Valutazzjoni kwantitattiva ta' infiltrati infjammatorji f'bijopsiji ta' trapjant tal-kliewi bl-użu ta' amplifikazzjoni tas-sinjal Multiplex Tyramide u tagħlim profond

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Astratt

Il-funzjoni tat-tilqim imdewma (DGF) hija fattur ta 'riskju qawwi għall-iżvilupp ta' fibrożi interstizjali u atrofija tubulari (IFTA) fi trapjanti tal-kliewi. Valutazzjoni kwantitattiva ta' infiltrati infjammatorji f'bijopsiji tal-kliewi ta' pazjenti b'DGF tista' tiżvela markaturi ta' tbassir għall-iżvilupp ta' IFTA. F'dan l-istudju, għaqqadna l-amplifikazzjoni tas-sinjal multiplex tyramide (mTSA) u netwerks newrali konvoluzzjonali (CNNs) biex nevalwaw il-mikroambjent infjammatorju f'bijopsiji tal-kliewi ta' pazjenti DGF (n=22) meħuda 6 ġimgħat wara t-trapjant. Il-pazjenti kienu stratifikati għall-iżvilupp IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola jipprevjeni l-mard tal-kliewi, ikklikkja hawn biex tikseb il-kampjun

Introduzzjoni

Il-funzjoni tat-tilqim imdewma (DGF) wara trapjant tal-kliewi hija multifatturi u prinċipalment relatata mal-karatteristiċi tad-donatur u l-ħin tal-iskemija. DGF huwa ġeneralment deskritt bħala l-ħtieġa għal dijaliżi fi żmien 7 ijiem wara t-trapjant u huwa fattur ta 'riskju qawwi għal korriment kroniku tat-trapjant tal-kliewi [1-3]. Komponent klassiku ta' ħsara kronika fil-kliewi hija l-preżenza ta' fibrożi interstizjali u atrofija tubulari (IFTA). Madankollu, mhux il-pazjenti kollha tad-DGF jimxu lejn l-iżvilupp tal-IFTA, u r-relazzjoni kumplessa bejn id-DGF u l-IFTA għadha mhix mifhuma ħażin. Dan huwa l-ewwel minħabba l-ħin ta 'dewmien bejn avvenimenti potenzjalment kawżattivi u tnaqqis funzjonali, u t-tieni minħabba l-effetti varjabbli u kumplessi ta' indutturi potenzjali bħal rifjut u effetti sekondarji tal-medikazzjoni [1, 4]. Il-preżenza ġenerali ta 'infjammazzjoni u makrofaġi speċifiċi ġiet deskritta f'ħafna studji bħala tbassir għat-telf ta' tilqim [5-8]. Madankollu, il-proċessi patoloġiċi sottostanti mhumiex mifhuma bis-sħiħ, u livelli għoljin ta 'infjammazzjoni ma jwasslux dejjem għal telf ta' tilqim fit-tul. Bħala riżultat ta 'stimoli ambjentali, il-makrofaġi jiksbu funzjonijiet speċjalizzati u jippolarizzaw f'fenotipi differenti. Bosta studji jissuġġerixxu li sottotipi speċifiċi ta' makrofaġi (makrofaġi attivati ​​alternattivament) huma involuti fir-rimodelazzjoni tat-tessuti billi jinduċu tiswija jew fibrożi tat-tessuti. Il-polarizzazzjoni lejn fenotip ta' remodeling tat-tessuti (xi kultant pro-fibrotiku) hija magħrufa li hija dipendenti fuq firxa wiesgħa ta' stimuli ambjentali, fost oħrajn ipprovduti minn sottotipi ta' limfoċiti T-helper [9-11]. Il-valutazzjoni tal-popolazzjonijiet taċ-ċelluli T-helper fit-tilqim fiż-żmien tad-DGF żvelat sottotip T-helper 1 prevalenti, iżda s'issa ma ġewx investigati korrelazzjonijiet mal-eżitu tat-tilqim jew il-progressjoni għal IFTA [12]. Valutazzjoni komprensiva tal-mikroambjent infjammatorju ffukat speċifikament fuq il-makrofaġi u s-sottosettijiet taċ-ċelluli T-helper f'koorti ta' pazjenti magħżula bir-reqqa tista' tipprovdi għarfien dwar għaliex xi wħud, iżda mhux il-pazjenti kollha tad-DGF, jimxu lejn l-iżvilupp ta' IFTA.

Madankollu, investigazzjoni komprensiva ta' infiltrati infjammatorji hija mfixkla minn diversi limitazzjonijiet (tekniċi). L-immunoistokimika tradizzjonali (IHC) u t-tekniki ta 'immunofluworexxenza jappoġġjaw il-viżwalizzazzjoni ta' numru limitat biss ta 'markaturi taċ-ċelluli f'sezzjoni waħda tat-tessut. It-taqsim tas-serje ta' frammenti ta' tessut żgħar u ta' valur bħal bijopsiji tal-kliewi mhuwiex mixtieq u l-interpretazzjoni tar-relazzjonijiet bejn iċ-ċelloli f'sezzjonijiet differenti hija diffiċli. Barra minn hekk, valutazzjoni kwantitattiva ta' l-infiltrati infjammatorji permezz ta' stima viżwali tiġi b'livell sinifikanti ta' varjabilità bejn l-osservaturi [13]. Tekniki tradizzjonali tal-ipproċessar tal-immaġini bħal thresholding tal-pixels, watershed, u segmentazzjoni bbażata fuq il-morfoloġija jiddependu fuq għarfien minn qabel tar-rappreżentazzjonijiet taċ-ċelluli morfoloġiċi kollha u l-intensità tat-tebgħa tat-tessuti matul sett ta 'dejta [14-16]. Għalhekk, dawn il-metodi ħafna drabi ma jkollhomx robustezza għal varjazzjonijiet ta' immaġini bijoloġiċi u tekniċi u jittraduċu ħażin għal settijiet ta' dejta ġodda jew esterni. Iż-żieda tal-patoloġija diġitali aċċellerat l-iżvilupp ta 'metodi alternattivi għall-valutazzjoni ta' immaġini full-slide (WSI) [17, 18]. Mudelli ta 'tagħlim profond, speċifikament, netwerks newrali konvoluzzjonali (CNNs) wrew li huma kapaċi jissegmentaw u jiskopru strutturi bijoloġiċi rilevanti fi slides istopatoloġiċi [19-23]. Dawn it-tekniki għandhom il-potenzjal li jimxu minn stima viżwali suġġettiva u proċessar ta 'immaġni tradizzjonali għal skoperta taċ-ċelluli preċiża, oġġettiva u riproduċibbli.

