SLC37A2, Molekula relatata mal-fosfru tiżdied fiċ-Ċelloli tal-Muskoli Lixxi fl-Aorma Kalkifikata

Kalċifikazzjoni vaskularihuwa sors ewlieni tamard kardjovaskularif'pazjenti b'mard kroniku tal-kliewi.Iperfosfatemjaiwassal għal żieda fl-influss tal-fosfru intraċellulari, li jwassal għal żieda fiċ-ċelloli li jixbħu l-osteoblast fiċ-ċelloli tal-muskoli lixxi vaskulari. PiT-1 jittrasferixxi l-fosfat fiċ-ċelloli vaskulari tal-muskoli lixxi. Madankollu, il-mekkaniżmu tal-kalċifikazzjoni vaskulari mhuwiex mifhum kompletament. Dan l-istudju investiga molekuli kandidati relatati mal-fosfru minbarra PiT-1. Aħna ipoteżijna li molekuli relatati mal-fosfru li jappartjenu għall-trasportatur tas-solut(SLC) superfamilja tkun involuta fil-kalċifikazzjoni vaskulari. Bħala riżultat tal-analiżi tal-mikroarray tad-DNA, aħna ffukajna fuq SLC37A2 u wrejna li l-espressjoni tal-mRNA ta 'dawn iċ-ċelloli żdiedet fuq ċelluli tal-muskoli lixxi aortiċi kalċifikati (AoSMC). SLC37A2 ġie rrappurtat li jittrasporta kemm skambji tal-glukożju-6-fosfat/fosfat kif ukoll fosfat/fosfat. Analiżi in vitro wriet li SLC37A2expression ma kinitx affettwata minn infjammazzjoni fuq AoSMC. L-espressjoni ta 'SLC37A2 mRNA u proteina żdiedet f'AoSMC kalċifikat. In vivo, analiżi wriet li SLC37A2 espressjoni mRNA fl-aorta tamard kroniku tal-kliewifirien kien korrelatat ma 'ġeni markaturi osteoġeniċi. Barra minn hekk, SLC37A2 kien espress fiż-żona tal-kalċifikazzjoni vaskulari fifirien mard kroniku tal-kliewi. Bħala riżultat, urejna li SLC37A2 hija waħda mill-molekuli li jiżdiedu magħhomkalċifikazzjoni vaskulariin vitro u in vivo.

Kliem Ewlenin: SLC37A2,kalċifikazzjoni vaskulari, ċelluli tal-muskoli lixxi aortiċi,mard kroniku tal-kliewi, iperfosfatemja

Agħfas HAWN BIEX IKseb ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU NATURALI B'25% ECHINACOSIDE U 9% ACTEOSIDE GĦALL-FUNZJONI TAL-KLIEI

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

Peress li n-numru ta 'pazjenti bimard kroniku tal-kliewi(CKD) żidiet, in-numru ta 'pazjentijeħtieġu dijaliżise jiżdiedu wkoll. Ħafna mill-imwiet f'pazjenti għaddejjindijalisihuma dovuti għalmard kardjovaskularibħalinsuffiċjenza kardijaka, disturbi ċerebrovaskulari, jew infart mijokardijaku. (,2) Sors ewlieni ta'mard kardjovaskularihija kalċifikazzjoni ektopika,() anormalità kkawżata mill-formazzjoni u d-depożizzjoni ta 'kristalli tal-fosfat tal-kalċju fit-tessuti rotob. (4 6) Diversi fatturi bħall-infjammazzjoni. stress ossidattiv, u żidiet fil-livelli tal-kalċju fil-plażma (Ca) u fosfru (P) huma involuti fil-progressjoni tal-kalċifikazzjoni vaskulari. Fost dawn il-fatturi, l-iperfosfatemja hija l-aktar assoċjata b'mod qawwi mal-kalċifikazzjoni vaskulari. (7.8) L-iperfosfatemja hija kkawżata minn konsum eċċessiv ta 'P fil-preżenza ta' funzjoni renali mnaqqsa. Għalhekk, pazjenti li jkunu qed jagħmlu d-dijalisi jeħtieġ li jillimitaw it-teħid ta’ P. (79-12) Madankollu, ġie rrappurtat likalċifikazzjoni vaskularidiġà qed jimxi 'l quddiem meta tinbeda d-dijalisi; deher ukoll f'pazjenti b'CKD fi stadju bikri meta l-iperfosfatemja ma tkunx evidenti. (3) Konsegwentement, huwa importanti li tiġi evitata l-kalċifikazzjoni vaskulari f'pazjenti b'CKD fi stadju bikri biex tittejjeb il-pronjosi tal-ħajja.

