mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Rapamycin Alternattivament Timmodifika d-Dinamika Mitokondrijali fiċ-Ċelloli Dendritiċi Biex Tnaqqas il-Kliewi Iskemika Riperfużjoni Korriment

Feb 22, 2022

edmund.chen@wecistanche.com

Astratt:Iċ-ċelloli dendritiċi (DCs) huma ċelloli immuni uniċi li jistgħu jgħaqqdu r-risponsi immuni intrinsika u adattivi u l-Immunometaboliżmu jaffettwa ħafna l-fenotip tagħhom. Rapamycin huwa kompost makrolidu li għandu funzjonijiet immunosoppressanti u jintuża biex jipprevjeni t-telf tat-tilqim fit-trapjant tal-kliewi. L-istudju attwali evalwa l-potenzjal terapewtiku tad-DCs ittrattati b'rapamicin ex-vivo biex jipproteġukliewif'mudell ġurdien ta 'akutakorriment fil-kliewi (AKI). Għat-trattament wieħed ta' rapamycin (S) (Rapa-S-DC), Veh-DCs ġew ittrattati b'rapamicin (10 ng/mL) għal siegħa qabel LPS. B'kuntrast, trattament multiplu ta' rapamycin (M) (Rapa-M-DC) ġew esposti għal 3 trattamenti fuq 7 ijiem. Trattamenti multipli ex-vivo ta' rapamycin biss ta' DCs wasslu għal riprogrammazzjoni persistenti tal-metaboliżmu mitokondrijali. Dawn id-DCs kellhom 18-darbiet aktar mitokondrija, kellhom kważi 4-darbiet rati ogħla ta' konsum ta' ossiġnu, u pproduċew aktar ATP meta mqabbla ma' Veh-DCs (DCs ta' kontroll ittrattati b'Veh). L-analiżi tal-mogħdija wriet sinjalazzjoni ta 'IL10 bħala mogħdija ewlenija li tikkontribwixxi għall-immunofenotip mibdul wara t-trattament b'Rapamycin meta mqabbel ma' vettura b'ċitokini Tnfa, Il1b u Il6 b'mod sinifikanti aktar baxxi, filwaqt li regolaturi tal-kontenut mitokondrijali Pgc1a, Tfam u Ho1 baqgħu elevati. B'mod kritiku, trasferiment adottiv ta' DCs ittrattati b'rapamiċina lil riċevituri WT 24 siegħa qabel bilateralikliewiiskemija protett b'mod sinifikanti l-kliewiminn korriment b’titjib sinifikanti 3-darbiet fifunzjoni tal-kliewi. Fl-aħħar, l-infużjoni ta’ DCs li fihom numri ogħla ta’ mitokondrija (trattati ex-vivo b’mitokondrija iżolata b’saħħitha (10 µg/mL) jum qabel) ipproteġiet ukoll parzjalment il-kliewimill-IRI. Dawn l-istudji juru li l-infużjoni preventiva ta’ DCs ipprogrammati mill-ġdid ex-vivo li għandhom kontenut ogħla ta’ mitokondrija għandha kapaċità terapewtika li tinduċi fenotip regolatorju anti-infjammatorju biex tipproteġi.kliewiminn korriment.

Kliem ewlieni:ċellula dendritika; rapamiċina; mitokondrija; korriment akut fil-kliewi; korriment minn riperfużjoni iskemika

IntroduzzjoniIl-patobioloġija ta 'akutakorriment fil-kliewihuwa multifatturi u jinvolvi interazzjonijiet kkomplikati bejnrenaliċelluli parenkimali u ċelluli immuni [1,2]. Ġolkliewi,ċelluli dendritiċi konvenzjonali (DCs) huma s-subsett ewlieni taċ-ċelluli immuni u jinstabu mill-qrib fl-ispazju interstizjali matul il-kliewi[3–5]. DCs huma wieħed mit-tipi ta 'ċelluli primarji involuti fl-immunità intrinsika u huma essenzjali biex jipprovdu protezzjoni kontra patoġeni. Ix-xogħol ippublikat preċedentement tagħna bl-użu ta 'DCs derivati ​​mill-mudullun wera li t-terapija DCs tista' tirregola diversi risponsi immuni intrinsiċi u adattivi assoċjati ma 'AKI [6,7].

DCs jinsabu b'mod estensiv fit-tessuti kollha, b'subsett ta' DCs (CD11c flimkien ma DCs) residenti fil-renaliparenkima. Madankollu, dawn CD11c flimkien ma 'DCs għandhom ukoll rwol patoġeniku fl-aggravarkorriment renaliwara korriment ta' iskemija-riperfużjoni (IRI) [8]. L-IRI hija definita bħala korriment li jirriżulta mill-introduzzjoni mill-ġdid ta' demm ossiġenat f'organu wara perjodu ta' iskemija u spiss jidher f'infart mijokardijaku, puplesija, u trapjant ta' organu solidu. Bi tweġiba għall-IRI, CD11c flimkien ma' DCs jinkludu porzjon konsiderevoli tal-infifiltrat taċ-ċelluli infjammatorji f'renalitessut.

cistanche-kidney disease-4(52)

DCs huma kapaċi jagħrfu mudelli molekulari assoċjati mal-patoġenu (PAMPs) permezz ta 'diversi riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudell li jinsabu fuq il-wiċċ ta 'DCs bħal riċetturi tolllike (TLRs) u riċetturi simili NOD. Ir-rabta ta 'riċetturi ta' rikonoxximent tal-mudell (PRRs) mal-PAMPs speċifiċi tagħhom tirriżulta fl-attivazzjoni ta 'bosta mogħdijiet, li jinkludu risponsi proinflammatorji, sintesi ta' peptidi antimikrobiċi, u induzzjoni ta 'immunità adattiva medjata minn limfoċiti [9]. Riċerka sinifikanti ġiet iddedikata għall-istudju tal-bidliet fil-bijoenerġija ċellulari tad-DCs mal-attivazzjoni mill-PAMPs. Ġie stabbilit li l-attivazzjoni ta’ DCs b’lipopolysaccharide (LPS; a PAMP distinta għal batterji gramnegattivi), permezz ta’ rbit mar-riċettur speċifiku tiegħu TLR4 tirriżulta f’bidla metabolika minn fosforilazzjoni ossidattiva effiċjenti ħafna għal proċess simili ħafna għall-metaboliżmu ta’ Warburg, jew glikolisi aerobika. . Il-metaboliżmu ta 'Warburg huwa kkaratterizzat mid-devjazzjoni tal-piruvat iġġenerat mill-glikolisi lejn konverżjoni f'laktat għall-produzzjoni tal-enerġija, u 'l bogħod mit-trasport fil-mitokondrija biex jgħaddi minn kataboliżmu permezz taċ-ċiklu TCA, minkejja disponibbiltà suffiċjenti tal-ossiġnu. Spjegazzjoni waħda għal dan il-fenomenu tinvolvi wieħed mill-ħafna effetti downstream ta 'attivazzjoni TLR4, li hija l-attività miżjuda tas-serine/threonine kinase il-mira tal-mammiferi ta' rapamycin (mTOR). L-inibizzjoni ta 'mTOR minn rapamycin tippreserva l-funzjoni mitokondrijali f'DCs attivati ​​billi tirregola iNOS, b'DCs ittrattati b'rapamicin stimulati fil-preżenza ta' LPS li juru livelli mnaqqsa ta 'glikolisi aerobika [10]. L-inibituri ta' mTORC1 bħal rapamycin bħalissa jintużaw fit-trapjant ta' organi solidi bħala alternattiva possibbli għall-inibituri ta' calcineurin biex jiġu evitati kroniċi.renaliħsara lill-allograft peress li għandha wkoll potenzjal li tespandi CD4 u CD25 flimkien ma' ċelluli T regolatorji [11,12]. Madankollu, l-użu ta' rapamycin fit-trapjant jista' jwassal għal kumplikazzjonijiet infjammatorji li jinkludu edema periferali, żidiet fil-krejatinina u tromboċitopenja. Studji preċedenti wrew li l-effetti avversi ta 'stimuli iposiċi huma msaħħa bl-espożizzjoni LPS u attenwati minn rapamycin [8,13].

