Astratt

Id-dipressjoni tirrappreżenta disturb psikjatriku prevalenti ħafna u diżabbli globalment. Evidenza dejjem tikber tindika li attivazzjoni newroinfjammatorja eċċessiva fi ħdan l-ippokampus tikkontribwixxi sostanzjalment għall-bidu u l-progressjoni ta 'sintomi depressivi. Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs), kostitwenti bijoattivi ewlenin estratti minn ħxejjex mediċinali li jittieklu tradizzjonaliCistanche deserticolauCistanche tubulosa, wrew proprjetajiet farmakoloġiċi newroprotettivi multipli fi studji preċedenti. Din l-investigazzjoni preżenti kellha l-għan li tesplora l-impatti terapewtiċi u l-mekkaniżmi molekulari eżerċitati minn CPhGs fuq fenotipi ta 'mġieba li jixbħu d-depressjoni attivati ​​minn stress ħafif kroniku imprevedibbli (CUMS) fil-ġrieden C57BL/6.

Sittin ġrieden C57BL/6 ta’ grad SPF ġew separati b’mod każwali f’sitt koorti sperimentali: grupp ta’ kontroll, grupp ta’ mudell CUMS, grupp ta’ CPhGs ta’ doża għolja (700 mg/kg), grupp ta’ CPhGs ta’ doża medja (350 mg/kg), grupp ta’ CPhGs ta’ doża baxxa (175 mg/kg) u grupp ta’ kontroll pożittiv (175 mg/kg/kg) u grupp ta’ kontroll pożittiv (175 mg/kg). Wara erba' ġimgħat ta' intervent ta' gavage tad-droga wara l-immudellar CUMS, ġew implimentati valutazzjonijiet newrokomportamentali komprensivi li jinkludu test ta' preferenza ta' sukrożju (SPT), test ta' kamp miftuħ (OFT), test ta' sospensjoni tad-denb (TST), u test ta' għawm sfurzat (FST). Kitts tal-assaġġ immunosorbenti marbut mal-enżimi (ELISA) ikkwantifikaw il-konċentrazzjonijiet tan-newrotrasmettituri tal-monoamini fis-serum, flimkien ma' ċitokini pro-infjammatorji tal-ippokamp u medjaturi infjammatorji. Tbajja ta 'Hematoxylin-eosin (HE) u tbajja 'Nissl viżwalizzaw korrimenti patoloġiċi newronali ġewwa reġjuni tal-ġirku dentat tal-hippocampal. L-immunoistokimika sabet l-intensità tal-espressjoni tal-proteina aċiduża fibrillari glial (GFAP), il-molekula tal-adapter tal-kalċju jonizzata-1 (Iba-1), NLRP3, u l-proteini Caspase-1. It-tbajja' ta' immunofluworexxenza evalwat aktar l-istatus ta' attivazzjoni tal-kaskata tas-sinjalar upstream TLR4/NF-κB.

Ir-riżultati sperimentali tagħna wrew li l-amministrazzjoni orali ta 'CPhGs mitigat b'mod notevoli l-anormalitajiet fl-imġieba relatati mad-dipressjoni. CPhGs elevati persentaġġ ta 'preferenza ta' sukrożju u naqsu t-tul ta 'immobbiltà f'paradigmi ta' mġiba bbażati fuq id-disperazzjoni. Barra minn hekk, it-trattament b'CPhGs irrestawra l-livelli tas-serum eżawrit u tas-serotonin tal-hippocampal (5-HT) kif ukoll tad-dopamina (DA). Sejbien bijokimiku żvelat soppressjoni sinifikanti ta 'medjaturi pro-infjammatorji tal-ippokamp u produzzjoni żejda taċ-ċitokini. Osservazzjonijiet istopatoloġiċi wrew eżenzjoni dipendenti mid-doża tal-ħsara newronali tal-hippocampal ipprovokata minn CUMS. Ir-riżultati immunoistokimiċi wrew li CPhGs żiedu d-densità tal-astroċiti mmarkata minn GFAP, inibixxu l-iper-attivazzjoni patoloġika tal-mikroglia pożittiva Iba-1, u l-abbundanza ta’ proteina relatata mal-infjammasoma NLRP3 irregolata 'l isfel. Assaġġi ta 'immunofluworexxenza vvalidaw li CPhGs trażżan l-attivazzjoni eċċessiva ta' TLR4 u NF-κB p65 fosforilata fit-tessut tal-hippocampal.

B'mod kollettiv, dawn is-sejbiet jikkonfermaw li CPhGs jeżerċitaw effikaċja prominenti bħall-antidipressanti kontra manifestazzjonijiet bħal depressjoni stimulati minn CUMS fil-ġrieden. Il-mekkaniżmu farmakoloġiku tiegħu huwa parzjalment medjat permezz ta 'funzjonijiet regolatorji doppji: ir-restawr tal-omeostażi tan-newrotrasmettitur monoamine u t-trażżin tar-risponsi newroinfjammatorji medjati mill-assi tas-sinjalar TLR4/NF-κB/NLRP3. Dan l-istudju fuq l-annimali jipprovdi bażi sperimentali preklinika li tappoġġja aktar sfruttament tas-CPhGs bħala aġenti kandidati naturali promettenti jew ingredjenti tal-ikel funzjonali għal intervent adjuvant tad-depressjoni.