li jwassal għal influss akbar ta 'P fiċ-ċelloli tal-muskoli lixxi vaskulari (VSMC). L-influss tal-P jitwettaq permezz tal-PiT-1, trasportatur fuq il-wiċċ tal-membrana taċ-ċellula tal-VSMC. PiT- huwa membru tas-superfamilja tas-solute-carrier (SLC), li jinkludi trasportatur tal-fosfat tas-sodju kodifikat minn SLC20A1.04 PiT- jittrasporta fosfat tul membrani taċ-ċelluli dipendenti fuq Na u sussegwentement mineralizzazzjoni tal-matriċi minħabba livelli p elevati.s) Bħala intraċellulari Il-livelli P jiżdiedu, VSMC jibda jesprimi fatturi ta 'traskrizzjoni osteoġeniċi, bħal fattur ta' traskrizzjoni relatat ma 'runt 2(Runx2)(16) Dan l-effett huwa segwit minn espressjoni akbar ta' ġeni speċifiċi għall-osteoblast, bħal osteopontin u osteocalcin. Barra minn hekk, naqqset l-espressjoni ta 'proteini speċifiċi għall-muskoli lixxi. bħal proteina tal-muskoli lixxi 22-0 (SM22-0), isseħħ. Bħala riżultat, VSMC jiġi trasformat f'ċelluli li jixbħu l-osteoblasti. (1718) Studji kliniċi riċenti wrew li l-livelli tad-demm ta 'kalċju. partiċelli tal-proteini (CPP), li jirrappreżentaw partiċelli kollojdali tal-fosfat tal-kalċju, jiżdiedu bit-tnaqqis tal-funzjoni renali. (19-21) Barra minn hekk, ġew irrappurtati korrelazzjonijiet mal-livelli ta' CPP u P fid-demm.2o2i) Huwa possibbli li s-CpP jista' jikkawża l-progressjoni tal-kalċifikazzjoni vaskulari.22-24)

Madankollu, kalċifikazzjoni vaskulari ġiet osservata f'pazjenti b'CKD fi stadju bikri b'livelli normali ta' P fil-plażma. (13) Barra minn hekk.PiT-1 mRNA huwa espress kullimkien fit-tessuti kollha. Għalhekk molekula oħra tista 'taġixxi primarjament fil-qasam tal-kalċifikazzjoni vaskulari. Hemm rapporti liinfjammazzjonijippromwovi kalċifikazzjoni vaskulari. Fatturi infjammatorji bħal interleukin (IL)-1B, IL-6, u fattur-alfa tan-nekrożi tat-tumur (TNF-a) ikkaġunat divrenzjar ta' VSMC f'ċelluli li jixbħu l-osteoblasti (2s26) TNF-a jinduċi kalċifikazzjoni vaskulari permezz tal-mogħdija tal-cAMP, li għandha rwol fid-divrenzjar tal-osteoblast.2728) IL-6 jirregola diversi mogħdijiet li jwasslu għall-kalċifikazzjoni vaskulari tal-VSMC2-31) Barra minn hekk. IllB, IL-6, u TNF-a huma wkoll fatturi assoċjati ma 'żieda fil-kalċifikazzjoni vaskulari indotta minn livelli p għolja.3233) Madankollu. data kurrenti ma tispjegax bis-sħiħ il-mekkaniżmu tal-vaskulari

kalċifikazzjoni indotta minn dawn il-fatturi. Aħna ipoteżijna li jista 'jkun hemm molekuli oħra relatati ma' P bħal dawk fis-superfamilja SLC, involuti fil-kalċifikazzjoni vaskulari. Aħna ffukajna fuq proteini tal-membrana fis-superfamilja SLC u investigajna molekuli kandidati potenzjali relatati ma 'P minbarra PiT-1 għall-involviment fil-kalċifikazzjoni vaskulari. Barra minn hekk, eżaminajna r-relazzjoni bejn il-molekuli kandidati u l-kalċifikazzjoni vaskulari fil-vidjo u in vivo.

