Kuntatt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui‐ying Shi|Ya‐jun Yang|Wei Chen|Lian‐feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche għandu effett kontra t-tixjiħ

Astratt

Sfond: It-tnaqqis relatat mal-ħin fil-kapaċità riġenerattiva u l-omeostażi tal-organi huwa karatteristika ewlenija ta 'tixjiħ. Rehmannia glutinosa u Astragalus membranaceus intużaw bħala mediċini erbali Ċiniżi tradizzjonali għal immunità msaħħa u ħajja fit-tul. Madankollu, il-mekkaniżmu li bih din il-mediċina tal-ħxejjex inaqqas it-tixjiħ mhux magħruf. F'dan l-istudju, investigajna l-mekkaniżmu tal-ħxejjexeffett kontra t-tixjiħ.

Metodi: Il-ġrieden ġew mitmugħa dieti supplimentati b'R. glutinosa jew A. membranaceus għal 10 xhur; il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ dieta standard. Il-fenotipi ġew evalwati permezz ta 'sistema ta' punteġġ ta 'gradazzjoni u analiżi tas-sopravivenza. Il-perċentwali tal-fenotipi tas-senescence taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSCs) ġew determinati b'analiżi tal-għażla taċ-ċelloli attivati ​​bil-fluworexxenza. Il-funzjoni u l-mekkaniżmu tal-HSCs ġew analizzati b'assaġġ klonoġeniku u r-reazzjoni fil-katina tal-polimerażi f'ħin reali.

Riżultati: Il-effett kontra t-tixjiħta 'R. glutinosa hija dovuta għall-funzjoni msaħħa ta' HSCs. Ġrieden mitmugħa b'R. glutinosa wrew karatteristiċi ta 'battimenttixjiħproċess, inkluż tnaqqis fis-senescenza u żieda fir-rata ta’ sopravivenza. L-analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss uriet numri mnaqqsa ta 'ċelluli Lin-Sca1 flimkien ma' c-kit- (LSK), HSCs fit-tul (LT-HSCs) u HSCs għal żmien qasir (ST-HSCs) fil-grupp R. glutinosa. In vitro, analiżi klonoġeniċi wrew żieda fil-kapaċità ta 'tiġdid ta' LT-HSCs mill-grupp R. glutinosa kif ukoll iż-żamma ta 'quiescence LSK permezz ta' espressjoni p18 upregulated. Il-grupp R. glutinosa wera wkoll livelli mnaqqsa ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv u l-perċentwal ta 'ċelluli ‐gal plus permezz ta' downregulation tal-proteina p53 u p16 assoċjata mas-senescence ċellulari.

Konklużjoni: Rehmannia glutinosa teżerċitakontra t-tixjiħeffetti billi tinżamm il-kwiet u titnaqqas is-senescenza tal-HSCs.

KELMI EWLENIN:anti-aging, ċelloli staminali ematopojetiċi, quiescence, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUZZJONI

It-tixjiħ huwa definit bħala t-tnaqqis funzjonali dipendenti fuq iż-żmien li jaffettwa l-biċċa l-kbira tal-organiżmi ħajjin.1 Il-lonġevità tal-organiżmi hija prinċipalment miżmuma minn ċelloli staminali.2 Iċ-ċelloli staminali speċifiċi għat-tessut għandhom il-kapaċità li jiġġeddu lilhom infushom u jiddifferenzjaw f’varjetà ta’ ċelluli effettivi. 3 Madankollu, matul il-proċess tat-tixjiħ, din il-kapaċità ta’ tiġdid waħdu tonqos, u eventwalment twassal għall-akkumulazzjoni ta’ tessuti mhux imsewwija u bil-ħsara f’organiżmi mdaħħla fiż-żmien. kompartiment jista 'jirriżulta f'mewt jew mard assoċjat mal-età.2 Barra minn hekk, studji reċenti jissuġġerixxu li t-tiġdid taċ-ċelluli staminali jista' jaqleb il-fenotip tat-tixjiħ.5,6 Fis-sistema ematopojetika, iċ-ċelloli staminali ematopojetiċi (HSCs) huma responsabbli għall-produzzjoni taċ-ċelluli tad-demm. Fil-ġrieden età, is-sistema ematopojetika turi indeboliment taċ-ċelluli limfoid T u B u n-numru ta 'ċelluli majelojdi jiżdied. L-HSCs ta' età wrew attività ta' tiġdid mnaqqsa u kapaċità ta' kostruzzjoni mnaqqsa tal-ematopoiesis. Notevolment, bidliet relatati mal-età fil-kompartiment tal-HSC huma manifestati fl-host li qed tixjieħ bħala anemija, żieda fil-propensità għal neoplażmi majeloproliferattivi, tnaqqis fil-funzjoni immuni u żieda fl-inċidenza tal-kanċer.7-9 Madankollu, il-mekkaniżmu tat-tixjiħ tal-HSC u l-effetti tal-mediċini erbali fuq ix-xjuħija tal-HSC mhumiex magħrufa.10