L-għan huwa li jiġu żviluppati metodi biex jintużaw mediċini ta 'grad kliniku approvati mill-FDA bħal Rapamycin biex jinduċu DCs regolatorji li jistgħu jikkontrollaw risponsi immuni intrinsiċi u adattivi mhux mixtieqa. L-għan ta’ dan l-istudju kien li jiddetermina l-mekkaniżmu(i) protettiv(i) potenzjali ta’ BMDCs stimulati minn rapamiċina f’mudell ta’ ġrieden prekliniċi ta’kliewiIRI. It-trattament ta' BMDCs ex-vivo b'rapamicin jevita kwalunkwe effett avvers mhux fil-mira u kumplikazzjonijiet infjammatorji assoċjati ma' injezzjonijiet sistemiċi tad-droga. L-aħjar doża u l-ħin tal-biċċa l-kbira tal-komposti farmakoloġiċi jew tad-drogi jiddependu fuq diversi parametri. Fiċ-ċelloli tal-kanċer doża baxxa ta 'rapamicin meta mqabbla ma' doża għolja jinibixxi b'mod differenzjali l-mTORC1 u l-mTORC2 li jirriżulta f'inibizzjoni jew parzjali jew kompleta tal-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli [14]. Għall-istudji tagħna kollha ta 'kondizzjonament tal-BMDCs ex-vivo fil-manuskritt attwali għażilna d-doża baxxa ta' 10 ng / mL ta 'rapamicin ibbażata fuq studji rrappurtati qabel b'BMDCs toleroġeniċi [15,16]. Iż-żmien ta 'kemm dożi (tlieta jew waħda) kien ibbażat fuq ix-xogħol ippublikat preċedentement tagħna bil-propagazzjoni tal-BMDCs tal-ġrieden u miżjud ma' GMCSF [17,18]. Id-dejta attwali tagħna turi li kemm trattament(i) wieħed u multipli ta' DCs b'rapamicin jinduċi risponsi immunoġeniċi inqas robusti (ċitokini aktar baxxi u molekuli ko-stimulatorji) wara stimulazzjoni LPS. It-trasferiment ta' DCs ittrattati b'rapamicin wieħed jew multipli jipproteġi bl-istess modkliewiminn IRI f'mudelli syngeneic (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 ġrieden) jew alloġeniċi (BALB/c BMDC→C57BL/6 ġrieden) ta 'IRI. Madankollu, trattament ex-vivo multiplu b'rapamicin (3 trattamenti fuq 7 ijiem), minbarra li tnaqqas ir-risponsi immunoġeniċi, żiedet ukoll in-numri u l-funzjoni tal-mitokondrija (Seahorse Analyzer) meta mqabbla ma 'DCs ittrattati bil-vettura. Dawn l-osservazzjonijiet sperimentali jissuġġerixxu DCs b'numri ogħla ta 'mitokondrija għandhom il-potenzjal li jsiru regolatorji, u t-trasferiment ta' dawn DCs jista 'jipproteġikliewiminn korriment iskemiku. Kif wera l-istudju reċenti tagħna bl-użu ta’ DCs trattati FTY720 [18], trapjanti farmakoloġiċi jew mitokondrijali li jinduċu numri ogħla ta’ mitokondrija fiċ-ċelloli immuni (DCs jew makrofaġi) jikkawżaw ukoll li dawn iċ-ċelloli jkollhom fenotip anti-infjammatorju, effett possibbilment minħabba ż-żamma tal-mitokondrija. fosforilazzjoni ossidattiva (OXPHOS) u bi swiċċ imnaqqas għal glycolysis għall-enerġija wara stimulazzjoni. Għal dawn l-effetti, żidna b'mod esoġenu n-numri tal-mitokondrija fid-DCs biex nittestjaw jekk numri ogħla tal-mitokondrija jistgħux jinduċu fenotip regolatorju billi nużaw trapjanti mitokondrijali. Trasferiment ta' dawn il-Mito-DCs protettikliewimill-IRI; madankollu, b'differenza Rapa-DCs dawn il-Mito-DCs m'għandhomx risponsi immunoġeniċi mnaqqsa (MHCII, molekuli ko-stimulatorji u ċitokini) wara stimulazzjoni LPS, possibbilment jindikaw li n-numru ta 'kopji tal-mitokondrija li qed jiżdied jista' jegħleb bidliet funzjonali indotti minn stimulazzjoni LPS eżoġena. F'dan l-istudju u kif muri qabel [6,7,18], id-DCs injettati b'mod sistemiku (trattati b'vettura, rapamycin jew mitokondrija) fid-doża ta' nofs miljun jinstabu fil-biċċa l-kbira biss fil-milsa u ftit jew xejn ma jinstab sinjal. ġolkliewi. Fil-milsa bħal FTY720-DCs, rapamycin u DCs sinjuri fil-mitokondrija jistgħu jinduċu rispons anti-infjammatorju li jirriżulta fi protezzjoni minnkliewiIRI. Dawn is-sejbiet seminali jipprovdu evidenza ġdida li tissuġġerixxi żieda fin-numri mitokondrijali (b'mod esoġenu permezz ta' trapjanti mitokondrijali jew permezz ta' intervent farmakoloġiku (FTY720 jew rapamycin)) fiċ-ċelloli immuni jistgħu jkunu mod terapewtiku ġdid biex fl-aħħar mill-aħħar jirregolaw ir-risponsi immunoloġiċi tagħhom għall-prevenzjoni u/jew trattamenti bikrija ta'korriment fil-kliewi.

Materjali u metodi

ĠriedenIl-proċeduri u l-immaniġġjar tal-annimali kollha saru b'konformità mal-Gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju, u n-numru tal-protokoll Bajwa UTHSC, 18-080, id-data tal-approvazzjoni 28/09/2018 ġiet approvata mill-Università ta' Kumitati Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali taċ-Ċentru tax-Xjenza tas-Saħħa ta' Tennessee (UTHSC). Il-politiki dwar il-kura tal-annimali tal-laboratorju jsegwu l-Politika tas-Servizz tas-Saħħa Pubblika dwar il-Kura Umana u l-Użu tal-Annimali tal-Laboratorju. Ir-riżultati kollha huma rrappurtati b'mod konsistenti mal-linji gwida ARRIVE [19]. Għall-istudji kollha tat-trasferiment, il-ġrieden C57BL/6J u BALB/c inxtraw minn The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Il-ġrieden inżammu f'akkomodazzjoni standard ta' vivarium b'ċiklu ta' 12-siegħa dawl/dlam fuq dieta chow u l-ilma kien disponibbli b'mod liberu.

Korriment Iskemija-Riperfużjoni Renali Il-proċeduri kirurġiċi dettaljati kollha ġew segwiti kif irrappurtat qabel [18]. Ġrieden maskili C57BL/6 (8-12-il ġimgħa) kienu soġġetti għal 26-min iskemija bilaterali segwita minn 20-24 siegħa riperfużjoni. Fil-qosor, il-ġrieden maskili kollha ġew anestetizzati b'injezzjoni intraperitoneali (ip) ta 'taħlita ta' ketamina u xylazine, b'injezzjoni taħt il-ġilda ta 'buprenorphine u mqiegħda fuq kuxxinett sħun biex tinżamm it-temperatura tal-ġisem f'34.5-36 ◦C. Il-ġrieden imbagħad ġew randomised għall-kundizzjoni tal-operazzjoni sham jew IRI. Saret inċiżjoni bilaterali fl-ġenb. It-temperatura tal-ġisem ġiet iċċekkjata u miżmuma matul il-perjodu iskemiku. Ġrieden shamoperated għaddew mill-istess proċedura ħlief għall-ikklampjar tal-bastiment u l-għeluq tal-feriti kirurġiċi. Ġrieden li kellhom wieħedkliewimingħajr riperfużjoni 24 siegħa wara iskemija ġew esklużi mill-analiżi kollha.

Valutazzjoni tal-Funzjoni tal-Kliewi u l-IstoloġijaId-demm inġabar taħt anestesija mis-sinus retro-orbitali, u l-krejatinina fil-plażma (mg/dL) ġiet iddeterminata bl-użu ta’ metodu enżimatiku b’modifikazzjonijiet minuri mill-protokoll tal-manifattur (Diazyme Laboratories, Poway, CA, USA) u nitroġenu fl-awrina tad-demm (BUN). ) u l-kejl tal-krejatinina sar bl-użu ta' QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) kif deskritt qabel [18,20]. Għall-istoloġija,kliewiġew iffissati matul il-lejl f'4 fil-mija PLP jew 10 fil-mija formalin u inkorporati fil-paraffina.Kliewiġew ippreparati għat-tbajja 'H&E kif deskritt qabel [18] u ttieħdu ritratti b'aġġustament tal-luminożità/kuntrast magħmul bil-mikroskopju EVOS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Għall-kwantifikazzjoni tal-punteġġ ta 'korriment tubulari, is-sezzjonijiet ġew evalwati billi jingħaddu l-perċentwali ta' tubuli li wrew nekrożi taċ-ċelluli, telf ta 'bord tal-pinzell, formazzjoni fonduta, u dilatazzjoni tat-tubuli kif ġej: 0=normali; 1=Inqas minn jew ugwali għal 10 fil-mija ; 2=10 sa 25 fil-mija; 3=26 sa 50 fil-mija; 4=51 sa 75 fil-mija; 5=Akbar minn jew ugwali għal 75 fil-mija . Ħames sa 10 fifields minn kull medula ta 'barra ġew evalwati u skurjati b'mod blinded. Il-bidla istoloġika ġiet espressa bħala nekrożi tubulari akuta (ATN), skurjat kif deskritt qabel [7,21]. Ċelloli apoptotiċi ġew skoperti permezz ta 'assaġġ TUNEL (In Situ Cell Death Detection kit, TMR Red; Roche, Basel, l-Isvizzera) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.

cistanche-kidney function-6(60)

Mudullun (BM)-Derivat-Ċellola Dendritika (DC) Kultura u Trasferiment AdottivĠrieden maskili C57BL/6J jew BALB/c WT ta' 8-10 ġimgħat intużaw biex jiġġeneraw DCs minn prekursuri BM sħaħ [22]. Is-supernatant b'ħafna GMCSF kien derivat minn ċelluli J558L trasfettati b'mod stabbli b'GMCSF tal-ġurdien. Il-linja taċ-ċelluli kienet rigal ġeneruż minn Dr Ira Mellman (Dipartiment tal-Bijoloġija, Yale University, New Haven, CT, USA). Fil-qosor, BM iżolat frisk ġie kkultivat b'6 ng/mL GMCSF tal-ġurdien rikombinanti (total ta 'trattamenti 3) għal 8 ijiem f'RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). L-aħjar doża ta '10 ng/mL rapamycin ġiet deċiża wara ttestjar ta' dożi varji (0.1-10 ng/mL). BMDC ġew ittrattati b'10 ng/mL rapamycin (Sigma, St. Louis, MO, USA) għal total ta' tliet trattamenti jew 1-trattament ta' matul il-lejl). Il-BMDCs ġew ittrattati bil-lipopolysaccharide agonist TLR4 (LPS; Escherichia coli serotip 0111: B4: 100 ng/mL; Sigma-Aldrich); jew vettura (1 × PBS) għal 24 siegħa f'medju tal-kultura għal studji sinġeneiċi (ġrieden C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J) u jitħalla mhux ittrattat għal studji alloġeniċi (ġrieden BALB/c BMDCs→C57BL/6J). Iċ-ċelloli ġew maħsula, u 0.5 × 106 ċelluli għal kull ġurdien ġew injettati ġol-vina (iv) fi ġrieden naive jum qabel bilateralikliewiIRI. Il-BMDCs ġew ittikkettati b'MitoTracker CMXRos Red jew MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min @ 37 ◦C, Invitrogen) jew Mitosox (5 µM; 10 min @ 37 ◦C; Invitrogen).

