4 proteini relatati mal-immunità fid-dieta ta' kontroll u l-ġelatina rjali tad-dieta tal-patoġeni: glucose oxidase, BiVSP, lysozyme, u defensin-1.

Analiżi statistika

Biex tevalwa l-abbundanza ta 'proteini relatati mal-immunità bejn id-dieta ta' kontroll u l-ġelatina rjali tad-dieta tal-patoġenu, qabbilna l-valuri PSM tal-proteini magħżula tagħna. Aħna użajna testijiet tas-somma tal-rank Wilcoxon mhux parametriċi biex nindirizzaw id-daqs limitat tal-kampjun tagħna (N=3 għal kull trattament). Aħna użajna paraguni ta 'denb wieħed peress li l-ipoteżi ppjanati tagħna bassru li dawn il-proteini immuni magħżula jkunu regolati 'l fuq fil-ġelatina rjali minn kolonji mitmugħa b'patoġeni. Bidliet darbiet fl-abbundanza tal-proteini ġew ikkalkulati bħala (PSMpathogen-PSMcontrol) / PSMcontrol. L-analiżi kollha saru f'R (verżjoni 3.5.2).

RIŻULTATI

Frammenti ta 'patoġenu fil-ġelatina rjali

Sibna li l-kampjuni tal-ġelatina rjali mill-kolonji kollha tad-dieta tal-patoġeni kien fihom partiċelli li jiffluworexxew b'intensità ogħla b'mod sinifikanti mil-limitu tal-fluworexxenza fl-isfond stabbilit tagħna (ara Materjali u Metodi), li jissuġġerixxi li l-frammenti batterjali ġew inkorporati fil-ġelatina rjali. L-ebda kampjun tal-ġelatina rjali tad-dieta ta 'kontroll ma kien fih partiċelli li qabżu dan il-limitu (Fig. 1). Bħala medja, il-kolonji tad-dieta tal-patoġeni kellhom 66.67±28.87 (medja±sd) partiċelli fluworexxenti għal kull mikrolitru ta’ royal jelly (N=3) ​​filwaqt li l-kolonji mitmugħa b’kontroll kellhom 0 partiċelli fluworexxenti għal kull mikrolitru ta’ royal jelly ( N=3) (Fig. 1).

Proteomika

Sibna total ta '496 hits ta' proteina, u minn dawn, 44 kellhom mill-inqas 2 peptidi uniċi assenjati lilhom (Tabella 1). L-aktar proteini abbundanti fil-kampjuni kollha kienu proteini ewlenin tal-ġelatina rjali, kif kien mistenni. B'mod ġenerali, il-proteini li osservajna fil-kampjuni tagħna kienu pjuttost konsistenti ma' studji proteomika reċenti oħra tal-ġelatina rjali (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Fujita et al., 2012, 2013; Hu et al., 2019; Zhang et al., 2014), iżda hemm ftit proteini identifikati f'dan l-istudju li ma ġewx irrappurtati x'imkien ieħor. Dawn jinkludu Transferrin, molekula tat-trasport tal-ħadid (Kucharski u Maleszka, 2003) li tinsab ukoll fit-tessut tal-glandola tal-velenu tan-naħal tal-għasel (Peiren et al., 2008); Serpin-5, inibitur tas-serine protease magħruf li jirregola l-attivazzjoni tal-profenolossidasi f'insetti oħra (Li et al., 2016); Qaqoċċ, proteina kimosensorja b'funzjonijiet fil-lokomozzjoni tal-larva f'Drosophila melanogaster (Andrés et al., 2014); u NPC2-bħal, trasportatur tal-kolesterol b'funzjonijiet alloparentali implikati fin-naħal tal-għasel (Thompson et al., 2006). Sibna wkoll 3 proteini addizzjonali fil-kampjuni tal-ġelatina rjali tad-dieta tal-patoġeni tagħna: Glutathione peroxidase, Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, u proteina mhux ikkaratterizzata (LOC725202). Dawn il-proteini nstabu wkoll fil-kampjuni tad-dieta ta 'kontroll tagħna, iżda naqsu milli jissodisfaw il-kriterji tagħna li jkollna 2 peptidi uniċi (Tabella 1).

Meta tqabbel il-kampjuni tad-dieta tal-kontroll u tad-dieta tal-patoġenu, osservajna ftit li xejn bidla fl-abbundanza relattiva tal-proteini fi ħdan ir-royal jelly (Tabella 1). Fost il-proteini immuni fokali tagħna, ma sibna l-ebda differenza sinifikanti fil-livelli tal-proteini bejn it-trattamenti għall-glucose oxidase (U=7, P=0.9), Bi-VSP (U=1.5, P=0.134), jew liżożima (U=2, P=0.184). Madankollu, sibna ferm aktar mid-defensin AMP-1 f'kampjuni tad-dieta tal-patoġenu milli f'kampjuni tad-dieta ta' kontroll (U=0, P=0.05) ( Fig. 2). Kellha bidla darbiet ta 'plus 0.68.