In-nies kienu mħassba li jdewmu l-proċess tax-xjuħija u li jibqgħu żgħar minn żminijiet antiki ukontra t-tixjiħhija fokus attwali tar-riċerka. Il-mediċina tradizzjonali Ċiniża rċeviet attenzjoni dejjem akbar għat-trattament ta 'diversi mard assoċjat mat-tixjiħ. Ħafna ħwawar użati fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża huma magħrufa li jipprovdu effetti pożittivi kontra t-tixjiħ permezz ta’ mekkaniżmi differenti. Rehmannia glutinosa u Astragalus membranaceus ġew użati b'mod wiesa 'b'dan il-mod għal eluf ta' snin.

Rehmannia glutinosa tintuża biex tikkura diversi disturbi dijabetiċi, ittejjeb il-metaboliżmu tal-għadam fl-osteoporożi, u tinibixxi l-infjammazzjoni u l-fibrożi tal-fwied. Barra minn hekk, dan il-ħaxix għandu effetti oħra inklużikontra l-għeja, proprjetajiet antidipressanti u newroprotettivi. Fl-aħħar ftit snin, studji farmakoloġiċi fuq R. glutinosa u l-komponenti attivi tagħha ffukaw prinċipalment fuq l-azzjonijiet wesgħin tiegħu fuq is-sistemi tad-demm, endokrinali, kardjovaskulari u nervużi.11-14 Għalhekk, R. glutinosa intwera li jippossjedi immuno qawwija. ‐attività ta’ titjib, li pprovdiet il-bażi teoretika għal aktar studji.

Astragalus membranaceus għandu proprjetajiet toniċi, epatoprotettivi, dijuretiċi u expectoranti15 u ntwera li juri immunomodulatorji,16anti-infjammatorji,uantiossidanteffetti.17 L-eluċidazzjoni tal-mekkaniżmi molekulari sottostanti l-effetti tal-mediċini tradizzjonali Ċiniżi fil-prattika klinika hija pass ewlieni lejn l-applikazzjoni dinjija tagħhom, u dan is-suġġett bħalissa huwa suġġett ta 'interess intens ta' riċerka.

Għalhekk, f'dan l-istudju, aħna mitmugħa dieti tal-ġrieden supplimentati b'R. glutinosa u A. membranaceus għal 10 xhur biex nesploraw il-mekkaniżmu sottostanti l-abbiltà ta 'R. glutinosa biex iżid il-lonġevità.

2|MATERJALI U METODI

2.1|Raggruppament u trattament ta' annimali

Ġrieden femminili C57BL/6J inżammu f'ambjent ħieles mill-patoġeni u mitmugħa b'dieta standard. L-użu tal-annimali f'dan l-istudju ġie approvat mill-Kumitati tal-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Istitut tax-Xjenza tal-Annimali tal-Laboratorju tal-Kulleġġ Mediku tal-Unjoni ta 'Peking. Il-ġrieden (ta' 10 xhur) kienu maqsuma b'mod każwali fi tliet gruppi (n=20/grupp). Il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ b'dieta standard (Beijing HFK Biosicence, Beijing, iċ-Ċina). Id-dieti taż-żewġ gruppi l-oħra ġew supplimentati b'art R. glutinosa u A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Beijing, iċ-Ċina), rispettivament, f'doża ta '200 mg/d għal 10 xhur. Din id-doża ntgħażlet bl-użu tal-metodu tan-normalizzazzjoni tal-erja tas-superfiċje tal-ġisem biex tikkonferma d-dożi tad-droga minn studji fuq il-bniedem għal studji fuq il-ġrieden. Il-piż tal-ġisem kien iddeterminat kull xahrejn u s-sopravivenza kienet irreġistrata kuljum.

2.2|Evalwazzjoni tal-grad ta 'senescence

Ġiet adottata sistema ta’ punteġġ ta’ gradazzjoni biex tevalwa l-grad ta’ senescenza skont il-kriterji definiti minn Takeda et al.18 Kull kategorija elenkata fil-protokoll intgħażlet mis-sinjali kliniċi assoċjati mal-proċess ta’ tixjiħ. Kull ġurdien ġie skurjat fl-età ta '18-il xahar u l-punteġġ f'kull kategorija ġie mgħoddi biex jiġi ddeterminat il-punteġġ tal-gradazzjoni ġenerali.

