Markers ta 'Kwalità Ta' Cistanches Herba Ibbażat Fuq Relazzjoni Spettru-Effett Antiossidant

Astratt: Għan: Biex jiġi stabbilit metodu ta' riċerka għall-markaturi tal-kwalità (markaturi Q) ta'Cistanches Herba(CH) ibbażat fuq il-relazzjoni spettru-effett antiossidant, li tipprovdi bażi għall-istudju tas-sustanzi farmakoloġiċi tagħha u l-kontroll tal-kwalità. Metodi: Kromatografija likwida ta 'prestazzjoni ultra-għolja (UPLC) ġiet użata biex tistabbilixxi profili tal-marki tas-swaba' għal 10 lottijiet ta 'CH. Ġie stabbilit mudell ta 'ħsara ossidattiva taċ-ċelluli bl-użu ta' H2O2, u l-kapaċità antiossidant ta 'CH ġiet iddeterminata abbażi tal-konċentrazzjoni inibitorja nofs massima ta' speċi reattivi ta 'ossiġnu, kif ukoll il-livelli ta'Superoxidedismutaseukatalażikifindikaturi farmakoloġiċi. Ir-relazzjoni tal-ispettru-effett inbniet permezz tal-analiżi tal-komponenti prinċipali, l-analiżi tal-korrelazzjoni Pearson, u l-analiżi tar-rigressjoni parzjali tal-inqas kwadri. Il-komponenti attivikienu soġġetti għalvalidazzjoni farmakoloġika. 

Riżultati:Profili tal-marki tas-swaba 'għal CH ġew stabbiliti bl-użu ta' UPLC, u identifikaw 17-il qċaċet komuni. Ibbażat fuq l-analiżi tal-korrelazzjoni tal-effett tal-ispettru, intgħażlu disa 'komponenti. Ir-riżultati tal-validazzjoni farmakoloġika indikaw li l-aċidu ġeniposiku, 8-aċidu epiloganiku,echinacoside,acteoside, isoacteoside, utubuloside Aesibit attività antiossidanti b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni.

Konklużjoni: Dan l-istudju esplora Q-markers għal CH ibbażat fuq ir-relazzjoni tal-ispettru-effett, u pprovda informazzjoni ta 'referenza għall-pedament tas-sustanza farmakoloġika tiegħu u t-titjib tal-istandard tal-kwalità.

Kliem ewlieni:Cistanches Herba; Q-markatur;relazzjoni spettru-effett; antiossidant

Cistanche deserticola huwa iz-zokk imnixxef imlaħħam bi weraq bil-qoxra ta 'Cistanche deserticola YCMa jew Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, pjanta li tappartjeni għall-orbaceae tal-familja Cistanche deserticola. Huwa sħun fin-natura, ħelu u mielaħ fit-togħma; jirritorna lejn il-meridjani tal-kliewi u tal-musrana l-kbira; għandu l-effetti li jsostni l-yang tal-kliewi, li jimla l-essenza u d-demm, li jxarrab l-imsaren u l-lassattiv, u huwa mediċina importanti għat-tonifikazzjoni tal-kliewi u l-essenza mill-ġdid [2-3]. Il-kliewi jaħżnu l-essenza, u l-essenza u d-demm jiġu mill-istess sors. Jekk l-essenza u d-demm huma defiċjenti, se jaffettwaw l-attivitajiet tal-ħajja ġenerali tal-ġisem tal-bniedem; il-mudullun li jipproduċi l-essenza huwa maħżun fl-għadam, u l-moħħ huwa l-baħar tal-mudullun. Jekk l-essenza tal-kliewi ma tkunx biżżejjed, l-għadam jitlef in-nutriment tiegħu u l-moħħ ikun defiċjenti, li jirriżulta f'bidliet deġenerattivi tal-għadam bħal tessut maħlul, telf tas-snien, telf tal-memorja, dimenzja, u tnaqqis fil-funzjoni immuni [4-6]. Cistanche deserticola fih phenylethanoid glycosides, iridojdi, lignans u komponenti strutturali oħra, inklużi echinacoside, verbascoside, verbascoside, genipininic acid, u 8-epistryanic acid. , tubulin A, eċċ [7]. Il-kontroll tal-kwalità attwali ta 'Cistanche deserticola fl-edizzjoni 2020 tal-"Pharmacopoeia tar-Repubblika Popolari taċ-Ċina" jistipula biss il-kontenut ta' echinacoside u verbascoside, li ma jistgħux jirriflettu bis-sħiħ il-karatteristiċi ta 'azzjoni multi-komponent u multi-mira tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża. , li ma jwassalx għall-kontroll u l-evalwazzjoni tal-kwalità tiegħu.