Kliem ewlieni: Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs); dipressjoni; stress ħafif kroniku imprevedibbli; newroinfjammazzjoni; astroċiti; mikroglia; Mogħdija tal-infjammazzjoni TLR4/NF-κB/NLRP3

1. Introduzzjoni

Id-dipressjoni hija marda psikjatrika affettiva multidimensjonali kkaratterizzata minn manifestazzjonijiet kliniċi ewlenin li jinkludu burdata baxxa persistenti, anedonja, ritardazzjoni psikomotriċi, disturbi fl-irqad u t-tqajjim u disfunzjoni somatika. Episodji depressivi severi potenzjalment iwasslu għall-awtonomija u ħsibijiet suwiċidali, li jimponu piżijiet tremendi għas-saħħa pubblika madwar id-dinja. Id-dejta tal-istħarriġ epidemjoloġiku miċ-Ċina rrapportat li l-prevalenza nazzjonali tad-dipressjoni laħqet it-2.1 %, u l-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa kklassifikat id-disturb depressiv kbir fost il-mard fl-ogħla livell li jikkontribwixxi għal telf ta’ snin ta’ ħajja globali aġġustati għad-diżabilità.

Madankollu, l-etjoloġija molekulari kompluta sottostanti tal-patoġenesi tad-dipressjoni għadha mhux kompletament spjegata, u tfixkel soluzzjonijiet terapewtiċi kliniċi perfetti. Ipotesi patofiżjoloġiċi kontemporanji bidlu l-attenzjoni lejn mekkaniżmi ta' crosstalk newroimmuni. L-akkumulazzjoni tar-riċerka preklinika u klinika tenfasizza n-newroinfjammazzjoni persistenti bħala mutur patoġeniku vitali għal disturbi depressivi. Taħt sfidi kroniċi ta 'stress psikoloġiku jew fiżjoloġiku, il-popolazzjonijiet taċ-ċelluli gliali tal-hippocampal jgħaddu minn attivazzjoni anormali. Mikroglia attivata żżejjed u astroċiti li ma jiffunzjonawx iqanqlu rilaxx b'saħħtu ta 'medjaturi pro-infjammatorji multipli, li joħolqu effetti ta' amplifikazzjoni ta 'kaskata ta' ċitokini pro-infjammatorji. Insulti newro-infjammatorji bħal dawn ikomplu jinduċu deterjorament morfoloġiku newronali, disturb metaboliku tan-newrotrasmettitur u indeboliment tal-plastiċità sinaptika, u fl-aħħar mill-aħħar jiffaċilitaw progressjoni patoloġika bħal dipressjoni.

L-interventi antidipressanti kliniċi prinċipali attwali jiddependu b'mod predominanti fuq antidipressanti kimiċi sintetiċi rappreżentati minn fluoxetine, inibitur selettiv tar-reuptake tas-serotonin (SSRI). Minkejja serħan parzjali tas-sintomi għal ċerti pazjenti, l-antidipressanti sintetiċi għandhom żvantaġġi magħrufa sew: proporzjonijiet ta’ remissjoni kompluta mhux sodisfaċenti, sintomi depressivi residwi frekwenti, probabbiltà għolja ta’ rikaduta wara t-twaqqif tal-medikazzjoni, flimkien ma’ effetti sekondarji gastrointestinali, epatiċi u metaboliċi avversi waqt amministrazzjoni fit-tul. B'kuntrast, il-mediċini erbali tradizzjonali għandhom karatteristiċi modulatorji multi-mira u profili ta' sigurtà relattivament ħfief, u għalhekk jiġbdu interess ta' riċerka dejjem jikber għal terapija awżiljarja tad-disturbi tal-burdata.

Cistanche deserticolauCistanche tubulosa, komunement imsejħa "ġinseng tad-deżert", jappartjenu għall-familja Orobanchaceae. Iz-zkuk imlaħħam tagħhom iservu bħala materja prima tal-ikel mediċinali omologu klassiku fil-prattika tal-ħxejjex tradizzjonali tal-Asja. Investigazzjonijiet farmakoloġiċi moderni jiddokumentaw bijoattivitajiet newroprotettivi multipli għalCistancheestratti, inklużi effetti kontra n-newrodeġenerazzjoni kontra l-marda ta' Alzheimer u l-marda ta' Parkinson. Phenylethanol glycosides jikkostitwixxu frazzjonijiet bijoattivi prinċipali ġewwaCistancheestratti, prinċipalment li fihom echinacoside u verbascoside. Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs) juru bijoattivitajiet kontra t-tumur, antiossidanti, immunomodulatorji u newroprotettivi fuq pjattaformi sperimentali multipli.

Xogħol preliminari tal-laboratorju minn qabel wera li CPhGs jistgħu jgħollu l-konċentrazzjoni tad-dopamina strijatali u jtaffu l-fenotipi bħal depressivi assoċjati mal-menopawsa f'mudelli ta 'annimali gerriema. Madankollu, jekk is-CPhGs jipproduċux influwenzi protettivi fuq depressjoni ikkawżata minn stress kroniku, u kaskati dettaljati tat-trasduzzjoni tas-sinjali li jimmedjaw bijoattivitajiet bħal dawn għad m'għandhomx esplorazzjoni sistematika. Il-paradigma ta' l-annimali ta' stress ħafif kroniku imprevedibbli (CUMS) hija mudell wieħed ta' depressjoni preklinika stabbilita sew. Billi jesponi annimali gerriema tal-laboratorju għal stressors ħfief bl-addoċċ diversifikati matul ġimgħat suċċessivi, CUMS jirrikapitola b'mod affidabbli l-karatteristiċi depressivi ewlenin bħall-anedonja, disprament fl-imġieba u ħsara newropatoloġika tal-ippokamp.

