mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Effetti Protettivi Ta' Cistanche Kontra Degradazzjoni Dermal Fibroblast Collagen Indotta minn H2O2/UVB Permezz ta' Hsa-microRNA-4535-medjata minn TGF/Smad Signaling Ⅱ

May 06, 2023

DISKUSSJONI

F'dan l-istudju, identifikajna li l-rwol protettiv ta' cistanchehija medjata permezz ta' attenwazzjoni ta' hsa-miR- 4535 li jimmira Smad4, u b'hekk jirregola s-sinjalar Smad2/3/4 kif ukoll is-sintesi tal-kollaġen fil-ġilda esposta għal H2O2/Ħsara dermali indotta mill-UVB in vitrouin vivo. Is-sejbiet tagħna jistgħu jinġabru fil-qosor bħala sitt punti ewlenin: (1) cistanche attenwat H2O2-senescence taċ-ċelluli HS68 indotta iżda mhux apoptożi f'doża ta '30 µM; (2) H2O2/ Indotta mill-UVBintraċellulari u mitokondrijal Il-formazzjoni ta 'ROS u l-iżbilanċ MMP ġew maqluba waratrattament cistanche; (3) cistanche mtejba b'mod sinifikanti sinjalazzjoni TGF /Smad kif ukoll attivazzjoni kumplessa Samd2/3/4 f'H2O2-ċelluli esposti; (4) regolazzjoni 'l fuq ta' hsa-miR-4535 minn H2O2/UVB ġie mrażżan waratrattament cistanche; (5) hsa-miR- 4535 hija involuta fir-regolazzjoni tas-sinjalar TGF/Smad billili jimmira Smad4 għal sinteżi indebolita tal-kollaġen f'H2O2/Ċelloli esposti għall-UVB; (6)applikazzjoni topika ta' cistanchefuq ilġilda dorsali ta nudeġrieden naqqsu b'mod sinifikanti l-UVB indottitixjiħ tal-ġilda,formazzjoni tat-tikmix, iperplażja tal-ġilda, u l-indebolimenttal-mogħdijiet tas-sinjalar TGF/Smad.


cistanche proteictive effect on skin care research


Figura 10. Effett ta 'cistanche fuq fotoħsara fil-ġilda tal-ġurdien nude C57BL6/J indotta mill-UVB. (A) Il-proċedura skematika ta 'esperimenti fuq l-annimali. Ġilda dorsali ta' ġrieden nudi C57BL6/J ta' erba' ġimgħat (n=6) ​​ġiet esposta għar-radjazzjoni UVB u ttrattata b'cistanche darba kull jumejn għal 8 ġimgħat (B) Ritratt li juri l-formazzjoni tat-tikmix fuq il-ġilda dorsali ta' nude ġrieden minħabba esponiment UVB, segwit minn applikazzjoni topika ta 'cistanche.

cistanche proteictive effect on skin care research

Ikklikkja Hawn Biex Tkun Taf Trattament ta' Cistanche Għal Tnaqqis tal-Ġilda Photdamage

Il-ġilda tal-bniedem hija magħmula minn żewġ saffi: l-epidermide u d-dermis. Il-dermis tal-ġildafih tessut konnettiv, follikuli tax-xagħar, u glandoli tal-għaraq. Il-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem huma inkorporati fid-dermis [33]. Diversi studji indikaw li t-tixjiħ intrinsiku u estrinsiku t-tnejn jirriżultaw f'senescence tal-fibroblast dermali tal-ġilda minħabba l-akkumulazzjoni ta 'ROS [16, 34, 35]. Għalhekk, il-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem tal-età iwaqqfu b'mod irriversibbli ċ-ċiklu taċ-ċelluli u jitilfu l-kapaċitajiet proliferattivi tagħhom [36]. L-irradjazzjoni H2O2 jew UVB huma sorsi karatterizzati tajjeb għall-aċċellerazzjoni tal-produzzjoni ta 'ROS fil-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem [37, 38]. Hawnhekk, sibna li t-trattament cistanche (10-50 μM) ma kkawżax ċitotossiċità iżda pjuttost attenwat sostanzjalment il-mewt taċ-ċelluli indotta minn H2O2/UVB f'fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem (Figura 1E, 1F). Barra minn hekk, it-trattament ta 'cistanche soppressa l-upregulation indotta minn H2O2 / UVB ta' p16, p21 u n-numru ta 'ċelluli pożittivi SA- -gal (Figura 2D). Għalhekk, l-effetti protettivi demo ta 'cistanche kontra ħsara H2O2 jew UVB jistgħu jkunu marbuta mat-trażżin ta' sorsi differenti ta 'ROS jew integrità tal-mitokondrija.


cistanche proteictive effect on skin care research

cistanche proteictive effect on skin care research

Figura 11. Applikazzjoni topika ta 'cistanche attenwat indotta mill-UVBiperplażja tal-ġildau degradazzjoni tal-kollaġen fil-ġilda dorsali tal-ġrieden nude C57BL6/J. It-tessuti tal-ġilda kienu sezzjonati b'serje u mtebbgħin b'H & E, trikromju ta 'Masson, u immunoistokimikament għal p-Smad2/3 Smad4 u -gal. It-tbajja' H&E wriet ħxuna epidermali. Vleġeġ ħomor b'rasu doppju jindikaw it-tħaxxin epidermali. It-tbajja tat-trikromju ta 'Masson uriet il-kontenut tal-fibra tal-kollaġen f'saffi dermali. Il-fibri tal-kollaġen jidhru blu. LD, doża baxxa; HD, doża għolja.

