Is-Serovars tas-Salmonella Enterica fin-nuqqas ta' Ġeni TtrA u PduA jtejbu r-rispons immuni taċ-ċelluli waqt l-infezzjonijiet tal-flieles

Salmonella spp. huwa wieħed mill-patoġeni ewlenin li jinġarru mill-ikel responsabbli biex jikkawża telf ekonomiku lill-industrija tat-tjur u jġib konsegwenzi għas-saħħa pubblika wkoll. Kemm l-abbiltà tas-sopravivenza tal-patoġenu fl-ambjent intestinali waqt l-infjammazzjoni kif ukoll ir-relazzjoni tagħhom mas-sistema immuni ospitanti, għandhom rwol ewlieni waqt infezzjonijiet fit-tjur. L-għan ta' dan l-istudju kien li jikkwantifika l-preżenza tal-popolazzjonijiet ta' makrofaġi u ċelluli CD4+ /CD{{8+ bl-użu tat-teknika tal-immunoistokimika, f'nisel kummerċjali ta' tiġieġ infettati b'mod sperimentali minn razez ta' Salmonella tat-tip selvaġġ u mutanti. Enteritidis u Salmonella Typhimurium nieqsa mill-ġeni ttrA u pduA. Is-Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA wassal għal perċentwal ogħla taż-żona mtebbgħin mit-tip selvaġġ, bl-eċċezzjoni tat-tiġieġ li jbidu ħfief. Ir-razza tat-tip selvaġġ tas-Salmonella Typhimurium u l-infezzjonijiet tas-Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA jwasslu għal mudell simili li fih, f'1 u 14 dpi, it-tunsilli ċekali u l-ileum ta 'l-għasafar wrew żona mtebbgħin aktar espressiva meta mqabbla ma' 3 u 7 dpi. Fid-niselijiet kollha studjati, ġiet osservata infiltrazzjoni prominenti tal-makrofaġi meta mqabbla maċ-ċelluli CD4+ u CD8+. B'mod ġenerali, l-annimali infettati mir-razza mutanti wrew żona mtebbgħin b'mod pożittiv ogħla mit-tip selvaġġ. Tħassir kemm fil-ġeni ttrA kif ukoll f'pduA rriżulta f'infiltrazzjoni aktar intensa ta' makrofaġi u ċelluli CD4+ u CD{8+ fl-għasafar ospitanti, li jissuġġerixxi l-ebda attenwazzjoni tal-patoġenu, anke f'razez differenti ta' Salmonella.

benefiċċji cistanche għall-irġiel issaħħaħ is-sistema immuni

Is-Salmonella enterica hija patoġenu li jinġarr mill-ikel li jipprovoka telf għall-bhejjem kif ukoll impatti direttament fuq is-saħħa pubblika. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) u Typhimurium (Salmonella Typhimurium) ġew assoċjati prinċipalment ma 'infezzjonijiet tal-ikel għal għexieren ta' snin. Bejn l-1995 u l-2010, is-Salmonella Enteritidis ġiet identifikata f'34,2 % tal-kampjuni kollha pożittivi għas-Salmonella spp1. Minbarra dan, Winter et al.2 ippubblikaw studju sostanzjali li jinvestiga r-rwol tal-ġene li jikkodifika tetrathionate, billi għażel is-serotip Salmonella Typhimurium iżda juża ġrieden bħala mudell sperimentali. Meta wieħed iqis dan, l-approfondiment tal-għarfien tagħna dwar l-interazzjoni ospitanti-patoġenu jista 'jgħin biex jitjieb il-kejl tal-kontroll u l-eradikazzjoni. Diversi fatturi huma involuti fil-patoġenesi tas-salmonellosi, bħall-abbiltà tal-patoġenu li jirreplika f'ambjent mukuż infjammat, skont l-akkwist tan-nutrijenti u r-respirazzjoni anerobika2. Madankollu, id-disponibbiltà tan-nutrijenti ma tiggarantixxix is-sopravivenza tal-batterja f'ambjent kompetittiv b'popolazzjoni densa minn mikro-organiżmi oħra. Għalhekk, l-abbiltà tas-Salmonella enterica li timmetabolizza tetrathionate billi tuża tetrathionate reductase biex tipproduċi 1,2-propanediol bħala sors ta 'enerġija tagħti vantaġġ ta' fitness. Din l-enzima hija kkostitwita minn TtrA, TtrB, u TtrC. L-ewwel subunità ċċitata tappartjeni għas-superfamilja tal-molybdopterin (MPT) u għandha dominju li jgħaqqad FeS li huwa involut fit-tnaqqis ta 'tetrathionate f'thiosulfate (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-propandiol jintuża minn mikrokompartimenti batterjali (MCP). Din l-istruttura hija kkostitwita minn seba 'proteini differenti, fosthom PduA huwa l-komponent ewlieni tal-istruttura MCP5. L-ewwelnett, 1,2-propanediol huwa kkonvertit għal propionaldehyde, li mbagħad jitnaqqas għal propanol u propionate permezz ta 'attività propanediol dehydratase. Dan il-proċess jiġġenera ATP permezz ta' fosforilazzjoni, gradjent ta' elettron (1-propanol) għar-riġenerazzjoni ta' NAD, u intermedjarju (propionyl-CoA) li jista' jintuża bħala sors ta' karbonju u enerġija matul iċ-ċitrat tal-metil permezz, li jiddependi fuq il-vitamina B12 sintetizzata. b’mod endoġenu6. Waqt l-infezzjonijiet tat-tiġieġ, il-kapaċità tas-serovars tas-Salmonella enterica li jinvadu u jgħix fiċ-ċelloli epiteljali intestinali u l-makrofaġi hija segwita minn evażjoni tar-rispons immuni7. F'dak il-kuntest, l-infezzjoni hija fażi kritika li tiddependi fuq l-interazzjoni bejn iċ-ċelluli batteriċi u ospitanti u l-kapaċità batterjali li tegħleb l-ostakli tal-epitelju intestinali biex tiggarantixxi l-kolonizzazzjoni u r-replikazzjoni tagħha. Madankollu, jattiva r-risponsi infjammatorji u immuni8 li jwasslu għal endoċitożi u fagoċitożi minn ċelluli epiteljali u li jippreżentaw l-antiġeni (APCs), rispettivament. L-attività antimikrobika ta' dawn iċ-ċelluli tixpruna rispons innat permezz tal-makrofaġi u l-assemblaġġ tar-rispons immuni adattiv jiddependi fuq l-attivazzjoni ta' CD4+ u CD8+9. Biex titfa’ dawl fuq l-interazzjonijiet ospitanti-patoġenu wara l-infezzjoni intestinali mis-Salmonella fit-tiġieġ, aħna nevalwaw il-popolazzjoni taċ-ċelloli tas-sistema immuni matul il-kolonizzazzjoni tal-imsaren u l-infezzjoni sistemika f’għasafar ta’ nisel kummerċjali kkontestati minn razez mutanti ta’ tip selvaġġ ta’ Salmonella Enteritidis u Salmonella Typhimurium. , li jġorru tħassir fil-ġeni relatati mal-metabolizzazzjoni ta 'tetrathionate (ttrA) u 1,2-propanediol (PDU).

