Effetti Protettivi Ta' Mikrovesikuli taċ-Ċelloli Proġenitriċi Endoteljali fuq Korriment taċ-Ċelloli tal-Kliewi tal-Firien Indott minn Ang II

edmund.chen@wecistanche.com

Astratt.Ipertensjoni kronika tista 'twassal għalħsara fil-kliewi,magħrufa bħala nefropatija ipertensiva jew nefrosklerożi ipertensiva. Fehim ulterjuri tal-mekkaniżmi molekulari li permezz tagħhom tiżviluppa n-nefropatija ipertensiva huwa essenzjali għal dijanjosi u trattament effettivi. L-istudju preżenti investiga l-mekkaniżmi li bihom iċ-ċelloli proġenitriċi endoteljali (EPCs) isewwi l-far primarjukliewiċelluli (PRKs). ELISA, Cell Counting Kit-8 u assaġġi taċ-ċitometrija tal-fluss intużaw biex janalizzaw l-effetti ta 'EPCs jew EPC-MVs fuq l-istress ossidattiv, infjammazzjoni, proliferazzjoni taċ-ċelluli, apoptożi u ċiklu ta' PRKs indotti minn AngII. Mudell ta' korriment PRK ġie stabbilit bl-użu ta' angiotensin II (Ang II). Wara l-induzzjoni ta 'Ang II, il-proliferazzjoni tal-PRK naqset, l-apoptosi żdiedet u ċ-ċiklu taċ-ċelluli ġie mblukkat fil-fażi G1 qabel ma daħal fil-fażi S. Instab li l-livelli ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv u malondialdehyde żdiedu, filwaqt li l-livelli ta 'glutathione peroxidase u superoxide dismutase naqsu. Barra minn hekk, il-livelli taċ-ċitokini infjammatorji IL-1, IL-6 u TNF- żdiedu b'mod sinifikanti. Għalhekk, Ang II għamel ħsara lill-PRKs billi stimola l-istress ossidattiv u jippromwovi r-rispons infjammatorju. Madankollu, meta PRKs ġew ko-kultivati ​​ma 'EPCs, il-ħsara indotta minn Ang II tnaqqset b'mod sinifikanti. L-istudju attwali ġabar il-mikrovesicles (MVs) imnixxija mill-EPCs u kkoltivahom flimkien ma' PRKs indotti minn Ang II, u identifika li EPC-MVs żammew l-effett protettiv tagħhom fuq PRKs. Bħala konklużjoni, l-EPCs jipproteġu l-PRKs minn ħsara indotta minn Ang II permezz ta' MVs imnixxija.

CISTANCHE SE TTEJJEB IL-MARD TAL-KLIEWA/KLIEWA

Introduzzjoni

Pressjoni għolja hija fattur ta 'riskju għall-inċidenza ta' mard kardjovaskulari u ċerebrovaskulari, u l-mortalità assoċjata tagħhom (1). Il-kliewijista 'jikkawża pressjoni għolja u huma wieħed mill-organi fil-mira tal-ħsara ta' pressjoni għolja (2). Kronikamard tal-kliewi(CKD) kienet waħda mill-kawżi ewlenin ta 'żieda fil-mortalità fost individwi bi pressjoni tad-demm għolja madwar id-dinja matul l-aħħar għoxrin sena (3,4). Għalhekk, hemm ħtieġa urġenti li jiġi promoss it-trattament tan-nefropatija ipertensiva u jiġi studjat il-mekkaniżmu patoloġiku tagħha. Studji preċedenti wrew li angiotensin II (Ang II) indotta ħsara vaskulari u serva rwol ewlieni fil-mard vaskulari permezz ta 'diversi mekkaniżmi, bħall-induzzjoni ta' apoptożi (5), arrest taċ-ċiklu taċ-ċelluli (6), żieda fil-livelli ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) ( 7), tippromwovi r-rispons għall-istress ossidattiv billi żżid is-sekrezzjoni ta 'malondialdehyde (MDA), u tnaqqas is-sekrezzjoni ta' glutathione peroxidase (GSH-Px) u superoxide dismutase (SOD) (8,9). Ang II jippromwovi wkoll il-produzzjoni ta' fatturi relatati mal-infjammazzjoni, bħal IL-6, IL-1 u TNF- (10-12). Il-ħsara kkawżata minn Ang II għalhekk ġiet użata biex timmudella pressjoni għolja in vitro, inkluż fil-far primarjukliewiċelluli (PRKs) (13,14).

Għal pazjenti bifunzjoni renaliindeboliment, ħsara liċ-ċelloli endoteljali u tnaqqis fir-riġenerazzjoni u t-tiswija huma l-kawżi ewlenin tat-telf ta 'microvesicles peritubulari (MVs) (15). Ċelloli proġenitriċi endoteljali (EPCs) derivati ​​mill-mudullun jistgħu jippromwovu t-tiswija endoteljali (16,17). Studji preċedenti wrew li l-EPCs jistgħu jtejbu r-riġenerazzjoni kardjovaskulari (18) u jirregolaw l-anġjoġenesi (19), kif ukoll jeżerċitaw effetti terapewtiċi fuq akut.renalikorriment iskemija-riperfużjoni (20) u f'pazjenti bitrapjant tal-kliewi(21). Madankollu, sa fejn nafu, l-effett tal-EPCs fuq in-nefropatija ipertensiva ma ġiex irrappurtat qabel. Aħna ipotizzat li l-EPCs jista 'jkollhom effett protettiv kontra nefropatija ipertensiva filrenaliċelloli. L-MVs jinħeles kontinwament minn varjetà ta 'ċelluli fil-ġisem, bħal ċelluli epiteljali, ċelluli tat-tumur u ċelloli staminali, u jeżistu f'diversi fluwidi tal-ġisem, bħal demm, awrina u ħalib, fejn jimmedjaw funzjonijiet bijoloġiċi (22). L-evidenza akkumulata ssuġġeriet li l-effett protettiv ta 'EPCs huwa assoċjat mill-qrib mar-rilaxx ta' MVs (23,24) Fl-istudju preżenti, l-applikazzjoni potenzjali ta 'EPC-MVs għat-trattament ta' nefropatija ipertensiva ġiet eżaminata billi ġew investigati l-effetti protettivi u l-mekkaniżmi. li permezz tagħhom l-EPC-MVs jipproteġu kontra l-ħsara PRK indotta minn Ang II, biex jipprovdu bażi teoretika bijoloġika għat-trattament tan-nefropatija ipertensiva.

Kliem ewlieni:EPC-MVs, nefropatija ipertensiva, Ang II, ROS, MVs, infjammazzjoni, kliewi, renali

materjali u metodi

Annimali.Total ta' firien irġiel Wistar-Kyoto (WKY) ta' 12 8-ġimgħat mingħajr patoġen speċifiku (piż, 80-120 g) inkisbu mill-Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (liċenzja Nru SCXK, Guangdong, 2015‑0063). Il-firien tpoġġew f’kamra b’temperatura u umdità kostanti (temperatura, 23±2˚C; umdità, 50±10 fil-mija), taħt ċiklu ta’ dawl/dlam ta’ 12-il siegħa b’aċċess ad libitum għal ikel u ilma standard tal-firien f’ gaġġa tal-polistirene. L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università Medika ta’ Hainan (Haikou, iċ-Ċina; approvazzjoni Nru HYLL-2021-053), u saru skont il-linji gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa (25).

CISTANCHE SE TTEJB IL-FUNZJONI TAL-KLIEI/RENALI

Iżolament u kultura ta' PRKs.Il-firien WKY b'aċċess ħieles għall-ilma sawmu għal 12-il siegħa qabel l-esperiment. Ġrieden WKY ġew ewtanizzati bl-użu ta’ injezzjoni intraperitoneali ta’ pentobarbital sodium (200 mg/kg piż tal-ġisem), imbagħadkliewitneħħew b'mod asettiku, u l-porzjon kortikali tal-kliewiġie mneħħi u trapjantat ġo tazza żgħira. Il-renalikortiċi nqatgħu fi frammenti ta 'tessut ta' ~ 1 mm3, maħsula tliet darbiet b'PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ċentrifugati f'1,000 xg f'25˚C għal 5 min u s-supernatant ġie mormi. Il-frammenti tat-tessut ġew miżjuda mal-collagenase tat-tip I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) f'konċentrazzjoni finali ta '1 g/l, u l-frammenti tat-tessut ġew oxxillati u diġeriti f'37˚C għal 30 min. Wara l-filtrazzjoni permezz ta 'skrin ta' l-istainless steel 200-mesh (0.075 mm), iċ-ċelloli ġew separati permezz ta 'ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (26). Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'1,000 xg f'25˚C għal 2 min, is-sospensjoni intermedja ġiet miġbura u mħallta ma' MEM/F12 medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), imlaqqma fi pjanċa b'6-well u ikkultivat f'37˚C taħt 5 fil-mija CO2. Wara 24 siegħa, il-medju tneħħa u sostitwit b'mezz frisk, u l-mhux imwaħħalrenaliċelluli u tessut ġew mormija. Wara 48 siegħa, il-medju reġa' tneħħa, iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn b'PBS u ġew indikati bħala PRKs (27,28); il-kostitwenti prinċipali kienu ċelluli mesanjali glomerulari tal-firien. Il-PRKs ġew ikkultivati ​​għal tliet ġenerazzjonijiet u ttrattati b'Ang II (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) f'37˚C għal 24 siegħa biex tiġi stabbilita l-PRKħsara renalimudell. L-infjammazzjoni kkaġunata minn Ang II fil-farrenaliċelluli epiteljali tubulari twettqet kif deskritt qabel minn Nair et al (29).

Il-PRKs ġew identifikati bl-użu ta 'assaġġ ta' immunofluworexxenza (IF).Wara li tlaħlaħ tliet darbiet bil-PBS u twaħħlu b'4 fil-mija paraformaldehyde f'25˚C għal siegħa, iċ-ċelloli ġew inkubati (25˚C) bi Triton X‑100 għal 2 sigħat, segwiti minn 5 fil-mija BSA (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) f'25˚C għal 30 min. Il-PRKs imbagħad ġew inkubati matul il-lejl fid-dlam b'-actina tal-muskolu lixx (-SMA; 1 µg/ml; cat. nru ab7817; Abcam) u vimentin (1:250; cat. nru ab92547; Abcam) f'4˚C. Wara li tlaħlaħ tliet darbiet bil-PBS, iċ-ċelloli ġew inkubati b'antikorpi sekondarji Alexa Fluor® 488- (1:100; cat. nr. ab150077; Abcam) jew 647-tikketta (1:200; kat. nru. ab150075; Abcam) f'37 ˚C għal siegħa. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew imtebba 'b'DAPI (0.5 µg/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) f'25˚C għal 5 min. Fl-aħħarnett, immaġini nqabdu permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (ingrandiment, x400; Leica Microsystems GmbH).

Kultura u identifikazzjoni ta' EPCs.Il-wirk tal-firien u t-tibja ġew dissected u kull tubu tal-mudullun kien imlaħlaħ b'PBS sterili. It-taħlita li tirriżulta ġiet ċentrifugata (1,000 xg; 25˚C; 15 min) u l-partiċelli ġew sospiżi mill-ġdid f'medju MEM/F12. Iċ-ċelloli ġew iżolati permezz ta 'ċentrifugazzjoni tal-gradjent tad-densità Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (1,000 xg; 25˚C; 20 min) u mqiegħda f'kunjett tal-kultura ta' 25-cm2 miksi b'fibronektin (BD Biosciences). Iċ-ċelluli nżammu f'mezz sħiħ taħt kundizzjonijiet standard (37˚C; 5 fil-mija CO2). Il-mezz tal-kultura nbidel wara 4 ijiem, u ċ-ċelloli aderenti ġew ikkultivati ​​għal 3 ijiem addizzjonali (30). Tbajja ta' lipoproteina ta' densità baxxa aċetilata Dil kumplessa (Dil-Ac-LDL) (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) intużat biex jiġu identifikati EPCs. Għas-sistema tal-ko-kultura, PRKs (1x104 ) ġew miżjuda mal-kamra t'isfel ta 'pjanċa tal-ko-kultivazzjoni (Corning, Inc.) għal 24 siegħa u mbagħad Ang II (1 µM) jew 200 µl PBS u EPCs (3x104 ) kienu miżjuda mal-kamra ta 'fuq u inkubata f'37˚C għal 24 siegħa qabel ma saret aktar analiżi tal-funzjoni taċ-ċelluli. Meta skrinjaw il-PRKs u l-aħjar proporzjon ta 'EPCs, il-proporzjonijiet tan-numru taċ-ċelluli kienu 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 u 1:7.

Preparazzjoni ta' EPC-MVs. EPCs ġew ikkultivati ​​għal 7 ijiem kif deskritt qabel (30), maħsula darbtejn b'PBS u serum-starved għal 12-il siegħa. Sussegwentement, il-medju MEM/F12 li fih EPCs ikkultivati ​​nġabar u ċentrifugat f'4˚C (1,000 xg; 15 min), u s-supernatant ġie estratt f'4˚C (100,000 xg; 60 min) għall-ġbir ta' EPC-MVs imnixxija. Wara l-inkorporazzjoni fir-reżina epoxy Pon 812 (Structure Probe, Inc.), tqiegħdet f'37˚C matul il-lejl. Imbagħad, soluzzjoni ta 'fissazzjoni tal-mikroskopju elettroniku (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ġiet miżjuda għal 4 sigħat, u aċetat tal-uranju (2 fil-mija; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) u ċitrat taċ-ċomb (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) kienu mtebbgħin f'25˚C għal 15-il minuta. MVs ġew ikkonfermati permezz ta 'mikroskopija elettronika ta' trasmissjoni. Fis-sistema ta 'ko-kultura, 50 µg/ml EPC-MVs (31) ġew miżjuda mal-kamra ta' fuq ta 'pjanċa tal-assaġġ Transwell, u parks ġew miżjuda mal-kamra tal-qiegħ kif deskritt qabel, u inkubati għal 24 siegħa.

Assaġġ tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli.Il-PRKs ġew diġeriti bi trypsin, imlaqqma fi pjanċi ta '96-well f'densità ta' 3x103 ċelluli/bir u kkultivati ​​għal 24 siegħa. Id-densità ottika f'450 nm ġiet imkejla bl-użu ta' 10 µl ta' reaġent tal-Kit-8 tal-Għoti taċ-Ċelluli (CCK-8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) f'37˚C għal 60 min, skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, biex tiġi evalwata l- rata ta' proliferazzjoni taċ-ċelluli.

CISTANCHE SE TTEJB L-UĠIGĦ TAL-KLIEI/KLIEWA

Assaġġ tal-apoptożi taċ-ċelluli.Twettqet analiżi tal-apoptosi taċ-ċelluli bl-użu ta' kit ta' Sejbien tal-Apoptożi tal-Annexin V-FITC (BD Biosciences), skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-PRKs inħasdu, inħaslu darbtejn b'PBS kiesaħ bis-silġ (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) u ġew sospiżi mill-ġdid f'500 µl buffer li torbot. Il-PRKs sospiżi mill-ġdid imbagħad ġew inkubati b'5 µl Annexin V-FITC u 5 µl PI fid-dlam għal 15-il minuta f'23±2˚C. L-apoptosi taċ-ċelluli ġiet ivvalutata bl-użu taċ-ċitometrija tal-fluss (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™ software, verżjoni: 1.0; BD Biosciences).

Fużjoni EPC-MV u PRK.Biex tosserva jekk l-EPC-MVs ġewx fusi ma' PRKs, l-EPC-MVs ġew ittikkettati b'żebgħa fluworexxenti inkorporata fil-membrana tal-lipidi (PKH26) qabel il-ko-inkubazzjoni. Fil-qosor, 50 µg/ml EPC-MVs ġew ikkombinati ma '2 ml PKH26 (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) u mħallta f'23±2˚C għal 5 min. It-taħlita ttikkettjata ġiet miżjuda ma '2 ml 1 fil-mija BSA (v) u ċentrifugata f'100,000 xg f'4˚C għal 60 min, imbagħad laħlaħ b'PBS kiesaħ. Il-preċipitat ġie sospiż f'1 ml MEM/F12 medium, miżjud ma' PRKs u inkubat f'37˚C għal 24 siegħa. Fl-aħħarnett, ġie miżjud 1 µg/ml DAPI għal tbajja nukleari f'25˚C għal 15-il minuta. Immaġini taċ-ċelluli ġew akkwistati permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (ingrandiment, x400; Leica Microsystems GmbH).

Assaġġ taċ-ċiklu taċ-ċelluli.L-assaġġ taċ-ċiklu taċ-ċelluli sar bl-użu tal-kit ta 'Sejbien taċ-Ċiklu taċ-Ċelluli (BD Biosciences). EPCs jew PRKs (1x106) ġew maħsuda, maħsula darbtejn b'PBS u mbagħad iffissati f'500 µl 70 fil-mija etanol kiesaħ fis-silġ għal 2 sigħat f'25˚C. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula darbtejn b'PBS kiesaħ u inkubati f'PI (400 µl) u RNase (100 µl) għal 30 min f'37˚C fid-dlam. Is-sinjal PI ġie skopert bl-użu ta 'FCM (FACSCanto II). Il-perċentwali taċ-ċelloli fil-fażi G1, S u G2 ġew magħduda u mqabbla bl-użu ta 'softwer FlowJo (verżjoni 10.0.6; FlowJo LLC).

Kejl ROS minn FCM.Il-PRKs ġew ikkultivati ​​għal 60-70 fil-mija ta 'konfluwenza u maħsuda permezz ta' trypsinization. Iċ-ċelloli kollha ġew inkubati b'1.0 µM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate għal 15-il minuta f'37˚C. Iċ-ċelloli mbagħad ġew maħsula darbtejn b'PBS u analizzati permezz ta 'FCM biex jinstabu ROS bl-użu ta' laser 488 nm għall-eċitazzjoni u laser 535 nm għall-iskoperta.

ELISA.Wara ċ-ċentrifugazzjoni (1,000 xg; 25˚C; 5 min), inġabar is-supernatant taċ-ċelluli ta' kull sottogrupp biex jiġu analizzati l-livelli ta' MDA, GSH-Px, SOD u l-fatturi infjammatorji IL-6, IL- 1 u TNF‑ . Il-kits li ġejjin intużaw skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur: Kit tal-assaġġ Micro MDA (nru tal-kat. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit tal-assaġġ GSH‑Px (nru tal-kat. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit ta' skoperta ta' attività SOD (cat. nru BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), far IL-1 ELISA kit (kat. nru RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), kit IL-6 Quantikine ELISA tal-far (nru tal-kat. R6000B; Sistemi R&D, Inc.) u kit ELISA tat-TNF Quantikine tal-far (nru tal-kat. RTA00; Sistemi R&D, Inc. ).

Analiżi statistika.L-esperimenti kollha ġew ripetuti tliet darbiet, u d-dejta kollha hija espressa bħala l-medja ± SD. Id-dejta ġiet analizzata bl-użu tas-softwer SPSS verżjoni 21.0 (IBM Corp.). Id-differenzi bejn il-gruppi multipli ġew evalwati bl-użu ta' ANOVA f'direzzjoni waħda u t-test post hoc ta' Dunnett. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Riżultati

Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated  EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A).  Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 fil-mija, li tikkonferma li l-EPCs ġew iżolati b'suċċess. PRKs iżolati ġew analizzati permezz ta' IF (vimentin/-SMA). Ir-riżultati wrew li l-livell ta 'espressjoni ta' vimentin/-SMA fi PRKs kien għoli u pożittiv, li jissuġġerixxi l-iżolament b'suċċess ta 'PRKs (Fig. 1B).

L-aħjar proporzjon ta 'EPCs għal PRKs.L-effett tal-kombinazzjoni ta’ proporzjonijiet differenti ta’ PRKs/EPCs f’sistema ta’ kokultura ġew eżaminati, u nstab li PRKs imkabbra fi proporzjon ta’ 1:3 PRKs/EPCs ma kellhomx rati ta’ proliferazzjoni miżjuda meta mqabbla ma’ PRKs imkabbra b’2: 1, 1:1 jew 1:2 proporzjon ta 'PRKs/EPCs (Fig. 1C). Barra minn hekk, proporzjonijiet dejjem jiżdiedu ta 'EPCs (1:4, 1:5, 1:6 u 1:7) irriżultaw f'żieda sinifikanti fil-proliferazzjoni PRK meta mqabbla ma' dik ta 'EPCs (1:3). Għalhekk, intgħażel proporzjon ta '1:3 PRKs/EPCs għal aktar studji biex tiġi evitata interferenza possibbli minn EPCs eċċessivi f'esperimenti sussegwenti.

Effett tal-kokultura tal-EPC fuq il-ħsara kkawżata minn Ang II.PRKs (1x104) ġew imlaqqma 24 siegħa bil-quddiem fil-kompartiment t'isfel ta 'pjanċa Transwell. Il-kamra ta 'fuq kien fiha 200 µl PBS fil-grupp ta' kontroll u 200 µl EPCs (3x104 ) fil-grupp sperimentali. Biex timmudellaħsara fil-kliewi,Ġie miżjud 1 µM Ang II mal-kompartiment t'isfel. Wara 24 siegħa, saru analiżi CCK-8 u FCM biex titkejjel ir-rata ta 'proliferazzjoni ta' PRKs. Il-PRKs li jirċievu Ang II fin-nuqqas ta’ EPCs kellhom tnaqqis sinifikanti (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the=""  g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">kliewimudell taċ-ċellula.

L-EPCs jipproteġu l-PRKs minn ħsara kkawżata minn Ang II, il-livelli ta 'stress ossidattiv indott minn Ang II f'PRKs ko-kultivati ​​ma' EPCs ġew eżaminati. Ir-riżultati mill-assaġġ FCM wrew li Ang II żdied b'mod sinifikanti (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).=""  similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted=""  mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c=""  and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while=""  prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">

Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs PRKs:EPCs, grupp 2:1; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.=""  (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;=""  prks,="" primary="" rat="">kliewiċelloli; FCM, ċitometrija tal-fluss; CCK-8, Kit ta' Għadd ta' Ċelloli-8; Dil-Ac-LDL, Lipoproteina ta' densità baxxa aċetilata kumplessa Dil; OD, densità ottika; -SMA, - actin tal-muskoli lixxi; NS, mhux sinifikanti. riżultati opposti fir-rigward tas-sekrezzjoni ta’ dawn l-enzimi. Il-ġenerazzjoni ta' ROS tista' għalhekk tkun involuta fil-ħsara taċ-ċelluli indotta minn Ang II, u tista' tittejjeb permezz ta' ko-kultura ma' EPCs.

Ang II jista 'wkoll jagħmel ħsara liċ-ċelloli billi jippromwovi s-sekrezzjoni ta' ċitokini infjammatorji, filwaqt li l-EPCs jistgħu jipprevjenu l-infjammazzjoni (32). Sussegwentement, ġie investigat jekk Ang II jippromwovix is-sekrezzjoni ta 'ċitokini infjammatorji fil-PRKs, u jekk l-EPCs jistgħux jeżerċitaw ir-rwol protettiv tagħhom billi jinibixxu s-sekrezzjoni ta' ċitokini infjammatorji. Is-sekrezzjoni ta 'IL-1, IL-6 u TNF- kienet regolata b'mod sinifikanti fil-PRKs biż-żieda ta' Ang II. B'kuntrast, fi PRKs ko-kultivati ​​ma 'EPCs, il-livelli ta' IL-1, IL-6 u TNF- (Fig. 2E-G) kienu komparattivament aktar baxxi (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">

L-effett protettiv tal-EPCs huwa eżerċitat permezz tal-MVs.Il-mekkaniżmi li permezz tagħhom l-EPCs jeżerċitaw effetti protettivi fuq Ang II indottikliewiċelluli ġew analizzati aktar billi iżolati MVs minn EPCs (Fig. 3A). EPC-MVs ġew ittikkettati b'PKH26 u ​​miżjuda ma 'PRKs flimkien ma' Ang II fi pjanċa Transwell, kif deskritt qabel. Il-fluworexxenza PKH26 ġiet skoperta fiċ-ċitoplasma ta 'PRKs (Fig. 3B), li tindika li EPC-MVs kienu fused ma PRKs. Imbagħad, instab li Ang II-indotta rata ta 'proliferazzjoni mnaqqsa, promossi l-apoptożi u l-arrest taċ-ċiklu fil-fażi G1, ġew inibiti minn EPC-MVs (Fig. 3C-E). Simili għal PRKs ko-kultivati ​​ma 'EPCs, PRKs imkabbra fil-preżenza ta' EPC-MVs u esposti għal Ang II kellhom livelli mnaqqsa ta 'ROS u MDA (Fig. 4A u B), żiedu l-livelli ta' GSH u SOD (Fig. 4C u D) u tnaqqis fis-sekrezzjoni taċ-ċitokini infjammatorji IL-1, IL-6 u TNF- (Fig. 4E-G), meta mqabbla mal-grupp Ang II.

Diskussjoni

Sa fejn nafu, l-istudju preżenti wera għall-ewwel darba li l-EPCs jistgħu jipproteġu l-PRKs mill-ħsara taċ-ċelluli indotta minn Ang II. Dan l-effett protettiv huwa, għall-inqas parzjalment, medjat minn MVs li huma mnixxija mill-EPCs u jingħaqdu ma' PRKs waqt il-kokultura. Billi żżid MVs arrikkit ma 'PRKs esposti għal Ang II, instab li l-EPC-MVs waħedhom jistgħu jipproteġu l-PRKs minn ħsara indotta minn Ang II billi jinibixxu l-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni. L-MVs huma definiti bħala nanodebris tal-membrana (0.05-1 µm) (33), u huma mxerrda mill-wiċċ taċ-ċellula wara attivazzjoni, stress jew apoptożi. Barra minn hekk, MVs jistgħu jiġu derivati ​​minn diversi tipi ta 'ċelluli, bħal plejtlits, ċelluli endoteljali, EPCs u ċelluli bojod tad-demm (34,35). L-MVs jesprimu markaturi speċifiċi tal-wiċċ taċ-ċelluli, li jvarjaw maċ-ċellula tal-oriġini u l-formazzjoni tagħhom u jistgħu jeżerċitaw effetti anti-infjammatorji, antikoagulanti u anġjoġeniċi (36). MVs rilaxxati mill-EPCs jistgħu jġorru l-informazzjoni bijoloġika taċ-ċellula ġenitur tagħhom, u għalhekk jeżerċitaw funzjoni simili fuq iċ-ċelloli fil-mira (33). Pereżempju, l-EPC-MVs jipproteġu kardjomijoċiti minn ipertrofija u apoptożi indotti minn Ang II (28), itejbu l-funzjoni endoteljali u l-abbiltà li jirregolaw l-anġjoġenesi (37), u jtaffu disfunzjoni endoteljali indotta minn stress ossidattiv (38). Madankollu, sa fejn nafu, l-effett tal-EPC-MVs fuq in-nefropatija ipertensiva ma ġiex irrappurtat qabel. Għalhekk, l-istudju preżenti kellu l-għan li jinvestiga l-effetti protettivi potenzjali ta 'EPCs u EPC-MVs filkorriment taċ-ċelluli tal-kliewi.

Fl-istudju preżenti, mudell ta 'korriment PRK ġie stabbilit billi jinduċi ħsara b'Ang II. B'mod konsistenti mar-rapporti preċedenti (26,39), Ang II naqqas il-proliferazzjoni tal-PRK, żied l-apoptożi u arresta ċ-ċiklu taċ-ċelluli fil-fażi G1 qabel ma tidħol fil-fażi S. Ibbażat fuq dawn il-markaturi relatati mal-ipertensjoni, ġie konkluż li l-mudell tal-ipertensjoni PRK indotta minn Ang II ġie stabbilit b'suċċess. Barra minn hekk, ġie ddeterminat li l-kokultura ma' EPCs ipproteġiet il-PRKs minn ħsara kkawżata minn Ang II. Wara l-ko-inkubazzjoni ta 'EPCs ma' PRKs flimkien ma' Ang II, il-livelli ta 'enzimi ta' stress ossidattiv u fatturi infjammatorji fil-PRKs naqsu. Għalhekk, il-mekkaniżmi potenzjali li permezz tagħhom l-EPCs jeżerċitaw l-effetti protettivi tagħhom fuq il-PRKs jistgħu jinvolvu r-regolazzjoni tal-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni. Sa fejn nafu, l-istudju attwali wera għall-ewwel darba li l-EPCs jistgħu jtejbu r-rispons għall-istress ossidattiv indott minn Ang II u l-infjammazzjoni fil-PRKs.

L-EPCs jipproteġu b'mod effettivfunzjoni renalif'CKD (40) u jservu rwol ewlieni fiż-żamma tal-integrità vaskulari u fit-tiswija tal-ħsara endoteljali (15), kif ukoll tnaqqas it-tnixxija vaskulari, ittejjeb il-funzjoni tal-organi u żżid ir-rata ta 'sopravivenza f'sepsis (41). L-evidenza akkumulata tissuġġerixxi li l-EPCs jistgħu jeżerċitaw rwol protettiv permezz tas-sekrezzjoni ta 'MVs (37,42,43). Biex jiġi ttestjat l-effett protettiv ta 'EPC-MVs fi PRKs, EPC-MVs ġew iżolati u ttikkettjati b'PKH26, u mbagħad l-MVs ittikkettjati ġew ko-inkubati ma' PRKs flimkien ma' Ang II. L-EPC-MVs ingħaqdu ma 'PRKs u inibixxu b'mod sinifikanti r-rispons għall-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni indotta minn Ang II, u dawn ir-riżultati huma simili għal dawk ta' Fu et al (44). L-effett inibitorju tal-EPC-MVs fuq il-livelli tal-enzimi tal-istress ossidattiv kien akbar minn dak tal-EPCs waħedhom; dan jista' jiġi attribwit lill-MVs li jkunu preżenti f'konċentrazzjoni ogħla fil-PRKs ittrattati bl-EPC-MVs milli f'dawk ko-kultivati ​​bl-EPCs. Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-effett protettiv tal-EPCs fuq PRKs kontra l-ħsara taċ-ċelluli indotta minn Ang II jista 'jiddependi fuq MVs imnixxija. Limitazzjoni tal-istudju preżenti hija li l-mekkaniżmi potenzjali li permezz tagħhom l-EPC-MVs jirregolaw il-mikroRNAs/mRNAs/assi tat-trasduzzjoni tas-sinjali ma ġewx eżaminati bis-sħiħ. Ir-rwol u l-mekkaniżmi li permezz tagħhom l-EPC-MVs jeżerċitaw protezzjoni kontraħsara fil-kliewigħandhom jiġu evalwati f'mudell ta 'annimali ta' nefropatija ipertensiva, li hija direzzjoni promettenti għal riċerka futura. Bħala konklużjoni, l-istudju preżenti wera li l-EPCs jistgħu jipproteġu l-PRKs minn stress ossidattiv indott minn Ang II u żieda fl-infjammazzjoni permezz tas-sekrezzjoni tal-MVs. Dan jipprovdi direzzjoni ġdida għat-trattament tan-nefropatija ipertensiva u jistabbilixxi mudell in vitro għall-istudjukorriment fil-kliewi.