Proprjetajiet U Kostitwenti Relatati Mal-ġilda Mill-Estratt tal-Partijiet tal-Ajru Tal-Persicaria Senticosa

Kuntatt: ali.ma@wecistanche.com

Yun-Hyeok Choi,1 Jae Yeon Lee,2 Ji Eun Lee,1 Yeon Woo Jung,1 Wonsik Jeong,1Seong Su Hong,1 Young-Rak Cho,2 u Chun Whan Choi 1

1. Introduzzjoni

Persicaria senticosahija pjanta annwali fil-familja Polygonaceae, li hija mqassma fil-Korea kollha. Minn żminijiet bikrin, dan l-impjant intuża bħala mediċina folkloristika b'effetti ta 'benefiċċju għat-trattament ta' diversi mard bħal tneħħija tal-partijiet nefħa tal-ferita jew carbunclesand cellulite u demm li jiċċirkola, u t-tneħħija tal-istaġnar tad-demm. Studji riċenti wrew liPersicaria senticosakellu effetti anti-infjammatorji [1]; madankollu, dan l-impjant ma ġiex irrappurtat bħala ingredjent kożmetiku bijoattiv. U studji fitokimiċi preċedenti dwar il-fjuri, iz-zokk, u l-għeruq tal-ġeneru Polygonum żvelaw flavonoids u komposti fenoliċi varji bħal hydroxybenzoic acid, rutin, quercetin-3-O-glucuronide, quercetin-3-O-glucoside, u luteolin-7-O-rutinoside kienu kkunsidrati bħala l-komponenti attivi maġġuri [2, 3]. Dawn il-komposti attivi juru effetti farmakoloġiċi varji, bħal effetti anti-infjammatorji, kontra l-ulċeri, kontra l-pressjoni għolja u kontra l-kanċer [4]. Waqt l-iskrinjar għall-ingredjenti kożmetiċi billi jitkejjel l-effett ta' tneħħija radikali fuq 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), tneħħija radikali ABTS, inibizzjoni ta' elastase,tyrosinasel-inibizzjoni, u l-assaġġ ta ' l-ossidu nitriku, diversi Polygonumeextracts instabu li juru attività qawwija.

Ikklikkja biexCistanche juża biex inaqqas l-attività tat-tyrosinase.

2. Materjali u Metodi

2.1. Materjali tal-Pjanti u Proċeduri Ġenerali tal-Prodotti Naturali.

Persicaria senticosainġabret minn Seo-myeon,Chuncheon-si, Gangwon-do, il-Korea, fi 2016 (GPS: N 37 grad 55′30.1″, E 127 grad 37′ 57.0″, altitudni: 434 m). Il-kampjuni tal-vawċers (G071) ġew awtentikati minn Dr Chun Whan Choi.Persicaria senticosaġew depożitati fil-erbarium ta 'Biocenter, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Korea t'Isfel (Fig. S3). L-estratt tal-metanol ta '99.9 fil-mija ta' erbgħa u tletin Polygonum inkiseb mill-Estratt tal-Pjanti tal-Korea Bankat l-Istitut tar-Riċerka tal-Korea tal-Bijoxjenza u l-Bijoteknoloġija (Daejeon, Korea). L-esperimenti 1H u 13C NMR saru fuq spettrometru Bruker Ascend 700 MHz b'tetramethylsilane (TMS). LC-ESI-MS inkiseb fuq strument Triple TOF 5600 plus (AB SCIX, USA) u HRESI-MSon strument LTQ Orbitrap XL (Thermo, USA). Il-kromatografija ta' saff irqiq (TLC) saret fuq pjanċi tal-ġel tas-silika 60F254 (Merck, il-Ġermanja) u ġel tas-silika 60 RP-18 F254S (Merck, il-Ġermanja). Il-kromatografija tal-kolonna (CC) saret bl-użu ta 'Silica gel 60 (70 ~ 230 malji, Merck, il-Ġermanja), ODS-A (12 nm S-7 μm, YMC GEL, Ġappun), u l-HPLC preparattiv sar fuq LC{{ 23}}A (Shimadzu, Ġappun).

2.2. LE Assaġġ.

Ċelloli RAW 264.7 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi bir-bir (5 × 104 ċelluli/bir) u ġew ittrattati b'kampjun għal siegħa qabel stimulazzjoni LPS (1 ug/mL) għal 24 siegħa. Il-kontroll negattiv ġie ttrattat b'medja ħielsa mis-serum. L-ammont ta 'nitrit, metabolit astable ta' NO, tkejjel bl-użu ta 'Griessreagent (1 fil-mija sulfanilamide u 0.1 fil-mija naphthyl ethylenediamine dihydrochloride f'2.5 fil-mija aċidu fosforiku). Sussegwentement, l-assorbiment tkejjel f'540 nm bl-użu ta' ELISAreader. Il-kwantità ta 'nitrat ġiet iddeterminata minn kurva standard għan-nitrat tas-sodju [5-7].

2.3. Assaġġ taċ-Ċitotossiċità taċ-Ċellula.

Ċelloli RAW 264.7 ġew ibbanjati f'densità ta '5 × 104 ċelluli/bir fi 96-pjanċi ta' bir. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'kampjuni għal siegħa qabel l-istimulazzjoni tal-LPS (1ug/mL) għal 24 siegħa. MTT (5 mg/mL f'PBS) ġie miżjud ma' kull welland inkubat għal 2 sigħat. Il-medju tneħħa mill-bjar b'aspirazzjoni, DMSO ġie miżjud ma 'kull bir, u l-pjanċa tħawwad. L-assorbiment ta' kull bir tkejjel b'wavelength ta' 540 nm bl-użu ta' qarrej ELISA. Id-dejta hija ppreżentata bħala l-medja ± devjazzjoni standard ta' tliet repliki.

2.4. Assaġġ ta 'Attività ta' Tkessiħ Radikali tad-DPPH.

L-attività ta 'scavenging radical DPPH ġiet imkejla bl-użu tal-metodu deskritt minn Blois [8] u Ozgen et al. [9]. Soluzzjoni DPPH maħlula fil-metanol ġiet miżjuda mal-kampjun, li kien dilwit għall-konċentrazzjoni meħtieġa, u r-reazzjoni kienet imwettqa f'temperatura tal-kamra għal 30 min. L-assorbiment tkejjel f'517 nm bl-użu ta' qarrej ELISA. L-antiossidant butylated hydroxyanisole (BHA) intuża bħala kontroll pożittiv, u ġie ddeterminat il-valur IC50 tal-kampjun.

2.5. ABTS Radical Scavenging Attività.

L-attività ta 'scavenging radikali tal-ABTS ġiet imkejla bl-użu ta' metodu deskritt qabel [10, 11]. ABTS plus ġie ffurmat billi tħallat 7 mM soluzzjoni ABTS u 2.45 mM soluzzjoni tal-persulfat tal-potassju (K2S2O8) b'ABTS: K2S2O8 (proporzjon 2: 1) għal 12-16 siegħa biex tifforma katjoni (ABTS plus). L-assorbiment kien imkejjel f'734 nmusing qarrej ELISA. BHA, antiossidant, intuża bħala kontroll pożittiv.

2.6. Assaġġ ta' Inibizzjoni ta' Tyrosinase.

Tyrosinaseattività inibitorja kienet imkejla bl-użu tal-metodu deskritt minn Yagiet al. [12]. Ir-reazzjoni twettqet f'0.1M buffer tal-fosfat tal-potassju (pH 6.5) li kien fih 1.5 mM L-tyrosine u 1250 unità/mL tyrosinase tal-faqqiegħ. It-taħlita ta' reazzjoni ġiet inkubata f'temperatura ta' 37 grad għal 20 minuta. Il-kampjuni tat-test ġew ttestjati għall-inibizzjoni tat-tyrosinase billi tkejjel l-effett tagħha fuqtyrosinaseattività bl-użu ta' SpectraMax 190PC microplate ELISAreader f'490 nm. Arbutin u kojic acid intużaw bħala kontroll pożittiv, u ġie ddeterminat il-valur IC50 tal-kampjun.

2.7. Assaġġ ta 'Inibizzjoni ta' Elastase.

Ir-reazzjoni twettqet f'{{0}}.5 mM Tris buffer (pH 8.5) li kien fih 1 mg/mL N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide u 0.6 unit/mL elastase . It-taħlita ta' reazzjoni ġiet inkubata f'25 grad għal 10 min. Il-kampjuni tat-test ġew ttestjati għall-inibizzjoni tal-elastasi billi tkejjel l-effett tagħha fuq l-attività tal-elastasi permezz ta' qarrej ELISA f'405 nm. Ursolicacid intuża bħala kontroll pożittiv, u ġie ddeterminat il-valur IC50 tal-kampjun [13].

2.8. Analiżi Statistika.

L-analiżi statistika tad-dejta saret permezz tas-softwer PRIZM5 (GraphPad, CA, USA), u d-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SD. It-test t tal-Istudent b'denb wieħed kien użat għall-analiżi tas-sinifikat tad-differenza bejn il-gruppi, u P < 0:05="" kien="" ikkunsidrat="" statistikament="">

3. Riżultati u Diskussjoni

3.1. Proprjetajiet Relatati mal-Ġilda tal-Estratti tal-Pjanti fil-Familja Polygonaceae.

Effett radikali ta' scavenging fuq DPPH, scavenging radikali ABTS, inibizzjoni ta' elastase,tyrosinasel-inibizzjoni, l-assaġġ ta ' l-ossidu nitriku fuq estratti Polygonum diversi kienu foundto juru attività qawwija. Ir-riżultati wrew li l-Persicariajaponica u Rumex longifolius għandhom l-assaġġ NO (IC{{0}}.3u taħt 25.0ug/mL). Għal DPPH, l-IC50 ta 'methanolicextract ta' Polygonum ciliinerve, Polygonum alpinum, u Persicaria Chinensis kien 36.9, 15.4, u 19.2ug/mL, rispettivament.Fl-attività ta 'scavenging radikali ABTS, l-IC50 ta' methanolicextract ta' Polygonum cuspidate u Polygonum cuspidate kien 2. u 5.3 ug/mL, rispettivament. Filtyrosinaseattività inibitorja, l-IC50 ta 'estratt metanoliku ta' Polygonum sachalinensroot u Polygonum cuspidata kien 289.0 u 483.9 ug/mL, rispettivament. Fl-assaġġ ta 'inibizzjoni ta' elastase, l-IC50 ta 'estratt metanoliku ta' Polygonum sachalinense, Polygonum cuspidatum, Persicaria hydropiper, Persicaria sieboldi, Polygonumorientale, Persicaria lapathifolia, Persicaria dissitiflora, Rumexacetosella, Rumex Crispus, Polygonum alpiniseta, Persicaria japonesa, Persicaria alpinum, Persicaria japonesa Persicaria conspicua, Rheum palmatum, andPersicaria lapathifolia kienet taħt 100 ug/mL (Tabella 1).

3.2. Proprjetajiet Relatati mal-Ġilda tal-Frazzjonijiet Persicaria senticosa.

Effett radikali ta' scavenging fuq 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), tneħħija radikali ABTS, inibizzjoni ta' elastase, u analiżi ta' nitric oxide fuq diversiPersicaria senticosafrazzjonijiet instabu li juru attività qawwija. Ir-riżultati wrew li l-frazzjonijiet CH2Cl2 u EtOAc għandhom l-assaġġ NO (taħt 25 u 44.64 ug/mL, rispettivament). L-attivitajiet ta' tneħħija radikali DPPH u ABTS tal-frazzjonijiet ta' EtOAc kienu 13.7 u 5.0 ug/mL. Fl-assaġġ ta 'inibizzjoni elastase, l-IC50 ta' frazzjonijiet n-hexane u CH2Cl2 kien taħt 100 ug/mL (Tabella 2).

3.3. Iżolament u Determinazzjoni ta' Komposti minn Estratt ta' Persicaria senticosa.

Persicaria senticosapartijiet ta' l-ajru (1.4kg), imnixxfa fid-dell u trab, ġew miżjuda ma' 4{{10}} Lof 70 fil-mija etanol (grad HPLC) u darbtejn f'temperatura tal-kamra (kull darba għal jumejn) u ġew ikkonċentrati f'vacuumat 40 grad biex jagħtu 180.4 g ta 'estratti. L-estratti ġew sospiżi f'ilma distillat u mbagħad maqsumin b'n-hexane (4:0L × 3), CH2Cl2 (4:0L × 3), EtOAc (4:0L × 3), u n-butanol (4:0L × 3) biex tagħti n-hexane (11.7 g), CH2Cl2 (7.4 g), EtOAc (21.7 g), butanol (22.5 g), u frazzjonijiet solubbli fl-ilma (110.1 g),(Skema 1). Il-frazzjoni ta 'EtOAc (21.7 g) ġiet isseparata minn MPLC li uża taħlitiet gradjent bħala elujenti (F001-003). Il-komposti 1 (3.2mg) u 5 (3.9mg) ġew iżolati minn F002that kienu użati minn prep-HPLC. Il-frazzjoni F001 ġiet isseparata minn MPLC li uża taħlitiet gradjent bħala eluwenti (F011-F018). Il-Kompon 6 (1.5mg) kien iżolat minn F016 li kien użat minn HPLC preparattiv. Il-kompost 7 (2.7mg) kien iżolat minn F017 li ntuża minn HPLC preparattiv. F012 ġie sseparat bl-użu ta' MPLC li uża taħlitiet gradjent bħala elwenti (F121-F124). Kompost 4 (10.8mg) kien iżolat minn F124li kien użat minn HPLC preparattiv. Barra minn hekk, F014 ġie separat permezz ta' HPLC preparattiv bl-użu ta' taħlitiet ta' gradjent bħala elwenti (F141-F143). Kompost 3 (2.3mg) kien iżolat minn F141 bl-użu ta' HPLC preparattiv. Kompost 2 (4.8mg) kien iżolat minn F142 bl-użu ta 'HPLC semipreparattiv. Il-purifikazzjoni tas-saff solubbli ta' EtOAc saret permezz ta' separazzjoni tal-kromatografija tal-kolonna u analiżi MPLC għal Komposti 1-7. Ġie identifikat bħala loliolide (1) [14], quercetin-3-O-glucoside (2) [15], querce tin-3-O-glucuronide (3) [16], 4-metossi aċidu caftraric (4) [17],kaempferol-3-(6-methylglucuronide) (5) [18], quercetin-3-(6-methylglucuronide) (6) [19, 20], u quercetin (7) [21]. L-istruttura ġiet spjegata b'kombinazzjoni ta '1D u 2D NMR u spettrometrija MS kif ukoll paragun mal-letteratura rrappurtata (Figura 1).

3.4. Proprjetajiet Relatati mal-ġilda ta 'Komposti minn Persicariasenticosa.

Effett radikali ta' tneħħija fuq id-DPPH,tyrosinaseinibizzjoni, u nitric oxide assay fuq diversi komposti minnPersicaria senticosainstab li juri attività qawwija (Fig. S4-7). Ir-riżultati wrew li l-Kompon 7 għandu l-NOassay (IC50 29.7 ug/mL). Għal DPPH, l-IC50 tal-Komposti 2, 3, 5, u 7 kien 39.6, 31.2, 37.0, u 22.7 ug/mL, rispettivament. Fl-attività inibitorja tat-tyrosinase, l-IC50 tal-Compound 7 kien 14.3 ug/mL (Tabella 3).

4. Konklużjonijiet

Persicaria senticosahija pjanta annwali fil-familja Polygonaceae li hija mqassma fil-Korea kollha. Minn żminijiet bikrin, dan l-impjant intuża bħala mediċina folkloristika b'effetti ta 'benefiċċju għat-trattament ta' diversi mard. Dan l-istudju evalwa l-proprjetajiet u l-kostitwenti relatati mal-ġilda mill-estratt aerialpart ta 'Persicaria senticosa u erbgħa u tletin pjanti Polygonaseae. Fil-kors ta 'screening għall-ingredjenti kosmetiċi billi tkejjel l-effett ta' scavenging radikali fuq DPPH, ABTS scavenging radikali, kontra t-tikmix ġie evalwat bl-użu ta 'inibizzjoni elastase, jbajdu ġie studjat minntyrosinaseinibizzjoni, u anti-infjammatorji kien ittestjat fuq nitriku oxideassay. Diversi estratti Polygonum instabu li juru potentattività. Ir-riżultati wrew li l-estratt senticosamethanolic Persicaria għandu l-attivitajiet ta ' scavenging radikali DPPH u ABTS (IC50 61.0 u 17.5 ug/mL). Fl-assaġġ ta 'inibizzjoni ta' elastase u analiżi ta 'ossidu nitriku, l-IC50 ta' methanolicextract ta 'Persicaria senticosa kien 241.5 ug/mL u 71.8 ug/mL, rispettivament. L-estratt etanoliku ta '70 fil-mija Persicaria senticosa kien maqsum b'n-hexane, CH2Cl2,EtOAc, n-BuOH, u frazzjonijiet milwiema.

Il-frazzjoni solubbli EtOAc wriet attività qawwija relatata mal-ġilda (Figura 2 u Tabella 3). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li komponenti attivi fiPersicaria senticosaresponsabbli għall-attività relatata mal-ġilda kienu kkonċentrati fil-frazzjoni soluble EtOAc ta 'Persicaria senticosa (Skema 1). Min-naħa l-oħra, il-frazzjoni solubbli n-hexane, dichloromethane, u l-frazzjoni solubbli BuOH derivata mill-estratt ta 'Persicaria senticosa wrew attività ekwipotenti fuq nitric oxideassay, DPPH, u attività ta' tneħħija radikali ABTS, filwaqt li l-frazzjoni ta 'ilma li jifdal wriet effetti inibitorji fqar (Tabella 2) ).

Għalhekk, purifikazzjoni iggwidata minn bijoassaġġ ta’ tliet frazzjonijiet attivi, jiġifieri, il-frazzjoni solubbli ta’ EtOAc ta’Persicaria senticosatwettqet biex tippurifika l-prinċipji attivi responsabbli għall-attività relatata mal-ġilda segwita mill-proċess deskritt fl-Iskema 1, rispettivament.

Il-purifikazzjoni tas-saff solubbli EtOAc minnPersicaria senticosaEstratt etanoliku ta' 70 fil-mija sar permezz ta' separazzjoni tal-kromatografija tal-kolonna u analiżi MPLC għal Komposti 1-7. Ġie identifikat bħala loliolide (1), quercetin3-O-glucoside (2), quercetin-3-O-glucuronide (3), 4-methoxy caftraric acid (4), kaempferol{{ 11}}(6-methylglucuronide) (5), quercetin-3-({6-methylglucuronide) (6), u quercetin (7). L-istruttura kienet spjegata b'kombinazzjoni ta '1Dand 2D NMR u spettrometrija MS kif ukoll paragun ma' letteratura rrappurtati (Fig. S2). Effett ta' tneħħija radikali fuq 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),tyrosinaseinibizzjoni, u l-assaġġ tal-ossidu nitriku fuq diversi komposti minn Persicaria senticosa instab li juri attività qawwija. Ir-riżultati wrew li l-Kompon 7 għandu l-assaġġ NO (IC5029.7 μM). Għal DPPH, l-IC50 tal-Komposti 2, 3, 5, u 7 kien 39.4, 32.1, 37.0, u 22.7 μM, rispettivament. Filtyrosinaseattività inibitorja, l-IC50 tal-Kompon 7 kien 14.3 μM.Kif muri fil-Figura 3, il-Komposti 2 u 5 huma l-komposti ewlenin fil-frazzjoni solubbli EtOAc ta 'Persicaria senticosa (-Fig. S1). U l-Komposti 2 u 5 wrew attività antiossidanti eċċellenti (Figura 4), li hija konsistenti ma 'studji preċedenti [18, 22].

Dan l-istudju preżenti wera liPersicaria senticosau Polygonaseae fihom komposti kimiċi b'attivitajiet relatati mal-ġilda u jistgħu jkunu interessanti bħala sors ġdid ta 'aġenti bijoattivi għall-industriji kożmetiċi.