cistanche proteictive effect on skin care research


cistancheAllegatament esebit proprjetajiet anti-apoptotiċi u antiossidanti f'diversi ċelluli bħal keratinoċiti u kardjomijoċiti [13, 39, 40]. L-amministrazzjoni orali ta 'cistanche soppressa b'mod effettiv il-ħsara fil-fwied indotta minn streptozotocin fil-firien dijabetiċi billi tnaqqas il-ħsara ossidattiva mitokondrijali u ttejjeb is-sinjalar antiossidant Nrf2 [13, 41]. Studji oħra wrew li cistanche tjiebet l-epatotossiċità indotta minn cyclophosphamide u n-nefrotossiċità indotta minn cisplatin billi attenwaw l-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni [42, 43]. L-espożizzjoni ta 'fibroblasti dermali għal UVB jew H2O2 tirriżulta fl-akkumulazzjoni ta' ROS fil-mitokondrija, li twassal għal frammentazzjoni tal-mitokondrija u tixjiħ ċellulari [44]. Studju preċedenti wera li l-mitokondrija frammentata tfixkel il-produzzjoni tal-kollaġen [45]. L-istudju tagħna indika li cistanche jippossjedi kapaċità ta 'scavenging radikali biex jipprevjeni żbilanċ tal-potenzjal tal-membrana tal-mitokondriju indott minn ROS u akkumulazzjoni ta' ROS fiċ-ċelloli indotti UVB u H2O2-. (Figura 3A–3C). Studji reċenti rrappurtaw li l-fibroblasti tal-ġilda huma responsabbli biex jorganizzaw ambjent b'ħafna ECM,


cistanche proteictive effect on skin care research

Figura 12. Effetti ta' cistanche fuq is-sinjalar TGF/Smad u l-espressjoni ta' hsa-miR-4535 fi ġrieden irradjati bl-UVB. (A u B) livelli ta 'mRNA ta' hsa-miR-4535 u Smad4 minn ġilda dorsali ta 'ġrieden esposti għall-UVB ġew skoperti bil-qRT-PCR. (C) Il-livelli ta 'proteina ta' TGF , p-smad2/3, u Smad4 fit-tessuti tal-ġilda dorsali ġew skoperti permezz ta 'western blotting. -tubulin intuża bħala kontroll tat-tagħbija. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SD. Il-kwantifikazzjoni tar-riżultati huma murija; *P < 0.05, **P < 0.01 kontra grupp ta' kontroll tal-vettura; #P < 0.05, ##P < 0.01 kontra UVB flimkien mal-grupp tal-vetturi.


li jikkonsisti fil-biċċa l-kbira minn tipi ta' kollaġen I u III [46]. L-omeostażi tal-kollaġen tipi I u III hija essenzjalment responsabbli għaż-żamma ta 'appoġġ strutturali u mekkaniku għall-ġilda [47]. Evidenza emerġenti ssuġġeriet li ROS abbundanti huma ġġenerati matul ix-xjuħija, li jirriżultaw f'telf progressiv ta 'qatet ta' kollaġen fis-saffi dermali u għalhekk, jikkontribwixxu għall-formazzjoni tat-tikmix minħabba mogħdija indebolita ta 'TGF / Smad u espressjoni MMP elevata [48, 49].medjata minn cistanchel-attivazzjoni tas-sinjalar TGF /Smad tipproduċi kollaġen li jżomm l-integrità tal-ġilda. Madankollu, għandu effetti differenti fiċ-ċelloli tal-kanċer; fil-kanċer tal-fwied,cistanche-trattamentinibit il-proliferazzjoni taċ-ċelluli HepG2 billi attiva s-sinjalar TGF /Smad [50]. B'kuntrast, cistanche inibixxi s-sinjalar TGF /Smad kif ukoll inattivat Smad3 li jirriżulta f'inibizzjoni tat-tkabbir fiċ-ċelloli tal-kanċer tal-prostata u tal-frixa [51]. Madankollu, ir-rwol ta ' cistanche fis-sinjalar TGF / Smad filfibroblasti tal-ġilda tal-ġildabaqgħet mhux magħrufa. Hawnhekk, osservajna li l-espressjoni ta 'Cistanche upregulated COL1A1 u COL3A1 li kienet irregolata 'l isfel f'ċelloli trattati H2O2 / UVB permezz ta' attivazzjoni ta 'sinjalazzjoni TGF / Smad (Figura 4A-4C, 8E, 9A). Barra minn hekk, l-induzzjoni ta 'MMP-1 minn H2O2/UVB ġiet imreġġa' lura wara trattament ta' cistanche (Figura 4A, 9A). Is-sejbiet tagħna jindikaw li cistanche tipproteġi l-fibroblasti tal-ġilda minn ħsara kkawżata minn H2O2/UVB billi jattiva s-sinjalar TGF /Smad u jinduċi l-produzzjoni tal-kollaġen.


cistanche proteictive effect on skin care research

Żvilupp tal-kollaġen tad-dermis tal-ġildahuwa proċess fiżjoloġiku kkumplikat, u r-regolamentazzjoni medjata mill-mikroRNA intweriet li tikkontribwixxi għar-rimodeljar u l-organizzazzjoni tal-ECM [23, 52, 53]. Il-kollaġen, l-elastin u l-aċidu hyaluronic (HA) huma t-tliet proteini ewlenin li jżommu l-integrità tal-ġilda. L-evidenza akkumulata tissuġġerixxi li diversi microRNAs huma involuti fit-tixjiħ tal-ġilda permezz tar-regolament ECM. miR-181a ġie regolat 'il fuq f'fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem senescent u ppermetta lill-kollaġen XVI jimmodula l-komponenti tal-ECM [54]. Interessanti, espressjoni għolja ta 'miR-23a-3p tista' tinduċi senescence dermali billi trażżan direttament hyaluronan synthase 2, waħda mill-isoenzimi transmembrane HA synthase li jissintetizzaw HA [21]. Riċentement, diversi komposti naturali ġew irrappurtati li attenwaw it-tixjiħ tal-ġilda permezz tar-regolamentazzjoni tal-microRNA [55-57]. Barra minn hekk, cistanche kien rappurtat involut fir-regolamentazzjoni tal-microRNA f'cholangiocarcinoma u karċinoma epatoċellulari u kkawża soppressjoni tat-tkabbir taċ-ċelluli u metastasi [58, 59]. S'issa, l-ebda studju ma identifika l-mekkaniżmu molekulari, bħar-regolamentazzjoni tal-microRNA, fiittrattati bi cistancheċelluli fibroblasti dermali tal-ġilda tal-bniedem. Hawnhekk, analiznajna l-profili tal-firxa tal-microRNA biex nidentifikaw diversi microRNAs li kienu differenti bejn il-kontroll u 30 µMittrattati bi cistanchegruppi (Figura 5A). Bl-użu tad-databases miRDB u TargetScanHuman, aħna mbassra Smad4 bħala l-hsa-miR-4535mira mRNA (Figura 5B). L-espressjoni ta' hsa-miR-4535 ġiet regolata 'l isfel wara trattament ta' cistanche f'ċelloli indotti minn H2O2/UVB (Figura 6C, 9B). B'kuntrast, l-espressjoni tal-mira tagħha, mRNA-Smad4, ġiet inibita b'mod sinifikanti fiċ-ċelloli esposti għal H2O2/UVB u żdiedet wara t-trattament ta 'cistanche (Figura 6D, 9C). Varjetà ta 'studji indikaw li ROS jaġixxi bħala fatturi ta' traskrizzjoni indotti mill-istress li jistimulaw intermedji, bħal p53, NF-κB u HIF [60]. Għalhekk, iddeduċajna li ċerti miRNAs jistgħu jiġu modulati permezz tar-regolamentazzjoni ta 'dawn il-fatturi ta' traskrizzjoni. Bl-użu tad-database tas-sit tal-irbit tal-fattur tat-traskrizzjoni (PROMO), aħna identifikajna li hemm element putattiv wieħed li jgħaqqad p53 fil-promotur hsa-miR-4535. L-istudju futur tagħna se jiffoka fuq ir-regolamentazzjoni tat-traskrizzjoni ta' p53 fil-promotur ta' hsa-miR-4535. Barra minn hekk, id-degradazzjoni tal-kollaġen indotta minn H2O2-ma setgħetx tiġi attenwata f'ċelloli hsa miR-4535 espressi żżejjed jew trasfettati b'si-Smad4 anke wara trattament ta' cistanche (Figura 8C, 8E). Dawn is-sejbiet jikkonfermaw aktar l-involviment ta' hsa-miR- 4535 fir-regolazzjoni tas-sintesi tal-kollaġen billi timmira Smad4.



cistanche proteictive effect on skin care research

Figura 13. Id-dijagramma skematika għall-mekkaniżmu ta 'azzjoni ta' cistanche. cistanche itejjeb il-mogħdijiet tas-sinteżi tal-kollaġen TGF/Smad billi jnaqqas l-H2O2-has-microRNA-4535 indott biex itejjeb il-fotoxjiħ fil-fibroblast dermali tal-ġilda umana. Abbrevjazzjonijiet: ECM: matriċi extraċellulari; TGF: trasformazzjoni tal-fattur imkabbar beta; T RI: riċettur TGF tip I; T RII: riċettur TGF tip II.


L-evidenza akkumulata wriet li l-akkumulazzjoni ta 'ROS indotta mill-UVB tista' tfixkel l-integrità tal-ġilda billi tbiddel il-komponenti tal-ECM kif ukoll billi tnaqqas is-sekrezzjoni tal-kollaġen, elastin u HA u b'hekk tiffaċilita l-formazzjoni tat-tikmix jew il-progressjoni tal-kanċer tal-ġilda [61, 62]. Applikazzjoni topika ta 'prodotti kożmetiċi li fihom komposti naturali biex jipproteġu kontra ħruq mix-xemxjista' effettivament itaffi l-ħsara kkawżata mill-UVB [63]. Barra minn hekk, suppliment tad-dieta ta 'aċidu suberiku ipproteġi ġrieden bla pil SKH-1 mid-degradazzjoni tal-kollaġen indotta mill-UVB u l-formazzjoni tat-tikmix [64]. F'dan l-istudju, sibna li l-applikazzjoni topika ta 'cistanche attenwat il-fotodannu tal-ġilda indott mill-UVB billi attenwat l-iperplażja tal-ġilda, il-formazzjoni tat-tikmix u s-sintesi tal-kollaġen (Figuri 10B, 11, 12). Madankollu, it-trattament cistanche ma żiedx b'mod sinifikanti s-sinjalar TGF / Smad billi qabbel mal-grupp espost għall-UVB fl-istudju in vivo (Figura 12C). Lisati totali tal-proteini mill-ġilda mingħajr dermis u saffi tal-epidermide separati għall-analiżi tal-western blotting ma setgħux jiskopru r-rwol preċiż ta 'cistanche fir-regolazzjoni tas-sinjalar TGF /Smad. Madankollu, it-tbajja 'IHC ta' Smad 4 u p-smad2/3 u l-ammont ta 'collagen (Figura 11) ġew imtejba fis-saffi tad-dermis tal-ġurdien taħt l-amministrazzjoni ta' cistanche li juru r-rwol li jippromwovi l-collagen ta 'cistanche. Meħuda flimkien, dawn is-sejbiet jindikaw li cstanche tista’ tippenetra l-epidermide u tilħaq id-dermis fejn eżerċitatabbiltajiet li jipproduċu l-kollaġen biex irażżnu l-fotoħsara kkawżata mill-UVB (Figura 13).

cistanche proteictive effect on skin care research

Bħala konklużjoni, is-sejbiet tagħna indikaw li cistanche tipproteġi kontra l-ġenerazzjoni ta 'ROS indotta minn H2O2/UVB, żbilanċ MMP, senescence ċellulari, u degradazzjoni tal-kollaġen fil-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem. L-effetti dermo protettivi ta 'cistanche kienu assoċjati mal-inibizzjoni ta' hsa-miR-4535 u l-attivazzjoni tal-kumpless Smad2/3/4 biex tittejjeb is-sintesi tal-kollaġen. L-attivazzjoni kumplessa ta' Smad2/3/4 kienet regolata minn hsa-miR-4535 permezz ta' rbit ma' Smad4-3′-UTR. Għalhekk, il-mekkaniżmu protettiv ta 'cistanche kontra ħsara fil-ġilda kkaġunata mill-H2O2/UVB jista' jinvolvi l-inibizzjoni tas-sinteżi Smad4/collagen minn hsa-miR- 4535


MATERJALI U METODI

Kultivi taċ-ċelluli u trattamenti

Il-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem HS68 inkisbu miċ-Ċentru ta’ Ġbir u Riċerka tal-Bijoriżorsi (BCRC, Hsinchu, Tajwan) u miżmuma fil-mezz essenzjali modifikat ta’ Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) li fih 10 fil-mija serum tal-fetu bovin (Invitrogen, CA, USA). ), 2 mM L-glutamina (Sigma-Aldrich, MO, USA), 100 U/mL peniċillina (Sigma-Aldrich), u 100 ug/mL streptomycin (Sigma Aldrich) f'37 grad u 5 fil-mija CO2. Biex jiġi evalwat l-effett ta 'cistanche kontra l-ħsara taċ-ċelluli H2O2-indotta, iċ-ċelloli HS68 ġew ittrattati b'200 μM ta' H2O2 għal siegħa u mbagħad ikkurati flimkien b'cistanche (282200, Sigma-Aldrich) għal 23 siegħa. Iċ-ċelloli ġew maħsula b'PBS u mqiegħda f'1 mL PBS frisk qabel l-espożizzjoni UVB. Għall-irradjazzjoni UVB, iċ-ċelloli ġew esposti għal crosslinker (CX-2000, Upland, CA, USA) u bozoz UVB f'intensità ta '40 mJ/cm2 u mbagħad ittrattati b'cistanche.

Assays MTT

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli HS68 wara t-trattament ġiet imkejla bl-użu tal-assaġġ MTT. Iċ-ċelluli HS68 ġew miżrugħa fi pjanċi 96-bjar u ttrattati b'20{0 μM H2O2 għal siegħa jew irradjati b'40 mJ/cm2 UVB u mbagħad inkubati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' cistanche (10, 20, 30 μM) għal 23 siegħa. Wara 24 siegħa, il-mezz tal-kultura ġie sostitwit b'100 μL MTT (3-(4,5-dimetiltiażol-2- yl)-2,5-difenil tetrazoli bromur) soluzzjoni (0.5 mg/mL; 5 mg/mL soluzzjoni stokk f'PBS ġiet dilwita b'mezz ta 'kultura għal 0.5 mg/mL) għal 4 sigħat f'37 grad. Imbagħad il-formazan ta 'kulur vjola ġie solubilizzat f'100 μL ta' dimethyl sulfoxide (DMSO) u d-densità ottika f'570 nm ġiet imkejla bl-użu ta 'spettrofotometru (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Trasfezzjoni transitorji

Plasmid li jikkodifika Smad4-3′-UTR fil-vettur tal-espressjoni fil-mira tal-miRNA luciferase dual pmirGLO inxtara minn GENEWIZ. SiRNA uman Smad4 (ID SASI_Hs{01_00207793) u siRNA ta' kontroll negattiv (SIC001) it-tnejn inxtraw minn Sigma-Aldrich. Iċ-ċelloli HS68 ġew trasfettati b'inibitur ta' hsa-miR-4535 (anti- sens RNA), hsa-miR-4535 jimitaw (sensRNA), kontroll negattiv miRNA, Smad4 siRNA bl-użu ta 'jetPRIME® (Polyplus Transfection Inc, Illkirch, Franza) skond il-protokoll tal-manifattur. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew inkubati bil-kumplessi tat-trasfezzjoni għal 24 siegħa.

Analiżi Microarray

L-RNA totali ġie estratt mill-kontroll, ċellula HS68 ittrattata b'10 μM- u 30 μM-galanin u mbagħad analizzat permezz ta 'miRNA Profiling bl-użu ta' Servizzi ta 'MiRNA Microarray (Human miRNA OneArray®; Kodiċi tas-Servizz: 1h216080404;).

Assaġġ ta' reporter ta' Luciferase

Iċ-ċelloli ġew ko-trasfettati b'kostrutti ta' reporter Smad4-3′-UTR-WT jew Smad4-3′-UTR-MT ta' tip selvaġġ u mutanti, rispettivament, u plasmidi tal-luċiferażi ta' kontroll intern. Wara t-trasfezzjonijiet, l-attivitajiet ta 'luciferase ġew skoperti minn Sistema ta' Assaġġ Dual-Glo Luciferase (Promega, Sunnyvale, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Il-pjanċi nqraw fuq Reporter Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). L-attivitajiet relattivi tal-luċiferażi ġew normalizzati għal dawk tar-Renilla luciferase.

Analiżi Western blot

Iċ-ċelloli ġew maħsula bl-użu ta’ 1 × phosphate-buffered saline (PBS) u lysed f’lysis buffer (50 mM Tris-base (pH7.5), {{10}}.5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), 1 mM -mercaptoethanol, 1 fil-mija NP-40, 1 fil-mija gliċerol, u pilloli cocktail inibitur tal-protease (Roche Molecular Biochemicals, Upper Bavaria, Ġermanja) għal 30 min fuq is-silġ u mbagħad ċentrifugati f' 12,000 × g għal 10 min fi gradi 4. Is-supernatanti nġabru f'tubi mikroċentrifugati ta' 1.5 mL. Il-konċentrazzjoni tal-proteina f'dawn is-supernatanti ġiet determinata bil-metodu Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kampjuni li fihom ammonti ugwali ta 'proteina (20 ug) ġew separati permezz ta' 6 fil-mija -12 fil-mija gradient sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) u mbagħad trasferiti fuq membrani polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Il-membrani ġew imblukkati bl-użu ta 'buffer ta' imblukkar (5 fil-mija ħalib xott bla xaħam, 20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, u 0.1 fil-mija Tween 20) għal siegħa f'RT. Imbagħad, membrani inkubati b'antikorpi primarji (1: 1,000 dilwizzjoni) kontra TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{{ 50}}, Santa Cruz),COL1A1 (sc-28657, Santa Cruz), COL3A1 (sc-271249,Santa Cruz), p16 ({10883-1-AP, Proteintech), p21 (sc-271249 {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc{-32233, Santa Cruz), u Histone H1 (sc-10806 , Santa Cruz) matul il-lejl f'4 gradi. Imbagħad, ġew inkubati b'antikorpi sekondarji xierqa (1:80, 000 dilwizzjoni), antifenek (A0545), antiġrieden (A9044), jew antimogħoż (A5420) IgG (Santa Cruz Biotechnology) għal siegħa f'RT. L-immunoblots ġew skoperti b'sottostrat tal-perossidażi tar-ravan (HRP) imtejjeb ta' kimiluminixxenza (ECL) (Millipore) bl-użu ta' ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, UK).

Estrazzjoni ta' proteina nukleari

Frazzjonijiet ċitosoliċi u nukleari ġew iżolati bl-użu ta 'Kit ta' Frazzjoni Nukleari/Ċitosol (BioVision, Milpitas, CA, USA) skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, iċ-ċelloli nġabru u ġew lisati f'buffer ta 'estrazzjoni ta' ċitosol (CEB) li kien fih 1 mM DTT u inibituri tal-protease. Wara ċ-ċentrifugazzjoni fi 12,000 rpm għal 2 min, supernatanti (frazzjonijiet ċitosoliċi) ġew trasferiti għal tubi ġodda. Imbagħad, ġie miżjud buffer tal-estrazzjoni nukleari (NEB) supplimentat b'1 mM DTT u inibituri tal-protease, imħawwad għal 15 s, u inkubat għal 10 min għal 40 min. Il-kontenut tal-proteini ġie kkwantifikat permezz ta 'assaġġ Bradford (Bio-Rad) u l-proteini ġew separati fuq 8 fil-mija -12 fil-mija gradjent SDS-PAGE għall-analiżi tal-western blot.

Estrazzjoni tal-RNA u qRT-PCR

L-RNA totali ġie estratt bl-użu ta 'kit kummerċjali Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, CA, USA) skont il-protokoll tal-manifattur [65, 66]. miRNAs ġew traskritti b'lura għal cDNA bl-użu ta 'kit ta' sinteżi ta 'cDNA miRNA (Takara, Shiga, Japan) kif deskritt qabel [16, 67]. L-espressjoni ta' hsa-miR-4535 u Smad4 ġiet skoperta permezz ta' PCR f'ħin reali f'Sistemi LightCycler 96 (Roche, Basel, l-Isvizzera) bl-użu tal-protokoll standard LightCycler 480 SYBR Green I Master. Ir-reazzjoni tal-PCR 10 μL inkludiet 2 μL cDNA, 5 μL 2× SyberGreen PCR Mix, 0.5 μL forward primer (10 μM), 0.5 μL reverse primer (10 μM), u 2 μL ddH2O. Ir-reazzjonijiet kollha twettqu fi tliet kopji. Għall-iskoperta tal-mRNA, iċ-ċiklu tal-limitu (Ct) ġie ddeterminat għal kull ġene u l-espressjoni ta 'kull ġene relattiva għal dik ta' GAPDH ġiet ikkalkulata bħala 2ΔCt fejn ΔCt=(ġene Cttarget - CtGAPDH). Għall-iskoperta ta 'miRNA, Ct ġiet iddeterminata għal kull ġene u l-espressjoni ta' kull ġene relattiva għal dik ta 'U6 rRNA ġiet ikkalkulata bħala 2ΔCt fejn ΔCt=(Cthsa-miR-4535 - CtU6 rRNA). Il-primers forward (F) u reverse (R) użati biex jiskopru l-espressjoni ta' miRNA u mRNA kienu: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); uman-Smad4 (F′-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R′- ATACGTGGACCCTTCTG GA); uman-GAPDH (F′-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R′-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); ġurdien-Smad4 (′'-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R′-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); ġurdien-GAPDH (F′-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R′-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).


Analiżi tal-immunofluworexxenza

Iċ-ċelloli HS68 ġew iffissati bl-użu ta' 4 fil-mija paraformaldehyde għal 15-il minuta f'RT, permeabilizzati b'{3}}.1 fil-mija Triton X-100 għal 15-il minuta f'RT, u mbagħad imblukkati b'5 fil-mija albumina tas-serum bovin għal 10 min f' RT. Minn hemm 'il quddiem, iċ-ċelloli ġew maħsula u mtebbgħin b'antikorpi sekondarji Alexa Fluor 594 tal-mogħoż kontra l-ġurdien jew Alexa Fluor 488 ħmar anti-mogħoż IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA,USA) għal 2 sigħat f'RT. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew maħsula b'1 × PBS u mtebbgħin b'DAPI biex jinstabu nukleu taċ-ċelluli (bluestain) għal 1 min f'RT. Stampi għat-tbajja 'Smad4 u p smad2/3 fiċ-ċelloli HS68 inqabdu bl-użu ta' mikroskopju afluworexxenti (DP73, Olympus, Tokyo, Ġappun).


Sejbien ta 'ROS totali u mitokondrijali

ROS totali u mitokondrijali ġew skoperti bl-użu ta '2',7'-Dichlorofluorescin diacetate DCFH-DA (D6883, Sigma-Aldrich) u indikatur ta' superossidu mitokondrijali aħmar MitoSOX (Invitrogen, M36008). Iċ-Ċelloli HS68 ġew inkubati b'5 μM DCFH-DA u 2 μM MitoSOX f'37 grad għal 30 min. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew maħsula b'1 × PBS u mtebbgħin b'DAPI biex jinstabu nukleu taċ-ċelluli (tebgħa blu) għal 1 min f'RT. Il-kampjuni kollha ġew analizzati bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti (DP73, Olympus).

Kejl tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (MMP)

MMP ġie determinat billi skopra l-bidliet fil-potenzjal mitokondrijali bl-użu ta 'kit tat-tbajja' tal-mitokondrija (CS0390, Sigma-Aldrich) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Iċ-ċelloli HS68 ġew miżrugħa fi 4-slajds tajjeb għal 24 siegħa qabel it-trattament. Wara t-trattament, iċ-ċelloli ġew maħsula b'1 × PBS u inkubati b'JC-1 f'temperatura ta' 37 grad għal 20 minuta u mbagħad maħsula darbtejn b'JC-1buffer taż-żebgħa. Immaġini nqabdu permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti (Olympus). Fluworexxenza ħamra (JC aggregata-1) indikat mitokondrija intatta, filwaqt li fluworexxenza ħadra (JC monomerika-1) indikat mitokondrija indebolita.


Tbajja ta' Annexin V u propidium iodide (PI) permezz ta' flow cytometry

Iċ-ċelloli apoptotiċi ġew imtebba 'b'Annexin V u PI u mbagħad ġew skoperti permezz ta' ċitometrija tal-fluss bl-użu ta 'tbajja'. Fil-qosor, iċ-ċelloli HS68 ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti (50, 100, 200, 300, u 400 µM) ta 'H2O2 għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli mbagħad inġabru permezz ta 'trypsinization u mtebbgħin bl-użu ta' kit ta 'skoperta ta' apoptosi ta 'Annex V u PI (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) skond il-protokoll tal-manifattur. Iċ-ċitometrija tal-fluss saret fil-Faċilità Core tal-Issortjar taċ-Ċelluli Attivati ​​bil-Fluworexxenza (FACS), l-Università Medika taċ-Ċina, it-Tajwan, bl-użu ta 'sistema FACS Canto™ (BD Biosciences).

Tbajja ta' -galactosidase (SA- -gal) assoċjata mas-senescence

Il-kit tat-tbajja' ta' SA{{0}}gal (9860, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) intuża biex jinstabu ċelluli senescent. Fil-qosor, iċ-ċelloli HS68 (20,000 ċelluli/bir) ġew ikkultivati ​​fuq slides għal 24 siegħa, iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde għal 10 minuti, maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ, u mbagħad inkubati matul il-lejl f'37 grad b'X- Gal f'pH 6.0. Wara l-ħasil, iċ-ċelloli tat-tixjiħ imtebbgħin blu ġew fotografati bl-użu ta 'mikroskopju tad-dawl (Olympus, Tokyo, Ġappun).

Mudelli tal-annimali

Ġrieden nude C57BL/6J ta 'erba' ġimgħat inkisbu minn BioLasco Taiwan Co., Ltd, Taipei, Tajwan. Skont il-protokolli taċ-Ċentru Nazzjonali tal-Annimali tal-Laboratorju (NLAC), l-annimali kienu miżmuma fiċ-Ċentru tal-Annimali tal-Università Medika taċ-Ċina taħt kundizzjonijiet ta' temperatura kkontrollata (22-24 grad) u ċiklu ta' 12-h dawl-dlam b'aċċess ħieles għal dieta standard tal-laboratorju u ilma tal-vit matul il-perjodu sperimentali. Ir-reġjuni tal-ġilda dorsali tal-ġrieden kienu mmarkati bil-linka tal-Indja u l-annimali kienu maqsuma f'erba 'gruppi (n=6/grupp): kontroll flimkien ma' grupp ta 'vetturi, irradjat bl-UVB flimkien ma' grupp ta 'vetturi, irradjat bl-UVB flimkien ma' doża baxxa ( 12 mg/kg) grupp ittrattat bil-galanin, u irradjat bl-UVB flimkien ma' doża għolja (24 mg/kg)ittrattati bi cistanchegrupp. Iż-żoni tal-ġilda allokati ġew irradjati b'150 mJ/cm2 UVB għal kull espożizzjoni u ttrattati topikament b'vettura jew cistanche tliet darbiet fil-ġimgħa għal 8 ġimgħat. Wara li jiżnu ġurdien ġisempiż, cistanche kien ippreparat frisk f'konċentrazzjoni ta '12 mg/kg u 24 mg/kg fi propylene glycol/etanol/H2O (1:1:8). Soluzzjoni (100uL) ġiet applikata topikament għas-siti magħżula (2 × 2 cm) fuq il-ġilda dorsali tal-ġrieden. Għall-espożizzjoni UVB, ġrieden tqiegħdu f'kaxxa UV crosslinker li kienet mgħammra b'bozoz UVB. Qabel ma l-ġrieden irċevew irradjazzjoni UVB, il-kontroll (żona mhux esposta għall-UVB) kien miksi bi stiker kontra l-UV. Dożi differenti ta 'cistanche jew vettura ġew applikati topikament fuq il-ġilda dorsali tal-ġrieden wara espożizzjoni UVB. Fi tmiem l-esperiment l-annimali kollha ġew miżuna u sagrifikati. Imbagħad, il-ġilda dorsali tagħhom ġiet imnaqqsa malajr, iffriżata immedjatament fin-nitroġenu likwidu, u maħżuna f'-80 grad għal analiżi ta 'proteini u RNA; parti ġiet iffissata b'soluzzjoni ta 'formalina ta' 10 fil-mija għal tbajja istoloġika.


Eżami istoloġiku

Il-kampjuni tal-bijopsija tal-ġilda ġew iffissati f'10 fil-mija formalin u reidratati bl-użu ta 'gradjent ta' alkoħol (100 fil-mija, 95 fil-mija, u 75 fil-mija) għal mill-inqas 24 siegħa. Imbagħad, il-kampjuni ġew inkorporati fix-xama 'tal-paraffin u qasmu bi ħxuna ta' 0.5 μm. Il-flieli tal-ġilda inkorporati kienu mtebbgħin b'ematossilin u eosina (H & E) u trikromju (MT) ta 'Masson biex jevalwaw l-istruttura tal-ġilda u l-kontenut tal-fibra tal-kollaġen, rispettivament. Immaġini nqabdu permezz ta 'mikroskopju tad-dawl (Olympus).


Immunoistokimika

Il-kampjuni ta 'tessut tal-ġilda ħxuna ta' 0.5 μm inkorporati ġew imnixxfa f'60 grad matul il-lejl wara dewaxing fi xylene għal 30 min, u reidratazzjoni f'100 fil-mija etanol għal 30 min. L-attività tal-perossidasi endoġena ġiet imblukkata b'inkubazzjoni f'buffer li jimblokka l-perossidu tal-idroġenu (3 fil-mija H2O2) għal 10 min. Wara li tlaħlaħ is-sezzjonijiet bl-ilma tal-vit għal 15-il minuta, twaħħil mhux speċifiku ġie mblukkat permezz ta 'inkubazzjoni b'serum taż-żiemel ta' 2.5 fil-mija għal 10 min. Imbagħad, is-sezzjonijiet ġew inkubati b'antikorpi primarji (dilwizzjoni 1:100) matul il-lejl f'4 gradi. Wara l-ħasil b'1 × PBS, il-kampjuni ġew ittrattati b'antikorpi sekondarji għal 10 min f'RT. Sussegwentement, HRP Polymer ġie miżjud mal-pjastri għal 10 min f'RT, segwit minn applikazzjoni ta 'substrat DAB (Roche) għal 15 s f'RT. Imbagħad, il-kampjun kien imtebba b'ematossilin għal 5 minuti f'RT. Fl-aħħarnett, il-kumpless tessut-polimeru ġie skopert permezz ta 'mikroskopju tad-dawl (Olympus).

Analiżi statistika

L-esperimenti kollha saru mill-inqas tliet darbiet. Analiżi statistiċi saru bl-użu ta 'softwer statistiku Graph Pad Prism5 (Graph Pad Software Inc., San Diego, CA, USA). Id-differenzi bejn il-mezzi ta' gruppi multipli ġew evalwati permezz ta' analiżi tal-varjanza. Id-dejta ġiet analizzata b'ANOVA one-way separata. Differenzi bejn il-mezzi individwali kienudeterminat jew mit-testijiet ta’ Tukey jew ta’ Dunnett. Id-dejta kwantitattiva hija ppreżentata bħala l-medja ± SD li tikkorrispondi għal tliet repliki jew aktar. Valur P< 0.05 was considered statistically significant. 


KONTRIBUZZJONIJIET TA' L-AWTUR

Kunċettwalizzazzjoni: WWK, CYH, JJL; Akkwist ta' Finanzjament: JJL; Investigazzjoni: YTN; Metodoloġija: SCN, YTN; Amministrazzjoni tal-Proġett: YTN; Riżorsi: WWK, CYH, JJL; Superviżjoni: WWK, JSL; Validazzjoni: CJC; Kitba - Tħejjija ta' Abbozz Oriġinali: YTN; Kitba - Reviżjoni u Editjar: SCN, WWK, VVP. WWK* u CYH* kkontribwew b'mod ugwali għal dan ix-xogħol. KONFLITTI TA' INTERESS

L-awturi ma jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess relatat ma' dan l-istudju.

FINANZJAMENT Dan l-istudju kien appoġġjat minn għotjiet mill-Ministeru tax-Xjenza u t-Teknoloġija (MOST 109-2320- B-039-038-MY3) u China Medical University (CMU110-MF{-39).


REFERENZI

1. Farage MA, Miller KW, Elsner P, Maibach HI. Fatturi intrinsiċi u estrinsiċi filtixjiħ tal-ġilda: reviżjoni. Int J Cosmet Sci. 2008; 30:87–95. https://doi.org/10.1111/j.1468-2494.2007.00415.x PMID:18377617 2. Mauviel A. It-trasformazzjoni tas-sinjalar tal-fattur tat-tkabbir-beta fil-ġilda: cross-talk stromali għal epiteljali. J Invest Dermatol. 2009; 129:7–9. https://doi.org/10.1038/jid.2008.385 PMID:19078982

3. Naylor EC, Watson RE, Sherratt MJ. Aspetti molekulari tatixjiħ tal-ġilda. Maturitas. 2011; 69:249–56. https://doi.org/10.1016/j.maturitas.2011.04.011 PMID:21612880

4. Kähäri VM, Saarialho-Kere U. Matrix metalloproteinases fil-ġilda. Exp Dermatol. 1997; 6:199–213. https://doi.org/10.1111/j.1600-0625.1997.tb00164.x PMID:9450622

5. Kim HH, Lee MJ, Lee SR, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH. Żieda tat-tikmix tal-ġilda kkaġunat mill-UV permezz ta 'irradjazzjoni infra-aħmar fil-ġrieden bla pil. Mech Aging Dev. 2005; 126:1170–77. https://doi.org/10.1016/j.mad.2005.06.003 PMID:16118013

6. Baumann L. Tixjiħ tal-ġilda u t-trattament tagħha. J Pathol. 2007; 211:241–51. https://doi.org/10.1002/path.2098 PMID:17200942

7. Massagué J. TGF sinjalazzjoni fil-kuntest. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012; 13:616–30. https://doi.org/10.1038/nrm3434 PMID:22992590

8. Murphy AM, Wong AL, Bezuhly M. Modulazzjoni tas-sinjalar ta 'angiotensin II fil-prevenzjoni tal-fibrożi. Tiswija tat-Tessut tal-Fibroġenesi. 2015; 8:7. https://doi.org/10.1186/s13069-015-0023-z PMID:25949522

9. Tu Y, Quan T. Stress Ossidattiv u Tixjiħ tat-Tessut Konnettiv tal-Ġilda tal-Bniedem. Kożmetiċi. 2016; 3:28. https://doi.org/10.3390/cosmetics3030028 10. Chung JH, Youn SH, Kwon OS, Eun HC, Kim KH, Park KC, Cho KH, Youn JI. Proliferazzjoni mtejba u sintesi tal-kollaġen tal-fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem f'ġilda b'mod kronikament fotoħsara. Photodermatolwww.aging-us.com 25361 TIJĦID Photoimmunol Photomed. 1996; 12:84–89. https://doi.org/10.1111/j.1600-0781.1996.tb00180.x PMID:8897594

Staqsi għal aktar:

Email:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: flimkien ma' 86 15292862950

Tista 'Tħobb ukoll