Għaldaqstant, din ir-riċerka bniet mudell tal-ġurdien depressiv indott minn CUMS biex tevalwa sistematikament il-qawwa bħal antidepressant in vivo ta 'tliet dożaġġi gradjenti ta' CPhGs. Aħna ffukajna b'mod partikolari fuq l-irkupru tan-newrotrasmettitur monoamini, it-trasformazzjoni fenotipika taċ-ċelluli gliali tal-hippocampal, u l-mogħdija newro-infjammatorja tal-infjammazzjoni NLRP3 regolata minn TLR4/NF-κB. Dan l-istudju għandu l-intenzjoni li jforni evidenza sperimentali oġġettiva biex tappoġġja l-iżvilupp farmaċewtiku futur u l-applikazzjoni tal-ikel funzjonali tas-CPhGs li jimmiraw it-titjib tas-sintomi depressivi.

2. Materjali u Metodi

2.1 Materjali, Reaġenti u Strumenti Sperimentali

L-estratt mhux ipproċessat standardizzat ta 'CPhGs ġie akkwistat minn Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (lott Nru . 20231221, Xinjiang, iċ-Ċina). Kontenut totali ta' phenylethanol glycoside Akbar minn jew ugwali għal 85 %, li fih echinacoside Akbar minn jew ugwali għal 40 % u verbascoside Akbar minn jew ugwali għal 16 %. Il-kapsuli tal-fluoxetine hydrochloride inkisbu minn Patheon France. Kits kummerċjali ta' analiżi ELISA għal 5‑HT, DA, iNOS, COX‑2, PGE2, TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑ ġew minn fornituri kwalifikati ta' reaġent bijoloġiku. L-antikorpi primarji applikati għall-immunoistokimika u l-immunofluworexxenza kienu jinkludu antikorpi anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-Caspase-1, anti-TLR4 u anti-phospho-NF-κB p65. Kitts ta 'tbajja' istoloġika għat-tbajja' HE u Nissl ġew ippreparati għall-ipproċessar tas-sezzjoni tal-moħħ tal-paraffin.

Strumenti analitiċi ewlenin tal-laboratorju koprew bilanċ analitiku elettroniku ta’ preċiżjoni għolja, workstation għall-purifikazzjoni tal-ilma ultrapur Milli-Q, qarrej tal-mikroplate multi-mode SpectraMax, mikroskopju fluworexxenti wieqfa Leica, flimkien ma’ ħardwer komplut tal-analiżi tal-imġiba tal-annimali gerriema u sistema ta’ softwer ta’ traċċar tal-moviment SMART 3.0.

Sittin maskili SPF-grade C57BL/6 ġrieden, ta’ seba’ ġimgħat b’medda inizjali ta’ piż tal-ġisem ta’ 18-22 g, inxtraw minn Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Il-manipulazzjonijiet sperimentali kollha tal-ġrieden kisbu approvazzjoni etika formali mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Università ta’ Shaanxi tal-Mediċina Ċiniża (ID tal-approvazzjoni tal-etika: SUCMDL1503100231002031). Il-ġrieden kienu miżmuma ġewwa faċilitajiet ta' akkomodazzjoni għall-annimali mingħajr patoġeni speċifiċi. Il-parametri ambjentali nżammu f'temperatura ambjentali (21 ± 2) grad, umdità relattiva 60 % ± 10 %, bl-implimentazzjoni ta 'ċikli standard ta' illuminazzjoni dawl-dlam ta '12-il siegħa. L-ikel tal-gerriema u l-ilma tax-xorb kienu aċċessibbli ad libitum. Twettaq perjodu ta' akklimatizzazzjoni adattiva ta' ġimgħa qabel ma nbdew flussi ta' xogħol sperimentali formali.

2.2 Raggruppament tal-Annimali, Immudellar CUMS u Amministrazzjoni tad-Droga

Wara t-trobbija adattiva ta' ġimgħa, screening preliminari tal-preferenza tas-sukrożju eskluda ġrieden individwali bi preferenza inerenti ta' xorb taz-zokkor baxx. Ġrieden sperimentali kwalifikati ġew randomised f'sitt gruppi ta' studju (n = 10 annimali f'kull grupp):

Grupp ta 'kontroll (Con): l-ebda stress CUMS, amministrazzjoni intragastrika ta' ilma dejonizzat isovolumetriku;

Grupp mudell CUMS (Mod): jirċievi stimulazzjoni sħiħa CUMS, gavage b'ilma dejonizzat b'volum ugwali;

Grupp ta' CPhGs b'doża għolja (CPhGs-H): Espożizzjoni għal CUMS, CPhGs 700 mg/kg ta' piż tal-ġisem permezz ta' gavage ta' kuljum;

Grupp ta' CPhGs ta' doża medja (CPhGs-M): Espożizzjoni ta' CUMS, CPhGs 350 mg/kg permezz ta' gavage ta' kuljum;

Grupp ta' CPhGs b'doża baxxa (CPhGs-L): espożizzjoni għal CUMS, CPhGs 175 mg/kg b'gavage kuljum;

Grupp ta 'kontroll pożittiv ta' Fluoxetine (FLX): Espożizzjoni CUMS, fluoxetine 15 mg/kg gavage darba kuljum.

Għall-kostruzzjoni tal-mudell CUMS, ġew adottati għaxar tipi differenti ta 'stressers ħfief: trażżin fiżiku (60 min), aġitazzjoni ta' tħawwad orizzontali (60 min), sospensjoni tad-denb (60 min), gaġġa inklinata angolu ta' 45 grad (24 h), ambjent ta' friex niedja (24 h), iżolament b'gaġġa vojta (24 h), illuminazzjoni ħafifa ta' matul il-lejl għal għawm 2 h, 1-illuminazzjoni sħuna għal 25 h. għawm bl-ilma kiesaħ f'4 gradi għal 5 min, u stimulazzjoni tal-klipp tad-denb li ddum 2 min. Żewġ stressors distinti ġew applikati b'mod każwali kull jum wieħed; stress identiku ma jkunx jidher konsekuttivament f'jumejn maġenb xulxin. Il-proċedura tal-immudellar CUMS baqgħet tippersisti għal erba' ġimgħat.