2.3|Ċitometrija tal-fluss

Iċ-ċelloli nħasdu mit-timu, il-milsa, id-demm periferali (PB) u l-mudullun (BM). Il-milsa u t-timu ġew imneħħija immedjatament, maħsula bis-salina u miżuna. Il-milsa u t-timu ġew omoġenizzati bil-mod f'omoġenizzatur tal-ħġieġ u ċ-ċelloli ġew sospiżi f'melħ sterili b'buffer bil-fosfat (PBS). Iċ-ċelloli mill-PB ġew applikati għal-liżi taċ-ċelluli ħomor tad-demm (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Iċ-ċelloli minn BM ġew iżolati billi tlaħlaħ kemm it-tibji kif ukoll il-wirk b'PBS sterili. Iċ-ċelloli kollha ġew iżolati permezz ta' filtrazzjoni fuq xibka tan-najlon sterili u mtebbgħin għal 30 minuta f'4 gradi bl-antikorpi konjugati bil-fluworofori li ġejjin: phycoerythrin (PE)-konjugat anti-CD3 (G4.18), allophycocyanin (APC)-konjugated anti ‐ CD4 (OX35) u anti‐CD8a konjugat PE‐Cy7 (OX8). Għaċ-ċelloli BM, il-markaturi tan-nisel kienu mtebbgħin bl-użu ta’ CD4 anti-ġurdien konjugat-bijotina (RM4‐5), CD5 (53‐7.3) CD8a (53‐6.7), CD11b (M1/70), B220 (RA3‐6B2), TER119 (TER‐ 119) u Gr1 (RB6‐8C5), segwit minn tbajja bl-antikorp APC‐eFluor 780-streptavidin konjugat inkiseb ukoll minn eBioscience (San Diego, CA, USA). L-antikorpi li ġejjin intużaw għat-tbajja’ tal-wiċċ: APC immunoglobu- lin (Ig)M (II/41), fluorescein isothiocyanate (FITC) IgD (11‐26), PE‐Cy7 Sca‐1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3‐6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP‐Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) u PerCP‐Cy5.5 CD3e (145‐2C11). L-antikorpi kollha nkisbu minn eBiosciences (San Diego, CA, USA). Id-dejta ġiet akkwistata minn FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) u analizzati bl-użu ta 'softwer FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Analiżi taċ-ċiklu taċ-ċelluli

Għall-analiżi taċ-ċiklu taċ-ċelluli, iċ-ċelluli BM totali ġew imtebba’ għal markaturi tal-wiċċ taċ-ċelluli staminali (Lin–Sca‐ 1 flimkien ma’ c‐KitHigh; LSTKs), imbagħad iffissati u permeabilizzati (00‐5123‐43; Becton Dickinson; ) qabel ma tbajja’ b’FITC Ki‐

67 antikorp u 7-aminoactinomycin D (7-AAD). L-akkwist tad-dejta sar fuq FACS Aria II (Becton Dickinson). Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer FlowJo.

2.5|Tbajja ‐gal assoċjata mas-senescence

L-attività assoċjata mas-senescence (SA)--gal ġiet ukoll ttestjata permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' C12FDG kif deskritt mill-manifattur (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Fil-qosor, ċelluli staminali l-ewwel ġew imtebbgħin għal markaturi tal-wiċċ taċ-ċelluli u mbagħad inkubati b'100 nmol L-1 bafilomycin A1 għal siegħa f'37 grad biex jinduċu alkalinizzazzjoni liżosomali. Wara l-ħasil bil-PBS, iċ-ċelloli ġew inkubati b'2 mmol L-1 C12FDG għal 1-2 sigħat f'37 grad u mbagħad ġew analizzati bl-użu ta 'FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Determinazzjoni tal-produzzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS).

Iċ-ċelloli ġew inkubati b'diaċetat dichloro-dihydro-fluorescein (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina) f'37 grad għal 20 minuta. DCFH-DA jinfirex b'mod passiv fiċ-ċelloli, fejn huwa deacetylated minn esterases biex jifforma 2′,7′-dichlorofluorescein mhux fluworexxenti (DCFH). L-ammont ta 'fluworexxenza emess jikkorrelata mal-kwantità ta' ROS fiċ-ċellula. Id-dejta nkisbet fuq FACS Aria I (Becton Dick- inson) u ġiet analizzata bl-użu tas-softwer FlowJo.

2.7|Analiżi ta' reazzjoni tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali (PCR).

L-RNA totali ġie estratt miċ-ċelloli bl-użu ta 'reaġent TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Ġeni ta’ interess ġew amplifikati minn RNAs totali ttrattati b’DNase I bl-użu ta’ M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)

u poly-dT primers. Il-primers użati għall-PCR kienu kif ġej: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ u 5′‐CGAAGAGACAACGG- CACACT‐3′, Tm=60 grad, 30 ċiklu), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC-TATC‐ 3′ u 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grad , 35 ċiklu), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ u 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 grad , 35 ċikli), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ u 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 grad, 30 ċiklu), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3′ u 5′‐GTAGTGTGGGGTCCTC ′, Tm=61 grad , 35 ċiklu), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ u 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 grad, 30 ċiklu), glyceraldehyde 3‐phosphate dehydrogenase (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ u 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, grad Tm=60 , 25 ċiklu). Real-time (RT)‐ PCR twettqet bl-użu ta’ SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Ġappun) fuq is-sistema ta’ skoperta ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2.8|Assays klonoġeniċi

L-HSCs għal żmien twil (LT) ġew magħżula permezz ta’ għażla taċ-ċelluli attivati ​​bil-fluworexxenza (FACS) u mbagħad ikkultivati ​​fi pjanċi ta’ ċelluli 96-well bl-użu ta’ mezz ta’ bażi ta’ methylcellulose (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . Għaxar bjar replikati ġew ippreparati għal kull kampjun. Aħna użajna pjanċa tal-kultura taċ-ċelluli 96-well, tliet ċelloli għal kull bir. Ġimagħtejn wara l-kisi, in-numru u d-daqsijiet tal-kolonji ġew magħduda taħt mikroskopju.

2.9|Analiżi statistika

Id-dejta ġiet analizzata bl-ANOVA one-way bl-użu ta’ softwer Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) u GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Id-dejta ġiet ippreżentata bħala l-medja ± SD. P < 0.05="" tqieset="" li="" tindika="" sinifikat="">

3|RIŻULTATI

3.1|R. glutinosa u A. membranaceus eżerċitaw effetti kontra t-tixjiħ

Biex tikkonferma l-effetti kontra t-tixjiħta' R. glutinosa u A. mem- branaceus, investigajna l-effetti tal-amministrazzjoni bħala suppliment tad-dieta (200 mg/d). Sussegwentement, irreġistrajna l-piż tal-ġisem, il-grad ta 'senescence u r-rata ta' sopravivenza tal-ġrieden. Il-piż tal-ġisem tal-ġrieden li jitimgħu b'R. glutinosa jew A. membranaceus kien normali meta mqabbel ma 'dawk fil-grupp ta' kontroll, għalkemm kien hemm tnaqqis fil-piż tal-ġisem tal-grupp R. glutinosa u A. membranaceus f'20 xahar (Figura 1A). Analiżi tal-grad ta 'senescence wriet żieda kostanti u irriversibbli fil-punteġġ tal-gradazzjoni bl-età avvanzata fil-gruppi R. glutinosa u A. membranaceus meta mqabbla ma' dik fil-grupp ta 'kontroll, għalkemm iż-żieda kienet aktar immarkata fl-A. mem- branaceus grupp (Figura 1B). Il-punteġġ ta' grad għoli kien dovut għal bidu aktar bikri ta' telf ta' passività u reattività, telf ta' tleqqija tal-ġilda u żieda fil-ħxuna, telf ta' xagħar, leżjonijiet perioftalmiċi, żieda fil-lordokifożi tas-sinsla u żieda aktar notevoli fis-severità tagħhom.18 Ġrieden fl-A. Grupp ta 'ġrieden membranaceus wera karatteristiċi ta' fenotip ta 'senescence aktar immarkati, inkluż telf ta' tleqqija tal-ġilda u telf ta 'xagħar. Il-kurvi tas-sopravivenza wrew li l-ħajja tal-ġrieden fil-gruppi R. glutinosa u A. membranaceus kienet kemmxejn itwal minn dik fil-grupp ta 'kontroll (Figura 1C). Din id-dejta kkonfermat il-effetti kontra t-tixjiħkemm ta 'R. glutinosa kif ukoll ta' A. membranaceus, għalkemm R. glutinosa instab li kien aktar effiċjenti biex inaqqas il-proċess tat-tixjiħ.

FIGURA 1 Rehmannia glutinosa u Astragalus membranaceus kellhomeffetti kontra t-tixjiħ. Il-ġrieden ġew mitmugħa dieti supplimentati b'R. glutinosa mitħun jew A. membranaceus (200 mg/d); il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ dieta standard. A, Bidliet fil-piż tal-ġisem tal-ġrieden imkejla kull xahrejn. B, Bidliet fil-punteġġ tal-gradazzjoni tas-senescence tal-ġrieden bl-età. C, Kurvi tas-sopravivenza. Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± SD; n=20 ġrieden/grupp. Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± SD; n=5 ġrieden/grupp.*P < 0.05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa naqqas in-numru ta 'ċelloli staminali ematopojetiċi