PCR kwantitattiv f'ħin realiLivell ta 'espressjoni tad-DNA mitokondrijali relattiva (mtDNA) tkejjel kif deskritt qabel [23]. Fil-qosor, id-DNA ġenomika totali ġie iżolat u ammonti ugwali (5 ng) intużaw għal RTPCR bl-użu ta 'ND1 bħala primers surrogati għal mtDNA u HK2 primers għal DNA nukleari (nDNA) għall-ġurdien u ND6 għal mtDNA uman kif deskritt qabel [23,24]. L-RNA totali ġie iżolat u traskritt lura għal cDNA, u RT-PCR twettaq kif deskritt qabel [7,25,26].

Iżolament u Kwantifikazzjoni tal-MitokondrijaIl-mitokondrija ġew iżolati miċ-ċelloli HEK293 kif deskritt qabel [18]. Fil-qosor, pjanċi ta '60 ċm ta' ċelluli HEK293 inġabru billi żiedu 5 mL ta 'buffer ta' omoġenizzazzjoni (300 mmol/L sukrożju, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, pH 7.4) b'1 mg Subtilisin A protease minn Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Protokoll dettaljat għall-iżolament tal-mitokondrija jista 'jinstab fil-manuskritt ippubblikat preċedenti tagħna [18].

2Seahorse Flux BioanalyzerBMDCs ta 'sebat ijiem ġew trasferiti għal Seahorse 24-pjanċi tal-kultura tat-tessuti bir-bir, u r-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR) ġiet imkejla, u l-parametri ġew ikkalkulati kif deskritt qabel [25] bil-modifika li ġejja. Wara li tkejjel ir-rata respiratorja bażali, oligomycin (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1.5 µM; carbonyl cyanide 4- (triflfluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP)), u inibituri tal-katina tat-trasport tal-elettroni (kumplessi I u III), rotenone (Sigma; 0.5 µM), u antimycin A (Sigma; 0.5 µM)) ġew injettati b'mod sekwenzjali waqt l-assaġġ. Respirazzjoni mitokondrijali bażali, respirazzjoni marbuta ma 'ATP, tnixxija ta' proton (konsum ta 'ossiġnu mhux marbut ma' ATP), respirazzjoni massima, respirazzjoni mhux mitokondrijali, kapaċità respiratorja ta' riżerva, proporzjon ta 'kontroll respiratorju, u effiċjenza ta' akkoppjar ġew determinati f'ċelloli sħaħ skond Brand et al . [27]; N=4–5 bjar intużaw għal kull grupp sperimentali u l-esperimenti ġew ripetuti minimu ta '3 darbiet.

Analiżi Ċitometrika tal-Fluss, Western Blot, u ELISAL-akkwist tad-dejta taċ-ċitometrija tal-fluss sar fuq FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) b'aġġornament taċ-ċitometrija tal-fluss tal-kulur Cytek {{{0}}color (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, USA). Id-dejta ġiet analizzata bis-softwer FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA) kif deskritt qabel [6,7,28]. Għal midja ELISA inġabret minn BMDCs 24 siegħa wara t-trattament b'100 ng/mL LPS. Il-livelli ta' TNF, IL6, jew IL10 tkejlu bl-użu ta' kits ELISA tal-ġurdien (Invitrogen) skont il-protokoll tal-manifattur u kif deskritt qabel [18]. Veh- jew Mito-DC ittrattati bi u mingħajr LPS għal 6 jew 24 siegħa ġew użati biex iżolati proteina totali bl-użu ta 'buffer ta' liżi RIPA supplimentat b'cocktail ta 'inibitur ta' protease u phosphatase (Thermo Fisher Scientific, Vernon Hills, IL, USA). Għal GAPDH lysate supernatanti kienu jew mgħollija (10 min f'100 ◦C) u lysates tħallew f'temperatura tal-kamra għal 10 min għal cocktail OXPHOS gerriema (Abcam, Cambridge, MA, USA) [18]. Metodi aktar dettaljati ġew deskritti qabel [18].

Data u Analiżi StatistikaGraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, USA) intuża biex janalizza u jippreżenta d-dejta. Id-dejta ġiet analizzata, wara trasformazzjoni jekk meħtieġa biex tiġġenera distribuzzjoni normali, permezz ta' 2-tailed t test jew 1-mod ANOVA b'analiżi post-hoc kif xieraq. It-test t mhux imqabbad b'żewġ denbu ntuża għall-analiżi ta' żewġ gruppi. p Inqas minn jew ugwali għal 0.05 intuża biex jindika s-sinifikat.

Riżultati

Trattamenti multipli b'Rapamycin (Rapa-M) Induċi Numri Ogħla ta' Mitokondrija u Inqas DCs ImmunoġeniċiC57BL/6 WT DCs ġew iżolati u propagati għal 8 ijiem fil-preżenza ta 'GMCSF u vettura (1X PBS) jew rapamycin (10 ng/mL), total ta' tliet trattamenti. DCs ġew ittrattati b'100 ng/mL LPS matul il-lejl. DCs ittrattati LPS intużaw għal RNASeq jew ittikkettati b'diversi żebgħat mitokondrijali. Id-dejta RNASeq ikkonfermat id-dejta preċedenti li t-trattament b'rapamicin jinduċi DCs inqas immunoġeniċi b'ċitokini pro-infjammatorji aktar baxxi li jirregolaw risponsi immuni intrinsiċi u adattivi b'IL10 bħala l-mogħdija ewlenija li tinbidel (Figura Materjal Supplimentari S1A, B u Tabella S1). Meta mqabbel mat-trattament tal-vettura, it-trattament b'rapamicin żied il-kontenut mitokondrijali fil-BMDCs (Figura 1A) kif iċċekkjat b'MitoTracker CMXRos Red (50 nM) bi u mingħajr LPS. Bl-istess mod, kien hemm tikkettar ogħla b'mod sinifikanti b'MitoTracker Deep Red (100 nM) u tikkettjar b'mod sinifikanti aktar baxx b'MitoSox (5 µM) u wara stimulazzjoni ta 'LPS matul il-lejl f'Rapa-M-DC meta mqabbla ma' Veh-DC (Figura 1B, C). Semi-kwantifikazzjoni tal-istogrammi MFI għaż-żebgħat mitokondrijali kollha (Figura 1D). Barra minn hekk, Veh- u Rapa-M-DCs kienu qed iżidu bl-użu ta' JC-1 biex jiċċekkjaw jekk it-trattament b'Rapamycin bidlitx il-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija. Trattament multiplu b'rapamicin ma jbiddilx il-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija tal-linja bażi meta mqabbel ma 'BMDCs ta' kontroll ittrattati bil-vettura kif muri mill-immunoflfluworexxenza (Figura ta 'Materjal Supplimentari S2A) u ċitometrija tal-fluss (Figura Materjal Supplimentari S2B, C).

image

Figura 1. It-trattament b'Rapamycin jinduċi DCs inqas immunoġeniċi li jżommu dinamika mitokondrijali ogħla wara stimulazzjoni LPS. Istogrammi ta' 8-jum Veh-DC u Rapa-M-DC ġew ittrattati b'100 ng/mL LPS għal 24 siegħa jew tħallew mhux stimulati

(Veh) u ttikkettjat b'(A) MitoTracker CMXRos (50 nM) jew (B) MitoSox (5 µM) jew (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Analiżi semi-kwantifikata ta 'MFI ta' żebgħa tal-mitokondrija ttikkettjati data ta 'ċitometrija flflow. (E) DCs ġew miżrugħa f'analizzatur Seahorse XF-24e, stimulat bi u mingħajr LPS għal 24 siegħa, u r-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR) ġiet iddeterminata waqt trattamenti sekwenzjali b'oligomycin (1), FCCP (2) u antimycin A/rotenone (3). (F) Kwantifikazzjoni tal-produzzjoni bażali ta 'OCR u ATP. (G) livelli ta 'mRNA ta' Pgc1a u Tfam f'Veh-DC u Rapa-M-DC ittrattati b'100 ng/mL LPS jew jitħallew mhux stimulati għal 24 siegħa. (H) Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss ta 'MHC II, molekuli ko-stimulatorji (CD40/80/86) u espressjoni PDL1 ġiet determinata bi u mingħajr stimulazzjoni LPS. (I) ELISA ta 'IL10, IL6, u TNF mill-Veh-DC u Rapa-M-DC trattati b'100 ng/mL LPS għal 24 siegħa. (J – L) livelli ta 'mRNA ta' Il10, Tnfa, u Il6 f'Veh-DC u Rapa-M-DC ittrattati b'100 ng/mL LPS jew jitħallew mhux stimulati għal 24 siegħa. * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05, ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01, u *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001, ANOVA f'direzzjoni waħda segwita mit-test ta 'wara ta' Tukey. Id-dejta tirrappreżenta mezzi ± SEM ta' triplikati.

Funzjoni mitokondrijali mibdula, analiżi bijoenerġetika ġiet evalwata bl-użu ta 'Seahorse Bioanalyzer. Kif irrappurtat qabel [18], l-LPS jonqos il-konsum tal-ossiġnu meta mqabbel mal-kontrolli Veh f'Veh-DCs kif mistenni (Figura 1E, linja blu għal sewda). Interessanti, rapa-M DCs bi jew mingħajr LPS għandhom OCR bażali ogħla (Figura 1E, linja ħadra għal blu fil-ħin żero). Rapa-M-DC wera nuqqas li tiżdied il-kapaċità respiratorja massima wara injezzjoni FCCP f'ċelluli mhux stimulati li nżammu bi stimulazzjoni LPS, li juri li rapamycin inaqqas il-kapaċità respiratorja żejda, kif ix-xogħol tagħna rrappurtat qabel ma 'FTY-DC [18]. DCs ittrattati LPS kellhom produzzjoni mnaqqsa ta 'ATP kif imkejla mill-OCR (blu għal iswed) meta mqabbla ma' Veh-DCs. Rapa-M-DC wera produzzjoni ta 'ATP b'mod sinifikanti akbar meta mqabbla ma' Veh-DC kemm f'DCs mhux stimulati kif ukoll stimulati minn LPS (Figura 1F). Rapa-M-DCs wrew livelli elevati ta' mRNA għal riċettur gamma attivat mill-proliferatur tal-peroxisome 1-alpha (Pgc1a) meta mqabbel ma' Veh-DCs (Figura 1G) u espressjoni tal-ġeni għal Pgc1a u fattur ta' traskrizzjoni mitokondrijali A (Tfam). ) inżammu f'Rapa-M-DCs wara stimulazzjoni LPS. Din id-dejta tindika li l-propagazzjoni ta 'BMDCs fil-preżenza ta' rapamycin żiedet il-kontenut mitokondrijali, l-OCR bażali u l-produzzjoni ta 'ATP.

Biex jiġi ttestjat jekk rapamycin flimkien maż-żieda tan-numri u l-funzjoni tal-mitokondrija indotta wkoll bidla fil-molekuli ko-stimulatorji tad-DC wara li l-LPS ġie ttestjat. Interessanti, wara t-trattament LPS, Rapa-M-DC għandhom livelli ta' espressjoni b'mod sinifikanti aktar baxxi ta' molekuli ta' preżentazzjoni ta' antiġeni ko-stimulatorji (CD80, CD86 u CD4{0), MHCII, u PDL1 meta mqabbel ma 'Veh-DC (Figura 1H, blu vs aħmar). Interessanti, Rapa-M-DCs kellhom livelli ta' espressjoni simili għal PDL1 meta mqabbla ma' Veh-DCs iżda kellhom żieda sinifikanti fil-proporzjon PDL1/CD86 wara stimulazzjoni LPS meta mqabbla ma' Veh-DCs trattati LPS fejn il-PDL1/CD{{ 18}} naqas (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 vs. Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33} }}02, p < 0.001="" u="" rapa/veh="" 0.56="" ±="" 0.001="" vs="" rapa/lps="" 0.73="" ±="" 0.02,="" p="">< 0.05).="" ma="" ġew="" osservati="" l-ebda="" bidliet="" sinifikanti="" fl-espressjoni="" cd11c="" bejn="" veh-="" u="" rapa-m-dcs,="" għalkemm="" rapa-m-dc="" kellu="" sinjal="" ta="" 'tixrid="" tal-ġenb="" aktar="" baxx="" li="" jindika="" d-daqs="" iżgħar="" taċ-ċelloli="" wara="" stimulazzjoni="" lps="" (dejta="" mhux="" murija).="" rapa="" m-dcs="" kellhom="" livelli="" relattivi="" ogħla="" ta="" 'mtdna/ndna="" meta="" mqabbla="" ma'="" veh-dcs="" (105.7="" ±="" 8.7="" vs="" 196.8.9="" ±="" 49.3),="" li="" juri="" t-trattament="" b'rapamicin="" iżid="" in-numri="" tal-mitokondrija="" dc.="" rapamycin="" naqas="" b'mod="" sinifikanti="" l-espressjoni="" tal-ġeni="" ta="" 'il6,="" il10,="" u="" tnfa="" indotti="" minn="" lps="" u="" konċentrazzjonijiet="" ta'="" proteini="" ta="" 'tnf="" u="" il6="" iżda="" żamm="" livelli="" ogħla="" ta'="" il10="" meta="" mqabbel="" ma="" 'veh-dc="" ittrattat="" b'lps="" (figura="" 1i-l).="" ġeni="" oħra="" magħrufa="" li="" huma="" regolati="" minn="" rapamycin="" (awtofaġija="" jew="" infjammazzjoni)="" huma="" elenkati="" fit-tabella="" tal-materjal="" supplimentari="" s2.="" il-ġeni="" wara="" lps="" indikati="" bl-aħdar="" kienu="" regolati="" 'l="" isfel="" u="" bl-aħmar="" kienu="" regolati="" 'l="" fuq="" meta="" mqabbla="" mat-trattament="" rispettiv="">

Trasferiment ta' Rapa-M-DC Jipproteġi l-Kliewi minn Korriment IskemikuId-DCs kollha ġew attivati ​​b'100 ng/mL LPS qabel it-trasferiment fl-istudji sinġeneiċi kollha (ġrieden C57BL/6 BMDC→C57BL/6). Nofs miljun DCs ġew injettati jum qabel 26-min bilateralikliewiIRI. Skematiku tad-disinn tal-istudju (Figura 2A). Bħala kontroll, il-ġrieden ġew injettati b'1 × PBS bħala kontrolli tal-ebda ċellula (NC). Meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati NC u Veh-DC, ġrieden ittrattati Rapa-M-DC ipproteġu b'mod sinifikanti l-kliewiminn korriment, krejatinina fil-plażma (Figura 2B); bidliet simili fil-BUN kienu osservati f'dawn il-ġrieden [Sham 41.30 ± 3.4 vs NC 159.75 ± 3.2 vs Veh-DC 151.82 ± 1.5 vs Rapa-M-DC 114.68 ± 16.3; p < 0.05="" nc="" jew="" veh-dc="" vs="" rapa-m-dc].="" bidliet="" morfoloġiċi="" (figura="" 2c,="" d)="" paralleli="" studji="" funzjonali.="" ġrieden="" ittrattati="" b'rapa-m-dcs="" għandhom="">kliewiLivelli ta' mRNA ta' Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 vs Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.0{01 ± 0.002], Ngal [Veh-DC 2.14 ± 1.2 vs Rapa-M-DC 0.12 ± 0.09] u Tnfa [Veh-DC 0.19 ± 0.15 vs Rapa-M-DC 0.0005 ± 0.0002] meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC. F'dawn l-istudji, u kif muri qabel [6,7,17,18], ġrieden ittrattati b'Veh-DC f'doża ta' nofs miljun għandhom bidliet komparabbli f'dawn l-istudji.funzjoni tal-kliewiukliewiprofil taċ-ċitokini. Fi studji ta 'trasferiment syngeneic, ġrieden ittrattati b'Rapa-M-DCs naqqsu l-apoptożi (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated digoxigenin deoxyuridine nick-end labeling [TUNEL]) meta mqabbla ma' ġrieden ittrattati b'Veh-DC (Veh-DC 3.8 ± 1.4 vs Rapa-). M-DC 1.1 ± 0.6;p <0.05); immaġini="" rappreżentattivi="" mill-analiżi="" tunel="" huma="" murija="" fil-figura="" s3="" tal-materjal="" supplimentari.="" interessanti,="" ma="" kien="" hemm="" l-ebda="" tibdil="" sinifikanti="" fin-numru="" ta’="" newtrofili="" infifiltranti="" fil-ġrieden="" ittrattati="" b’rapa-m-dc="" meta="" mqabbla="" ma’="" veh-dc="" (dejta="" mhux="" murija),="" li="" tissuġġerixxi="" ġrieden="" ittrattati="" b’rapa-m-dc="" jista’="" ma="" jkollhom="" l-ebda="" tibdil="" fil-kimokini,="" għalkemm="" il-funzjoni="" ta="" 'dawn="" iċ-ċelluli="" immuni="" intrinsiċi="" infifiltranti="" tista'="" tiġi="">

image

Trattament Waħdieni b'Rapamycin (Rapa-S) Induċi Inqas DCs Immunoġeniċi mingħajr Tbiddel id-Dinamika MitokondrijaliImbagħad ittestjajna jekk trattament wieħed b'rapamicin kienx biżżejjed biex jinduċi fenotip regolatorju u b'hekk il-fattibbiltà tal-induzzjoni tal-fenotip regolatorju tad-DCs tkun aktar klinikament rilevanti. WT DCs ġew iżolati u propagati għal 8 ijiem fil-preżenza ta 'GMCSF, total ta' tliet trattamenti. DCs ta' sebat ijiem ġew ittrattati b'rapamicin (10 ng/mL) qabel it-trattament b'10{0 ng/mL LPS għal inkubazzjoni ta' matul il-lejl u ttikkettati l-għada b'MitoTracker CMXRos Aħmar (50 nM). Meta mqabbel mat-trattament tal-vettura, it-trattament Rapa-S ma jbiddilx il-kontenut mitokondrijali fil-BMDCs (Figura 3A) bi u mingħajr LPS. Bl-istess mod, ma kien hemm l-ebda bidla fl-ittikkettjar b'MitoTracker Deep Red (100 nM) u MitoSox (5 µM) u wara stimulazzjoni ta' LPS matul il-lejl f'Rapa-S-DC meta mqabbla ma' Veh-DC (Figura 3B, C). Semi-kwantifikazzjoni tal-istogrammi MFI għaż-żebgħat mitokondrijali kollha (Figura 3D). Bl-istess mod, għal analiżi ta 'trattament multiplu, Veh- u Rapa-S-DCs kienu tbajja bl-użu magħmul bl-użu ta' JC{{20}} biex jiċċekkja jekk trattament wieħed ta 'rapamicin ibiddilx il-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija. Trattament wieħed b'rapamicin ma jbiddilx il-potenzjal tal-membrana tal-mitokondrija tal-linja bażi meta mqabbel ma 'BMDCs ta' kontroll ittrattati bil-vettura kif muri mill-immunoflfluworexxenza (Figura Materjal Supplimentari S2A) u ċitometrija flflow (Figura Materjal Supplimentari S2B, C). LPS naqqas il-konsum tal-ossiġnu meta mqabbel mal-kontrolli Veh f'Veh-DCs kif mistenni (Figura 3E, linja blu għal sewda). Rapa-S-DCs ma kellhom l-ebda bidla fl-OCR bażali (Figura 3E, linja ħadra għal blu fil-ħin żero). Meta l-produzzjoni tal-ATP ġiet ikkwantifikata, LPS naqqas il-produzzjoni tal-ATP kif imkejla mill-OCR (blu għal iswed) f'Veh-DCs u Rapa-S-DC (Figura 3F). Madankollu, Rapa-S-DCs wrew livelli elevati ta 'mRNA għal Pgc1a meta mqabbla mal-kontrolli Veh, u dawn il-livelli nżammu f'Rapa-S-DCs wara LPS (Figura 3G), ftit jew xejn bidla kienet osservata fil-livelli tat-traskrizzjoni ta' Tfam. Sussegwentement, ittestjajna jekk trattament wieħed bir-rapamiċin ikkaġunix bidla fil-molekuli ko-stimulatorji tad-DC wara LPS. Interessanti, wara t-trattament LPS, Rapa-S-DC għandhom livelli ta’ espressjoni sinifikament aktar baxxi ta’ molekuli ta’ preżentazzjoni ta’ antiġeni ko-stimulatorji (CD80, CD86, u CD4{0), MHCII, u PDL1 meta mqabbla ma 'Veh-DC (Figura 3H). Rapa-S-DCs kellhom livell ta' espressjoni simili għal PDL1 meta mqabbla ma' Veh-DCs u kellhom tnaqqis sinifikanti simili fil-proporzjon PDL1/CD86 wara stimulazzjoni LPS meta mqabbla ma' Veh-DCs (Veh/Veh 0. 59 ± 0.03 vs Veh/LPS 0.43 ± 0.002, p < 0.001="" u="" rapa-s/veh="" 0.69="" ±="" 0.02="" vs="" rapa-s/lps="" 0.56="" ±="" 0.008,="" p="">< 0.05).="" trattament="" wieħed="" b'rapamycin="" naqqas="" b'mod="" sinifikanti="" l-espressjoni="" tal-ġeni="" ta="" 'il6,="" il10="" u="" tnfa="" indotti="" minn="" lps="" flimkien="" ma'="" konċentrazzjonijiet="" ta="" 'proteini="" aktar="" baxxi="" ta'="" il10="" bi="" ftit="" jew="" xejn="" bidla="" fit-tnf="" u="" wara="" ttrattata="" b'lps="" (figura="" 3i-l).="" ġeni="" magħrufa="" oħra="" li="" għandhom="" jiġu="" regolati="" minn="" rapamycin="" (awtofaġija="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" u="" lamp2]="" jew="" infjammazzjoni="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" u="" ho1])="" kienu="" parzjalment="" regolati="" biss="" meta="" mqabbla="" ma="" 'vetturi="" dcs="" wara="" stimulazzjoni="" lps="" (supplimentari="" tabella="" tal-materjal="">

Trasferiment ta' Rapa-S-DC Jipproteġi l-Kliewi minn Korriment IskemikuId-DCs kollha ġew attivati ​​b'100 ng/mL LPS jew ittrattati b'rapamicin (10 ng/mL) qabel it-trasferiment fl-istudji sinġeneiċi kollha (ġrieden C57BL/6 BMDC→C57BL/6). Nofs miljun DCs ġew injettati jum qabel bilateralikliewiIRI. Skematiku tad-disinn tal-istudju (Figura 4A). Bħala kontroll, il-ġrieden ġew injettati b'1 × PBS bħala kontrolli tal-ebda ċellula (NC). Meta mqabbla mal-ġrieden ittrattati Veh-DC, ġrieden ittrattati Rapa-S-DC ipproteġu b'mod sinifikanti l-kliewimill-krejatinina tal-plażma tal-ħsara (Figura 4B); bidliet simili fil-BUN kienu osservati f'dawn il-ġrieden [Veh-DC 151.82 ± 1.5 vs Rapa-S-DC 139.53 ± 3.8]. Bidliet morfoloġiċi (Figura 4C, D) paralleli studji funzjonali. Ġrieden ittrattati b'Rapa-S-DCs għandhom inqaskliewiLivelli ta' mRNA ta' Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 vs Rapa -S-DC 0.{0{04 ± 0.002], Ngal [Veh DC 2.14 ± 1.2 vs Rapa-S-DC 0.14 ± 0.008] u Tnfa [Veh-DC 0.196 ± 0.196 ± 0.15 vs Rapa-S-DC 0.0017 ± 0.001] meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC.

image

image

Trasferiment Alloġeniku BMDC ta' Rapa-M-DC jew Rapa-S-DC Jipproteġi l-Kliewi bl-istess mod minn Korriment IskemikuNofs miljun DC ġew injettati jum qabel bilateralikliewiIRI għal studji ta' trasferiment alloġeniku (BALB/C BMDC→C57BL/6 ġrieden). Skematiku tad-disinn tal-istudju (Figura 5A). Bħala kontroll, il-ġrieden ġew injettati b'1x PBS bħala kontroll tal-ebda ċellula (NC). Meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC, ġrieden ittrattati Rapa-M-DC, jew Rapa-S-DC, ipproteġu b'mod sinifikanti l-kliewiminn korriment (Figura 5B). Bidliet morfoloġiċi (Figura 5C, D) paralleli studji funzjonali. Ġrieden ittrattati b'DCs rapamycin għandhom inqaskliewiLivelli ta' mRNA ta' Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 vs Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{{30}}2 vs Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 vs RapaM-DC 0.19 ± 0.11 vs Rapa- S-DC 0.05 ± 0.01] u Tnfa [Veh-DC 0.037 ± 0.02 vs Rapa-M-DC 0.007 ± 0.003 vs Rapa-S-DC 0.008 ± 0.005] meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC. Fi studji ta’ trasferiment alloġeniku, ġrieden ittrattati b’Rapa-M-DC jew Rapa-S-DC naqqsu l-apoptosi TUNEL meta mqabbla ma’ ġrieden ittrattati b’Veh-DC (Veh-DC 16.7 ± 8.2 vs Rapa-M-DC 7.2 ± 2.5 vs Rapa- S-DC 9.1 ± 0.1).

image

DCs Mitokondriji Eżoġeni Mgħobbija (Mito-DC) b'Dinamika Mitokondrijali Ogħla u Fenotip Aktar Immunoġeniku wara Stimulazzjoni LPSWT DCs ġew iżolati u propagati għal 8 ijiem fil-preżenza ta 'GMCSF, total ta' trattamenti 3. DCs ta' sebat ijiem ġew ittrattati matul il-lejl b'mito chondria eżoġena umana (10 µg/mL). Meta mqabbel mat-trattament tal-vettura, DC Mito-DCs trattati mitokondrija għandhom mitokondrija ogħla. Il-mitokondrija ġew iżolati mil-linja taċ-ċelluli umani HEK293. Il-BMDCs ġew analizzati għall-preżenza ta 'mitokondrija umana f'WT DCs tal-ġrieden bl-użu ta' primers tal-mtDNA tal-bniedem għal NADH dehydrogenase (ND). Kontenut relattiv uman [mtDNA] f'Veh-DC kien {{10}}.26 ± 0.10 kontra 16.8 ± 0.59; p < 0.001,="" żieda="" ta'="" 63-darbiet="" fid-dna="" ġenomika="" iżolata="" minn="" bmdcs.="" limitazzjoni="" tal-assaġġ="" attwali="" hija="" li="" tkejjel="" l-mtdna="" tal-bniedem="" jew="" tal-moue="" relattiv="" mad-dna="" nukleari="" u="" l-ammont="" żgħir="" ta’="" mtdna="" uman="" misjub="" f’veh-dc="" jista’="" jkun="" dovut="" għal="" koinċidenza="" minuri="" fis-sekwenza="" ta’="" nd="" fl-assaġġ="" tal-pcr="" jew="" possibbiltà="" peress="" li="" aħna="" li="" juri="" espressjoni="" relattiva="" għad-dna="" nukleari="" tal-ġrieden.="" biex="" jiġi="" ddeterminat="" jekk="" kontenut="" mitokondrijali="" ogħla="" biddilx="" ukoll="" il-funzjoni="" mitokondrijali,="" saret="" analiżi="" bijoenerġetika="" bl-użu="" ta="" 'seahorse="" bioanalyzer.="" il-konsum="" ta="" 'l-ossiġnu="" b'lps="" ċċarat="" meta="" mqabbel="" mal-kontrolli="" tal-veh="" f'veh-dcs="" kif="" mistenni="" (figura="" 6a,="" linja="" blu="" għal="" sewda).="" mito-dcs="" għandhom="" ocr="" bażali="" ogħla="" (figura="" 6a,="" linja="" ħadra="" għal="" blu="" fil-ħin="" żero).="" mat-trattament="" b'uncoupler="" fccp,="" mito-dc="" wera="" nuqqas="" biex="" tiżdied="" il-kapaċità="" respiratorja="" massima="" f'ċelluli="" mhux="" stimulati="" li="" nżammet="" bi="" stimulazzjoni="" lps,="" u="" wera="" li="" t-trattament="" b'mitokondrija="" iżolata="" ablates="" kapaċità="" respiratorja="" żejda="" (probabbli="" għax="" diġà="" f'ocr="" massimu="" fi="" stat="" bażali).="" meta="" l-produzzjoni="" tal-atp="" ġiet="" ikkwantifikata,="" lps="" naqqas="" il-produzzjoni="" tal-atp="" kif="" imkejla="" mill-ocr="" (blu="" għal="" iswed)="" f'veh-dcs.="" mito-dc="" wera="" produzzjoni="" bażali="" ta="" 'ocr="" u="" atp="" sinifikament="" akbar="" meta="" mqabbla="" ma'="" veh-dc="" f'dcs="" stimulati="" minn="" lps="" (figura="" 6b).="" mito-dcs="" wrew="" livelli="" elevati="" ta="" 'mrna="" għal="" pgc1a="" u="" tfam="" interessanti="" b'mod="" sinifikanti="" aktar="" baxxi="" meta="" mqabbla="" mal-kontrolli="" veh="" (figura="" 6c).="" id-differenzi="" f'pgc1a="" u="" tfam="" f'dawn="" is-sett="" ta="" 'esperimenti="" wara="" stimulazzjonijiet="" lps="" meta="" mqabbla="" mad-dejta="" fil-figuri="" 1="" u="" 3="" huma="" possibbilment="" minħabba="" l-użu="" ta'="" balb/c="" bmdcs.="" meta="" mqabbla="" ma="" 'c57bl="" 6="" bmdcs,="" dcs="" minn="" balb="" c="" għandhom="" bidliet="" sinifikanti="" fil-produzzjoni="" tal-mitokondrija="" u="" taċ-ċitokini="" wara="" stimulazzjoni="" [29,30].="" possibbiltà="" minħabba="" dawn="" il-bidliet="" fid-dcs,="" storikament="" użajna="" ħin="" iskemiku="" ogħla="" fil-ġrieden="" balb/c="" meta="" mqabbla="" ma’="" c57bl/6="" biex="" ikollna="">kliewikorriment [6,18]. Din id-dejta tindika li t-trasferiment ta 'mitokondrija b'saħħitha eżoġena jirriżulta f'kontenut mitokondrijali miżjud, OCR bażali, u produzzjoni ta' ATP. Dan jissuġġerixxi l-potenzjal għal fenotip anti-infjammatorju fid-DCs wara trattament b'mito chondria eżoġenu, kif muri fl-istudju preċedenti tagħna [18]. Sussegwentement, aħna nittestjaw jekk DCs ittrattati b'mitokondrija eżoġena li tirriżulta f'numri u funzjoni mitokondrijali miżjuda wkoll indottawx bidla fil-molekuli ko-stimulatorji tad-DC wara LPS. B'mod notevoli, bi u mingħajr stimulazzjoni ta 'LPS, Mito-DC għandhom livelli ta' espressjoni ogħla b'mod sinifikanti ta 'molekuli ta' preżentazzjoni ta 'antiġeni ko-stimulatorji (CD80, CD86 u CD40), MHCII, u PDL1 meta mqabbla ma' Veh-DC (Figura 6D). Barra minn hekk, Mito-DCs kellhom livell ta 'espressjoni ogħla għal PDL1 meta mqabbla ma' Veh-DCs; madankollu, kellhom ukoll żieda fil-proporzjon PDL1/CD86 wara stimulazzjoni LPS meta mqabbla ma Veh-DCs ittrattati bl-LPS (dejta mhux murija). Mito-DC kellu espressjoni tal-ġeni b'mod sinifikanti ta' Tnfa indott mill-LPS, iżda espressjoni tal-ġeni ogħla ta' Il6 u Il10 meta mqabbla ma' Veh-DC u konċentrazzjonijiet aktar baxxi ta' proteini ta' TNF u IL10 iżda żammet livelli ogħla ta' IL6 meta mqabbla ma' Veh-DC trattat b'LPS (Figura 6E –H). Ġeni oħra magħrufa li huma regolati minn mitokondrija (awtofaġija [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b u Lamp2] jew infjammazzjoni [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a u Ho1]) kienu parzjalment regolati wara stimulazzjoni LPS (Tabella Materjal Supplimentari S3). Veh-DC u Mito-DCs ġew ittrattati b'LPS għal 6 u 24 siegħa. Bidliet relattivi fil-kumpless mitokondrijali ġew imkejla. Mito-DC trattat bi u mingħajr LPS għandhom livelli ta 'proteina ogħla b'mod sinifikanti tal-kumplessi mitokondrijali IV, II, u I u livelli b'mod sinifikanti aktar baxxi ta' Kumpless V u III meta mqabbla ma 'Veh-DCs (Figura 6I). Analiżi semi-kwantitattiva ta 'espressjoni ta' proteina relattiva ta 'kumplessi mitokondrijali għal GAPDH (Figura 6J). Blots ta 'tul sħiħ huma pprovduti bħala figuri supplimentari (Figuri ta' Materjal Supplimentari S4–S7).

image

Figura 6. DCs mgħobbija mitokondrija (Mito-DC) għandhom funzjoni mitokondrijali ogħla u immunoġeniċità wara stimulazzjoni LPS meta mqabbla ma 'Veh-DCs. Veh-DC ta' sebat ijiem u ġew inkubati b'10 µg/mL mitokondrija HEK293 jum qabel it-trattament b'100 ng/mL LPS għal 24 siegħa addizzjonali jew tħallew mhux stimulati ( Veh). (A) 24 siegħa wara ż-żieda tal-mitokondrija, DCs ġew miżrugħa f'analizzatur Seahorse XF-24e, stimulat bi u mingħajr LPS għal 24 siegħa, u r-rata tal-konsum tal-ossiġnu (OCR) ġiet iddeterminata waqt trattamenti sekwenzjali b'oligomycin (1) ), FCCP (2) u antimycin A/rotenone (3). (B) Kwantifikazzjoni tal-produzzjoni bażali ta 'OCR u ATP. (C) livelli ta 'mRNA ta' Pgc1a u Tfam f'Veh-DC u Mito-DC ittrattati b'100 ng/mL LPS jew jitħallew mhux stimulati għal 24 siegħa. (D) Analiżi taċ-ċitometrija tal-fluss ta 'MHCII, molekuli ko-stimulatorji (CD40/80/86) u espressjoni PDL1 ġiet determinata bi u mingħajr stimulazzjoni LPS. (E) ELISA ta 'IL10, IL6, u TNF mill-Veh-DC u Mito-DC trattati b'100 ng/mL LPS għal 24 siegħa. (F – H) livelli ta 'mRNA ta' Tnfa, Il6, u Il10 f'Veh-DC u Mito-DC ittrattati b'100 ng/mL LPS jew jitħallew mhux stimulati għal 24 siegħa. Id-dejta tirrappreżenta mezzi ± SEM, * p Inqas minn jew ugwali għal 0.05, ** p Inqas minn jew ugwali għal 0.01, u *** p Inqas minn jew ugwali għal 0.001, ANOVA one-way segwit minn post-test ta 'Tukey. Id-dejta tirrappreżenta mezzi ± SEM ta' triplikati.

Trasferiment BMDC alloġeniku ta 'Mito-DC ProtesKliewiminn Korriment Iskemiku Nofs miljun DCs ġew injettati jum qabel bilateralikliewiIRI għal studji ta 'trasferiment Mito-DC allo geneic (BALB/C BMDC→C57BL/6 ġrieden). Skematiku tad-disinn tal-istudju (Figura 7A). Bħala kontroll, il-ġrieden ġew injettati b'1x PBS bħala l-ebda kontroll taċ-ċellula (NC). Meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC, ġrieden ittrattati Mito-DC ipproteġu b'mod sinifikanti l-kliewiminn korriment (Figura 7B). Bidliet morfoloġiċi (Figura 7C, D) paralleli studji funzjonali. Ġrieden ittrattati b'Mito-DCs għandhom inqaskliewiLivelli ta' mRNA ta' Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 vs Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 vs Mito-DC 0.39 ± {{29} }.20] u Tnfa [Veh-DC 0.037 ± 0.02 vs Mito-DC 0.0028 ± 0.0013] meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati Veh-DC. Fi studji ta 'trasferiment alloġeniku, ġrieden ittrattati b'Mito-DC naqqsu l-apoptosi TUNEL meta mqabbla ma' ġrieden ittrattati b'Veh-DC (Veh-DC 16.7 ± 8.2 vs Mito-DC 3.0 ± 1.2).

image

Diskussjoni Fl-istudju attwali aħna wrejna protezzjoni minnkliewiIRI indott minn trasferiment adottiv ta 'DCs ittrattati b'rapamicin (jew darba waħda jew multipli) jirregola alternattivament il-funzjoni tad-DC li hija dipendenti fuq bidliet relattivi fid-dinamika tal-mitokondrija. Kemm trattament(i) wieħed kif ukoll multiplu b'rapamicin jinduċu DCs immunoġeniċi mnaqqsa (ċitokini aktar baxxi u molekuli ko-stimulatorji). It-trasferiment ta' jew Rapa-M-DCs jew Rapa-S-DCs jipproteġi l-kliewiminn korriment ta 'riperfużjoni iskemika, li jindika l-istat immunoġeniku mnaqqas ta' DCs modifikati ta 'rapamicin jinduċi l-protezzjoni. Barra minn hekk, it-trasferiment ta 'Veh-DC li kellu żidiet temporanji fin-numri tal-mitokondrija jipproteġi wkollkliewimill-IRI (Figura 8A–D)). Minn dawn l-istudji nistgħu nikkonkludu li l-injezzjoni ta 'DCs inqas immunoġeniċi hija ċentrali biex tinduċi protezzjoni mill-IRI proċess li jista' jinkiseb permezz ta 'trattament farmakoloġiku (rapamiċin) jew permezz ta' trasferiment ta 'mitokondrija eżoġena b'saħħitha. Kif irrappurtat qabel [31] u kkonfermat fl-istudji RNAseq tagħna, b'mod ġenerali, m'hemm l-ebda firma toleroġenika ċara assoċjata ma 'DCs modulati b'rapamicin. Għalkemm id-DCs rapamycin juru xi bidliet sinifikanti fil-ġeni wara stimulazzjoni LPS meta mqabbla ma 'DCs tal-vetturi, dawn kienu limitati għal RapaM-DCs li kellhom sinjalazzjoni medjata minn ċitokini aktar baxxi u produzzjoni ta' ċitokini (sinjalazzjoni ta 'TNF permezz ta' produzzjoni ta 'NF-kB u IFN) kollha kritiċi fiż-żewġ. reazzjonijiet immuni intrinsiċi u adattivi. Kif ġie rrappurtat u kkonfermat qabel fl-istudju tagħna, is-sinjalar IL-10 ġie identifikat bħala l-mogħdija ewlenija li kienet differenti f'DCs ittrattati bir-rapamiċina b'FDR ta' 5.87 × 10 4 (Figura ta' Materjal Supplimentari S1), ċitokina distintiva. ta’ firma toleroġenika fid-DCs.

image

Storikament, DCs toleroġeniċi (Tol-DC) huma identifikati bħala li huma indeboliti fil-maturazzjoni jew semi-immaturi b'espressjoni baxxa ta' ko-stimulazzjoni (CD80, CD86, CD40) bi produzzjoni miżjuda ta' IL10 akkumpanjata minn sekrezzjoni baxxa ta' IL12 u IFN. , kapaċità aktar baxxa biex ipprajm iċ-ċelluli T u potenzjal li jinduċi Treg wara stimulazzjoni proinflflammatory [32,33]. DCs regolatorji jew toleroġeniċi jistgħu jiġu differenzjati in vitro billi jintużaw mediċini immunosoppressanti jew komposti bħal FTY720 [18] jew rapamycin (l-istudju attwali), jew ċitokini anti-infjammatorji bħal IL10 [34] jew permezz ta 'modifika ġenetika.

Rwol taċ-Ċelloli Dendritiċi fil-Ħsara Akuta fil-Kliewi (AKI)Għalkemm saru avvanzi farmakoloġiċi kbar għall-prevenzjoni jew it-trattament ta' diversi korrimenti, l-ebda wieħed mhu disponibbli għall-AKI, għalhekk jibqa' bħala piż kbir għas-saħħa [35]. Barra minn hekk, għall-prevenzjoni jew it-tnaqqis tar-risponsi immuni adattivi medjati r-rifjut ta 'allograft jew mard awtoimmuni użu ta' mediċini immunosoppressivi mhux speċifiċi huwa assoċjat ma 'effetti sekondarji avversi. Għalhekk, l-użu ta 'tip ta' ċellula immuni bħal DCs li jistgħu jimmiraw risponsi immuni intrinsiċi u adattivi huwa vantaġġi. Barra minn hekk, id-DCs huma ċelluli importanti fl-immunità jew it-tolleranza, u l-idea li jintużaw DCs regolatorji jew tollerizzati ex-vivo f'terapiji bbażati fuq iċ-ċelluli għall-kanċer, disturbi awtoimmuni u trapjant ilha taħt investigazzjoni [36]. Strateġiji farmakoloġiċi (FTY720 [18]) jew bijoloġiċi (modifikati ġenetikament) jinduċu DCs regolatorji jew toleroġeniċi (Tol-DC) [37], li jew huma reżistenti għall-maturazzjoni jew għandhom livelli ta’ maturazzjoni aktar baxxi jew huma alternattivament attivati ​​li fl-aħħar mill-aħħar jesprimu livelli baxxi ta’ MHC I jew MHC II u molekuli ko-stimulatorji bħal CD40, CD80, u CD86. Bl-użu tal-ġrieden transġeniċi CD11c-DTR qabel ippubblikajna studji li wrew li t-tnaqqis tad-DCs bit-tossina tad-difterite ipproteġi b’mod sinifikanti l-ġurdienkliewiminn korriment ta' riperfużjoni ta' iskemija (IRI) [7,38], u bil-maqlub żieda fin-numri DC dipendenti fuq id-doża aggravatkorriment fil-kliewi[7], li jissuġġerixxi li DCs jista 'jkollhom rwol ewlieni fir-regolazzjoni tal-AKI. Ta 'min isemmi li fl-AKI, il-mudell ta' AKI li huwa utilizzat (kimoterapija bl-użu ta 'cisplatin jew iskemija) jiddetta r-rwol li għandhom id-DCs biex ibiddlu r-risponsi immunoloġiċi. F'AKI indott minn cisplatin, l-ablazzjoni tad-DC jew bl-użu ta 'ġrieden transġeniċi jew permezz ta' injezzjoni ta 'chlodronate liposomali tirriżulta f'aktar korriment peress li IL-10 prodott minn DCs f'dan il-mudell huwa fl-aħħar meħtieġ biex itaffu l-ħsara nefrotossika [39,40].

Rapamycin: Infjammazzjoni, Ċelloli immuni, Korriment ta' Riperfużjoni ta' Iskemija (IRI)Studji ppubblikati preċedentement urew rwol protettiv tar-rapamiċina f'mudelli AKI bl-użu ta' studji IRI li kienu jinvolvu r-regolazzjoni tal-infifiltrazzjoni taċ-ċelluli NKT u l-funzjoni u b'hekk ittejjeb.korriment fil-kliewi[41], f'dan l-istudju ġrieden ġew ittrattati oralment tliet darbiet b'rapamicin 24 siegħa, 1 siegħa qabel l-iskemija u 12-il siegħa wara l-iskemija. Doża orali kronika ta 'ġrieden ġurnata qabelkliewiIRI u kull jum wara (sa 7 ijiem) irriżultaw f'ogħlakorriment fil-kliewiminħabba inibizzjoni tarenaliproliferazzjoni taċ-ċelluli tubulari fi ġranet 1 u 3 wara l-iskemija [42]. Dan kien evidenti bħal f'mudell tal-ġurdien ta' ostruzzjoni ureteral unilaterali (UUO), fejn it-trattament b'rapamiċina tjiebetkliewifibrożi billi jinibixxi direttament is-sinjalar tal-mTOR f'myofibroblasts u makrofaġi interstizjali [43]. Dawn l-istudji jissuġġerixxu li rapamycin jista' jkollu effetti opposti f'diversi akuti kontra kroniċikliewimudelli. Madankollu, studji varji rrappurtaw rwol detrimentali għar-rapamicin f'mudelli ta 'l-annimali ta' IRI. Dożar orali b'rapamicin (4 mg / jum) għal 7 ijiem fil-ħnieżer Yorkshire indebolita vasorelaxation dipendenti fuq l-endotelju u żieda fin-nekrożi mijokardijaka f'mudell ta 'okklużjoni ta' l-arterja koronarja [44]. Madankollu, fil-ġrieden, trattament akut b'rapamicin (siegħa qabel iskemija, injezzjoni intraperitoneali) indotta kardjo-protezzjoni billi rregola s-sinjalar JAK2-STAT3 biex jipproteġi kontra infart mijokardijaku [45]. Skont ir-rotta (gavage jew taħt il-ġilda jew intraperitoneali), id-dożaġġ (0.1–6 mg/kg/kuljum), il-ħin (bikri jew ittardjat) [46], u t-tip ta’ mudell użat (qalb [47] , fwied [48] jewkliewi[41,49]), rapamycin intwera li huwa protettiv [47] jew mhux protettiv [50].