Malli spiċċaw l-immudellar tal-istress ta’ erba’ ġimgħat, is-sustanzi tat-test korrispondenti jew il-vettura tas-solvent ġew mogħtija intragastrikament darba kuljum għal erba’ ġimgħat kontinwi oħra. Fit-tmien ġimgħa sperimentali, il-proġetti kollha ta 'skoperta newroimġieba ġew implimentati b'mod sekwenzjali.

2.3 Batterija tat-test newro-komportamentali

2.3.1 Test ta' Preferenza ta' Sukrożju (SPT)

It-test tal-preferenza tas-sukrożju jevalwa l-fenotip depressiv tal-qalba bħal anhedonia f'annimali gerriema. Qabel il-kejl formali, kull ġurdien kien jinżammu individwalment. Twettqet il-fażi ta' adattament tax-xorb sukrożju ta' tlett ijiem. L-ewwel jum: żewġ fliexken ta’ soluzzjoni ta’ sukrożju 1 % mqiegħda f’kull gaġġa għal 24 siegħa. It-tieni jum: flixkun wieħed tas-soluzzjoni ta’ sukrożju flimkien ma’ flixkun wieħed ta’ ilma purifikat. It-tielet jum: tbiddel il-pożizzjoni tal-kontenituri tal-ilma taz-zokkor u tal-ilma pur biex tiġi eliminata l-influwenza tal-preġudizzju tal-post. Wara ċ-ċiklu ta 'adattament, il-ġrieden sawmu mill-ikel u l-ilma għal 24 siegħa. Sussegwentement, ġew ipprovduti flixkun ta' l-ilma ta' sukrożju u flixkun ta' l-ilma purifikat miżun minn qabel. Il-pożizzjonijiet tal-flixkun ġew skambjati wara 12-il siegħa. Wara t-tul totali tal-ittestjar ta' 24 siegħa, il-piż tal-likwidu li jifdal taż-żewġ fliexken ġie rreġistrat b'mod preċiż. Rata ta' preferenza ta' sukrożju (%)=(konsum ta' soluzzjoni ta' sukrożju)/(konsum ta' soluzzjoni ta' sukrożju + konsum ta' ilma purifikat) × 100 %.

2.3.2 Test fuq il-post miftuħ (OFT)

L-apparat tal-kamp miftuħ ifforma kaxxa kubika miftuħa ta’ 50 cm × 50 cm × 50 cm. Ir-reġjun kwadru ċentrali kien definit bħala żona ċentrali ta '25 cm × 25 cm iċċentrata ġewwa l-arena. Kull ġurdien kien pożizzjonat bil-mod fuq il-wiċċ ċentrali tal-kaxxa open-field. Kien permess ħin ta' adattament b'xejn ta' ħames minuti. Ir-reġistrazzjoni tal-imġieba u l-analiżi tad-dejta kkonċentrati fuq perjodu sussegwenti ta’ osservazzjoni ta’ ħames minuti. L-indikaturi primarji tal-qari kien fihom id-distanza totali tal-moviment, il-ħin imqatta’ fiż-żona ċentrali, u l-frekwenza tal-entrati fiż-żona ċentrali. Dawn il-parametri jirriflettu attività lokomotriċi spontanja u rieda esploratorja taħt kundizzjonijiet ambjentali mhux familjari.

2.3.3 Test tas-Sospensjoni tad-Denb (TST)

Il-porzjon tad-denb tal-ġurdien kien imwaħħal b'mod sikur u jippermetti lill-annimal jiddendlu rasu 'l isfel fuq il-wiċċ tal-art. Il-ħin totali tar-reġistrazzjoni kien ta’ sitt minuti. It-tul tal-ħin immobile matul is-segment ta 'erba' minuti ta 'wara ġie dokumentat. Żieda fil-ħin tal-immobbiltà tirrappreżenta status mtejjeb ta' disprament fl-imġieba bħal depressiv.

2.3.4 Test tal-Għawm Sfurzat (FST)

Barmil ta 'l-għawm ċilindriku trasparenti (dijametru 15 ċm, għoli 50 ċm) kien mimli bl-ilma miżmum fi (25 ± 2) grad; fond tal-ilma laħaq 20 ċm. Kull ġurdien tpoġġa bil-mod fil-kontenitur tal-għawm għal intervall ta’ reġistrazzjoni totali ta’ sitt minuti. Il-ħin ta' immobilità f'wiċċ l-ilma ta' l-aħħar erba' minuti ġie kkwantifikat statistikament. Perjodu ta' immobilità itwal jindika prestazzjoni komportamentali intensifikata relatata mad-disprament.