L-eżawriment taċ-ċelloli staminali huwa maħsub li huwa l-konsegwenza integrattiva ta’ tipi multipli ta’ ħsara assoċjata mat-tixjiħ u waħda mill-kawżi ewlenin tat-tixjiħ tat-tessuti u l-organiżmi. ipotizzat li l-effetti kontra t-tixjiħta 'R. glutinosa huma medjati billi jtejbu l-funzjoni taċ-ċelloli staminali. Għalhekk, għamilna analiżi ċitometrika tal-fluss tan-numru ta 'ċelluli staminali / proġenitriċi ematopoietiċi iżolati minn ġrieden (ta' 20 xahar) dieti mitmugħa supplimentati b'R. glutinosa jew A. membranaceus (200 mg / d) għal 10 xhur (Figura 2A) . Il-persentaġġ ta 'LSKs tnaqqas fil-gruppi R. glutinosa u A. membranaceus (Figura 2B). In-numri ta' LT- u għal żmien qasir (ST)- HSCs tnaqqsu b'madwar doppju fil-grupp R. glutinosa meta mqabbel man-numru fil-grupp ta 'kontroll (Figura 2C- D). Numri akbar ta 'proġenituri limfoid komuni (CLPs) ġew skoperti fil-grupp R. glutinosa meta mqabbel man-numru fil-grupp ta' kontroll (Figura 2I). Ma kien hemm l-ebda differenzi fin-numri ta 'proġenituri multipotenti (MPPs), proġenituri majelojdi komuni (CMPs), proġenituri tal-granulocyte‐macrophage (GMPs) u proġenituri megakaryoċiti‐eritrodi (MEPs) fil-grupp R. glutinosa meta mqabbel man-numru fil- grupp ta' kontroll. Fil-grupp A. membranaceus, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fin-numri ta 'LT- u ST- HSCs meta mqabbla man-numri fil-grupp ta' kontroll (Figura 2C-D). Barra minn hekk, ma kien hemm l-ebda differenza fin-numri ta 'ċelluli MPP, CMP, MEP u CLP meta mqabbla man-numri fil-grupp ta' kontroll (Figura 2E, 2F, 2H u 2I); madankollu, in-numru ta 'GMPs naqas fil-grupp A. membranaceus. Għalhekk, ġrieden mitmugħa dieti supplimentati b'R. glutinosa urew numri mnaqqsa ta 'ċelloli staminali ematopojetiċi u proġenitriċi.

3.3|R. glutinosa saħħaħ il-funzjoni u żamm il-kwiet ta 'HSCs

Biex tiġi evalwata l-funzjoni tal-HSCs, il-potenzjal klonoġeniku tal-LT‐ HSCs ġie eżaminat in vitro. Aħna għamilna ċelluli LT-HSCs f'mezz ta 'bażi ​​ta' metil-ċelluloża bl-użu ta 'FACS u għoddna n-numru u d-daqs tal-kolonji wara 14-il jum. Meta mqabbla man-numru u d-daqs ta 'kolonji prodotti minn ċelluli minn ġrieden fil-grupp ta' kontroll, ċelluli minn ġrieden fil-grupp R. glutinosa wrew żieda fin-numru ta 'kolonji, speċjalment għad-daqs żgħir (P=0.0241 ) u klonu ta 'daqs kbir (P=0.0418), filwaqt li ma kien hemm l-ebda differenza fin-numru mill-ġrieden fil-grupp A. membranaceus (Figura 3). Iż-żieda fid-daqs u n-numru tal-kolonji fil-grupp ta 'R. glutinosa issuġġerixxa li din il-ħaxixa ttejjeb il-potenzjal ta' tiġdid tal-LT‐HSCs.

Il-biċċa l-kbira tal-HSCs fil-ġrieden adulti jibqgħu quiescent;19 għalhekk, iż-żamma tal-kwietenza ċellulari hija mekkaniżmu essenzjali għat-tiġdid taċ-ċelluli staminali awto-tiġdid.20,21 It-tnaqqis osservat fl-HSCs jissuġġerixxi proliferazzjoni taċ-ċelluli mnaqqsa fir-R. glutinosa u A. gruppi membranaceus; għalhekk, eżaminajna l-istatus taċ-ċiklu taċ-ċelluli tal-HSCs permezz tal-analiżi tal-markatur taċ-ċelluli proliferattivi Ki-67 flimkien mad-determinazzjoni tal-kontenut tad-DNA 7-AAD fil-popolazzjoni LSK. Aħna osservajna numru akbar ta 'ċelluli LSK fil-fażi G0 fil-gruppi R. glutinosa u A. membranaceus meta mqabbla ma' dak fil-grupp ta 'kontroll (Figura 4A). Dawn ir-riżultati indikaw li R. gluti- nosa u A. membranaceus żammew il-kwiet ta 'HSCs.