L-għan ta' dan l-istudju huwa li jiżviluppa metodu għal valutazzjoni oġġettiva u kwantitattiva ta' markaturi multipli ta' ċelluli infjammatorji, li jevita l-ħtieġa ta' sezzjoni estensiva ta' slide serjali. Biex nagħmlu dan, aħna ngħaqqdu IHC multiplex, immaġini multi-spettrali, u mudelli ta 'tagħlim fil-fond. Biex nuru l-applikabbiltà ta 'dawn it-tekniki, aħna nistudjaw il-korrelazzjonijiet tal-mikroambjent infjammatorju, kwantifikati minn mudelli ta' tagħlim fil-fond, ma 'l-iżvilupp ta' IFTA f'bijopsiji ta 'trapjant ta' sorveljanza ta 'pazjenti DGF.

estratt ta' cistanche li jikkura mard tal-kliewi

materjali u metodi

Biex nevalwaw il-mikroambjent infjammatorju fil-bijopsiji tal-kliewi ta 'pazjenti DGF, wettaqna IHC multiplex fuq bijopsiji ta' sorveljanza meħuda 6 ġimgħat wara t-trapjant. Il-pazjenti kienu stratifikati għall-iżvilupp IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Kampjuni tat-tessuti

Aħna użajna bijopsiji ta 'sorveljanza minn riċevituri ta' trapjant tal-kliewi fl-Iskola Medika ta 'Hannover (Hannover, il-Ġermanja), miksuba fil-kuntest ta' programm ta 'bijopsija ta' sorveljanza prospettiva. Il-kriterji ta’ inklużjoni kienu: okkorrenza ta’ DGF (definita bħala<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

Valutazzjoni tal-IFTA

Il-firxa tal-fibrożi interstizjali (ci) u l-atrofija tubulari (ct) (IFTA) f'6 ġimgħat u 6 xhur, espressa bl-użu tas-sistema ta 'gradazzjoni tal-leżjoni ta' Banff [24] ġiet akkwistata mir-rapport tal-patoloġija. Biex tiġi evalwata r-relazzjoni bejn l-infiltrati inflammatorji bikrija u l-iżvilupp IFTA f'aktar dettall, il-pjastri kollha mtebbgħin bil-PA ġew diġitizzati għal eżaminazzjoni mill-ġdid bl-użu ta' skaner diġitali Pannoramic 250 Flash II (3DHistech, Ungerija) b'20. × objettiv f'riżoluzzjoni ta' 0.24 μm/pixel. Il-PAS WSI taż-żewġ punti ta 'żmien (6 ġimgħat u 6 xhur) ġew skurjati għall-firxa ta' IFTA (perċentwal tal-erja tal-wiċċ, b'intervalli ta '10 fil-mija) minn tliet patoloġisti tal-kliewi. Il-punteġġi medji tal-IFTA tal-patoloġi ntużaw bħala punteġġ finali biex tiġi kkalkulata l-bidla fl-IFTA bejn 6 ġimgħat u 6 xhur wara t-trapjant. Il-pazjenti kienu stratifikati b'żieda assoluta fil-punteġġ IFTA ta' 10 fil-mija jew aktar (n=13) u l-ebda jew<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Barra minn hekk, il-punteġġi tal-leżjoni ta 'Banff tqabblu bejn il-punti tal-ħin bl-użu tat-test tal-gradi ffirmati ta' Wilcoxon. Dan wera differenzi sinifikanti bejn bijopsiji ta' 6 ġimgħat u 6 xhur għall-kategoriji ta' Banff ti (p=0.017), ci (p=0.004), u ct (p=0.011) .

Tbajja Multiplex TSA

Aħna għamilna IHC multiplex bl-użu ta 'mTSA biex viżwalizzaw markaturi taċ-ċelluli multipli fil-bijopsiji ta' 6 ġimgħat. Wara inkubazzjoni b'antikorp primarju u sekondarju, it-tessut ġie ttrattat b'tyramide ttikkettjat b'mod fluworexxenti. Il-perossidasi tar-ravanell taż-żiemel mill-antikorp sekondarju jikkatalizza l-formazzjoni ta 'radikali attivi tat-tyramide. Ir-radikali tat-tyramide jorbtu b'mod kovalenti mar-residwi tat-tyrosine fuq l-antiġen. Dan it-twaħħil permanenti ppermetta t-tneħħija kkaġunata mis-sħana tal-kumpless tal-antikorp primarju-sekondarju filwaqt li ppreserva d-depożitu ta' tiramide fluworexxenti [25]. Dan ippermetta l-inkubazzjoni suċċessiva sussegwenti b'aktar antikorpi mill-istess speċi kontra l-antiġeni fil-mira.

mTSA sar fuq żewġ slides konsekuttivi mill-bijopsiji ta' sorveljanza ta' 6 ġimgħat. Aħna żviluppajna żewġ pannelli mTSA biex nevalwaw l-infiltrat infjammatorju u l-firxa kapillari peritubulari fil-gruppi ta 'pazjenti tagħna. Panel I kien jeżisti ta' antikorpi anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68, u CD34. Panel II intuża biex jinvestiga ċ-ċellula T-helper u l-polarizzazzjoni tal-makrofagi bl-użu ta 'antikorpi anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68, u CD163. L-ispeċifikazzjonijiet tal-antikorpi, id-dilwizzjonijiet, u l-ordnijiet tat-tbajja’ huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 1. Il-pjastri kollha ġew deparaffinizzati fi xylene, deidratati f’95 fil-mija etanol, maħsula fl-ilma tal-vit, u mgħollija għall-irkupru tal-epitopi f’10x trisborat-EDTA dilwit (TBE 10x). , 0658, VWR Life Sciences, US) buffer. Wara li tkessaħ, il-pjastri ġew maħsula f'soluzzjoni ta 'perossidasi ta' idroġenu ta '3 fil-mija għall-imblukkar tal-perossidasi endoġenu u maħsula b'buffer salin tris-buffered b'0.05 fil-mija Tween 20 (822184, Merck KGaA, Ġermanja) (TBS-T). L-imblukkar tal-proteini sar bl-użu ta 'TBS-T b'1 fil-mija albumina tas-serum bovin (BSA) (mTSA pass 1). Antikorpi primarji ġew inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra, jew matul il-lejl f'erba 'gradi Celsius (mTSA pass 2). Wara l-ħasil f'TBS-T, il-pjastri ġew inkubati b'antikorp sekondarju konjugat bl-HRP (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, The Netherlands) għal 30 min f'temperatura tal-kamra (mTSA pass 3). Sussegwentement, TSA saret bl-użu tal-fluorophores Opal TSA minn Opal 7-Kit tal-IHC Manwal tal-kulur (NEL811001KT, Akoya Biosciences, US) (mTSA pass 4) (il-fluorophores u l-antikorpi korrispondenti tagħhom huma elenkati fit-Tabella Supplimentari 1). Il-kumpless antikorp-TSA tneħħa b'ċiklu ta 'togħlija fil-buffer TBE (mTSA pass 5). Il-passi 1-5 tal-mTSA ġew ripetuti sakemm is-slajds ġew imtebba bl-antikorpi kollha mill-pannell ikkonċernat. Is-slajds kienu koperti bil-fluoromount-G b'DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, US).