2.4 Ġbir tal-Kampjuni u Preparazzjoni tat-Tessuti

Fil-punt terminali sperimentali ta' ġimgħa 8, il-ġrieden għaddew minn injezzjoni intraperitoneali ta' 3 % pentobarbital sodium (10 mL/kg) għal anestesija profonda. Il-kampjuni tad-demm inħasdu permezz ta’ teknika ta’ fsada li tneħħi l-boċċa tal-għajnejn. Wara saret l-ewtanasja tad-dislokazzjoni ċervikali. Il-perfużjoni kardijaka kiesħa normali-salina neħħiet id-demm li jiċċirkola ġewwa t-tessuti ċerebrali. Kampjuni sħaħ tal-moħħ sħiħ ġew dissekjati malajr. Nofs tessuti tal-moħħ ġew mgħaddsa f'4 % ta' soluzzjoni ta' paraformaldehyde għal 72 siegħa ta' fissazzjoni tat-tessuti għall-istoloġija sussegwenti. Ir-reġjuni tal-moħħ tal-ippocampal ġew iżolati malajr minn kampjuni tal-moħħ li kien fadal fuq pjattaforma tas-silġ imkessħa minn qabel u ppreservati ġewwa ambjent ta 'ħażna ta' nitroġenu likwidu. Għall-kejl bijokimiku, kampjun tat-tessut ta 'l-ippokampju ta' 10 mg tħallat ma' salina normali mkessħa minn qabel wara proporzjon tal-volum tal-massa 1:9, li għadda minn omoġenizzazzjoni mekkanika tal-banju tas-silġ. L-omoġenat tat-tessut ġie ċentrifugat taħt 4000 r/min għal 15-il minuta, u l-frazzjonijiet supernatant inġabru għall-kwantifikazzjoni tal-bijomarkatur ELISA.

2.5 Kejl tal-Indiċi Bijokimiku

Skont il-manwali tat-tħaddim tal-manifattur ta 'kits ELISA kummerċjali, kampjuni supernatant ta' serum u omoġenat tal-hippocampal tkejlu biex jiksbu valuri ta 'konċentrazzjoni ta' newrotrasmettituri monoamine inklużi 5-HT u DA. Is-supernatant omoġenat tal-ippocampal ġie ttestjat aktar għal indikaturi medjaturi infjammatorji iNOS, COX-2, PGE2, flimkien ma' ċitokini pro-infjammatorji TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 u IFN-. Il-qari tal-assorbiment tad-densità ottika nqabad permezz tal-ispettrofotometru tal-mikroplate. Il-konċentrazzjoni tal-proteina tal-kampjun ġiet ikkalibrata bl-applikazzjoni ta' kit ta' kwantifikazzjoni tal-proteini BCA qabel is-sejbien taċ-ċitokini.

2.6 Tbajja istopatoloġika tal-Hippocampal

Kampjuni fissi tat-tessut tal-moħħ ġew inkorporati fix-xama' tal-paraffin u mqattgħin f'sezzjonijiet istoloġiċi ta' ħxuna ta' 4 μm. Għat-tbajja 'HE: sezzjonijiet tal-paraffin għaddew minn xylene dewaxing, gradjent ta' idratazzjoni tal-etanol, tbajja nukleari tal-ematossilina, kontro-tbajja ċitoplasmika tal-eosin, differenzjazzjoni tal-alkoħol idrokloriku, deidrazzjoni tal-etanol gradjent, trattament ta 'trasparenza tal-xylene u immuntar newtrali tal-gomma. Osservazzjoni mikroskopika ffukat fuq il-morfoloġija ċellulari, l-istatus nukleari u l-integrità strutturali ċitoplasmika fir-reġjun tal-ġir dentat tal-hippocampal.

It-tbajja' ta' Nissl tivisualizza corpuscles ta' Nissl newronali li jirriflettu l-attività bijosintetika newronali u l-vitalità taċ-ċelluli. Flieli tal-paraffin dewaxed ġew inkubati f'soluzzjoni ta 'ħidma tat-tbajja' Nissl. Wara passi tal-ħasil bl-ilma distillat, is-sezzjonijiet irċevew deidrazzjoni, proċedura ta 'trasparenza u siġillar. Varjazzjonijiet istomorfoloġiċi tan-newroni tal-hippocampal ġew osservati taħt mikroskopju ottiku.

2.7 Assaġġ Immunoistokimika

Is-sezzjonijiet tat-tessuti tal-hippocampal inkorporati fil-paraffin ġew dewaxed u idratati. L-irkupru tal-antiġenu, l-imblukkar tal-perossidasi endoġenu u l-passi mhux speċifiċi tal-imblukkar tal-irbit tal-proteini ġew implimentati b'mod sekwenzjali. Flieli tat-tessut ġew inkubati matul il-lejl f'temperatura ta '4 gradi b'antikorpi primarji dilwiti: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-Caspase-1 (1:400). Wara l-inkubazzjoni tal-antikorpi sekondarji, saret reazzjoni kromoġenika DAB. Tlestew il-proċeduri ta' kontro-tbajja, deidrazzjoni u immuntar tan-nukleu. Mikroskopju tad-dawl maqbud immaġini diġitali tal-kamp tal-vista. Is-softwer tal-ipproċessar tal-immaġni tal-Immaġini-J ikkalkula valuri medji tad-densità ottika biex jevalwa b'mod semi-kwantitattiv l-intensità tal-espressjoni tal-proteina fil-mira.

2.8 Tbajja ta' immunofluworexxenza

Sezzjonijiet tal-hippocampal tal-paraffin ippreparati esperjenzaw dewaxing, irkupru tal-antiġen u operazzjoni ta 'imblukkar. Antikorpi primarji anti-TLR4 (1:400) u anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) ġew applikati u inkubati matul il-lejl f'kundizzjoni ta' erba' gradi Celsius. Antikorpi sekondarji ttikkettjati fluworexxenti ġew miżjuda għal inkubazzjoni ta 'siegħa taħt status ta' protezzjoni mid-dawl. Il-kontro-tebgħa nukleari DAPI ġiet inkluża fil-mezz ta' muntaġġ. Mikroskopju tal-fluworexxenza bil-lejżer fotografat sinjali tal-fluworexxenza. Is-softwer Image-J ikkalkula l-intensità medja tal-fluworexxenza li tirrappreżenta l-kobor tal-attivazzjoni tal-proteini p-NF-κB p65.