L-analiżi tal-PCR f'ħin reali tar-regolaturi taċ-ċiklu taċ-ċelluli fiċ-ċelloli LSK wriet li p18, p19 u p57 kellhom rwoli kritiċi fiż-żamma tal-kwietenza tal-HSC. 22-24 Ma kien hemm l-ebda tibdil ovvju osservat għal p57 u p19 (Figura 4C- D), u p18 kien uppregulated fil-grupp R. glutinosa meta mqabbel ma 'dak fil-grupp ta' kontroll, u kemmxejn upregulated fil-grupp A. membranaceus (Figura 4B).

FIGURA 2 Rehmannia glutinosa u Astragalus membranaceus affettwaw in-numru taċ-ċelloli staminali/proġenitriċi ematopojetiċi. Ġrieden (età

20 xhur) ġew mitmugħa dieti supplimentati b'R. glutinosa jew A. membranaceus (200 mg/d) għal 10 xhur (n=5/grupp); il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ dieta standard. Ċelluli tal-mudullun (BM) iżolati friski ġew imtebba bl-antikorpi indikati u analizzati permezz ta 'ċitometrija tal-fluss. A, Profili rappreżentattivi ta 'tbajja' ta' popolazzjonijiet ta 'ċelluli staminali ematopojetiċi BM u ċelluli proġenituri. B, Il-perċentwal ta' Lin–Sca1 flimkien ma' ċelluli c-kit– (LSKs) fiċ-ċelluli BM. C‐ I, Numri taċ-ċelluli ta’ (C) fit-tul (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus – , Flt3–); D, għal żmien qasir (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, proġenitur multipotenti (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, proġenitur majelojde komuni (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, proġenitur tal-granulocyte‐macrophage (GMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/CD32 plus ); H, proġenitur megakaryocyte‐erythroid (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit– , CD34–, CD16/CD32–); u jien, proġenitur limfoid komuni (CLP; Lin– ​​, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ). Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± SD; n=5 ġrieden/grupp. *P < 0.05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa ittardja s-senescence tal-HSCs

Supplimentazzjoni tad-dieta fit-tul b'R. glutinosa tista' testendi l-ħajja tal-ġrieden. Is-senescence ċellulari tiżdied bl-età; għalhekk, investigajna s-senescenza tal-HSC fil-ġrieden li qed jixjieħu permezz ta’ analiżi ċitometrika tal-fluss ta’ HSCs imtebbgħin SA‐ ‐gal bl-użu ta’ substrat fluworexxenti ‐gal (C12FDG). Grupp R. glutinosa, li jindika li r-R. glutinosa idewwem is-senescence taċ-ċelluli LSK (Figura 5A).

Speċijiet ta 'ossiġnu reattivi għandhom rwol ewlieni fis-senescence HSC, u t-telf ta' quiescence HSC huwa ta 'spiss korrelatat ma' ROS ċellulari miżjuda.26 Analiżi tar-ROS intraċellulari f'LSKs wriet li l-livelli naqsu fil-grupp R. glutinosa meta mqabbla ma 'dawk fil-kontroll. grupp (Figura 5B). Din id-dejta indikat li R. glutinosa jista 'jżomm il-kwiet tal-HSC u jsaħħaħ il-funzjoni tal-HSC billi jnaqqas il-livelli ta' ROS.

Imbagħad investigajna l-espressjoni diversi ġeni involuti fis-senescence ċellulari permezz ta 'analiżi RT-PCR taċ-ċelloli LSK. Imqabbla

FIGURA 3 Funzjoni taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi mtejba b'supplimentazzjoni tad-dieta ta' Rehmannia glutinosa. Potenzjal klonoġeniku in vitro ta' ċelloli stellati epatiċi fit-tul mill-ġrieden (n=3)

mal-grupp ta 'kontroll, l-espressjoni ta' proteini assoċjati ma 'senescence ċellulari p53 u p16 kienet regolata 'l isfel fil-grupp R. glutinosa (Figura 5D-E). Iżda l-espressjoni ta 'p53 u p16 ma kinitx irregolata b'mod sinifikanti bejn il-grupp A. membranaceus u l-grupp ta' kontroll (Figura 5D-E). Meħuda flimkien, din id-dejta turi li diversi ġeni taċ-ċiklu taċ-ċelluli ewlenin u s-senescence taċ-ċelluli jirregolaw il-funzjoni tal-HSCs f'dieti mitmugħa tal-ġrieden supplimentati b'R. glutinosa.

3.5|R. glutinosa tejbet l-immunità taċ-ċelluli B

Limfoċiti B u T huma t-tnejn importanti għal reazzjonijiet immunoloġiċi. Il-limfoċiti T għandhom rwol kritiku fl-immunità ċellulari u r-regolamentazzjoni tagħha, filwaqt li l-limfoċiti B jipparteċipaw prinċipalment fl-immunità umorali. Il-proliferazzjoni tal-limfoċiti hija l-aktar indiċi immedjat li jirrifletti l-immunità organika. Biex tinvestiga r-rwol fit-titjib immunoloġiku, ġew eżaminati l-effetti ta 'R. glutinosa u A. membranaceus fuq il-proliferazzjoni tal-limfoċiti.