herba cistanche

Validazzjoni Multiplex TSA

Ċikli ta 'togħlija ripetuti jistgħu jaffettwaw l-affinità ta' l-epitope fil-mira. Xi antikorpi juru mudell ta 'tbajja' aktar dgħajfa wara li t-tessut jiġi mgħolli bosta drabi, antikorpi oħra jeħtieġu aktar ċikli ta' togħlija biex jilħqu l-aħjar intensità tat-tbajja ', u oħrajn ma huma affettwati xejn. Aħna vvalutajna dan l-effett għall-antikorpi kollha bl-użu ta 'IHC kromoġeniku fuq it-tessut tat-tunsilli ta' kontroll FFPE. Għal kull antikorp ittestjat (n=9), sitt sezzjonijiet inqatgħu (4 μm ħxuna). Il-pjastri kollha ġew deparaffinizzati fi xylene, deidratati f'95 fil-mija etanol, maħsula fl-ilma tal-vit, u mgħollija għall-irkupru tal-epitopi f'TBE dilwit 10x (ċiklu tat-togħlija wieħed). Wara li tkessaħ, slide waħda għal kull anti-korp ittestjat ġiet maħżuna f'saline buffered phosphate (PBS). Is-slajds li kien fadal reġgħu ġew mgħollija. Dan iċ-ċiklu ġie ripetut ħames darbiet. Il-pjastri kollha ġew sussegwentement maħsula f'soluzzjoni ta 'hydrogen peroxidase ta' 3 fil-mija u segwiti minn tlaħliħ fil-PBS. Antikorpi primarji (Tabella Supplimentari 1) ġew inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Wara l-inkubazzjoni, il-pjastri ġew maħsula fil-PBS. Slajds mtebbgħin b'antikorpi anti-CD68, Tibet, u GATA3 kienu jeħtieġu inkubazzjoni addizzjonali b'imblukkar ta' wara l-antikorpi (PAB) għal 15-il minuta (imblukkar tal-VWRKDPVB, Immunologic, l-Olanda). Wara l-inkubazzjoni, il-pjastri ġew maħsula f'PBS u inkubati b'antikorp sekondarju konjugat bl-HRP (wara PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, L-Olanda, għal oħrajn, ara Tabella Supplimentari tal-antikorp sekondarju 1). Il-viżwalizzazzjoni saret bl-użu ta '3,3′- diaminobenzidine (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, l-Olanda). Ir-riżultati huma viżwalizzati f'Fig. 1 Supplimentari. Ibbażat fuq dawn ir-riżultati, iddeterminajna l-aħjar ordni ta 'antikorpi għall-esperimenti mTSA, kif elenkat fit-Tabella Supplimentari 1.

Jekk epitopi ta 'interess huma ko-lokalizzati, id-depożiti ta' tyramide jistgħu jinterferixxu ma 'xulxin. Biex nittestjaw għal din l-inibizzjoni sterika, użajna slides tat-tessut tal-kontroll tat-tunsilli u mtebbgħin dawn bil-pannelli mTSA tagħna. L-espressjoni tal-antikorpi fl-mTSA ġiet imqabbla ma 'dik fi slides b'tebba waħda, li għaddew mill-istess numru ta' ċikli ta 'togħlija. Aħna ma osservajnax differenzi fix-xejriet ta 'tbajja' bejn is-slajds imtebba' wieħed u multiplex (eżempji inklużi mill-pannell I, Figuri Supplimentari 2 u 3). L-antikorpi primarji kollha fl-mTSA intużaw fl-istess dilwizzjoni li ntużat għall-IHC kromoġeniku. L-intensità tas-sinjal fluworexxenti ġiet ottimizzata billi ġew aġġustati d-dilwizzjonijiet tas-soluzzjoni TSA.

Immaġini Multiplex TSA

L-immaġini multispettrali twettqet bl-użu ta’ Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, US) b’objettiv 20x, b’riżoluzzjoni ta’ 0.49 μm għal kull pixel, u bl-użu ta’ DAPI, FITC, CY3, Texas Red, u Kubi spettrali Cy5. Is-sistema Vectra tippermetti għażla manwali ta 'reġjuni għall-akkwist multispettrali, li sussegwentement huma maqsuma mis-sistema fi madum (Fig. 1.1). L-ispettri ta 'awto-fluworexxenza u l-fluorofori kollha Opal TSA ġew irreġistrati minn qabel f'"librerija" spettrali bl-użu tas-Software ta' Analiżi tal-Immaġini Avvanzata Inform 2.4.6. (Akoya Biosciences, l-Istati Uniti). Il-librerija spettrali ppermettiet id-dekompożizzjoni tal-madum multiplex f'madum wieħed multipli li jirrappreżenta l-kontribuzzjoni ta 'kull fluorophore ("unmixing"). Dan irriżulta fi madum mono-kromju, b'ħafna kanali, kull kanal jikkorrispondi għal fluorophore wieħed u għalhekk, antikorp (Fig. 1.2).

Konverżjoni għal IHC ta' kamp qawwi artifiċjali

Ibbażat fuq koordinati maħżuna, il-madum ġew meħjuta biex jinħoloq WSI b'ħafna kanali bl-użu ta 'script python personalizzat (Fig. 1.3). Il-kanali li jirrappreżentaw is-sinjal DAPI (IDAPI) u l-kanali li jirrappreżentaw wieħed mill-antikorpi (IIHC) ġew ikkonvertiti għal ematossilin artifiċjali u tbajja' DAB, rispettivament (Figuri 1.4 u 1.5). Ibbażat fuq ematossilin kromatiku magħruf u DAB Cx, koordinati Cy wara t-trasformazzjoni tad-densità tas-saturazzjoni tal-lewn (HSD), il-vettori tat-tebgħa ġew akkwistati fi studji preċedenti [26, 27]. Dawn il-vettori tat-tbajja' ntużaw biex jikkalkulaw il-valuri aħmar-aħdar-blu għall-IHC ta' kamp qawwi artifiċjali (Fig. 1.5), kif:

ma CR, st l-assorbiment tad-dawl ta ' dye st fil-parti ħamra ta ' l-ispettru. Il-valuri għal B u G ġew ikkalkulati b'mod simili.

Analiżi tal-immaġni

Reġjuni ta' interess (ROIs)

Reġjuni ta 'interess (ROIs) ġew annotati għal kull każ fil-koorti bl-użu tas-softwer tal-pjattaforma awtomatizzata ta' analiżi slide (ASAP; verżjoni 1.9, disponibbli bħala softwer open-source fuq GitHub). Dawn ir-ROIs kienu magħmula minn tubulointerstitium kortikali, u b'hekk jeskludu l-kapsula, il-glomeruli, u l-arterji. Peress li l-infjammazzjoni fir-reġjuni subkapsulari renali hija kkunsidrata mhux speċifika fil-patoloġija tat-trapjant, il-bijopsiji f'dan l-istudju ġew analizzati primarjament eskluż ir-reġjun subkapsulari (definit bħala 400 µm taħt il-kapsula). Sekondarjament, irripejna l-analiżi inkluż ir-reġjun subkapsulari. Eżempji viżwali tar-ROIs huma inklużi fil-Fig. 4 Supplimentari.

Sejbien tal-limfoċiti CNN I

L-immaġini artifiċjali tal-IHC brightfield li jirrappreżentaw CD3, CD4, CD8, u CD20 tbajja ġew analizzati bl-użu ta 'CNN eżistenti b'arkitettura U-Net [22, 28]. Dan in-netwerk kien iddisinjat speċifikament għall-iskoperta ta 'markaturi limfoċiti ċitoplasmatiċi fl-IHC. Il-prestazzjoni tas-CNN tista' tiġi espressa fi preċiżjoni, recall, u punteġġ F1-, fejn:

Is-CNN kiseb preċiżjoni ta' {{0}}.76, recall ta' 0.79, u F1-score ta' 0.78 fuq is-sett tat-test li ntuża fil-karta oriġinali, li tinkludi IHC WSI tradizzjonali. L-iskoperta ta 'ċelluli pożittivi individwali teħtieġ threshold tal-output tas-CNN, segwit minn postproċessar. Minħabba li t-tbajja 'CD3 fil-panel mTSA kienet aktar b'saħħitha meta mqabbla ma' CD4, CD8, u CD20, intuża limitu ta 'skoperta ta' oġġett aktar baxx għal dawn l-aħħar tlieta (0.4) u l-limitu ta 'skoperta ta' oġġett oriġinali għal CD3 (0.7). Biex tiġi evalwata l-prestazzjoni tas-CNN fuq il-WSIs tal-IHC tal-kamp qawwi artifiċjali f'dan l-istudju, intużaw erba' WSI tal-IHC tal-kamp qawwi artifiċjali (CD8 u CD20 minn żewġ pazjenti) bħala sett tat-test f'dan l-istudju. L-annotazzjonijiet b'punti (n=1115) ġew iġġenerati bl-użu ta' softwer ASAP. Wara l-applikazzjoni tan-netwerk, il-preċiżjoni, ir-recall, u l-punteġġ F1- ġew ikkalkulati biex tiġi vvalutata l-prestazzjoni tas-CNN. Is-sejbiet kienu kkunsidrati bħala pożittivi tassew jekk instabu sa 4 µm (dijametru medju tal-limfoċiti) minn annotazzjoni tal-verità tal-art. Meta nstabu żewġ skoperti f'medda ta' 4 µm, l-iskoperta li kienet l-eqreb għall-annotazzjoni biss tqieset tassew pożittiva. Sussegwentement, is-sejbien tal-limfoċiti CNN I intuża għall-analiżi tal-IHC WSI artifiċjali kollha li jirrapreżentaw il-markaturi tal-limfoċiti ċitoplasmatiċi (CD3, CD4, CD8, u CD20).

Sejbien tal-limfoċiti CNN II

L-analiżi ta 'artificial brightfield IHC WSI ma' mudelli ta 'tbajja' nukleari (kif ippreżentat minn T-bet u GATA3) kanali li jirrappreżentaw DAPI u CD4 ġew magħżula biex jiġu kkombinati f'WSI wieħed (4). Vettori tat-tebgħa miksuba fi studji preċedenti ntużaw biex ikkulurit artifiċjalment is-sinjal DAPI blu (hematoxylin) u s-sinjal CD4 kannella (DAB), li rriżulta f'IHC WSI artifiċjali ta' kamp qawwi (5).

taħriġ meħtieġ, validazzjoni, u ttestjar ta 'CNN ġdid. Għal dan il-għan, inqatgħu disa 'slajds minn tessut ta' kontroll tal-kliewi, tat-tunsilli u tal-appendiċi FFPE. Dawn il-pjastri kienu mtebbgħin bl-IHC b'anti-Tibet (klonu 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, US) u anti-GATA3 (klonu L50-823, CM -405B, Biocare Medical, l-Olanda) antikorpi. Is-slajds ġew diġitizzati bl-użu ta' Pannoramic 250 Flash II slide scanner diġitali b'riżoluzzjoni ta' 0.12 μm/pixel. Żewġ osservaturi pproduċew 5726 dot annotation f'reġjuni differenti bl-użu tas-softwer ASAP. Annotazzjonijiet minn ħames slides intużaw għat-taħriġ ta 'arkitettura U-Net CNN bl-użu ta' garża ta '256 × 256 pixels b'daqs ta' pixel ta '0.49 μm / pixel. Żewġ WSI intużaw għall-validazzjoni tas-CNN u għad-determinazzjoni tal-limitu ta 'skoperta tal-oġġett (0.4). Il-prestazzjoni tas-CNN fuq l-IHC WSI tradizzjonali ġiet evalwata fuq sett ta' test miżmuma ta' żewġ IHC WSI. Il-prestazzjoni tas-CNN fuq IHC WSI artificial brightfield ġiet evalwata fuq sett tat-test sekondarju magħmul minn erba' IHC WSI artifiċjali brightfield (Tibet u GATA3 minn żewġ pazjenti) b'1082 dot annotations. Preċiżjoni, recall, u F1-score ġew ikkalkulati biex tiġi vvalutata l-prestazzjoni fuq iż-żewġ settijiet tat-test. L-iskoperti kienu kkunsidrati bħala pożittivi tassew jekk instabu f'4 µm minn annotazzjoni tal-verità tal-art. Meta nstabu żewġ skoperti f'medda ta' 4 µm, l-iskoperta li kienet l-eqreb għall-annotazzjoni biss tqieset tassew pożittiva. Sussegwentement, is-sejbien tal-limfoċiti CNN II intuża għall-analiżi tal-WSIs IHC ta' kamp qawwi artifiċjali kollha li jirrappreżentaw markaturi nukleari (limfoċiti) (Tibet u GATA3).

Sejbien tal-makrofagi CNN

B'kuntrast mal-kxif tal-limfoċiti, l-identifikazzjoni tal-makrofaġi individwali mhijiex inekwivokabbli. Speċjalment f'xeni raggruppati, jista' jkun mistenni livell sinifikanti ta' varjabilità ta' osservatur. Għalhekk, numru ferm akbar ta 'każijiet u annotazzjonijiet umani ntużaw biex iħarreġ CNN dedikat, it-tielet għall-iskoperta ta' CD68 plus u CD163 plus makrofaġi. Inġabru slides imtebbgħin bl-IHC (n=111) minn tessut tal-kliewi nattiv u tat-trapjant. Tbajja’ IHC saru bl-użu ta’ anti-CD68 (klonu PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, id-Danimarka jew klonu KP1, M0876, Dako, id-Danimarka) jew anti-CD163 (klonu MRQ -26, jew 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antikorp. Is-slajds tal-IHC ġew diġitizzati permezz ta' skaner panoramiku ta' slide diġitali ta' 250 Flash II jew Aperio AT2 Slide Scanner (Leica Biosystems, Wetzlar, il-Ġermanja) b'riżoluzzjoni ta' 0.24 jew 0 .25 μm/pixel, rispettivament. Erba 'osservaturi pproduċew 37,709 annotazzjoni dot fuq ROIs multipli fil-WSIs, bl-użu ta' protokoll għall-annotazzjoni tal-makrofagi, li kien miftiehem wara esperimenti pilota inizjali. L-annotazzjonijiet minn 101 slides intużaw għat-taħriġ ta 'arkitettura YoloV2 CNN [29]. Yolo huwa adattat b'mod speċifiku għal kompiti mmirati lejn kompiti ta 'skoperta. In-netwerk, li jikkonsisti f'seba' saffi konvoluzzjonali, ġie mħarreġ fuq irqajja ta '256 × 256 pixel estratti b'riżoluzzjoni ta' 0.98 μm / pixel b'kaxxi tal-konvoluzzjoni ta '21 μm (ibbażat fuq id-daqs medju tal-makrofagi). Għaxar WSI intużaw għall-validazzjoni tas-CNN u għad-determinazzjoni tal-limitu ta 'skoperta tal-oġġett (0.45) u parametri ta' soppressjoni mhux massimi (0.05). Il-prestazzjoni tas-CNN fuq l-IHC WSI tradizzjonali ġiet evalwata fuq sett ta' test miżmuma ta' għaxar IHC WSI. Il-prestazzjoni tas-CNN fuq IHC WSI artificial brightfield ġiet evalwata fuq sett tat-test sekondarju magħmul minn erba' IHC WSI artifiċjali brightfield (CD68 u CD163 minn żewġ pazjenti) b'1033 dot annotazzjonijiet. Preċiżjoni, recall, u punteġġi F1 ġew ikkalkulati biex tiġi vvalutata l-prestazzjoni fuq iż-żewġ settijiet tat-test. L-iskoperti kienu kkunsidrati bħala pożittivi tassew jekk instabu fi ħdan 21 µm (dijametru medju tal-makrofagi) minn annotazzjoni tal-verità tal-art. Meta nstabu aktar skoperti f'medda ta' 21µm, l-iskoperta li kienet l-eqreb għall-annotazzjoni biss tqieset bħala pożittiva vera. Sussegwentement, is-CNN tas-sejbien tal-makrofagi intuża għall-analiżi tal-WSI artifiċjali tal-IHC brightfield kollha li jirrappreżentaw markaturi tal-makrofagi (CD68 u CD163).

cistanche tubolosa testosterone

Pożittività doppja

Il-pożittività taċ-ċelloli għal żewġ markaturi (pożittività doppja) ġiet evalwata billi ġie ddeterminat in-numru ta 'pixels bejn is-sejbien taċ-ċelluli fil-kanali differenti. Jekk id-distanza bejn żewġ sejbiet limfoċiti kienet<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

In-numri taċ-ċelluli ġew ikkalkulati ġewwa r-ROIs, u d-densitajiet taċ-ċelluli kienu bbażati fuq l-għadd taċ-ċelluli u ż-żona tar-ROI annotata.

Relazzjonijiet spazjali

L-iskoperta awtomatizzata taċ-ċelloli fil-WSI tippermetti l-investigazzjoni tar-relazzjonijiet spazjali bejn iċ-ċelloli. L-iqsar distanza medja ġiet determinata (f'reġjuni li jeskludu r-reġjun subkapsulari) għal ċelloli CD68 plus u CD3 plus , CD3 plus CD8 plus , u CD20 plus ċelluli fil-WSI tal-panel I għaż-żewġ gruppi ta 'pazjenti, u bejn CD163 plus ċelluli u CD4 plus , CD4 plus Tbet plus , u CD4 plus GATA3 plus fil-WSI għaż-żewġ gruppi ta' pazjenti.

Estensjoni kapillari peritubulari

Sabiex tiġi vvalutata l-firxa kapillari peritubulari, WSIs mhux imħallta li jirrappreżentaw il-kanal CD34 ġew analizzati fil-Fiġi (ImageJ verżjoni 2.0.0, US, macros u plugins: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pixels pożittivi ġew determinati permezz ta 'thresholding awtomatiku u sussegwentement espressi bħala l-perċentwal tan-numru totali ta' pixels ġewwa r-ROI.

Analiżi statistika

Id-densitajiet tal-popolazzjonijiet taċ-ċelluli li ġejjin ġew ikkalkulati fil-bijopsiji ta’ 6 ġimgħat: limfoċiti T (CD3 plus ), limfoċiti T ċitotossiċi (CD3 plus CD8 plus ), limfoċiti B (CD20 plus ), makrofaġi (CD68 plus , pannelli I u II), makrofaġi polarizzati (CD68 plus CD163 plus , CD163 plus ), limfoċiti T-helper 1 (CD4 plus Tbet plus ), u limfoċiti T-helper 2 (CD4 plus GATA3 plus ). Il-koeffiċjenti ta’ korrelazzjoni ta’ Spearman ġew ikkalkulati biex jevalwaw jekk kienx hemm korrelazzjoni bejn id-densità tal-limfoċiti T-helper 1 u T-helper 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) u d-densità tal-makrofagi polarizzati (jew CD68 plus CD163 plus jew CD163 plus). Osservajna sinjal CD68 (fluorophore 540 nm) fil-CD4 artifiċjali (fluorophore 520 nm) IHCs ta 'pannell I. Għalhekk, aħna wkoll nirrappurtaw id-densitajiet taċ-ċelluli għal CD3 flimkien ma' ċelluli CD8-. Biex nevalwaw id-differenzi bejn il-gruppi ta 'pazjenti b'riżultati IFTA differenti, aħna nirrapportaw valuri medjani, minimi u massimi tad-densità taċ-ċelluli għal kull grupp. Differenzi sinifikanti fid-densità taċ-ċelluli u l-estent kapillari peritubulari (definiti bħala l-perċentwali tal-pixel pożittiv CD34-) bejn il-gruppi ġew evalwati bl-użu tat-test U ta 'Mann-Whitney għal kampjuni indipendenti. Jekk pazjenti b'riżultati IFTA differenti jurux CD3 flimkien ma' CD8-/CD3 flimkien ma' CD8 flimkien ma' proporzjonijiet ta' ċelluli differenti b'mod sinifikanti, ġie evalwat bl-użu ta' t-test għal kampjuni indipendenti. Id-differenzi bejn il-gruppi ta' pazjenti fir-relazzjonijiet spazjali ta' ċelluli CD68 plus u CD163 plus ma' ċelluli immuni oħra ġew ivvalutati għas-sinifikat bl-użu tat-test U ta' Mann–Whitney għal kampjuni indipendenti.

Riżultati

Sejbien ibbażat fuq CNN ta 'ċelluli pożittivi IHC

Sabiex jiġu applikati CNNs eżistenti, li oriġinarjament kienu żviluppati għall-mikroskopija brightfield, immaġini ta 'fluworexxenza mTSA ġew trasformati għal stampi artifiċjali brightfield. Eżempji ta' reġjuni mtebbgħin b'mTSA bl-immaġini IHC artifiċjali korrispondenti tagħhom huma inklużi fil-Fig. 2. Eżempju ta 'IHC WSI artifiċjali b'kamp qawwi jintwera fil-Fig. 4 Supplimentari. softwer bħal ASAP u Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kif viżwalizzat fil-Fig. 2, l-artificial brightfield IHC WSI kien adattat għal analiżi awtomatizzata minn CNNs li kienu oriġinarjament żviluppati għal tradizzjonali IHC WSI.

Tliet CNNs intużaw għall-valutazzjoni kwantitattiva ta 'ċelluli infjammatorji fil-bijopsiji ta' trapjant imtebbgħin bl-mTSA ta '6 ġimgħat: għal sejbien ta' limfoċiti bi tbajja 'ċitoplasmika (CNN I) u nukleari (CNN II) IHC u għal sejbien ta' makrofagi. Tabella 2 turi l-prestazzjoni tas-CNN (preċiżjoni, recall, u punteġġi F1-) għal settijiet ta' hold-out kemm ta' WSIs IHC mtebbgħin bid-DAB kif ukoll WSIs IHC ta' kamp qawwi artifiċjali. Il-prestazzjoni tas-CNN kienet tipikament tajba daqs, jew aħjar mil-linja bażi tas-CNN deskritta qabel (b'punteġġ F1-ta' 0.78), li ntwera li kellu prestazzjoni komparabbli ma' osservaturi manwali b'esperjenza [22] . Filwaqt li l-iskoperta tal-limfoċiti CNN II wera prestazzjoni kemmxejn mnaqqsa fuq immaġini virtwali ta 'kamp qawwi meta mqabbla mal-immaġni DAB reali (li fuqhom is-CNN kien imħarreġ), l-oppost kien osservat għas-CNN għall-iskoperta tal-makrofagi.

Eżempju ta' valutazzjoni awtomatika ta' pożittività doppja b'suċċess huwa inkluż fil-Fig. 3.

Korrelazzjoni ta 'tipi ta' ċelluli differenti

L-aktar korrelazzjoni b'saħħitha kienet osservata bejn CD4 flimkien ma' GATA3 flimkien mad-densità taċ-ċelluli u CD163 flimkien mad-densità taċ-ċelluli (il-koeffiċjent ta' Spearman 0.75, p < 0.001)="" fil-="" 6="" ġimgħat="" bijopsija="" (fig.="" 5a="" supplimentari).="" din="" il-korrelazzjoni="" kienet="" aktar="" dgħajfa="" bejn="" cd4="" flimkien="" ma'="" tbet="" flimkien="" mad-densità="" taċ-ċelluli="" u="" cd163="" flimkien="" mad-densità="" taċ-ċelluli="" (il-koeffiċjent="" ta'="" spearman="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (figura="" supplimentari="" 5b)="" .="" meta="" llimitat="" il-popolazzjoni="" taċ-ċelluli="" għal="" makrofaġi="" doppju="" pożittiv="" (cd68="" plus="" cd163="" plus),="" il-koeffiċjent="" ta'="" korrelazzjoni="" ta'="" spearman="" kien="" 0.65="" (p=""><0.01) ma'="" cd4="" flimkien="" ma'="" gata3="" plus="" ċelluli="" u="" 0.66="" (p=""><0.01) ma'="" cd4="" flimkien="" ma="" 'ċelluli="" tbet="" flimkien="" (figura="" supplimentari="" 5c,="" d).="" l-inklużjoni="" tar-reġjun="" subkapsulari="" fl-analiżi="" ma="" bidlitx="">

Tqabbil ta 'infiltrati inflammatorji bejnpazjenti li qed jagħmlu progress għal IFTA versus mhux IFTA

Pazjenti li għamlu progress għal IFTA wara 6 xhur urew densitajiet ta' CD163 flimkien ma' ċelluli b'mod sinifikanti ogħla fil-bijopsiji meħuda 6 ġimgħat wara t-trapjant (medjan ta' 505 ċelluli/mm2) kontra pazjenti li ma għamlux progress għal IFTA (medjan ta' 370 ċelluli/mm2; p=0 .043) (Tabella 3). L-inklużjoni tar-reġjun subkapsulari rriżultat fi tnaqqis żgħir ta 'dan l-effett (p=0.051). CD68 u CD4 intużaw fiż-żewġ pannelli. Slajds mtebbgħin bil-pannell mTSA I wrew aktar pożittività CD68 mill-pjastri mtebbgħin bil-pannell mTSA II. Id-densità taċ-ċelluli CD4 hija ogħla f'mTSA panel II meta mqabbla mal-mTSA panel I (Tabella 3).

Il-firxa kapillari peritubulari kienet simili f'bijopsiji ta' 6 ġimgħat ta' pazjenti DGF b'riżultati IFTA differenti (Tabella 3), kemm meta eskluż (p=0.74) kif ukoll inkluż (p=0}.90) ir-reġjun subkapsulari minn/fl-analiżi.

Il-valutazzjoni tal-proporzjonijiet ta’ CD3 flimkien ma’ CD8−/CD3 flimkien ma’ CD8 flimkien ma’ ċelluli wriet proporzjon sinifikament ogħla f’pazjenti b’<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

L-iqsar distanza medja minn ċelluli CD68 plus għal CD3 plus , CD3 plus CD8 plus , u CD20 plus ċelluli (pannell I) u minn CD163 plus ċelluli għal CD4 plus , CD4 plus Tbet plus , u CD4 plus GATA3 plus cells (pannell II) għamlet ma jvarjax b'mod sinifikanti bejn il-gruppi ta' pazjenti. Ir-riżultati huma viżwalizzati fil-Fig. 4.

Estratt ta 'cistanche: ittejjeb il-funzjoni tal-kliewi u s-saħħa fiżika

Diskussjoni

F'dan l-istudju, żviluppajna metodu għall-kwantifikazzjoni preċiża u oġġettiva ta 'infiltrati taċ-ċelluli infjammatorji f'bijopsiji tat-tilqim ta' pazjenti bi trapjant tal-kliewi b'DGF li jevita qtugħ serjali estensiv ta 'materjal tal-bijopsija tal-kliewi. Għal dan il-għan, għaqqadna IHC multiplex, amplifikazzjoni tas-sinjal tat-tyramide, immaġini multispettrali, u kwantifikazzjoni minn CNNs. Konna l-ewwel li kkonverti d-dejta multispettrali bil-madum għal immaġni kromoġenika artifiċjali waħda għal kull markatur taċ-ċellula, li ffaċilitaw l-analiżi WSI u l-applikazzjoni ta 'CNNs iddisinjati għal IHC ta' kamp qawwi. Iddisinna żewġ CNNs ġodda għall-iskoperta ta 'limfoċiti u makrofaġi mtebbgħin nukleari u wrejna l-ġeneralizzazzjoni tas-CNN żviluppati fuq IHC WSI tradizzjonali għal IHC WSI ta' kamp qawwi artifiċjali. L-applikabbiltà tal-metodu tagħna ntweriet bl-użu tar-riżultati kwantitattivi miksuba mis-CNNs biex jistudja korrelazzjonijiet tal-mikroambjent infjammatorju f'bijopsiji ta '6 ġimgħat ta' pazjenti DGF bl-iżvilupp ta 'IFTA 6 xhur wara t-trapjant.

Aħna użajna kit ta 'tbajja' manwali disponibbli kummerċjalment għal IHC multiplex biex Ħares ċelluli immuni u kapillari peritubulari f'bijopsiji ta' sorveljanza miksuba 6 ġimgħat wara t-trapjant. Il-proċedura tat-tbajja’ multiplex kienet tikkonsisti f’diversi stadji ta’ ħasil, inkubazzjoni u togħlija tat-tessuti u tinvolvi diversi soluzzjonijiet ta’ reaġenti. Validazzjonijiet estensivi ta' metodi u kontrolli ta' kwalità huma għalhekk ta' importanza kbira, u l-użu ta' antikorpi speċifiċi li jagħtu intensità ta' tbajja konsistenti huwa rakkomandat. Minkejja l-passi ta 'validazzjoni mwettqa, xejriet ta' tbajja bħal makrofaġi dehru fil-kanali CD4 ta 'slajds minn pannelli mTSA I u II. Iċ-ċikli tat-tbajja CD4 u CD68 ma sarux konsekuttivament, għalhekk dan il-fenomenu ma setax ikun ikkawżat minn tqaxxir mhux komplut tal-antikorp CD68 (Tabella Supplimentari 1). Għalkemm ġew deskritti okkorrenzi rari ta’ pożittività doppja tal-makrofagi ma’ CD4 [31], spjegazzjoni aktar plawżibbli tinsab fil-viċinanza tal-ispettri tal-emissjoni tal-fluorofori li ntużaw għall-viżwalizzazzjoni ta’ CD4 (520 nm) u CD68 (540 nm), it-tnejn koperti. mill-kubu tal-filtru FITC tal-mikroskopju tal-fluworexxenza. Dan jista 'jikkawża "fsada" tas-sinjal qawwi CD68 fil-kanal CD4. Ħafna minn dan is-sinjal kien eskluż mill-analiżi fil-panel I minħabba li ċelloli CD4 plus biss li kienu doppju pożittivi ma 'CD3 intużaw għall-analiżi ġenerali taċ-ċelluli T-helper. Madankollu, iddeċidejna li nevalwaw indirettament iċ-ċelluli T-helper ġenerali wkoll, billi nużaw CD3 plus CD8− bħala sostituzzjoni. Fil-pannell II, CD4 intuża biss flimkien ma 'Tibet u GATA3, li jillimita r-riskju għall-użu ta' sejbien ta 'pożittivi foloz.

Pożittività aktar baxxa ta 'CD68 ġiet osservata fil-pannell II meta mqabbla mal-pannell I. Aħna nipoteżi li dan huwa r-riżultat ta' inibizzjoni sterika minn depożitu ta 'tyramide li jappartjeni għal CD163 ("effett umbrella") [32]. Aħna osservajna b'mod sinifikanti aktar ċelluli CD163-pożittivi fil-koorti studjata milli fit-tessut tat-tunsilli li ntuża biex jiċċekkja l-inibizzjoni sterika, possibilment spjega għaliex dan l-effett ma ġiex skopert waqt il-validazzjoni.

Multiplex IHC ġie kkombinat ma 'immaġini multispettrali għall-eżami tal-mikroambjent tat-tumur f'diversi studji onkoloġija, u reċentement ukoll għall-analiżi tar-rifjut tal-allograft tal-kliewi [33-35]. Biex tiġi estratta l-kontribuzzjoni tal-markaturi kollha fl-mTSA slides, sezzjonijiet huma immaġini b'sistema Vectra jew mikroskopju ta 'fluworexxenza simili b'setup multispettrali. Wara li tirreġistra immaġni ġenerali b'ingrandiment baxx, is-sistema Vectra taqsam it-tessut f'madum u awtomatikament tiskennja l-madum b'mod multi-spettrali. Dan jirriżulta fi madum tal-immaġni bi spettri li jikkontribwixxu multipli. Minħabba li l-ispettri tal-fluorofori singoli huma magħrufa mil-"librerija" spettrali rreġistrata minn qabel, huwa possibbli li l-madum multiplex jiġi dekompost f'madum singolu multipli li jirrappreżenta l-kontribuzzjoni ta' kull fluorofor ("unmixing"). Fil-biċċa l-kbira tal-istudji, l-immaġini mhux imħallta huma sussegwentement analizzati b'softwer kummerċjali. F'ħafna każijiet, dawn il-programmi ma jappoġġjawx l-analiżi WSI, għandhom diffikultà janalizzaw ċelluli raggruppati, u ħafna drabi ma jkunux reżistenti għall-artifacts u l-varjazzjonijiet tat-tbajja '. Il-konverżjoni tal-madum mhux imħallat f'WSIs IHC ta' kamp qawwi artifiċjali, ippermettilna napplikaw CNN eżistenti ddisinjat speċifikament għall-iskoperta tal-limfoċiti fl-IHC [22] (imsejħa CNN I għall-iskoperta tal-limfoċiti). Dan in-netwerk jista 'jsib limfoċiti individwali u raggruppati bi preċiżjoni għolja filwaqt li jkun reżistenti għat-tbajja' fl-isfond (Fig. 2, CD3). Barra minn hekk, aħna mħarrġa żewġ CNNs ġodda għall-iskoperta ta 'ċelloli b'mudelli ta' tbajja nukleari (Tibet, GATA3) (skoperta ta 'limfoċiti CNN II) u għall-iskoperta ta' makrofaġi. Il-makrofagi huma notorjament diffiċli biex jinkixfu minħabba l-mudell tagħhom ta' tbajja' mxerrda. Is-CNN tal-kxif tal-makrofagi għalhekk ġie mħarreġ bl-użu tal-annotazzjonijiet ta 'erba' esperti differenti. Qabel ma saru l-annotazzjonijiet, ġew ippjanati laqgħat multipli fejn ġew diskussi u vvalutati l-kriterji għall-annotazzjoni tal-makrofaġi. Dan irriżulta f'netwerk li jista 'jsib makrofaġi b'mod riproduċibbli filwaqt li jkun robust għal tbajja' mhux speċifika (Tabella 2, Fig. 2, u Fig. 6 Supplimentari). Sa fejn nafu tagħna, dan huwa l-ewwel algoritmu għall-iskoperta tal-makrofagi f'sezzjonijiet istopatoloġiċi skennjati. Aħna ttestjajna l-prestazzjoni tat-tliet netwerks kollha fuq sett tat-test magħmul minn IHC WSI tradizzjonali (simili għal dawk użati waqt it-taħriġ) u fuq sett tat-test sekondarju li kien jikkonsisti f'IHC WSI ta' kamp qawwi artifiċjali, iġġenerat mill-immaġini rrekordjati b'mod spettrali multi. Is-CNNs kollha juru prestazzjoni tajba ħafna fuq is-settijiet tat-test primarji u punteġġi F1-simili fuq is-settijiet tat-test sekondarji. Il-metriċi tal-prestazzjoni tas-sejbien tal-limfoċiti CNN I ġew ikkalkulati fuq tessut normali, artifacts, u clusters ta 'ċelluli. L-IHC tal-kamp qawwi artifiċjali tat-tieni sett tat-test ma kien fih l-ebda artifacts fit-tessuti u inqas gruppi ta 'ċelluli. Dan jista 'jispjega l-prestazzjoni aħjar ġenerali ta' dan in-netwerk fuq it-tieni sett tat-test. Is-CNN għall-iskoperta tal-makrofagi ġie mħarreġ u ttestjat fuq annotazzjonijiet minn erba' annotaturi differenti. Filwaqt li l-kriterji ta' annotazzjoni ġew diskussi b'mod partikolari, xorta waħda ġew osservati varjazzjonijiet fl-istil ta' annotazzjoni. Is-sensittività tas-CNN hija għalhekk probabbilment x'imkien fin-nofs tal-estremi tal-istil tal-annotazzjoni. L-annotazzjonijiet għat-tieni sett tat-test ġew iġġenerati minn annotatur wieħed, li jidher li jaqbel mas-sensittività tas-CNN.

L-użu tas-CNN deskritt ippermettilna ninvestigaw l-infiltrat infjammatorju bi preċiżjoni bla preċedent f'serje unika ta' bijopsiji ta' sorveljanza bikrija magħżula b'mod rigoruż ta' pazjenti trapjantati b'DGF.

Sfortunatament, kampjuni multipli kellhom jiġu esklużi mill-analiżi, l-aktar minħabba tessut residwu insuffiċjenti wara xogħol dijanjostiku. Anke bid-daqs limitat tas-sett tad-dejta, sibna CD163 u densitajiet taċ-ċelluli b'mod sinifikanti ogħla f'bijopsiji ta 'pazjenti DGF li għamlu progress lejn l-iżvilupp ta' IFTA, li huwa konformi mar-rwol potenzjalment profibrotiku ta 'dawn iċ-ċelloli [11]. Filwaqt li t-tendenza osservata kienet konsistenti mad-dejta ppubblikata, ma stajniex nikkonfermaw l-effett detrimentali tal-preżenza bikrija ta 'CD68 flimkien mal-makrofaġi li kienu rrappurtati qabel għal gruppi oħra ta' pazjenti bi trapjant tal-kliewi [7, 36, 37]. Sibna korrelazzjoni pożittiva bejn id-densitajiet taċ-ċelluli CD4 plus GATA3 plus u CD163 plus ċelluli, li jistgħu jikkonfermaw il-kontribut tal-limfoċiti T-helper 2 lejn mikro-ambjent pro-fibrotiku. Filwaqt li f'dan l-istudju ma ġew skoperti l-ebda bijomarkaturi ta 'tbassir ġodda għall-iżvilupp ta' IFTA f'pazjenti DGF, żviluppajna b'suċċess metodi għall-valutazzjoni preċiża, riproduċibbli u skalabbli ta 'infiltrat infjammatorju f'tessut skars bħal bijopsiji ta' trapjant. Dawn il-metodi huma ta 'valur għal studji kwantitattivi futuri dwar l-infjammazzjoni fit-tessut istopatoloġiku.

Biex ittaffi l-għeja adrenali b'cistanche, ikklikkja hawn biex tikseb aktar dettalji

Disponibbiltà tad-dejta

Talbiet ta' kollaborazzjoni li jinvolvu l-użu ta' data ppreżentata f'dan l-istudju jistgħu jiġu indirizzati lill-awtur korrispondenti (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) jew FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Rikonoxximenti

Nirringrazzjaw lil Mark Gorris u Kiek Verrijp għall-pariri tagħhom dwar it-tbajja 'mTSA u l-immaġini, Merijn van Erp għall-iżvilupp ta' funzjonalità ImageJ personalizzata, u Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg, u Martijn Otten talli ġġeneraw il-verità tal-art għan-netwerk ta 'skoperta tal-makrofagi. Barra minn hekk, nirringrazzjaw lil Irina Scheffner għall-għajnuna tagħha fil-ġbir tad-dejta klinika.

Kontribuzzjonijiet tal-awturMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH, u JAWML

iddisinjat l-istudju. Il-materjal tal-pazjent u d-dejta klinika nġabru u ġew ipprovduti minn JS, WG, u FF. FF ikkoordina l-isforzi mwettqa fl-MHH. JHB, EJS, u JK skorjaw il-pjastra PAS għall-perċentwali IFTA. MH wettaq it-tbajja 'mTSA, validazzjonijiet ta' pannelli I u II, u l-immaġini u t-taħlit tal-pannell I. VV immaġni u panel mhux imħallat II. DJG żviluppa l-metodi għall-konverżjoni tal-madum ta 'mTSA għal WSI ta' kamp qawwi artifiċjali. MH wettaq il-konverżjonijiet. ZS-C żviluppa s-CNNs għall-iskoperta tal-limfoċiti u kiteb l-iskripts għall-kwantifikazzjonijiet tal-limfoċiti. JL żviluppa s-CNNs għall-iskoperta tal-makrofagi u kiteb l-iskripts għall-kwantifikazzjonijiet tal-makrofagi. MH wettaq il-kwantifikazzjonijiet taċ-ċelluli u kapillari. L-NSS ikkalkula d-distanzi taċ-ċelluli. MH, BS, LBH, u JAWML analizzaw id-dejta. MH għamel iċ-ċifri u abbozza l-karta. Il-verżjoni finali tal-manuskritt ġiet riveduta u approvata mill-awturi kollha.

FinanzjamentDin il-ħidma kienet appoġġata mill-inizjattiva ERACoSysMed (proġett SysMIFTA) bħala parti mill-Programm ta’ Qafas Orizzont 2020 tal-Unjoni Ewropea offrut minn ZonMw (għotja nru. 9003035004), b’kofinanzjament mill-Ministeru Ġermaniż tar-Riċerka u l-Edukazzjoni (BMBF), għotja Nru. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T), u FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML irċieva miżati ta' konsulenza mingħand Philips (l-Olanda), u għotjiet minn

ContextVision, Philips (l-Olanda), u Sectra (l-Iżvezja), barra mix-xogħol sottomess. JK irċieva appoġġ finanzjarju mill-Fondazzjoni Olandiża tal-Kliewi (proġett DEEPGRAFT, Għotja Nru 17OKG23).

Konformità ma' standards etiċi

Kunflitt ta' interessL-awturi ma jiddikjaraw l-ebda interessi li jikkompetu.

Approvazzjoni etika u kunsens għall-parteċipazzjoniIl-ġbir u l-analiżi tad-dejta saru b'kunsens infurmat tal-pazjent u bl-approvazzjoni tal-bord tal-etika (nru. 2765) tal-Iskola Medika ta 'Hannover.

Nota tal-PubblikaturSpringer Nature tibqa' newtrali fir-rigward ta' pretensjonijiet ġurisdizzjonali f'mapep ippubblikati u affiljazzjonijiet istituzzjonali.

Aċċess MiftuħDan l-artikolu huwa liċenzjat taħt Creative Commons Attribution 4.0 Liċenzja Internazzjonali, li tippermetti l-użu, il-qsim, l-adattament, id-distribuzzjoni, u r-riproduzzjoni fi kwalunkwe mezz jew format, sakemm tagħti kreditu xieraq lill-awtur(i) oriġinali ) u s-sors, ipprovdi link għal-liċenzja Creative Commons, u indika jekk sarux bidliet. L-immaġini jew materjal ieħor ta’ partijiet terzi f’dan l-artikolu huma inklużi fil-liċenzja Creative Commons tal-artikolu sakemm ma jkunx indikat mod ieħor f’linja ta’ kreditu għall-materjal. Jekk il-materjal mhuwiex inkluż fil-liċenzja Creative Commons tal-artikolu u l-użu intiż tiegħek mhuwiex permess minn regolament statutorju jew jaqbeż l-użu permess, ikollok bżonn tikseb permess direttament mid-detentur tad-drittijiet tal-awtur.

Referenzi

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Funzjoni tat-tilqim ittardjata fit-trapjant tal-kliewi. Am J Trapjant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Fatturi ta 'riskju ta' telf ta 'trapjant fit-tul f'riċevituri ta' trapjant renali b'disfunzjoni kronika ta 'allograft. Exp Clin Trapjant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Assoċjazzjoni bejn il-funzjoni mdewma tat-tilqim u l-allograft u s-sopravivenza tal-pazjent: reviżjoni sistematika u meta-analiżi. Nephrol Dial Trapjant. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Funzjoni mdewma tat-tilqim tal-kliewi: mill-mekkaniżmu għat-traduzzjoni. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Il-punteġġ tal-inflammazzjoni totali huwa superjuri għall-punteġġ attwali tal-inflammazzjoni ta' Banff fit-tbassir tar-riżultat u l-grad ta' disturb molekulari fl-allografts tal-kliewi. Am J Trapjant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MD. Tbassir ta 'tnaqqis sussegwenti fil-funzjoni allograft tal-kliewi minn bijopsiji ta' sorveljanza bikrija. Am J Trapjant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Ir-rwol tal-makrofaġi fl-iżvilupp tal-fibrożi tal-allograft renali tal-bniedem fl-ewwel sena wara t-trapjant. Am J Trapjant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Makrofaġi attivati ​​alternattivament fil-patoġenesi ta 'ħsara kronika ta' allograft tal-kliewi. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plastiċità tal-makrofagi u interazzjoni ma 'sottogruppi ta' limfoċiti: kanċer bħala paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Il-mikroambjenti tal-kliewi, u l-fenotipi tal-makrofagi jiddeterminaw il-progressjoni jew ir-riżoluzzjoni tal-infjammazzjoni renali u l-fibrożi. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Macrophages in organ transplantation. Fruntieri Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T helper 1, 2, u 17-il sottogruppi taċ-ċelluli f'pazjenti bi trapjant tal-kliewi b'funzjoni tat-tilqim ittardjata. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Punteġġ ta 'limfoċiti li jinfiltraw it-tumur: minn stima viżwali għal tagħlim bil-magni. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metodu bbażat fuq l-analiżi tal-immaġni għall-kwantifikazzjoni tal-parametri tal-indiċi tal-ħsara kronika tal-allograft. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Applikazzjoni ta 'algoritmi ta' l-ilma għas-segmentazzjoni ta 'nuklei raggruppati. Ċitometrija. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Rosin PL. Limitazzjoni ċirkolari effiċjenti. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992– 1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Stħarriġ dwar it-tagħlim fil-fond fl-analiżi tal-immaġni medika. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analiżi tal-immaġni u tagħlim tal-magni fil-patoloġija diġitali: sfidi u opportunitajiet. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Valutazzjoni dijanjostika ta 'algoritmi ta' tagħlim fil-fond għall-iskoperta ta 'metastasi tal-lymph node f'nisa b'kanċer tas-sider. ĠAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Valutazzjoni istopatoloġika bbażata fuq tagħlim profond tat-tessut tal-kliewi. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.