2.9 Analiżi Statistika

Id-dejta sperimentali oriġinali ġiet ipproċessata bl-użu ta 'softwer tal-istatistika SPSS 26.0 u l-programm tal-grafika GraphPad Prism 9.0. Id-dejta kollha dwar ir-riżultat kwantitattiv kienet espressa bħala medja ± devjazzjoni standard (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Twettqu paraguni statistiċi bejn il-gruppi b'testijiet statistiċi xierqa. Il-valur P inqas minn 0.05 ġie ġġudikat bħala differenza statistikament sinifikanti; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Riżultati Sperimentali

3.1 CPhGs Imtejba Sintomi ta 'Anhedonia u Livelli Restawrati ta' Newrotrasmettitur Monoamine

Qabel il-bidu tal-immudellar CUMS, ir-rati bażi ta' preferenza ta' sukrożju ma wrew l-ebda varjanza statistika ovvja fil-koorti kollha tal-annimali sperimentali. Wara stress CUMS ta’ erba’ ġimgħat flimkien ma’ ċikli ta’ intervent ta’ erba’ ġimgħat, il-grupp tal-mudell CUMS wera proporzjon ta’ preferenza ta’ sukrożju mnaqqas b’mod distint fir-rigward ta’ annimali ta’ kontroll mhux stressati (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

Meta mqabbla mal-koorti tal-mudell Mod, gruppi ta' trattament b'CPhGs b'doża għolja, medja u baxxa kif ukoll grupp pożittiv ta' fluoxetine iġġeneraw elevazzjoni prominenti fuq il-perċentwali ta' preferenza ta' sukrożju, 5-HT fis-serum, DA fis-serum, 5-HT tal-hippocampal u kontenuti DA tal-ippokampu (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 Attività Esploratorja Mtejba tas-CPhGs fit-Test fuq il-Qasam Miftuħ

Fl-evalwazzjoni tal-imġieba fuq il-post miftuħ, il-ġrieden tal-mudell CUMS urew tnaqqis notevoli fuq id-distanza totali tal-moviment, il-ħin tal-waqfa fiż-żona ċentrali u l-frekwenza tad-dħul fir-reġjun ċentrali versus il-ġrieden tal-kontroll (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhGs Imqassar Żmien ta' Immobbiltà f'Paradigmi ta' Imġieba Ibbażati fuq Disperazzjoni

It-test tas-sospensjoni tad-denb u t-test tal-għawm sfurzat jiskopru disprament fl-imġieba, li jirrappreżenta qari tal-imġieba bħal depressivi ewlenin. Il-grupp Mod wera ħin ta’ immobilità mtawwal drastikament kemm f’TST kif ukoll f’FST (P< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhGs Mnaqqsa Ċitokini Pro-Infjammatorji Ippocampali Espressi Żejjed

Il-konċentrazzjonijiet ta' ċitokini pro-infjammatorji ta' l-ippokampu (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) f'annimali tal-mudell CUMS kienu elevati drastikament meta mqabbla mal-kontropartijiet ta' kontroll (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 CPhGs Bijomarkaturi Infjammatorji-Medjaturi tal-Ippokampju Irregolati Down

Il-medjaturi infjammatorji tal-ippocampal iNOS, COX-2 u PGE2 fil-ġrieden mudell CUMS żdiedu b'mod sinifikanti (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 CPhGs Attenwat Korriment Patoloġiku Newronali Ippokampali Ixprunat minn CUMS

Riżultati tat-tbajja 'HE: newroni hippocampal dentate-gyrus mill-grupp Mod ippreżentaw leżjonijiet patoloġiċi severi: arranġament ċellulari diżordinat, nukleu piknosi, deġenerazzjoni vakuolari ċitoplasmika, li timmanifesta ħsara newronali prominenti. Il-grupp CPhGs-L wera biss effett ta 'titjib trivjali. CPhGs ta' doża medja u ta' doża għolja ovvjament ireġġgħu lura tali alterazzjonijiet patoloġiċi; grupp CPhGs-H b'doża għolja wera effett ta 'protezzjoni newronali superjuri meta mqabbel mal-grupp ta' fluoxetine f'kampi viżivi parzjali.

Riżultati tat-tbajja 'Nissl: In-newroni tal-hippocampal tal-grupp Mod urew arranġament diżorganizzat, tnaqqis evidenti tal-kwantità ta' corpuscle Nissl, li rrifletta funzjoni sintetika newronali indebolita u vitalità ċellulari baxxa. L-amministrazzjoni ta' CPhGs tiddependi mid-doża rrestawra l-abbundanza tal-ġisem Nissl. Il-morfoloġija newronali u d-densità ta' Nissl-corpuscle fi ħdan il-grupp CPhGs-H resqu lejn il-livell normali tal-grupp ta' kontroll. Is-sejbiet istopatoloġiċi kkonfermaw li CPhGs ipproteġu l-integrità tan-newroni tal-hippocampal kontra l-qerda medjata minn stress kroniku.