Il-ġrieden fil-grupp ta 'R. glutinosa urew numri mnaqqsa ta' HSCs u numru akbar ta 'CLPs. Analiżi ċitometrika tal-fluss uriet għadd akbar ta 'ċelluli B maturi (B220 plus ) fil-PB, BM u milsa tal-ġrieden fil-grupp R. glutinosa meta mqabbla man-numri misjuba fil-grupp ta' kontroll (Figura 6A); madankollu, ma kien hemm l-ebda differenzi sinifikanti fin-numri ta 'ċelluli T (CD4 plus u CD8 plus), monoċiti u granuloċiti (CD11b plus) bejn iż-żewġ gruppi (Figura 6B-D). Għalhekk, dawn ir-riżultati jindikaw li R. glutinosa tad-dieta ttejjeb l-immunità taċ-ċelluli B.

FIGURA 4 Supplimenti tad-dieta ta 'Rehmannia glutinosa u Astragalus membranaceus żammew il-kwiet taċ-ċelloli staminali ematopojetiċi. A, Il-perċentwal taċ-ċelloli f'kull fażi taċ-ċiklu taċ-ċelluli. Analiżi ċitometrika tal-fluss ta '7-aminoactinomycin D (7-AAD) u tbajja Ki-67 ta' Lin-Sca1 flimkien ma 'ċ-kit-ċelluli (LSKs). B, Analiżi tar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali tal-espressjoni tal-ġeni taċ-ċelluli LSK magħżula; GAPDH intuża għan-normalizzazzjoni. Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± SD ta' tliet esperimenti. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

FIGURA 5 Supplimentazzjoni tad-dieta ta' Rehmannia glutinosa naqqset is-senescenza taċ-ċelluli stellate tal-fwied (HSC). Ġrieden (ta' 20 xhur) ġew mitmugħa dieti supplimentati b'Rehmannia glutinosa jew Astragalus membranaceus (200 mg/d) għal 10 xahar (n {{4} }}/grupp); il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ dieta standard. A, Analiżi ċitometrika tal-fluss ta 'ċelluli SA--gal-pożittivi Lin-Sca1 flimkien ma' c-kit- (LSK) bl-użu ta' substrat fluworexxenti ‐galactosidase (C12FDG). B, Il-perċentwal ta 'ċelluli pożittivi ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) f'LSKs. Analiżi ċitometrika tal-fluss ta' LSKs pożittivi għal ROS. Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± devjazzjoni standard (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0.001.="" c,="" il-mudell="" ta="" 'espressjoni="" ta'="" ġeni="" assoċjati="" mas-senescence="" ċellulari="" fl-lsks;="" gapdh="" intuża="" għan-normalizzazzjoni.="" id-dejta="" tirrappreżenta="" l-medja="" ±="" sd="" ta'="" tliet="" esperimenti.="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

4|DISKUSSJONI

F'dan l-istudju, investigajna l-mekkaniżmu tal-effetti kontra t-tixjiħta 'R. glutinosa jew A. membranaceus billi jissupplimentaw id-dieti tal-ġrieden bil-ħxejjex aromatiċi f'doża ta' 200 mg/d għal 10 xhur. R. glutinosa instab li juri effetti kontra t-tixjiħ, inkluż tnaqqis fis-senescenza u żieda fis-sopravivenza tal-HSCs kif ukoll

immunità msaħħa taċ-ċelluli B. F'termini tal-mekkaniżmu tal-effetti kontra t-tixjiħ, sibna li r-R. glutinosa naqqas in-numru ta 'HSCs, filwaqt li żdiedet il-kapaċità ta' proliferazzjoni. Barra minn hekk, R. glutinosa żammet kwiet tal-HSC u naqqas in-numri ta 'ċelluli pożittivi SA--gal u livelli ta' ROS permezz tar-regolamentazzjoni ta 'p18, p53 u p16. Flimkien, ir-riżultati tagħna kkonfermaw li l-effetti kontra t-tixjiħta 'R. glutinosa fil-ġrieden huma medikati billi jżommu l-kwiet u jtejbu l-funzjoni ta' HSCs.

Rehmannia glutinosa, li ilha tintuża bħala mediċina tal-ħxejjex tradizzjonali Ċiniża għal eluf ta’ snin, tista’ tintuża biex tikkura l-ipogliċemija f’diversi disturbi dijabetiċi.27,28 Ġie rrappurtat ukoll li l-estratt ta’ R. glutinosa itejjeb il-metaboliżmu tal-għadam.29 Barra minn hekk, R. glutinosa jinibixxi r-reazzjonijiet u s-sindromi infjammatorji,30,31 u jipproteġi kontra l-ħsara taċ-ċelluli billi jneħħi r-radikali ħielsa.14,32 F'dan l-istudju, sibna li supplimentazzjoni tad-dieta tal-ġrieden b'R. glutinosa eżerċitateffetti kontra t-tixjiħu l-immunità mtejba taċ-ċelluli B billi żżid il-kapaċità proliferattiva ta 'LT-HSCs u tnaqqas in-numri ta' ċelluli pożittivi SA--gal u livelli ROS.