DISKUSSJONI

Dan l-istudju juri li l-infermiera li jibilgħu ċelluli tal-patoġenu P. larvae jidhru li jinkorporaw frammenti taċ-ċelloli fil-ġelatina rjali li jipproduċu (Fig. 1). Riċentement urejna li l-batterji li jinbelgħu mill-ħaddiema huma ttrasportati lejn il-glandoli ipofarinġi, is-sit tas-sintesi tal-ġelatina rjali (Harwood et al., 2019), u hawnhekk nuru li huma inkorporati fil-ġelatina rjali. Din is-sejba tirrappreżenta mogħdija ta 'immunità soċjali injorata li tista' tippermetti lil sħabi tal-bejta jaqsmu memorja immunoloġika. Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu wkoll li l-kompożizzjoni tal-ġelatina rjali tista 'tkun sensittiva għal materjal barrani li jiċċirkola b'mod sistemiku fl-emolymph. Fi studju reċenti simili, riċerkaturi sabu li infermiera mitmugħa b'RNA double-stranded (dsRNA) setgħu jinkorporaw dawn il-molekuli fil-ġelatina rjali u jittrasferixxuhom għal larva, fejn id-dsRNA baqa 'bijoloġikament attiv (Maori et al., 2019). dsRNA jattiva l-mogħdija ta 'interferenza ta' RNA antivirali (RNAi) li tqanqal is-sajlenser tal-ġeni speċifiċi għas-sekwenza, u dsRNA sintetiku jintuża ta 'spiss għal studji ta' knockdown tal-ġeni mmirati (Fire et al., 1998). Barra minn hekk, studju ieħor wera li infermiera mitmugħa bil-pestiċidi jistgħu wkoll jinkorporaw traċċi ta’ dawn l-agrokimiċi fil-ġelatina rjali tagħhom (Böhme et al., 2018), għalkemm l-enfasi hawnhekk kienet fuq kemm il-glandoli ipofarinġi jipprevjenu l-pestiċidi sistemiċi milli jidħlu fil-ġelatina rjali. .

Madankollu, dawn ir-riżultati jindikaw li l-kompożizzjoni tal-ġelatina rjali tista’ tkun sensittiva għall-kundizzjoni tan-naħal infermiera. Dawn is-sejbiet jimplikaw li l-ġelatina rjali tista' sservi bħala kondjuwit għal AB Fig. 1. Mikrografiji ta' fluworexxenza u brightfield ta' kampjuni ta' ġelatina rjali minn trattamenti ta' dieta ta' kontroll u patoġeni osservati fuq emoċitometru. Il-kampjuni kollha (A, trattament ta 'dieta ta' kontroll; B, trattament ta 'dieta ta' patoġenu) ġew ippreparati simultanjament bl-użu ta 'protokolli identiċi u osservati taħt settings identiċi tal-mikroskopju bl-użu ta' Leica DM6000. Immaġini skuri fil-kolonni tan-naħa tax-xellug ittieħdu b'laser TRITC biex jidentifikaw il-fluworexxenza fil-wavelength ta 'Texas Red, filwaqt li immaġini fil-kolonni tal-lemin huma stampi brightfield tal-istess żona biex juru d-depożizzjoni tal-ġelatina rjali fuq l-emoċitometru. Spots pożittivi ta' fluworexxenza (vleġeġ bojod) kienu osservati biss fil-kampjuni tad-dieta tal-patoġenu (B) u mhux fil-kampjuni tad-dieta ta' kontroll (A). 4 mistoqsijiet immedjati.

L-ewwel, kif l-espożizzjoni għal patoġenu twassal biex l-infermiera jipproduċu livelli elevati ta' defensin-1 fir-royal jelly? Possibbiltà waħda hija li frammenti ta' P. larvae jingħaqdu mar-riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudell tal-patoġenu fil-mogħdija Toll (għall-batterji Gram-pożittivi) u jinduċu traskrizzjoni akbar tal-ġeni tad-defensin-1, iżda l-evidenza għal dan hija kemmxejn inkonsistenti. Studji wrew li l-ħaddiema adulti esposti għall-batterja, inkluż il-foulbrood Amerikan, se jżidu l-espressjoni tad-defensin-1 (Evans et al., 2006; CasteelsJosson et al., 1994), iżda studju reċenti naqas milli josserva upregulation sinifikanti ta ' espressjoni tad-defensin-1 fit-tessut tar-ras tal-infermiera wara espożizzjoni għal foulbrood Amerikan (López-Uribe et al., 2017).