3.7 Status ta' Attivazzjoni taċ-Ċellola Glial tal-Hippocampal Irregolat minn CPhGs

GFAP huwa bijomarkatur speċifiku għall-popolazzjoni tal-astroċiti. Meta mqabbel mal-grupp Con, l-intensità tas-sinjal pożittiv tal-GFAP tal-ippocampal tal-grupp Mod naqset b'mod sinifikanti (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Il-markatur tal-proteina Iba-1 jirrappreżenta l-mikroglia. Il-grupp tal-mudelli CUMS wera sinjal ta’ espressjoni pożittiva Iba-1 li żdied b’mod drammatiku (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs Inibit Espressjoni tal-Proteina Relatata mal-Inflammasome NLRP3-Hippocampal

L-iskoperta ta' l-immunoistokimika uriet l-espressjoni tal-proteina NLRP3 u Caspase-1 ġewwa l-ippokampus tal-grupp Mod kienu regolati sew (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhGs Imrażżna Attivazzjoni Żejjed tal-Passaġġ tas-Sinjali TLR4/NF-κB

L-iskoperta tal-immunofluworexxenza wriet li l-ġrieden tal-mudell CUMS wrew intensità tal-fluworexxenza miżjuda b'mod sinifikanti tar-riċettur TLR4 u s-subunità NF-κB p65 fosforilata (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Diskussjoni

Disturb depressiv maġġuri jikkostitwixxi mard newro-psikjatriku sever. F'dawn l-aħħar snin, it-teorija newro-infjammatorja tad-dipressjoni ġibdet attenzjoni ta' riċerka mifruxa. Stress psikoloġiku kroniku ripetut jista 'jikkawża attivazzjoni tas-sistema immuni innata fis-sistema nervuża ċentrali. Hippocampus, reġjun wieħed tal-moħħ vulnerabbli ħafna għall-insulti tal-istress, huwa korrelatat sewwa mal-modulazzjoni tal-burdata, l-ipproċessar tal-premju u l-funzjoni tal-memorja. Taħt stimulazzjoni sostnuta tal-istress, l-omeostażi taċ-ċelluli gliali tal-hippocampal tikkollassa. Mikroglia attivata żżejjed u astroċiti bil-ħsara inixxu kwantitajiet kbar ta 'ċitokini pro-infjammatorji, li jagħtu lok għal korriment strutturali newronali, disturb metaboliku ta' monoamine-newrotrasmettitur, li eventwalment jippromwovi emerġenza ta 'mġieba bħal dipressjoni.

Prodotti naturali attivi tradizzjonali derivati ​​mill-mediċina tal-ħxejjex jippossjedu vantaġġi farmakoloġiċi multi-mira, li jsiru riżorsi kandidati promettenti għall-iskoperta ta 'mediċini antidipressanti. Is-CPhGs huma komponenti bijoattivi tal-firma iżolati minnCistancheħaxix mediċinali. Din ir-riċerka bniet mudell tal-ġurdien ta' depressjoni ta' stress kroniku ikkawżat minn CUMS, u vverifika b'mod komprensiv l-effikaċja in vivo bħal antidipressanti ta' CPhGs b'dożaġġ gradwali. Riżultati sperimentali tal-imġieba wrew li t-trattament b'CPhGs tejjeb b'mod sinifikanti s-sintomi tal-anedonja, tejbet l-attività esploratorja, u naqqas il-ħin tal-immobbiltà relatat mad-disperazzjoni fil-ġrieden tal-mudell tad-depressjoni, u wera korrelazzjoni ċara tal-effett tad-doża.

L-ipoteżi tan-newrotrasmettitur tal-monoamine hija teorija klassika tad-depressjoni-patoġenesi. Is-serotonin u d-dopamina jieħdu rwoli regolatorji kritiċi li jkopru l-istabbilizzazzjoni emozzjonali, il-perċezzjoni ta’ premju-feedback u l-modulazzjoni tal-imġieba relatata mal-motivazzjoni. L-istress CUMS wassal għal tnaqqis ovvju tal-konċentrazzjonijiet ta '5-HT u DA fis-serum u t-tessut tal-ippocampal fl-annimali mudell tagħna. L-intervent ta 'CPhGs irrestawra b'mod effettiv dawn iż-żewġ livelli ta' newrotrasmettitur monoamine. Dan ir-riżultat huwa konsistenti ma 'rapporti ta' riċerka ppubblikati preċedenti dwarCistancheestratti li jimmodulaw in-newrotrasmettituri tal-monoamini tal-moħħ.

Ittestjar ulterjuri tal-bijomarkaturi bijokimiċi wrew li CUMS wassal għal elevazzjoni robusta ta 'ċitokini pro-infjammatorji multipli (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) flimkien ma' medjaturi infjammatorji (iNOS, COX-2, PGE2) fit-tessut tal-hippocampal. L-intervent tas-CPhGs qaleb b'mod sinifikanti tali status ta' espressjoni eċċessiva infjammatorja. It-tbajja istopatoloġika ta' HE u Nissl ippruvat b'mod intuwittiv li CPhGs mitigaw il-ħsara tan-newroni tal-hippocampal ikkawżata mill-istress u pproteġu l-integrità morfoloġika newronali.

Popolazzjonijiet taċ-ċelluli gliali jservu bħala parteċipanti ċentrali li jimmedjaw risponsi newro-infjammatorji. L-astroċiti jżommu r-riċiklaġġ tan-newrotrasmettituri, l-istabbiltà strutturali tal-barriera tad-demm-moħħ u l-provvista tan-nutrizzjoni newronali. Il-mikroglia jiffunzjona bħala ċelluli effetturi innati-immuni residenti ġewwa parenkima tal-moħħ. L-istress kroniku jipprovoka telf tal-astroċiti jew inkompetenza funzjonali, flimkien mal-iperattivazzjoni patoloġika tal-mikroglia. Id-dejta tal-immunoistokimika tagħna indikat li t-trattament b'CPhGs elevat id-densità tal-astroċiti pożittivi għall-GFAP, sadanittant naqqset il-kwantità tal-mikroglia attivata żżejjed immarkata bl-Iba-1 fl-ippokampus. Din il-proprjetà regolatorja tal-fenotip taċ-ċelluli gliali tista' tkun ibbażata parzjalment fuq il-qawwa farmakoloġika newroprotettiva u kontra d-depressjoni tas-CPhGs.