Il-grad ta 'ħsara ossidattiva nstab li jiżdied bl-età f'varjetà ta' ċelloli u tessuti. L-istress ossidattiv huwa determinant kritiku tat-tiġdid awtonomu tal-HSC. Telf ta 'quiescence LT‐ HSC fre-quentment jikkorrelata ma' ROS ċellulari miżjuda, li hija assoċjata b'mod negattiv mat-tiġdid tal-HSCs.26 Catalpol huwa glucoside iridojdi, li nstab fl-għerq ta 'R. glutinosa. Catalpol wera li jinibixxi l-istress ossidattiv, il-ħsara fid-DNA u t-tqassir tat-telomeri permezz tal-mogħdija PGC‐ 1 / TERT fi studju preċedenti.33 Fl-istudju tagħna, il-livell ta 'ROS naqas fiċ-ċelloli LSK mill-grupp R. glutinosa meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll. Għalhekk R. glutinosa itawwal is-sopravivenza tal-ġrieden billi jinibixxi l-istress ossidattiv fl-HSCs.

FIGURA 6 Analiżi ċitometrika tal-fluss tal-perċentwali ta' ċelluli immuni maturi fid-demm periferali (PB), il-mudullun (BM), il-milsa u t-timu. Ġrieden (ta' 20 xhur) ġew mitmugħa dieti supplimentati b'Rehmannia glutinosa jew Astragalus membranaceus (200 mg/d) għal 10 xhur (n=5/grupp); il-grupp ta 'kontroll kien mitmugħ dieta standard. A, Analiżi ċitometrika tal-fluss tal-perċentwali taċ-ċelluli B (B220 plus ) f'PB, BM, u milsa. B, Analiżi ċitometrika tal-fluss tal-perċentwali ta 'ċelluli monoċiti u granuloċiti (CD11b plus ) f'PB u BM. C u D, Analiżi ċitometrika tal-fluss tal-perċentwali ta 'ċelluli CD4 plus u CD8 plus f'PB, milsa, u timu. Id-dejta tirrappreżenta l-medja ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus jintuża wkoll fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża biex jippromwovi l-immunità, inaqqas iz-zokkor fid-demm u jippromwovi l-apoptożi taċ-ċelluli tat-tumur, u għandu wkollantiossidazzjoniukontra t-tixjiħproprjetajiet. F'dan l-istudju, sibna li s-supplimentazzjoni tad-dieta b'A. memranaceus għal 10 xhur ma kellha l-ebda effetti ovvji meta mqabbla ma 'dawk osservati fil-ġrieden ta' kontroll, filwaqt li l-piż tal-ġrieden tnaqqas f'20 xahar. Għalhekk, A. membranaceus jista 'jkun mhux adattat għat-trattament LT għall-ġrieden mitmugħa.

Bħala konklużjoni, ir-riżultati tagħna juru li R. glutinosa jista 'jtawwal il-ħajja tal-ġrieden billi jżomm il-kwiet u jsaħħaħ il-funzjoni tal-HSCs. Barra minn hekk, R. glutinosa jista 'jnaqqas il-livelli inter-ċellulari ta' ROS u n-numru ta 'ċelluli SA--gal-pożittivi u jsaħħaħ l-immunità taċ-ċelluli B.

RIKONOXXIMENTI

Dan l-istudju kien appoġġjat parzjalment mill-Fondazzjoni Nazzjonali tax-Xjenza għaċ-Ċina (31672374), Fond ta 'Innovazzjoni CAMS għax-Xjenzi Mediċi (CIFMS) (2016‐ 12M‐ 1‐012) u l-Fond taż-Żgħażagħ PUMC (2017310018).

KONFLITTI TA' INTERESS

Xejn.

KONTRIBUZZJONIJIET TA' L-AWTUR

L-awturi kollha elenkati jissodisfaw ir-rekwiżiti għall-awtur. CQ u LFZ ikkonċepiw u ddisinjaw l-esperimenti. LB wettaq l-esperimenti u kiteb it-test tal-manuskritt prinċipali. GYS wettaq u analizzat id-dejta tal-FACS. YJY iddisinjat l-esperiment dwar il-Mediċina tradizzjonali Ċiniża. WC mexxiet il-ġrieden. L-awturi kollha qraw u approvaw il-manuskritt.