Madankollu, AMPs tal-insetti bħad-defensin-1 jistgħu jiġu osservati fl-emolymph għal ġimgħat wara l-espożizzjoni tal-patoġenu (Casteels, 1998), anke meta t-traskrizzjoni ta’ ġeni AMP bħal dawn tonqos matul dak iż-żmien (Uttenweiler-Joseph et al., 1998), għalhekk il-kejl tal-espressjoni tal-ġeni biss jista' jitlef informazzjoni importanti dwar id-disponibbiltà tal-prodotti finali tal-peptidi. Alternattivament, l-espożizzjoni tal-patoġenu tista' tirregola 'l fuq it-traduzzjoni ta' defensin-1 mRNA f'peptidi, jew iżid ir-rata ta' modifiki ta' wara t-traduzzjoni użati biex jattivaw il-peptide (Casteels-Josson et al., 1994), iżda dan irid ikun studjat aktar.

It-tieni mistoqsija mqajma minn dawn ir-riżultati hija jekk bidla relattiva ta' darbiet ta' plus 0.68 fid-defensin-1 hijiex bijoloġikament rilevanti. Konvenzjonalment, ħafna studji tal-proteomika tal-bniedem jagħżlu limitu ta' plus 1.2 għal upregulation sinifikanti (Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009), għalhekk id-defensin-1 ma tissodisfax dan il-kriterju. Madankollu, anki żidiet modesti fil-konċentrazzjoni tad-defensin-1 fir-royal jelly jistgħu jtejbu r-reżistenza tal-larva għall-foulbrood Amerikan. Mhux biss id-defensin-1 intwera li jinibixxi direttament lill-foulbrood Amerikan (Bachanová et al., 2002; Bíliková et al., 2001) iżda wkoll huwa effettiv kontra batterji Gram-pożittivi f'konċentrazzjonijiet baxxi daqs 1 µmol l− 1 (Fujiwara et al., 1990). Barra minn hekk, bosta komponenti tas-sistema immuni intrinsika huma magħrufa li jaħdmu b'mod sinerġiku, fejn żewġ komponenti li jaħdmu flimkien għandhom effetti inibitorji tal-patoġenu akbar mis-somma ta 'kull komponent li jaħdem b'mod indipendenti.

Pereżempju, testijiet ta 'inibizzjoni tat-tkabbir batterjali wrew li l-AMPs u l-lysozyme jaħdmu flimkien biex itejbu ħafna l-effettività ta' xulxin (Chalk et al., 1994). Lysozyme intwera wkoll li jiġġieled il-patoġeni b'mod sinerġiku ma' apolipoprotein-III (ApoLp-III) (Zdybicka-Barabas et al., 2013), proteina li tittrasporta l-lipidi b'funzjonijiet anti-patoġeniċi fl-insetti (Whitten et al., 2004; Kim; u Jin, 2015) li jinstab fil-ġelatina rjali (Furusawa et al., 2008; Han et al., 2011; Zhang et al., 2014; Fujita et al., 2013). Fl-aħħarnett, is-sistemi immuni tal-larva tan-naħal tal-għasel żgħar li jimmaturaw jistgħu jitħabtu biex jipproduċu d-defensin-1 tagħhom meta jiġu attakkati minn foulbrood Amerikan, peress li studji wrew li sfida bħal din tinduċi ftit jew xejn espressjoni tad-defensin-1 fil-larva (Romanelli et al., 2011 Cremer et al., 2007; Serang et al., 2013; Keenan et al., 2009, għalkemm ara Bachanová et al., 2002 għal eċċezzjoni). Għalhekk, defensin addizzjonali-1 minn infermiera esposti jistgħu jissupplimentaw in-nuqqas tal-larva ta' dan l-AMP kruċjali. Meħuda flimkien, dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li anke żidiet modesti fid-defensin-1 fir-royal jelly jistgħu jkunu bijoloġikament rilevanti fil-protezzjoni tal-membri l-aktar vulnerabbli tal-kolonja.

Dan l-istudju wera wkoll aktar ir-rwol kritiku li għandha l-proteina Vg fl-immunità tan-naħal. Minħabba r-rwol tiegħu bħala riċettur ta' rikonoxximent tal-mudell tal-patoġenu, li ġie dokumentat f'firxa wiesgħa ta' taxa tal-annimali (Salmela et al., 2015; Du et al., 2017; Garcia et al., 2010; Knight, 2019; Li et al., 2015; al., 2008, 2009; Liu et al., 2009; Zhang et al., 2011), kif ukoll ir-rwol tiegħu fil-formazzjoni tal-bajd, Vg ġie identifikat bħala l-proteina trasportatur li tittrasporta l-elicitors immuni fil-bajd tar-reġina (Salmela et al. al., 2015). Bl-istess mod, fl-infermiera, sejbiet reċenti jissuġġerixxu li Vg għandu rwol ewlieni fit-trasport ta 'patoġeni inġeriti lejn il-glandoli ipofarinġi (Harwood et al., 2019). Vg jittieħed mill-glandoli ipofarinġi tal-infermiera biex jintuża bħala donatur ta 'aċidu amminiku fil-produzzjoni tal-ġelatina rjali (Amdam et al., 2003), u Vg jista' jittrasporta batterji fil-glandoli biex jiġu inkorporati fil-ġelatina. Għalhekk, Vg jista’ jkollu rwol fl-istadji kollha tat-TGIP fil-livell tal-kolonja fin-naħal tal-għasel, mill-ewwel inokulazzjoni u inkorporazzjoni fil-ġelatina rjali sal-kunsinna lir-reġina jew lill-larva, u finalment fit-trasport fl-ovarji tar-reġina.

Dan l-istudju wera li l-kompożizzjoni tal-ġelatina rjali tista' tiġi mibdula minn sfida ta' patoġenu, kemm bl-inkorporazzjoni ta' frammenti ta' patoġenu kif ukoll permezz ta' livelli miżjuda tad-defensin AMP-1. Il-kapaċità li jittrasferixxu frammenti ta 'patoġenu fil-ġelatina rjali tfisser li l-priming immuni transġenerazzjonali jista' jiffunzjona f'livell ta 'kolonja kollha fin-naħal tal-għasel. Minbarra t-trasferiment vertikali ta’ li eliċituri immuni minn mara riproduttiva għall-frieħ tagħha, in-naħal tal-għasel jista’ jkollhom passaġġ aktar kumpless li jmur minn frieħ adulti (infermiera) għal nisa riproduttivi għal frieħ futuri, kif ukoll trażmissjoni orizzontali minn frieħ adulti għal immaturi. frieħ. Il-benefiċċju hawnhekk ikun li l-larva jiġu mlaqqma b’repertorju akbar ta’ elicitors immuni akkumulati mill-esperjenza immunoloġika kollettiva ta’ ħaddiema li jiġbru riżorsi minn barra l-bejta, u b’hekk il-larva tkun aktar reżistenti kontra patoġeni li x’aktarx jiltaqgħu magħhom meta joħorġu mill-bejta. .

Rikonoxximenti

Nirringrazzjaw lil Siiri Fuchs, Salla Lohi, Mati Leponiemi, Franziska Dickel, Maarit Nurminen, Marianne Teichmann, u Taina Stark għall-għajnuna tagħhom fil-ġbir tad-dejta u l-konsultazzjoni tal-analiżi. Nirringrazzjaw ukoll lil Austin Cyphersmith għall-assistenza teknika bil-mikroskopija.

Interessi li jikkompetu

GH u GA ma jiddikjaraw l-ebda interessi kompetittivi jew finanzjarji. HS u DF huma elenkati bħala inventuri fuq privattiva (WO2017017313A1) għal vaċċin tan-naħal li jittiekel. Din il-privattiva hija assenjata lil Dalan Animal Health Inc., fejn DF iservi bħala Uffiċjal Kap Xjentifiku. Ir-riċerka ppreżentata f'dan id-dokument twettqet b'mod indipendenti, mingħajr ebda riżorsi finanzjarji, materjali jew analitiċi pprovduti minn Dalan Animal Health Inc. jew kwalunkwe intrapriża kummerċjali oħra.

Kontribuzzjonijiet tal-awtur

Kunċettwalizzazzjoni: GH, HS, GA; Metodoloġija: GH, HS; Validazzjoni: GH; Analiżi formali: GH, HS; Investigazzjoni: GH, HS; Riżorsi: HS, DF, GA; Kurazzjoni tad-dejta: GH; Kitba - abbozz oriġinali: GH; Kitba - reviżjoni u editjar: GH, HS, DF, GA; Viżwalizzazzjoni: GH; Superviżjoni: GA; Amministrazzjoni tal-proġett: DF, GA; Akkwist ta 'finanzjament: GH, DF, GA

Finanzjament

GH kien appoġġjat mill-Programm ta 'Riċerka u Appoġġ tal-Gradwati tal-Università tal-Istat ta' Arizona (LM51097GH). DF kien appoġġjat minn għotja tal-Finlandja tan-Negozju (2348/31/2017), u għotja tal-Akkademja tal-Finlandja (6303369). GA kienet appoġġata min-Norges Forskningsråd (262137).

For more information:1950477648nn@gmail.com