NLRP3 inflammasome jirrappreżenta pjattaforma molekulari vitali li timmedja kaskata newro-infjammatorja. L-attivazzjoni tagħha tmexxi l-maturazzjoni u s-sekrezzjoni taċ-ċitokini pro-infjammatorji IL-1 u IL-18 downstream. L-assi tas-sinjal TLR4/NF-κB jaġixxi bħala sinjal ta 'priming upstream essenzjali għall-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3. L-istimulazzjoni tar-riċettur TLR4 tippromwovi l-fosforilazzjoni tas-subunità NF-κB u t-traslokazzjoni nukleari, aktar trans-attiva NLRP3, traskrizzjoni tal-ġene pro-IL-1. Fl-istudju preżenti tagħna, l-istress CUMS qajjem titjib konkorrenti għal TLR4, NF-κB p65 fosforilat, NLRP3 u espressjoni tal-proteina Caspase-1. L-intervent ta 'CPhGs inibixxi b'mod distint l-attivazzjoni ta' din il-kaskata tas-sinjali kollha. Aħna għalhekk nikkonkludu li CPhGs itaffu l-ħsara newro-infjammatorja parzjalment billi trażżan l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 medjata minn TLR4/NF-κB.

Meħuda flimkien, l-evidenza sperimentali tal-mudell tal-annimali tagħna tappoġġja l-mudell mekkanistiku: CPhGs jiġġeneraw effetti bħal antidepressanti fil-ġrieden depressivi indotti minn CUMS permezz ta 'żewġ dimensjonijiet primarji: (1) restawr tal-omeostażi ta' newrotrasmettituri monoamine relatati mal-burdata (5-HT, DA); (2) jimmodulaw l-omeostażi taċ-ċelluli gliali tal-hippocampal u jrażżnu l-kaskata patoloġika newro-infjammatorja NLRP3 mmexxija minn TLR4/NF-κB.

Diversi limitazzjonijiet ta' din l-investigazzjoni jistħoqqilhom konsiderazzjoni. Dan ix-xogħol implimenta biss esperimenti in vivo fil-livell tal-annimali. Aħna ma għamilniex validazzjoni mekkanistika fil-livell ċellulari u lanqas provi kliniċi umani. Għalhekk, l-inferenza translazzjonali lejn it-terapija tad-depressjoni umana għandha tibqa' prudenti. Barra minn hekk, din ir-riċerka ma ħarbitx kontribuzzjonijiet ta 'komposti monomeriċi individwali (echinacoside, verbascoside) fi ħdan estratt ta' CPhGs imħallat. Ir-riċerka futura tista' tikkonċentra fuq il-verifika mekkanistika tal-kultura taċ-ċelluli, it-tqabbil tal-attività tal-komponenti individwali, kif ukoll l-osservazzjoni pilota preliminari tas-suġġett uman.

5. Konklużjoni

Cistanche phenylethanol glycosides (CPhGs) jipproduċu azzjonijiet farmakoloġiċi sinifikanti bħal antidepressanti kontra fenotipi komportamentali kroniċi imprevedibbli li jixbħu d-depressjoni ikkawżata minn stress ħafif fil-ġrieden C57BL/6. Il-mekkaniżmi relatati ma 'terapewtiċi tiegħu huma assoċjati mal-irkupru tal-livelli ta' serotonin u dopamine newrotrasmettitur tas-serum u tal-hippocampal, preservazzjoni tal-integrità tal-istruttura newronali tal-ippokamp, ​​modulazzjoni tal-ekwilibriju funzjonali tal-astrocyte-microglia, kif ukoll soppressjoni ta 'TLR4/NF-κB/NLRP3 medjata minn kaskata infjammatorja newro-infjammatorja. Dan l-istudju prekliniku fuq l-annimali jipprovdi referenza sperimentali għal aktar żvilupp ta’ CPhGs bħala sustanza awżiljarja terapewtika naturali jew ingredjent ta’ ikel funzjonali li jimmira għat-titjib tas-sintomi depressivi.

Referenzi

Ren L, Shao YT, Qin SH. Studju dwar l-identifikazzjoni tal-mira u l-effett tas-saponin A fuq id-disturb depressiv. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44‑51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Il-glikożidi totali minn zkuk ta 'Cistanche tubulosa itaffu l-imgieba li jixbħu d-dipressjoni: interazzjoni bidirezzjonali tal-fitokimiċi u l-mikrobijota tal-musrana. Phytomedicine, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et al. Analiżi integrata tal-kompożizzjoni fitokimika, farmakokinetika, u farmakoloġija tan-netwerk biex tinvestiga distinzjonijiet bejn iz-zkuk ta 'Cistanche deserticola u C. tubulosa ibbażati fuq attività antidipressanti. Food & Function, 2022,13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depressjoni bħala marda mikrogliali. Trends in Newroxjenzi, 2015, 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Mikroglia fid-dipressjoni: perspettivi attwali. Science China-Life Sciences, 2021, 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. iż-żejt volatili jtejjeb l-imġiba depressiva u jinibixxi n-newroinfjammazzjoni fil-ġrieden esposti għal CUMS billi jinibixxi l-mogħdija tas-sinjalar MyD88/NF-κB medjata minn TLR4. Ġurnal ta 'Newroanatomija Kimika, 2023,130:102270.