Sabiex itejjeb il-livell ta 'kontroll tal-kwalità tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża u jottimizza l-evalwazzjoni tal-kwalità tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, l-Akkademiku Liu Changxiao ippropona l-kunċett ġdid ta' markatur ta 'kwalità (Q-marker) tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża [8]. Fosthom, "effettività" hija l-element ewlieni fil-"Ħames Prinċipji" ta 'Q-marker [9] u hija wkoll il-qalba tal-valutazzjoni tal-kwalità tal-mediċini tradizzjonali Ċiniżi.

Fid-dawl tal-istatus attwali tar-riċerka ta 'korrelazzjoni fqira bejn l-istandards ta' kwalità u l-effikaċja tad-droga, l-esplorazzjoni tal-markaturi Q tal-mediċini tradizzjonali Ċiniżi u l-istabbiliment ta 'standards ta' kwalità aktar xjentifiċi u raġonevoli hija ta 'sinifikat kbir għat-titjib tal-kwalità tal-mediċini tradizzjonali Ċiniżi. Ir-relazzjoni tal-ispettru-effett torbot il-qċaċet kromatografiċi tal-marki tas-swaba 'tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża ma' data farmakodinamika speċifika biex issib is-sustanzi effettivi tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, u b'hekk tirrifletti l-kwalità inerenti tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża [10]. L-istabbiliment ta 'mudell matematiku ta' effiċjenza spettrali jista 'jiċċara l-QMarker tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża minn perspettiva ta' "vista olistika", li jipprovdi aktar referenza għal kontroll tal-kwalità aktar tard tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, formulazzjoni ta 'standards ta' kwalità, u screening ta 'ingredjenti attivi. Dan l-istudju juża marki tas-swaba 'kombinati mar-rata ta' nofs inibizzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS IC50), il-kontenut ta 'superoxide dismutase (SOD) u catalase (CAT) biex jistudja r-relazzjoni tal-ispettru-effett tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża, u juża analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) ), analiżi ta 'korrelazzjoni Pearson (PCC) u analiżi ta' rigressjoni parzjali tal-inqas kwadri (PLS) biex tanalizza b'mod komprensiv il-markatur Q ta 'Cistanche deserticola biex tipprovdi bażi għall-kontroll tal-kwalità tagħha.

1 materjal

1.1 Kampjun

Cistanche deserticola inħasad mill-Kontea ta 'Yutian, Xinjiang, u l-bażi tat-tħawwil ta' Prattika Agrikola Tajba (GAP) ta 'Cistanche deserticola fil-Mongolja ta' ġewwa. Ġie identifikat mir-riċerkatur Zhang Tiejun ta 'Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. bħala Cistanche tubulosa (Schenk) Wight u Cistanche deserticola.

YC Ma, informazzjoni dettaljata tidher fit-Tabella 1.

1.2 Ittestja l-mediċina

Echinaceaside (numru tal-lott: 111670-201907, purità: 91.8%) u verbascoside (numru tal-lott: 111530-201914, purità: 95.2%) it-tnejn inxtraw miċ-Ċina Istitut tal-Kontroll tal-Ikel u d-Droga; isorescoside (numru tal-lott: 61303-13 -7), salidroside (numru tal-lott: 10338-51-9), 8-aċidu epistrychnoic (numru tal-lott: 82509-41-9), aċidu ġenipiniku (numru tal-lott: Z24A10X95926) , tuberose B (Numru tal-lott: 112516-04-08), 2-acetyl eugenol glycoside (Numru tal-lott: 94492-24-7) inxtraw minn Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., purità Akbar minn jew ugwali għal 98%; Cistanche glycoside A (Numru tal-lott: MUST -20062806, purità: 98.51%), floridin A (numru tal-lott: MUST19110102, purità: 98.57%) inxtraw minn Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd.; acetonitrile kromatografikament pur u aċidu formiku nxtraw minn Tianjin Concord Technology Co., Ltd. Ilma Purifikat (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamina E (VE, V8010, Beijing Solarbio Company); dimethyl sulfoxide (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company tal-Istati Uniti); CellTiter 96® AQueous kit ta 'skoperta ta' proliferazzjoni ta 'ċelluli b'soluzzjoni waħda (G3580, Promega Company ta' l-Istati Uniti); Sejbien tal-CAT Il-kit (S0051), il-kit ta 'detezzjoni tal-attività SOD (S0101M), u l-kit ta' skoperta ROS (S0033S) inxtraw minn Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Strumenti