Terapija taċ-Ċelloli u RapamycinIl-propagazzjoni ta 'BMDCs tal-ġrieden jew CD14 tal-bniedem flimkien ma' monoċiti li nqisu kroniċi indotta fenotip protettiv jew regolatorju alternattiv fid-DCs li rregola r-risponsi immuni intrinsika u adattivi. Fil-marda letali tal-graft-versus-host, DCs iġġenerati bir-rapamicin kienu naqsu l-MHC II u molekuli ko-stimulatorji iżda kellhom popolazzjoni ogħla ta 'IL12 li tipproduċi wara stimulazzjoni LPS. Dawn l-IL12 li jipproduċu Rapa-M-DC tejbu l-apoptosi taċ-ċelluli T alloreattivi, mekkaniżmu li kien jinvolvi IFN [51]. Bl-istess mod, CD14 flimkien ma 'monoċiti propagati fil-preżenza ta' rapamycin ipproduċew ukoll IL12p70 ogħla flimkien ma 'livelli IL27 li rregolaw il-funzjoni taċ-ċelluli NK, u b'hekk biddlu r-rispons taċ-ċelluli T alloġeniċi permezz ta' IFN [52]. Filkliewi,it-trasferiment ta’ Tregs ittrattati b’rapamiċina kien soppressa b’mod sinifikanti r-reazzjonijiet taċ-ċelluli T, taċ-ċelluli majelojdi u tal-myofibroblast, li rriżultaw f’titjib akut u kroniku.mard tal-kliewimeta mqabbel mat-trattament dirett tal-ġrieden b'Rapamycin [53]. Bl-istess mod, it-trasferiment adottiv ta’ ċelluli suppressor derivati ​​minn majelojdi (MDSCs) ittrattati bir-rapamiċina fil-ġrieden tjiebfunzjoni tal-kliewib'danni istoloġiċi mnaqqsa, u infifiltrazzjoni taċ-ċelluli immuni [54]. Dawn l-istudji jipprovdu evidenza li t-terapija taċ-ċelluli li tinvolvi trattament ta' ċelluli b'rapamicin qabel l-injezzjoni tevita effetti sekondarji avversi li jistgħu jkunu assoċjati ma' trattament sistemiku b'rapamiċin. Barra minn hekk, ittestjajna l-użu ta’ metformin jew komposti bħal 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1- -4- ribofuranoside (AICAR) biex jinduċu fenotip regolatorju fid-DCs tal-ġrieden biex jittestjaw ir-rwol tagħhom fil-bidla.kliewiIRI. Bħall-istrateġija ta 'dożaġġ użata ma' rapamycin (Rapa-S-DC), aħna kkurajna BMDCs b'dożi baxxi ta 'metformin (1 mM) jew AICAR (1 mM) f'jum 7 flimkien ma' LPS. Injettajna b'mod sistemiku 0.5 x 106 jew metformin-DCs jew AICAR-DCs jum qabelkliewiIRI. Ġrieden ittrattati jew b'metformin-DCs jew AICAR-DCs kienu protetti b'mod sinifikanti meta mqabbla ma 'ġrieden ittrattati jew NC jew Veh-DCs (osservazzjonijiet mhux ippubblikati, laboratorju Bajwa). Għalhekk, mediċini jew komposti multipli li jinduċu bidliet metaboliċi jew jattivaw il-mogħdija AMPK jistgħu jkunu ta 'min ittestjat waħedhom jew flimkien. Ta 'min jinnota li l-użu ta' kombinazzjoni multipla ta 'drogi jew komposti (metformin jew AICAR) li potenzjalment jistgħu jikkumplimentaw l-effetti protettivi ta' rapamycin għad irid jiġi esplorat meta jiġi evalwat l-użu tagħhom fil-BMDCs. Fiċ-ċelloli tal-kanċer, il-kombinazzjoni ta 'AICAR ma' rapamycin ittejjeb l-effikaċja ta 'rapamicin biex tkompli trażżan mTORC2 biex jinduċi apoptożi [55]. Fiċ-ċelluli T, l-użu kombinat ta 'metformin u rapamycin ġie ttestjat ukoll bħala regolatur tal-punt ta' kontroll metaboliku potenzjali biex jinfluwenza l-funzjoni taċ-ċelluli T [56]. Għalhekk, dawn il-modalitajiet terapewtiċi kombinati għandhom jiġu ttestjati fil-futur b'BMDCs toleroġeniċi jew regolatorji bħala regolaturi potenzjali diretti jew indiretti tal-punti ta 'kontroll metaboliċi.

cistanche-nephrology-2(38)

Rapamycin: Rwol tal-Mitokondrija fiċ-Ċelloli Dendritiċi u l-MakrofaġiIl-funzjonijiet DC u makrofaġi huma regolati mill-metaboliżmu mitokondrijali. Makrofagi tat-tip 1 [57,58] u DCs immunoġeniċi (attivazzjoni medjata minn TLR) għandhom transizzjoni metabolika li fiha l-fosforilazzjoni ossidattiva mitokondrijali hija inibita minn nitric oxide (NO) sintetizzat b'mod endoġeniku u impenn għal rati glikolitiċi aerobiċi għoljin [59]. L-attivazzjoni ta 'DCs jew makrofaġi minn diversi agonisti TLR (LPS jew CpG) twassal għal żieda mgħaġġla fil-glikolisi, segwita minn tnaqqis fl-OXPHOS u l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali [59-61]. Xi rwol għall-mitokondrija ġie muri b'DCs ittrattati in-vitro bil-vitamina D; dawn id-DCs żiedu OXPHOS, massa mitokondrijali, u produzzjoni mROS [62], l-istudju reċenti tagħna bl-użu ta 'FTY720 [18] wera bidliet simili fid-DC (OXPHOS ogħla u inqas immunoġeniċità), trattament akut b'rapamycin intwera li jestendi l-ħajja ċellulari ta' DCs li kienu dipendenti mill-preservazzjoni tal-funzjoni mitokondrijali [10] permezz ta 'inibizzjoni ta' NO. Għall-kuntrarju taż-żieda fil-ħajja tad-DCs, l-istess gruppi rrappurtaw ukoll li l-espożizzjoni akuta jew qasira għal rapamycin fid-DCs tagħmilhom ukoll attivaturi qawwija ta 'ċelluli CD8 plus T speċifiċi għall-antiġen, u b'hekk itejbu l-kontroll tal-melanoma B16 bħala tilqim fil-ġrieden [63]. Trattament akut (90 min) ta 'DCs derivati ​​minn monoċiti umani b'rapamycin irażżan molekuli immunostimulatorji indotti minn LPS u potenzjal allo-stimulatorju li kien jinvolvi l-inkapaċità ta' DCS ittrattat biex iżid is-sinjalar NF-kB [64]. Fil-makrofaġi, rapamycin irażżan il-produzzjoni ta' IL1 u IL-18wara l-istimulazzjoni ta 'LPS, proċess li jinvolvi wkoll it-tnaqqis ta' ROS mitokondrijali (mtROS) billi jinibixxi direttament il-mogħdijiet NLRP3 inflflammasome-p38 MAPK-NF-kB [65]. Rapamycin kondizzjonat DC (Rapa-DC) mill-ġrieden u l-bnedmin jaġixxu b'mod differenti, meta mqabbla mal-ġurdien Rapa-DC, uman Rapa-DC wrew li huma parzjalment reżistenti għall-maturazzjoni wara ċitokini proin- flammatory u juru eteroġeneità fir-regolazzjoni ta ' l-espansjoni taċ-ċelluli T effetor u funzjoni [66]. Ħafna mill-proprjetajiet immunoregolatorji tad-DCs derivati ​​minn monoċiti kkondizzjonati minn rapamycin u r-rwol tagħhom fit-trapjant ġew riveduti b'mod eleganti minn Macedo et al. [67].

Is-sejbiet attwali tagħna jindikaw li DCs ikkurati b'rapamicin wieħed jew multipli għandhom fenotip immunoġeniku u immunostimulatorju mnaqqas wara stimulazzjoni LPS. It-trasferiment ta 'dawn id-DCs jipproteġikliewimill-IRI. Rapamycin alternattivament jirregola d-dinamika tal-mitokondrija; trattament multiplu biss jinduċi numri ogħla ta 'mitokondrija. Din id-dejta tissuġġerixxi li d-dinamika mitokondrijali DC (kontenut ogħla ta’ mitokondrija), flimkien ma’ fenotip inqas immunoġeniku indott minn rapamycin, jipproteġu b’mod kooperattivkliewiminn hija korriment kimiku. Għalkemm aktar interessanti, id-dejta tagħna b'DCs ittrattati b'mitokondrija eżoġena tindika li numri ogħla ta 'mitokondrija jistgħu jegħlbu l-istat aktar immunoġeniku ta' DCs wara stimulazzjoni LPS biex jipproteġu wkollkliewimill-IRI. Ikun interessanti li jiġi kkonfermat jekk numri ogħla tal-mitokondrija fid-DCs ibiddlux ir-risponsi taċ-ċelluli T, id-DCs għandhomx il-kapaċità li jbiddlu r-rispons immuni kif indikat l-istudju preċedenti tagħna. Id-dejta preliminari tagħna tindika, fi studji dwar il-proliferazzjoni taċ-ċelluli T alloġeniċi, DCs b'numri ogħla ta 'mitokondrija jrażżnu l-proliferazzjoni taċ-ċelluli T CD4 f'reazzjonijiet ta' limfoċiti mħallta (MLR, dejta mhux murija). Bħalissa mhux ċar jekk DCs b’numri mitokondrijali ogħla jistgħux jinduċu rispons Treg li jista’ jikkontribwixxi b’mod pożittiv għall-protezzjoni.kliewimill-IRI. Dawn se jkunu l-fokus tal-istudji li jmiss tagħna.

Konklużjonijiet Fil-qosor, urejna li l-BMDCs jistgħu jirregolawkorriment fil-kliewib'mekkaniżmu li jinvolvi bijoġenesi tal-mitokondrija jew permezz ta' trattamenti multipli b'rapamiċin jew iż-żieda eżoġenika tan-numri tal-mitokondrija billi tuża mitokondrija eżoġena. Aħna nikkonkludu li DCs regolatorji (DCs b'numri ogħla ta 'mitokondrija) jistgħu jkunu utli fihomkliewiIRI kif ukoll fi stati infjammatorji oħra bħal trapjant u disturbi awtoimmuni biex jipprevjenu jew jittrattaw korriment.

Tista 'Tħobb ukoll