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Riżultati

Esperiment 1—Isfida tas-Salmonella Enteritidis.

Ir-riżultati tal-kwantifikazzjoni tal-preżenza taċ-ċelloli tar-rispons immuni fit-tunsilli ċekali, ċecum, ileum u fwied minn brojlers, tiġieġ li jbidu ħfief, u tiġieġ li jbidu nofshom tqal huma murija fit-Tabelli 1, 2 u 3. Sibna aktar CD 4+ u infiltrazzjoni taċ-ċelluli tal-makrofagi minn brojlers ikkontestati bis-Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) milli minn brojlers ikkontestati bir-razza tat-tip selvaġġ tas-Salmonella Enteritidis (wt-SE) jew għasafar mhux infettati, fit-tessuti kollha evalwati. Instabet eċċezzjoni għall-infiltrazzjoni taċ-ċelluli CD4+ bi 3 dpi fit-tunsilli ċekali, ileum, u l-fwied, u għall-infiltrazzjoni tal-makrofaġi fi 3 u 14 dpi fil-fwied minn broilers sfidati SEΔttrAΔpduA. Barra minn hekk, in-numru ta' ċelluli CD8+ infiltrati kien osservat fi kwantità akbar minn għasafar ikkontestati b'SEΔttrAΔpduA f'1 u 7 dpi fiċ-ċecum u fil-fwied, bi 3 dpi fit-tunsilli ċekali, u 14 dpi fl-ileum. B'kuntrast, l-għasafar sfidati wt-SE kellhom infiltrazzjoni għolja ta 'ċelluli CD8+ fit-tunsilli ileum u ċekali f'1 u 7 dpi, rispettivament (Tab. 1; Fig. Supplimentari S1). Tabella 2, u Fig. S2 Supplimentari juru s-CD4+ u s-CD{8+, u l-infiltrazzjoni tal-makrofagi misjuba fit-tessuti ta' tiġieġ li jbid semi-tqal. B'mod ġenerali, kien hemm varjazzjoni kbira bejn iż-żoni tal-infiltrati taċ-ċelluli li jikkonċernaw kemm ir-razza tal-isfida kif ukoll it-tessuti studjati. L-għasafar ikkontestati b'SEΔttrAΔpduA wrew żoni ogħla koperti minn ċelluli CD4+ (fl-ileum f'1 u 14 dpi, u l-fwied f'7 dpi), u makrofaġi (fl-ileum f'7 dpi, u fwied f'3, 7 u 14). dpi), milli fl-istess tessut ta 'għasafar wt-SE-challenged. Min-naħa l-oħra, ċelluli CD8+ instabu f'ammonti akbar fit-tunsilli ċekali (f'1 u 7 dpi) u ċ-ċecum (bi 3 dpi) ta' għasafar sfidati b'razza wt-SE. Osservat b'mod differenti fil-flieles tal-brojlers u semi-tqal li jbidu, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA wassal għal żoni ta 'ċelluli ta' rispons immuni inqas intens mit-tip selvaġġ, fl-isfida minn tiġieġ li jbidu ħfief. L-għasafar b’sfida Wt-SE wrew żoni akbar ta’ infiltrazzjoni ta’ CD4+ fit-tunsilli ċekali (f’1 u 3 dpi), ċecum (f’3, 7, u 14 dpi), ileum (f’1 u 7 dpi), u fwied (f’ 14 dpi). Bl-istess mod, l-isfidi b'SEΔttrAΔpduA rriżultaw f'żoni ta' infiltrazzjoni mnaqqsa ta' kemm CD8+ fit-tunsilli ċekali (f'1 dpi) u ileum (f'7 u 14 dpi), u makrofaġi f'tunsilli ċekali u ċekku (bi 3 dpi), meta mqabbla ma 'għasafar wt-SE-sfidati. L-ebda alterazzjoni sinifikanti taż-żona taċ-ċelluli tas-sistema immuni ta 'CD8+ u ċelluli makrofaġi ma ġew osservati fil-fwied kemm mill-għasafar SEΔttrAΔpduA kif ukoll minn għasafar sfidati b'wt-SE. Ir-riżultati dettaljati tal-isfida bi tiġieġ li jbidu ħfief huma murija fit-Tabella 3 (ara Fig. S3 Supplimentari).

Tabella 1. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta' ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta' brojlers infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Enteritidis fi ġranet differenti ta' wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis tat-tip selvaġġ; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwit mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.05; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-SE jew wt-SE) bħala sinifikanti fl-organu u DPI hija dik murija l-erja maġġuri ta 'inflazzjoni għal kull ċellola.

Tabella 2. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta' ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta' tiġieġ li jbidu semi-tqal infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Enteritidis fi ġranet differenti ta' wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis tat-tip selvaġġ; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwita mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.{{10}}5 ; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-SE jew wt-SE) bħala sinifikanti fl-organu u DPI hija dik murija l-erja maġġuri ta 'inflazzjoni għal kull ċellola.

Tabella 3. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta 'ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta 'tiġieġ li jbidu ħfief infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Enteritidis fi ġranet differenti wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis tat-tip selvaġġ; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwit mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn il-valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.{{10}}5 ; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-SE jew wt-SE) bħala sinifikanti fl-organu u DPI hija li turi ż-żona ta 'infiltrazzjoni ewlenija għal kull ċellula.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Esperiment 2—Isfida tas-Salmonella Typhimurium.

Ir-riżultati tal-kwantifikazzjoni tal-preżenza taċ-ċelluli tar-rispons immuni fit-tunsilli cecal, ċecum, ileum, u fwied minn brojlers, tiġieġ li jbidu nofshom tqal, u tiġieġ li jbidu ħfief huma murija fit-Tabelli 4, 5, u 6, rispettivament. B'mod ġenerali, il-brojlers infettati mir-razza mutanti wrew żona mmarkata pożittiva ogħla minn dawk ikkontestati bir-razza tat-tip selvaġġ tas-Salmonella Typhimurium (wt-STM), fl-erba' ijiem kollha tat-teħid tal-kampjuni. Barra minn hekk, ma ġew osservati l-ebda alterazzjonijiet taċ-ċelloli tar-rispons immuni fil-gruppi ta 'kontroll mhux infettati. Iż-żoni taċ-ċelluli CD4+ fit-tessuti kollha tal-brojlers laħqu differenza statistika f'1 dpi, b'infiltrazzjonijiet akbar għall-isfida b'Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Differenza sinifikanti bejn iż-żona tar-rispons immuni kwantifikat minn għasafar sfidati STM∆ttrA∆pduA- u wt-STM kienet, b'infiltrazzjonijiet akbar meta l-isfida kienet bir-razza mutanti fiċ-ċecum u l-ileum f'1 dpi, u fwied f'14 dpi (ċelluli CD8+); fiċ-ċecum, ileum u fwied f'1 u 14 dpi (makrofaġi) (Tabella 4; Fig. S4 Supplimentari). Ir-riżultati minn għasafar li jbid semi-tqal ma wrew l-ebda differenza statistika bejn l-isfidi tar-razza mutanti u tat-tip selvaġġ għaċ-ċelloli CD4+ fiċ-ċecum, u ċ-ċelloli CD8+ fit-tunsilli ċekali u l-ileum fl-4 ijiem kollha. wara l-infezzjonijiet evalwati (Tabella 5; Fig. S5 Supplimentari). Madankollu, meta żona ta 'konċentrazzjoni sinifikanti ta' ċelluli tas-sistema immuni kienet osservata l-tiġieġ li jbidu semi-tqal ġew sfidati minn STM∆ttrA∆pduA: żona ta 'infiltrazzjoni makrofaġi maġġuri fit-tessuti kollha studjati (f'1 u 14 dpi); żona ta 'infiltrazzjoni maġġuri ta' ċelluli CD4+ fit-tunsilli ċekali u l-fwied (f'1, 7, u 14 dpi) (Tabella 5; Fig. Supplimentari S5). Tabella 6, u Fig. S6 Supplimentari juru s-CD4+, CD{8+, u l-infiltrazzjoni tal-makrofaġi misjuba fit-tessuti tat-tiġieġ ħfief li jbidu. Għasafar ikkontestati b'STM∆ttrA∆pduA wrew żona ta' ċelluli tas-sistema immuni maġġuri ta' CD4+ u ċelluli makrofaġi f'tunsilli ċekali u ċecum (f'14 dpi), u ileum (f'1 u 14 dpi) meta mqabbla maċ-ċelluli ta' rispons immuni żona ta 'l-istess tessuti minn għasafar wt-STM-challenged. Ma nstabet l-ebda differenza statistika għaż-żona ta' infiltrazzjoni tas-CD8+ fit-tunsilli ċekali, iċ-ċecum, u l-ileum minn għasafar sfidati. B'kuntrast ma' riżultati miksuba f'tessuti oħra, il-fwied minn għasafar ikkontestati mill-STM∆ttrA∆pduA kellu żona mtebbgħin aktar espressiva ta' ċelloli ta' rispons immuni għaċ-ċelloli CD4+ u CD{8+ fl-erba' dpi kollha, u makrofaġi f'1 u 14 dpi.

Tabella 4. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta' ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta' brojlers infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Typhimurium fi ġranet differenti ta' wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium wild-type; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwit mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.05; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-STM jew wt-STM) bħala sinifikanti fl-organu u DPI hija dik murija l-erja maġġuri ta 'inflazzjoni għal kull ċellula.

Tabella 5. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta' ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta' tiġieġ li jbidu semi-tqal infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Typhimurium fi ġranet differenti ta' wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium wild-type; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwita mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.{{10}}5 ; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-STM jew wt-STM) bħala sinifikanti fl-organu u DPI hija dik murija l-erja maġġuri ta 'inflazzjoni għal kull ċellula.

Tabella 6. Rappreżentazzjoni tad-differenza sinifikanti relatata mad-distribuzzjoni kwantitattiva ta 'ċelluli ta' rispons immuni differenti f'organi ta 'tiġieġ li jbidu ħfief infettati b'razez selvaġġi u mutanti ta' Salmonella Typhimurium f'jiem differenti wara l-infezzjoni. DPI, jiem wara l-infezzjoni; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium wild-type; ns, l-ebda differenza sinifikanti. F'kull organu u DPI, * tfisser differenza b'ANOVA f'żewġ direzzjonijiet segwit mit-test ta' tqabbil ta' Bonferroni bejn il-valuri ta' razez selvaġġi u mutanti (*P Inqas minn jew ugwali għal 0.{{10}}5 ; **P Inqas minn jew ugwali għal 0.01; ***P Inqas minn jew ugwali għal 0.001; ****P Inqas minn jew ugwali għal 0.0001). Ir-razza ppreżentata fit-tabella (∆-STM jew wt-STM) bħala sinifikanti fl-organu u DPI li turi ż-żona ta 'infiltrazzjoni ewlenija għal kull ċellula.

Diskussjoni

Il-batterji, meta jkunu esposti għal kundizzjonijiet anerobiċi, jistgħu jużaw substrati metaboliċi ta' tetrathionate u 1,2-propandiol għal sorsi ta' enerġija u respirazzjoni10. Għalhekk, is-Salmonella spp. ilu għal żmien twil suġġett għal investigazzjonijiet dwar kif it-tħassir tal-ġeni magħrufa li huma responsabbli għal dawn il-mogħdijiet jaffettwa s-sopravivenza tagħhom fl-ospitant. Sa fejn nafu tagħna, ġie ppubblikat studju wieħed biss li jinvestiga simultanjament ir-rwoli tal-ġeni li jikkodifikaw it-tetrathionate u l-propanediol. Il-grupp ta 'riċerka tagħna rrapporta l-effetti ta' dawn it-tħassir billi evalwa infezzjoni sistemika u eskrezzjoni tal-ħmieġ ta 'Salmonella Enteritidis u Salmonella Typhimurium f'nisel kummerċjali ta' flieles11. Biex tiżdied id-diskussjoni dwar dan is-suġġett, ir-riżultati preżenti enfasizzaw iċ-ċellula immuni infiltrata f'tessuti differenti ta 'nisel tal-flieles ikkontestati kemm b'razez tat-tip selvaġġ u mutanti li jġorru tħassir fil-ġeni ttrA u pduA. Matul l-esperiment ta' 2-ġimgħa, iż-żoni mtebbgħin b'mod pożittiv taċ-ċelluli CD{4+ u CD{8+ u l-makrofagi jsegwu l-aktar mudell simili, fejn f'1 u 14 dpi jippreżentaw numru ogħla ta' rispons immuni ċelloli. Dan jista 'jiġi spjegat mill-kuntatt primarju tas-sistema ta' difiża ospitanti meta l-patoġenu jinvadi. Ir-rapport preċedenti wera li fit-tiġieġ infettati, anke meta s-Salmonella ma tiġix eliminata fi 12 dpi, l-infezzjoni tista’ ssir pożittiva permezz ta’ swab tal-kloaka minn 13 dpi12, u jispjega għaliex iż-żoni taċ-ċelloli tas-sistema immunitarja fi 3 u 7 dpi kienu aktar baxxi iżda lura għal żieda. . L-ewwel daqqa t'għajn, ikun mistenni li r-rispons ikkawżat tal-ospitant jitnaqqas meta kemm pduA kif ukoll ttrA tħassru peress li dawn il-ġeni għandhom rwol importanti fis-sopravivenza waqt l-infezzjoni mis-Salmonella2,4,13-15. Madankollu, ir-riżultati tagħna li qabblu mutant doppju li m'għandux iż-żewġ ġeni wrew l-oppost, ir-razez mutanti ta 'Salmonella Enteritidis u Salmonella Typhimurium wasslu għal ċelloli ta' rispons immuni ogħla mit-tipi selvaġġi ta 'razez.

Benefiċċji ta' cistanche tubulosa-ssaħħaħ is-sistema immuni

L-iqsar żona mtebbgħin tista’ twassal għal numru għoli ta’ kolonji fil-passaġġ intestinali, li jikkorrobora studju preċedenti, fejn ir-razez tas-Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA u s-Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA ġew irkuprati f’numri ogħla minn tampuni cloakali mit-tip selvaġġ korrelatat11. . Is-Salmonella tista’ taġixxi bħala batterju extraċellulari jew intraċellulari, skont ir-repertorju tan-nutrijenti disponibbli, u sseħħ bħala bidla bejn kolonizzazzjoni intestinali u internalizzazzjoni fiċ-ċelloli ospitanti16. Meta l-batterji jiġu inġeriti u maqtula mill-makrofaġi, xi frammenti tal-peptidi jiġu trasferiti għall-wiċċ taċ-ċellula li tippreżenta l-antiġenu, u jiġu kkodifikati mill-kumpless ta 'istokompatibilità maġġuri (MHC), klassi II. Dan it-twaħħil peptide-MHC II jistimula l-limfoċiti T CD4+. Madankollu, jekk il-batterji jiddeċiedu li jinvadu ċ-ċellula ospitanti, jidħlu fiċ-ċitoplasma tal-makrofagu, il-konnessjoni tal-peptide ma 'tip ieħor ta' MHC, klassi I, tistimula l-produzzjoni tal-limfoċiti T CD8+17. Interessanti, iċ-ċelloli CD4+ u CD8+ jippreżentaw l-istess mudell tal-makrofaġi matul l-esperiment, anke jirrappreżentaw risponsi immuni differenti. Peress li ċ-ċelloli CD4+ u CD8+ huma prinċipalment jirrappreżentaw limfoċiti T li huma parti mir-rispons immuni adattiv, il-makrofaġi, huma parti mir-rispons immuni innat9. Barra minn hekk, osservajna li l-brojlers jippreżentaw żoni mmarkati pożittivi aktar espressivi minn tiġieġ li jbidu, ikkonfermat minn studju preċedenti fejn brojlers sfidati b’razez mutanti wrew, pereżempju, kolonizzazzjoni intestinali aktar invażiva u infezzjoni sistemika11. Is-sejbiet tagħna jissuġġerixxu li l-approċċ tal-immunoistokimika jipprovdi informazzjoni interessanti dwar l-imġieba taċ-ċelloli tar-rispons immuni fuq organi multipli ta 'nisel kummerċjali differenti waqt l-infezzjoni minn serovars ta' Salmonella enterica. Barra minn hekk, l-istudju preżenti evidenza li t-tħassir taż-żewġ ġeni, anke f'razez differenti ta 'Salmonella, irriżulta f'batterji li wasslu għal ċellula ta' rispons immuni ogħla fl-ospitant, li juri li l-patoġenu ma ġiex attenwat. Nistgħu nikkunsidraw li forsi s-Salmonella setgħet issib mekkaniżmu ieħor ta 'sopravivenza li jsir saħansitra aktar patoġeniku. L-użu ta 'operons ttr u pdu f'konsonanza ma' operons cob u PRP intwera, fl-istudju preċedenti, bħala meħtieġ għal respirazzjoni anerobika16, li wassalna biex nemmnu li mhux biss huwa meħtieġ li tħassar aktar ġeni minn kull operon18, iżda għandna wkoll biex taħseb li tħassar dan is-sett kollu, biex tilħaq razez inqas patoġeniċi tas-Salmonella enterica.

materjali u metodi

L-esperimenti, imwettqa skont linji gwida u regolamenti rilevanti, ġew approvati mill-Kumitat Etiku dwar l-Użu tal-Annimali tal-Università Statali ta’ Sao Paulo (Proċess CEUA/Unesp—006621/18; fl-10 ta’ Mejju, 2018), saru fil-Patoloġija tat-Tjur. Laboratorju tad-Dipartiment tal-Patoloġija, Terjoġenoloġija, u Saħħa Waħda mill-Iskola tax-Xjenzi Agrikoli u Veterinarji, Università Statali ta 'Sao Paulo (FCAV/ Unesp), Jaboticabal, Brażil.

Razez batterjali u kostruzzjoni mutanti.

Ir-razez batterjali użati hawn ġew maħżuna f'medju krijoprotettant kompost minn brodu Lysogeny (LB; BD DifcoTM, USA) supplimentat bi 30% ta 'gliċerol (Merck, BR—H30402394 228) u ħażna f'ultra-friża (- 80 grad ) fil-Laboratorju tal-Patoloġija tat-Tjur minn FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (numru ta’ adeżjoni: AM933172) u Salmonella Typhimurium str. 9819 ġew indotti għal reżistenza għall-aċidu nalidixic u l-ispektinomycin (Nalr Spcr) u pprovdew l-isfond ġenetiku għall-kostruzzjoni ta 'razez mutanti permezz ta' teknika Lambda-aħmar20 b'modifiki minuri, deskritti f'Saraiva et al.11. Batterji mutanti mibnija hawn huma identifikati fuq it-test bħala SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) u STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Esperiment in vivo.

Esperiment 1—Salmonella Enteritidis. Sitta u tletin 1-flieles ta’ jum minn kull tliet nisa differenti (brojlers, tiġieġ li jbidu nofshom tqal, u tiġieġ li jbidu ħfief), li jammontaw għal mija u tmien annimal, inkisbu minn mafqas kummerċjali. Mal-wasla, il-qiegħ tal-kaxxi tal-karti tat-trasport ġie eżaminat biex jiġi kkonfermat l-istatus ħieles tas-Salmonella tal-għasafar21, u l-annimali kienu miżmuma f'gaġeġ metalliċi ġewwa l-kamra akklimatizzata u rċevew għalf u ilma mingħajr antibijotiċi ad libitum. Fl-ewwel jum intgħażel programm ta' dawl 24-h biex jiżgura l-aħjar inġestjoni ta' ilma u ikel, imbagħad ġie adottat programm ta' dawl 12-h fl-ewwel ġimgħa, li jonqos għal 8 sigħat fil-jiem li fadal. L-inoculum kien ippreparat skont Berchieri Junior et al.22. Għal dan, il-kulturi ffriżati ġew imlaqqma f'LB u inkubati matul il-lejl f'37 grad taħt 150 rpm. L-għada, il-kulturi batterjali ġew trasferiti f'midja friska u inkubati għal 18-il siegħa taħt l-istess kundizzjonijiet bħal qabel. Imbagħad, 0.2 mL mill-kulturi li fihom 108 unitajiet li jiffurmaw kolonja għal kull mL (CFU/mL) ġew mlaqqma mill-ħalq permezz ta 'gavage metalliku direttament fil-wiċċ tar-raba' ta' l-għasafar. Disa' gruppi ġew iffurmati (A sa I) u maqsuma b'mod każwali skont in-nisel u razez differenti (Tabella 7). Fi jum, tlieta, seba’, u 14-jum wara l-infezzjoni (dpi), tliet għasafar għal kull grupp kull jum, sa filgħodu, ġew ewtanizzati permezz ta’ dislokazzjoni ċervikali biex jinħasdu s-sezzjoni medjali tat-tunsilli ċekali, ċecum, u ileum, u s-sezzjoni distali tal-lobu tax-xellug tal-fwied għal aktar analiżi ta 'immunohistochemistry (IHC). Għal dan, il-kampjuni ġew mgħaddsa fi ħdan n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brażil) li qabel kienu mkessħa fin-nitroġenu likwidu. Immedjatament wara l-iffriżar tat-tessuti, ġie trasferit f'cryotube ta '2 mL (Corning, USA) u kkundizzjonat f'nitroġenu likwidu. Wara t-teħid tal-kampjuni, it-tessuti ġew maħżuna f'-80 grad sal-proċess għall-IHC.

Esperiment 2-Salmonella Typhimurium. Dan l-esperiment sar wara l-istess karatteristiċi msemmija hawn fuq fl-Esperiment 1. Sitta u tletin flieles (jum 1) kienu maqsuma b’mod każwali f’disa’ gruppi (A sa I) ibbażati fuq in-nisel u r-razez tagħhom (Tabella 7).

Tabella 7. Gruppi stabbiliti skond in-nisel u razez differenti. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis tat-tip selvaġġ; wt-STM, Salmonella Typhimurium wild-type; NC, kontroll negattiv.

Immunoistokimika.

Sezzjoni tat-tessut. Il-kampjuni miġbura ġew trasferiti minn -80 grad għal krijostat (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, il-Ġermanja) f'-22 grad fejn ġew imblukkati individwalment f'kompost OCT (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Olanda) kull 30 minuta qabel sa sezzjoni ta' 6 µm bl-użu ta' xfafar li jintremew bi profil baxx (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, il-Ġermanja). Ta' min jinnota li s-sezzjonijiet saru f'-22 grad, ħlief sezzjonijiet tal-fwied, li saru f'-15 grad. Ġew ippreparati slides li kien fihom tliet repetizzjonijiet tat-taqsim ta 'kull organu għal kull rispons taċ-ċellula immuni mmarkat, b'tirqiq bejn kull ripetizzjoni. Bl-użu ta 'pinzell, il-qatgħat tas-sezzjoni tat-tessuti tqiegħdu fuq slides istoloġiċi ttrattati minn qabel b'poly-l-lysine (Sigma-Aldrich, ir-Renju Unit, Cat nru P4832) e silane (Sigma-Aldrich, USA. Cat nr. 440574). Il-pjastri ġew maħżuna f'-20 grad minn hemm 'il quddiem sakemm tbajja IHC. Tbajja taċ-ċelluli immuni. L-ewwelnett, il-pjastri ġew mgħaddsa f'200 mL aċetun refriġerat (Acetone PA-ACS, Synth, Brażil) u inkubati f'-20 grad għal 10 min. Wara dan, il-pjastri ġew trasferiti f'kamra ta 'umdità (EasyPath®, Brażil) f'temperatura tal-kamra għal 5 min biex jinxef il-kampjuni. Il-pjastri ġew maħsula minn hemm 'il quddiem b'PBS u għadira tħalliet għal 5 minuti biex tiġi evitata d-deidrazzjoni tat-tessut. Għaxar, tessuti ġew mgħaddsa f'200 mL ta '4% H2O2 kull 10 min f'post mudlam u maħsula mill-ġdid b'PBS. Iż-żona madwar is-sezzjonijiet tat-tessuti kienet imnixxfa b'karta assorbenti u l-kampjun kien bypassed minn pinna idrofobika (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danimarka). Il-pass tal-ħasil li jħalli għadira ġie ripetut bħal qabel. Il-kit mingħajr bijotina Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) intuża biex itebba ċ-ċelloli immuni, billi għażel il-metodu Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). Għal dan, il-puddle tneħħiet, u qtar ta 'reaġent li jimblokka l-kulur tal-isfond mhux speċifiku ġew miżjuda mat-tessuti. Il-pjastri nżammu ġewwa l-kamra ta' l-umdità f'post mudlam għal 30 minuta, il-pass tal-ħasil ġie ripetut, u 200 µL ta' antikorp primarju (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) dilwit fi proporzjon ta '1:200 (v/v) fir-reaġent tad-dilwent tal-antikorpi (dilwent tal-antikorpi, Abcam©, USA) ġie miżjud wara. Il-pjastri ġew inkubati f'4 gradi għal 18-il siegħa. L-għada, il-pjastri ġew maħsula bħal qabel. Għaxar, qtar tal-antikorp sekondarju (Reveal Complement, Abcam©, USA) ġew miżjuda wara li tneħħiet il-PBS żejjed, u l-kamra tal-umdità tqiegħdet f'ambjent skur għal 30 min. Sussegwentement, qatra ta’ 3,3′-diaminobenzidine (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) ġiet dilwita f’1 mL ta’ substrat (DAB Substrat, Abcam©, USA), liema volum huwa biżżejjed għal tliet slides, u miżjuda ma’ is-sezzjonijiet tat-tessuti. Minuta wara, il-pjastri ġew mgħaddsa f'200 mL dH2O għal 5 min. Wara dan, ġew trasferiti għal kubu tal-plastik li kien fih Harris ematoxylin (Êxodo Científca, il-Brażil) u tħallew għal 1 min. Wara, il-pjastri nħaslu għal 10 minuti taħt ilma ġieri bi pressjoni baxxa. Il-pjastri ġew sottomessi għas-serje alkoħol-xylene (70% Alkoħol, 90% Alkoħol, 100% Alkoħol, Xylene I, u Xylene II). Fl-aħħar, il-coverslips tqiegħdu fuq is-slajds wara li żiedet qatra ta 'mezz ta' immuntar mingħajr ilma (Entellan®, Merck, Brażil). L-immaġini mit-taqsimiet tat-tessuti ttieħdu b'mod każwali, billi għażlu ħames oqsma ta' viżjoni każwali, bl-użu ta' mikroskopju ottiku (lenti 400×) (Coleman®, mudell N-120) b'adapter għall-kamera diġitali, għal aktar analiżi statistika (Fig. 1 ).

Analiżi tad-dejta.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Il-perċentwal taċ-ċelloli CD{{0}} u CD8+ u makrofaġi ġie kkalkulat bl-użu ta' Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). Kienu kkwantifikati bħala valuri perċentwali mill-erja pożittiva tal-markatur taċ-ċellula immuni/erja totali. Analiżi statistika u grafika saru bl-użu tas-softwer GraphPad Prism v.8.0.1 għal macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA) u d-dejta ġiet sottomessa lill-Analiżi tal-Varjanza (ANOVA) segwita minn paraguni multipli Bonferroni, meta wieħed iqis livell ta' sinifikat inqas minn 5% (P Inqas minn jew ugwali għal 0.05).

Figura 1. Sezzjoni taċ-ċiecum tal-brojler infettat minn Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA li turi immunoreazzjonijiet fil-makrofaġi, 7 ijiem wara l-infezzjoni (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase, counterstained b'Hematoxylin).

Referenzi

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Sorsi ta 'salmonellożi mhux tifojde umana: Reviżjoni. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE et al. L-infjammazzjoni tal-imsaren tipprovdi aċċettatur tal-elettroni respiratorju għas-Salmonella. Natura 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Speċifiċità tal-mogħdijiet respiratorji involuti fit-tnaqqis tal-komposti tal-kubrit minn Salmonella enterica. Mikrobijoloġija (Qari) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. et al. L-infjammazzjoni intestinali tippermetti lis-Salmonella tuża l-etanolamina biex tikkompeti mal-mikrobijota. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Regolament ta' l-użu ta' fucose u 1,2-propandiol minn Salmonella enterica serovar Typhimurium. Quddiem. Microbiol. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Kataboliżmu tal-propionat fis-Salmonella Typhimurium LT2: Żewġ unitajiet traskritti b'mod diverġenti jinkludu l-locus prp f'8.5 ċentiżomi, prpR jikkodifika membru tal-familja sigma-54 ta' attivaturi, u l-ġeni prpBCDE jikkostitwixxu operon. J. Bacteriol. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Tqabbil ta 'metodi ta' kultura 3 u analiżi PCR għal skoperta ta 'Salmonella Gallinarum u Salmonella Pullorum fl-għalf tat-tjur. Polt. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. et al. Dinamika ta 'infiltrazzjoni taċ-ċelluli immuni fil-lamina propria taċ-ċekali tat-tiġieġ wara infezzjoni tat-twelid b'razza ta' Salmonella Enteritidis. Dev. Komp. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do sistema immuni. F'Doenças das Aves (eds AndreattiFilho, RL et al.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR It-tetrathionate alternattiv li jaċċetta l-elettroni jappoġġja t-tkabbir anerobiku dipendenti B12- tas-Salmonella enterica serovar Typhimurium fuq etanolamina jew 1,{{4} }propandiol. J. Bacteriol. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. et al. Id-deċifrar tar-rwol tal-ġeni ttrA u pduA għas-serovars tas-Salmonella enterica f'mudell ta 'infezzjoni tat-tiġieġ. Pathol tat-tjur. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Reazzjonijiet immuni ċellulari u umorali cross-reactive għas-serovars ta' Salmonella enterica Typhimurium u Enteritidis huma assoċjati ma' protezzjoni għal sfida mill-ġdid eterologa. Vet. Immunol. Immunopathol. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ A proeza isbaħ: Biex tikkompeti mal-mikrobijota tal-musrana, is-Salmonella tmexxi lill-ospitant tagħha biex tipprovdi aċċettatur tal-elettroni respiratorju. Mikrobi tal-Imsaren 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI et al. Is-Salmonella tuża taxis tal-enerġija biex tibbenefika minn infjammazzjoni intestinali. PLoS Pathog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Interazzjonijiet dinamiċi bejn is-Salmonella u l-mikrobijota, fi ħdan in-niċċa ta 'sfida tal-passaġġ gastrointestinali. Int. Sch. Res. Le. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Enzyme IIANtr tirregola l-invażjoni tas-Salmonella permezz tal-kataboliżmu ta '1,2-propanediol u propionate. Sci. Rep 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Difiżi Ospitanti kontra patoġeni batteriċi: Difiżi tat-tessuti u tad-demm. Fil-Patoġenesi Batterjali: Approċċ Molekulari (eds Salyers, AA & Whitt, DD) 16-29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. et al. Salmonella Heidelberg telf tal-ġeni fil-ġenb tar-rekwiżiti respiratorji f'mudell ta 'infezzjoni tat-tiġieġ. Mikrob Pathog. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Tnaqqis fl-eskrezzjoni tal-ħmieġ tas-Salmonella Typhimurium razza F98 fi tiġieġ imlaqqma bil-ħajja u organiżmi S. Typhimurium maqtula. Epidemjol. Infetta. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Inattivazzjoni f'pass wieħed ta' ġeni kromosomali f'Escherichia coli K-12 bl-użu ta' prodotti PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. investigazzjoni fil-kaxxa tat-trasport ta’ għasafar ta’ jum. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Osservazzjonijiet dwar il-persistenza u t-trażmissjoni vertikali ta 'Salmonella enterica serovars Pullorum u Gallinarum fit-tiġieġ: Effett ta' sfond ġenetiku batterjali u ospitanti. Pathol tat-tjur. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).