Ilmijiet H-class-PDA kromatografu likwidu ta 'prestazzjoni ultra-għolja (Waters Company, USA); Bilanċ elettroniku Sartorius BT25S (Sartorius Company, il-Ġermanja); Ċentrifuga tad-desktop ta 'veloċità għolja H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.); SpectraMax M5

Microplate reader (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.); Mikroskopju bijoloġiku WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1.4 ċelluli

Ċelluli tal-kliewi embrijoniċi tal-bniedem Ċelloli HEK 293 intużaw f'dan l-esperiment u nxtraw mill-bank taċ-ċelluli tal-Akkademja tax-Xjenzi Ċiniża.

2 metodi

2.1 Stabbiliment ta' mappa tal-marki tas-swaba'

2.1.1 Preparazzjoni tas-soluzzjoni tat-test: Iżen 2 g ta' materjal mediċinali Cistanche deserticola, żid 10 darba l-ammont ta' ilma, saħħan u rifluss 3 darbiet, 1 siegħa kull darba, ċentrifuga f'1.0 ×105r·min-1 għal 15-il minuta (ir-raġġ ċentrifugali huwa ta' 300 mm), Għaqqad is-supernatanti u kkonċentra biex tagħmel soluzzjoni stokk b'konċentrazzjoni tal-massa ta' 100 mg·mL-1, iddilwaha 10 darbiet, u ffiltraha minn membrana ta’ filtru mikroporuża ta’ 0.22 µm biex tiksebha.

2.1.2 Preparazzjoni ta' soluzzjoni ta' referenza mħallta

Ħu 8-epistrrychnic acid, salidroside, echinaceaside, cistanche glycoside A, genipininic acid, verbascoside, anthocyanoside A, isorbascoside, u 2'-acetyl eugenol. Sustanzi ta' referenza ta' glycoside u angioside B ġew imkejla f'ammonti xierqa u miżuna b'mod preċiż. Żid 50% soluzzjoni ta' metanol biex tħoll u pprepara soluzzjoni ta' sustanza ta' referenza mħallta b'konċentrazzjoni tal-massa ta' 20 µg·mL–1.

2.1.3 Kundizzjonijiet kromatografiċi

Kolonna ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.7 µm); fażi mobbli hija acetonitrile (A) ~ 0.1% soluzzjoni ta 'aċidu formiku (B), programm ta' elużjoni gradjent (0 ~ 6 min, 5% ~ 8% A; 6 ~ 10 min, 8% ~ 15%A 10 ~ 13 min, 15% ~ 19% A, 13 ~ 20 min, 19% ~ 25% A); wavelength ta 'skoperta huwa 237 nm; ir-rata tal-fluss hija 0.4 mL·min –1; it-temperatura tal-kolonna hija 40 grad; volum ta' injezzjoni huwa 3 µL.

2.1.4 Għażla tal-quċċata ta' referenza

Fil-kromatogramma tal-kromatografija likwida ultra-prestazzjoni (UPLC) ta 'Cistanche deserticola, il-quċċata bl-akbar proporzjon taż-żona tal-quċċata, ħin ta' żamma moderat, u separazzjoni tajba ġiet magħżula bħala l-quċċata ta 'referenza tal-ispettru tal-marki tas-swaba'. 2.1.5 Investigazzjoni metodoloġika Test ta' preċiżjoni: Ħu l-kampjun T1 u pprepara s-soluzzjoni tat-test skond il-metodu taħt 2.1.1. Injetta l-kampjun 6 darbiet kontinwament u rrekordja l-marki tas-swaba. Ir-riżultati juru li l-erja tal-quċċata relattiva RSD ta' kull quċċata hija 0.10%~4.61%. , l-RSD tal-ħin ta 'żamma relattiv huwa 0.08% ~ 1.32%, li jindika li l-istrument għandu preċiżjoni tajba.