Materjali u metodi

Kultura taċ-ċelluli. Ċelloli normali humanaorticsmoothmuscle(AoSMC) inkisbu minn Lonza (Basel, l-Isvizzera)AoSMC ġie kkultivat skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. AoSMC inżammu f'mezz ta 'tkabbir (medju bażali taċ-ċelluli tal-muskoli lixxi supplimentat b'5% serum bovin tal-fetu (FBS), fattur tat-tkabbir epidermali, insulina, fattur tat-tkabbir tal-fibroblast-B, u gentamicin/amphotericin-B). Il-midja nbiddlu kull jum ieħor. AoSMC tkabbru f'inkubatur umidifikat ta '5% CO f'37 grad u miżmuma sakemm intlaħqet il-konfluwenza u mbagħad użata f'esperimenti.

AoSMC kalċifikat.Il-kalċifikazzjoni ta 'AoSMC ġiet indotta kif deskritt qabel.435) AOSMC ġew ikkultivati ​​fil-medium Eagle'smodified Dulbecco supplimentat b'15% FBS u penicillin-streptomycin u kkultivati ​​b'2.6 mM P għal 3, 6, 9, 12 u 14-il jum. Il-konċentrazzjoni P ġiet aġġustata mill-P bufferNaH, PO/Na, u HPO. pH 7.2). AoSMCs oħra ma kinux ikkultivati ​​b'2.6 mM P.

mikroarray tad-DNA. Intużaw RNA totali ta 'kampjuni AoSMC kkultivati ​​u mhux ikkultivati ​​b'2.6 mM P. RNA totali 5.0 ug ġie analizzat bl-użu ta' mikroarray tad-DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Ġappun). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray intuża biex jeżamina madwar 26,000 ġene. Il-proporzjon ġie kkalkulat billi jiġi diviż il-livell ta' espressjoni ta' AoSMC ikkultivat b'2.6 mM għal 12-il jum bil-livell ta' espressjoni ta' AoSMC mhux ikkultivat b'2.6 mM P

mikroarray tad-DNA

Intużaw RNA totali ta 'kampjuni AoSMC kkultivati ​​u mhux ikkultivati ​​b'2.6 mM P. RNA totali 5.0 ug ġie analizzat bl-użu ta' mikroarray tad-DNA (Agilent Technologies, Tokyo. Ġappun). SurePrint G3 Human GE 8 x 60k ver. 2 Microarray intuża biex jeżamina madwar 26,000 ġene. Il-proporzjon ġie kkalkulat billi jiġi diviż il-livell ta 'espressjoni fuq AoSMC ikkultivat b'2.6 mM għal 12-il jum bil-livell ta' espressjoni fuq AoSMC mhux ikkultivat b'2.6 mM P.Espressjoni ta 'SLC37A2 f'infjammazzjoni vaskulari. Biex jinduċi rispons infjammatorju f'AoSMC, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​b'mezz ta' tkabbir sakemm laħqu l-konfluwenza u mbagħad ittrattati b'1 ugmL lipopolysaccharides (LPS) (LPS minn escherichia coli O111: B4; Sigma, St. Louis, MO) għal 24 u 72 mingħajr 2.6 mM P. AoSMC oħra ma kinux ikkultivati ​​b'analiżi ta 'reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) f'ħin reali. L-RNA totali ġie estratt minn AoSMC ittrattat b'LPS għal 24 u 72 siegħa u ċelloli mhux ittrattati b'LPS. Twettqet PCR kwantitattiva f'ħin reali bbażata fuq l-aħdar SYBR bl-użu ta 'cDNA sintetizzat u sett ta' primer xieraq għal kull ġene fil-mira b'sistema PCR f'ħin reali aStepOnePlus (Applied Biosystems, FosterCity, CA). Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: IL-6.5-AATTCGGTACATCCTCGACGG-3' u 5-GCCATCTTTGGAAGGTTCAGG-3'; uman SLC37A2,5TCACTTTAGTGCCAAGGAGGC-3' u 5CCATTGGTGTAGTCAGAGACG-3'; glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH5'-CTGCACCACCAACTGCTTAGC- u 5-CTTCGGGIGGCAGTGATGGC{-3.IL{-6 u SLC37A2 mRNA livelli ta' espressjoni ġew ikkalkulati wara normalizzazzjoni b'GAPDH37.A2 f'Scalcified. AoSMC.Total ġew estratti minn AoSMC mhux ikkultivati ​​b'2.6 mM P u ċelluli AoSMC kkultivati ​​b'2.6 mM P għal ġranet 3, 6, 9, 12, u 14. PCR f'ħin reali twettqet bl-użu tal-cDNA sintetizzat.Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: Runx2 uman, 5-TGAGGCCGCTTCTCCAACCC-3', u 5-CTCTGGCTTTGGGAAGAGCCG-3. Il-livelli ta' espressjoni tal-mRNA ta' Runx2 u SLC37A2 ġew ikkalkulati wara n-normalizzazzjoni b'APPH.

Analiżi tal-Blott tal-Punent.

Proteina totali nġabret minn kampjuni AoSMC kkultivati ​​taħt l-istess kundizzjonijiet użati għall-analiżi PCR f'ħin reali. Dawn il-kampjuni ġew lysed bl-użu ta 'salina buffered Tris (pH 75) supplimentat b'5% NP-40 u cocktail inibitur ta' 1% protease. Il-kampjuni tal-konċentrazzjoni tal-proteina tkejlu bl-użu tal-Kit tal-Assaġġi tal-Proteina BCA (Thermo FisherScientific.Waltham, MA). u l-konċentrazzjoni ġiet aġġustata minn western blotting, 10 ugs ta 'proteina ġew separati f'ġell ta' 10% polyacrylamide bl-użu ta 'elettroforesi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide. Il-membrana ġiet ittrattata b'antikorp SLC37A2 (Novus Biologicals, Centennial, CO) jew GAPDH (GeneTex, Irvine, CA) bħala l-antikorpi primarji, inkubati b'antikorp Rabbit lgG Horseradish peroxidase-konjugat (R&D Systems, Minneapolis, MN) bħala l-antikorp sekondarju u viżwalizzat bl-użu ta' Amersham ECL Select (GE Healthcare. Buckinghamshire, Ingilterra) u analizzatur tal-immaġni luminexxenti (LAS-1000 plus, FUNIFILM, Tokyo, Ġappun). Il-banda kienet kwantifikata bl-użu ta 'lmagel.

Sperimentali

Il-protokolli kollha tal-istudju ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Università ta 'Hyogo, l-Iskola tax-Xjenza tal-Bniedem u l-Ambjent. Irġiel ta 'tnax-il ġimgħa, firien Sprague-Dawley inxtraw mill-Ġappun SLC (Shizuoka, il-Ġappun). Il-firien inżammu fuq ċiklu ta' 12-dawl, 12-h skur (09:00-21:00) u ppermettew aċċess liberu għall-ikel u ilma extra-pur.

Id-dieti sperimentali jinkludu dieta P ta' kontroll (1.0% P, 0.6Ca, 20% proteina), dieta adenina (0.75% adenina , 1.0% P, 0.6%Ca, 2.5% proteina), dieta b'livell baxx ta' P (LP) (0.2% P,0 .6% Ca, 10%proteina), u dieta b'ħafna P (HP) (1.0% P, 0.6% Ca, 10% proteina) ibbażata fuq id-dieta AIN93-G (Orjentali Ħmira, Tokyo, Ġappun) bil-kaseina bħala s-sors tal-proteina.3637) Ġiet irrappurtata dieta baxxa ta’ proteini li tippromwovi kalċifikazzjoni vaskulari fil-firien b’insuffiċjenza renali kkaġunata mill-adenina, għalhekk saret restrizzjoni tal-proteini.3738) Qabel ma jiġu miġbura, il-firien kollha (n=23) ġew mitmugħa dieta MF standard (Ħmira Orjentali) għal ġimgħa biex jakklimatizzaw. Ta' 13-il ġimgħa, il-firien ġew maqsuma f'2 gruppi: il-grupp ta' kontroll (n=5) u l-grupp ta' CKD indott minn adenina (n=18). Il-grupp ta' kontroll irċieva d-dieta P ta' kontroll għal 6 ġimgħat . Il-grupp CKD indott minn adenine irċieva d-dieta ta 'adenine għal madwar 3 ġimgħat u mbagħad ġie maqsum aktar f'2 sottogruppi: il-grupp CKD-LP (n=8) jew il-grupp CKDHP (n=10). Il-firien tal-grupp CKD-LP u l-grupp CKD-HP irċevew id-dieta LP u d-dieta HP għal ġimgħat 3, rispettivament matul il-perjodu sperimentali, it-teħid tal-ikel ġie rreġistrat kuljum. Matul id-dieta tal-adenina, inġabru kampjuni tad-demm mill-vina tad-denb bejn l-10:00 AM u l-11:{00 AM darba fil-ġimgħa sat-tieni ġimgħa, u wara darba kull jumejn biex jiġu mmonitorjati l-livelli tal-plażma. Matul id-dieta LP jew id-dieta HP, inġabru kampjuni tad-demm darba fil-ġimgħa. Inġabru kampjuni tal-awrina u l-volum tal-awrina ġie rreġistrat darba kull ġimgħa. Il-firien ġew sagrifikati b'anestetiku bl-użu ta 'isoflurane (Wako Pure Chemical Industries. Osaka Ġappun) u laparotomies. Kampjuni tad-demm meħuda mill-vina cava inferjuri u l-aorta torakoaddominali inġabru għall-analiżi.

Espressjoni SLC37A2 fuq l-aorta.

Madwar terz tal-aorta torakoaddominali miġbura ntużat biex tiġi viżwalizzata l-kalċifikazzjoni u twettaq immunostaining. L-aorta kienet inkorporata fil-paraffin u sezzjonijiet 4-um inqatgħu. Is-sezzjonijiet ġew imtebba bl-użu ta 'Metodu Von Kossa għal Kit tal-Kalċju (Polysciences. Warrington, PA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Twettqet analiżi ta' immunostaining b'sezzjonijiet serjali. Is-sezzjonijiet ġew inkubati b'antikorp SLC37A2 matul il-lejl f'4 grad u mbagħad ittrattati b'Histofine Simple Stain Rat MAX-POMULTI) (Nichirei Biosciences, Tokyo, Japan) għal 30 min f'temperatura tal-kamra. Minn hemm 'il quddiem, is-sezzjonijiet ġew ittrattati b'kit DABsubstrat (Nichirei).

L-RNA totali ġie estratt mill-bqija tal-aorta torakoaddominali ffriżata. Twettqet PCR f'ħin reali bl-użu tas-cDNA sintetizzat. Is-sekwenzi tal-primer kienu kif ġej: far osteo-pontin,5ACCCATCTCAGAAGCAGAATC-3' u 5ATCCATGTGGTCATGGCTTTC-3' u; far SLC37A2,5-TAGTCCCAGCTTCGAGTACGG-3' u 5'-CTGATGGGCTTTCTTGGACATG-3.Il-livelli ta' espressjoni ta' mRNA ta' osteopontin u mRNA ta' SLC37A2 ġew ikkalkulati wara n-normalizzazzjoni b'GAPDH

Analiżi statistika.

Id-dejta hija ppreżentata bħala l-medja + SE. Id-differenzi bejn il-gruppi ġew analizzati bl-użu tat-test t. F'esperimenti AoSMC kalċifikat indotti mill-fosfat, id-differenzi ġew analizzati bl-użu ta 'analiżi ta' varjanza f'direzzjoni waħda segwita mill-metodu ta 'Dunnett. Fl-esperimenti tal-mudell CKD, id-differenzi ġew analizzati bl-użu tat-test K ruskal-Wallis segwit mill-metodu Steel-Dwass. Il-koeffiċjenti ta' korrelazzjoni (rs) ġew determinati bl-użu tat-test tal-grad tal-koeffiċjent ta' korrelazzjoni ta' Spearman. Għat-testijiet kollha. valuri p b'żewġ denbu<0.05 were considered statistically significant.