Test tar-ripetibbiltà: Ħu l-kampjun T1 u ipprepara 6 kampjuni tas-soluzzjoni tat-test b'mod parallel skont il-metodu taħt 2.1.1, u injetta l-kampjun kontinwament. Ir-riżultati juru li l-erja tal-quċċata relattiva RSD ta 'kull quċċata kromatografika hija 1.35% ~ 4.8 0%, u l-ħin relattiv ta' żamma RSD huwa 0.10% ~ 1.80%, li jissodisfa r-rekwiżiti tal-marki tas-swaba 'u juri li r-ripetibbiltà tal-istrument huwa tajjeb.

Test ta 'l-istabbiltà: Ħu l-kampjun T1 u ħejji s-soluzzjoni tat-test skond il-metodu taħt 2.1.1, injetta kampjuni għall-ittestjar f'0, 2, 4, 8, u 12-il siegħa, u rreġistra l-marki tas-swaba'. L-RSD ikkalkulat taż-żona tal-quċċata relattiva ta 'kull quċċata kromatografika hija 0.53% ~ 4.82%, u l-RSD tal-ħin ta' żamma relattiv hija 0.09% ~ 2.17%, li tissodisfa r-rekwiżiti tal-marki tas-swaba' u jindika li l-prodott tat-test huwa stabbli fi żmien 12-il siegħa.

2.2 Riċerka dwar l-effett antiossidant ta 'Cistanche deserticola

2.2.1 Preparazzjoni ta' likur omm Cistanche deserticola:Ħu l-likur omm taħt il-punt 2.1.1, iffiltra u sterilizza, u ħallat b'mezz ta' kultura sal-konċentrazzjoni meħtieġa qabel l-użu.

2.2.2 Effetti ta' Cistanche deserticola u VE ta' kontroll pożittiv fuq il-vijabbiltà taċ-ċelloli HEK 293

Twaqqaf il-grupp normali (sospensjoni taċ-ċelluli), grupp ta' amministrazzjoni ta' Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), grupp VE (20, 40, 60, 80, 100 µmol·L–1), kull Set 6 bjar duplikati f'kull konċentrazzjoni u kultura għal 24 siegħa. Żid 20 µL ta' reaġent ta' soluzzjoni waħda CellTiter 96® AQueous ma' kull bir biex tiskopri l-vijabbiltà taċ-ċelluli. Kompli kkultura għal sagħtejn. Uża microplate reader biex tiskopri l-valur ta' l-assorbenza (OD) ta' kull bir f'490 nm. Ikkalkula r-rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli skont il-formula (1). Rata ta' sopravivenza (%)=(grupp sperimentali OD/grupp vojt OD) × 100% (1)

2.2.3 Effett ta 'Cistanche deserticola fuq ROS indott minn H2O2 fiċ-ċelloli HEK 293

Iċ-ċelloli ġew maqsuma fi grupp normali (sospensjoni taċ-ċelluli) u grupp ta 'amministrazzjoni ta' Cistanche deserticola (6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola u 60 µm·L–1 H2O2), u kkultivati ​​għal 24 siegħa. Segwi l-passi tal-kit ta 'skoperta ROS għal operazzjonijiet sussegwenti, osserva direttament it-tbajja taċ-ċelluli permezz ta' mikroskopju, u uża qarrej tal-mikroplate biex tiskopri l-intensità tal-fluworexxenza ta 'kull grupp. Is-settings tal-parametri użaw wavelength ta 'eċitazzjoni ta' 488 nm u wavelength ta 'emissjoni ta' 525 nm. L-esperiment ġie ripetut tliet darbiet.

2.2.4 Effett ta' Cistanche deserticola fuq SOD indott minn H2O2-taċ-ċelloli HEK 293

Aqsam iċ-ċelloli fi grupp normali (sospensjoni taċ-ċelluli) u grupp mudell

(60 µm·L–1 H2O2), grupp VE (60 µm·L–1 VE u 60 µm·L–1 H2O2), grupp ta’ amministrazzjoni ta’ Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola u 60 µm·L–1 H2O2), iġbor iċ-ċelloli wara 24 siegħa ta' kultura, żid is-soluzzjoni tal-preparazzjoni tal-kampjuni SOD biex tissawwar iċ-ċelloli, ċentrifuga f'4 gradi, 12000 r·min-1 għal 5 min (ir-raġġ ċentrifugali huwa 300 mm), ħu s-supernatant bħala l-kampjun li għandu jiġi ttestjat, segwi l-kit ta 'skoperta SOD Segwi l-passi hawn taħt. L-esperiment ġie ripetut tliet darbiet.

2.2.5 Effett ta' Cistanche deserticola fuq CAT indott minn H2O2-fiċ-ċelloli HEK 293

Segwi l-metodu taħt 2.2.4 u l-amministrazzjoni tal-grupp, żid soluzzjoni liżi, ċentrifuga f'4 gradi, 12000 r·min-1 għal 10 minuti (ir-raġġ taċ-ċentrifuga huwa 300 mm), ħu s-supernatant, u segwi l-passi tal- Kit ta' skoperta CAT. Operazzjonijiet ta' segwitu. L-esperiment ġie ripetut tliet darbiet.

2.2.6 Analiżi statistika

SPSS 26.0 intuża softwer għall-analiżi statistika. Kull grupp ta' dejta kien rappreżentat minn (±±(). Analiżi one-way tal-varjanza saret fuq id-dejta li tikkonforma mad-distribuzzjoni normali. Jekk il-varjanzi kienu ugwali, intuża l-metodu ta' l-inqas Differenza Sinjifikanti. Jekk il-varjanzi kienu irregolari, intuża l-metodu T3 ta’ Dunnett GraphPad Prism 8 għall-grafika, u P<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analiżi tal-korrelazzjoni tal-effett tal-ispettru tal-antiossidant Cistanche deserticola

2.3.1 PCA L-ogħla żoni tal-qċaċet komuni ta' 10 lott ta' Cistanche deserticola li stabbilixxew marki tas-swaba' ġew standardizzati bil-valur Z, u magħmula f'matriċi tad-dejta tal-ordni 10 × 17, li ġiet importata fis-softwer SPSS 26.0 għall-PCA.

2.3.2 PCC Uża SPSS 26.0 biex twettaq analiżi bivarjata biex tistudja r-relazzjoni tal-effiċjenza spettrali bejn il-marki tas-swaba' ta' Cistanche deserticola u l-antiossidanti.

L-ittestjar tas-sinifikat juża test fuq żewġ naħat (T) b'P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 PLS Importa r-riżultati sperimentali taż-żona tal-quċċata standardizzata ta 'Cistanche deserticola u l-antiossidant fis-softwer SIMCA-P 14.1, issettja l-erja tal-quċċata bħala l-varjabbli X, u ssettja l-indiċi farmakodinamiku bħala l-varjabbli Y biex twettaq PLS.

2.4 Cistanche deserticola Q-marker verifika tal-attività antiossidanti

2.4.1 Preparazzjoni ta' likur omm ta' ingredjent attiv

Iżen b'mod preċiż ammonti xierqa ta' aċidu ġenipiniku, 8-aċidu epistrikniku, echinaceaside, verbascoside, isorebascoside, u anthocyanoside A, u żid DMSO biex tħollhom f'10 mmol·L–1 għall-kontroll. soluzzjoni tal-prodott.

2.4.2 Effett ta' ingredjenti attivi fuq iċ-ċitotossiċità ta' HEK 293

Wara li ċ-ċelloli HEK 293 ġew inkubati għal 24 siegħa, 100 µL ta’ soluzzjonijiet ta’ ingredjent attiv taħt il-punt 2.4.1 (0.781, 1.563, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µmol·L–1) ta’ konċentrazzjonijiet differenti ġew miżjuda ma 'kull bir, u l-istimulazzjoni kompliet. Reaġent ta' soluzzjoni waħda CellTiter 96® AQueous ġie miżjud maċ-ċelloli 24 siegħa wara biex tiġi identifikata l-vijabbiltà taċ-ċelluli.

2.4.3 L-effett antiossidant tal-ingredjenti attivi fuq iċ-ċelloli HEK 293 H2O2-indotta

Iċ-ċelloli ġew miġbura kif ġej: grupp normali, grupp mudell, grupp VE ġew miġbura kif fi 2.2.4, grupp sperimentali (0.781, 1.563, 3.125 µm·L–1 ingredjent attiv u 60 µm·L–1 H2O2), ikkultivat għal 24 siegħa. Iddetermina livelli intraċellulari ta' ROS, SOD u kontenut ta' enzimi CAT skond il-metodi taħt 2.2.3, 2.2.4 u 2.2.5 rispettivament.

Servizz ta' Appoġġ Ta Wecistanche

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop