It-Tagħlim tal-Biża' Qabel Jippermetti L-Assimilazzjoni Rapida ta' Memorji Ġodda tal-Biża' Direttament F'Netwerks Kortikali Parti 3

Disinn sperimentali

Ir-riproduċibbiltà tad-dejta ġiet ivvalutata b'repliki differenti (Tabella S1). L-ewwel esperimenti ta 'inattivazzjoni CNQX f'Te2 (Fig 1A-1C) saru f'numru ogħla ta' repliki minħabba li kienu l-ewwel esperimenti li wettaqna u servew biex tittestja l-ipoteżi ewlenija tal-istudju tagħna. L-annimali kienu a priori assenjati għal gruppi ta 'mġieba differenti b'mod ibbilanċjat mal-piż. Annimali maskili mill-istess nilda ġew assenjati b'mod każwali għal kull grupp sperimentali. L-ewwel indirizzajna l-ipoteżi ewlenija tal-istudju tagħna, jiġifieri, l-inattivazzjoni tal-kortika tista 'taffettwa b'mod differenti l-konsolidazzjoni ta' memorja ġdida tal-biża 'f'firien naïve b'mod sperimentali u f'annimali li kienu tgħallmu avveniment ta' biża' minn qabel.

L-annimali rġiel għandhom memorji qawwija ħafna minħabba li għandhom istint ta 'sopravivenza aktar b'saħħtu u xewqa li jirriproduċu. Annimali li jgħixu fis-selvaġġ jeħtieġ li jiftakru ħafna informazzjoni ġeografika, tipi ta 'ikel, binarji tal-predaturi, u l-postijiet tal-membri tal-grupp biex jadattaw aħjar għall-ambjent u jipproteġu l-ħajja.

Pereżempju, l-iljuni maskili jeħtieġ li jiftakru l-istatus tat-territorju kollu, ir-relazzjonijiet tas-sħubija, u l-postijiet tal-kompetituri biex jipproteġu t-territorju u l-istatus tagħhom. Iż-żebri maskili jeħtieġ li jiftakru l-post tas-sorsi tal-ilma u l-ikel fuq il-mergħat biex jgħixu u jirriproduċu. Kumpanija tas-soda darba ħarġet reklam li juri li ors polari maskili seta’ jiftakar bugħaddas u r-riħa unika tiegħu sabiex ikun jista’ jidentifikah id-darba li jmiss rawh.

Għalhekk, l-annimali rġiel jeħtieġ li jkollhom memorji b’saħħithom f’termini ta’ protezzjoni tat-territorju tagħhom, jipprovdu biżżejjed ikel, u jirriproduċu l-frieħ. Dan jagħmilhom ukoll suġġetti importanti fir-riċerka tal-bniedem, pereżempju, biex jesploraw mard bħal indeboliment tal-memorja u l-marda ta 'Alzheimer.

Fid-dinja tal-bniedem, nistgħu wkoll nieħdu ispirazzjoni mill-memorja tal-annimali rġiel. L-espożizzjoni kontinwa għal affarijiet ġodda, it-tagħlim kontinwu u l-ħsieb jistgħu jtejbu l-memorja u l-adattabilità tagħna, u jtejbu l-istandards tal-għajxien u l-effiċjenza tax-xogħol tagħna. Għalhekk, ejjew nitgħallmu minn annimali maskili, inkomplu nakkumulaw għarfien u esperjenza, ikollna instinti ta 'sopravivenza qawwija u xewqat riproduttivi, u noħolqu futur aħjar. Wieħed jista 'jara li għandna bżonn ntejbu l-memorja tagħna. Cistanche deserticola jista 'jtejjeb b'mod sinifikanti l-memorja minħabba li Cistanche deserticola huwa materjal mediċinali tradizzjonali Ċiniż b'ħafna effetti uniċi, li wieħed minnhom huwa li jtejjeb il-memorja. L-effikaċja tal-laħam ikkapuljat ġejja mid-diversi ingredjenti attivi li fih, inklużi l-aċidu, il-polisakkaridi, il-flavonoids, eċċ. Dawn l-ingredjenti jistgħu jippromwovu s-saħħa tal-moħħ b'diversi modi.

Ikklikkja taf modi biex ittejjeb il-funzjoni tal-moħħ

Fil-każ ta 'differenzi statistiċi bejn dawn il-gruppi, imbagħad eventwalment wettaqna gruppi ta' kontroll addizzjonali permezz tal-injezzjoni ta 'salina. Approċċ simili ġie applikat għall-esperimenti optoġenetiċi, fejn il-grupp ta 'kontroll AAV sar biss wara li ġew skoperti differenzi statistiċi bejn firien naïve u mħarrġa qabel. Dawn l-iskedi sperimentali ppermettewlna nevitaw gruppi ta 'kontroll bla bżonn u l-użu ta' annimali mhux meħtieġa, kwistjoni ewlenija fil-leġiżlazzjoni Ewropea u Taljana dwar l-esperimentazzjoni fuq l-annimali (prinċipju 3 Rs).

Proċeduri ta' mġiba

L-esperimenti kollha twettqu matul il-fażi ħafifa tal-ġurnata (8 AM sa 4 PM). L-annimali ġew trasportati singolarment mill-faċilità għall-kmamar sperimentali fi bramel żgħar trasparenti differenti skont it-talbiet sperimentali.

Taħriġ tas-smigħ: L-ewwel sessjoni ta’ mġiba. Annimali kondizzjonati mill-biża' tas-smigħ (CS1-CS2). F'dan il-grupp, il-firien ttieħdu bil-mod mill-gaġġa tad-dar tagħhom u nġarru mill-kamra tad-djar għall-kamra li ma tagħmilx ħsara lill-ħoss. Ladarba hemm, l-annimali tqiegħdu ġewwa l-apparat ta 'kondizzjonament li jikkonsisti f'gaġġa sewda rettangolari (35 × 40 cm) mgħammra bi gradilja tal-vireg tal-istainless steel (1 ċm fid-dijametru, spazjati 1.5 ċm 'il bogħod minn xulxin) imqabbda ma' setup ta 'kunsinna ta' xokk.

Il-firien tħallew mhux disturbati għal minuta. Wara dan iż-żmien, ġew amministrati 7 stimuli kondizzjonati (CSs) li jikkonsistu f'ton pur ta '15 kHz ta' frekwenza (15 s ta 'tul kull wieħed, 80 dB, intervall ta' provi 36 s). L-aħħar 1 s ta 'kull ton kien imqabbel ma' US bl-uġigħ (0.5 mA, 1 s). Fl-aħħar tas-sessjoni ta 'kondizzjonament, il-firien tressqu lura fil-gaġġa tad-dar tagħhom.

Annimali xokk biss (shock-CS2). F'dan il-grupp, il-firien tqiegħdu bl-istess mod ġewwa l-istess apparat ta 'kondizzjonament. Immedjatament wara, kull far kien suġġett għal 7-xokkijiet tas-saqajn (1 s, 0.5 mA) wieħed immedjatament wara l-ieħor. Fi tmiem l-istimulazzjoni, l-annimali nġiebu lura fil-gaġġa tad-dar tagħhom. Il-permanenza tal-ħin fil-gaġġa tal-kondizzjonament kienet inqas minn 9 sekondi. Studji preċedenti wrew li din il-proċedura tippermetti li jiġu evitati proċessi assoċjattivi bejn stimuli bl-uġigħ u stimuli sensorji [29,30].

Riħa annimali kondizzjonati mill-biża' (riħa-CS2). F'dan il-grupp, il-firien tqiegħdu ġewwa l-istess gaġġa sewda rettangolari użata fil-gruppi sperimentali ta 'hawn fuq u konnessi ma' setup ta 'kunsinna ta' xokk. Il-firien tħallew mhux disturbati għal 2 min. Wara dan iż-żmien, ġew amministrati 7 CSs li jikkonsistu f'irwejjaħ tal-vanilla (10 s ta' tul kull wieħed, intervall ta' prova ta' 24 s). L-aħħar 1 s ta 'kull riħa kienet imqabbla ma' US bl-uġigħ (0.5 mA, 1 s). Il-modulu ta 'kondizzjonament tqiegħed ħdejn sors ta' ventilazzjoni biex tiġi evitata l-persistenza ta 'l-istimoli mogħtija wara l-offset tagħhom. Il-gaġġa kienet żgurata bi gradilja ta 'fuq. L-irwejjaħ ġew ippreżentati bl-użu ta' olfactometer ta' dilwizzjoni tal-fluss. Arja nadifa (1.5 L/min) kienet diretta lejn valv tas-solenojd, li meta jitħaddem, għadda l-arja għal flixkun ta '15 ml li kien fih 10 ml ta' riħa tal-vanilla.

Annimali tat-ton biss (Tone-CS2). Il-firien f'dan il-grupp tpoġġew ġewwa l-istess gaġġa sewda u ġew ippreżentati bit-ton 15-kHz (7 stimuli, 15 s ta 'tul, 36 s ITI) mogħtija fl-assenza tal-Istati Uniti.

Annimali esposti minn qabel (Tone-CS1-CS2). Il-firien tpoġġew ġewwa l-gaġġa tal-kondizzjonament u, 1 min wara, ġew ippreżentati 20 darba bit-ton 15-kHz waħdu, u 24 siegħa wara l-istess ton ġie mqabbad mal-Istati Uniti li saret is-CS1.

Annimali tal-ħsejjes abjad ikkundizzjonati mill-biża’ (WN-CS2). F'dan il-grupp, il-firien tqiegħdu ġewwa l-gaġġa sewda rettangolari u tħallew mhux disturbati għal minuta. Wara dan iż-żmien, ġew amministrati 7 CSs li jikkonsistu f'WN (15 s ta' tul kull wieħed, 75 dB, 36 s intervall bejn il-provi). L-aħħar 1 s ta 'kull ton kien imqabbel ma' US bl-uġigħ (0.5 mA, 1 s). Fl-aħħar tas-sessjoni ta 'kondizzjonament, il-firien tressqu lura fil-gaġġa tad-dar tagħhom.

Tagħlim tal-biża' tas-smigħ: It-tieni taħriġ fl-imġieba. Ġimagħtejn wara l-proċeduri deskritti fil-paragrafu ta 'hawn fuq, l-annimali ġew imħarrġa f'kompitu ieħor differenti ta' kondizzjonament tal-biża 'smigħ. Il-firien tpoġġew f'kaxxa standard tal-ġilda, bħal fil-ħidma preċedenti tagħna [10], u tħallew mhux disturbati għal 2 min. Wara dan iż-żmien, ġew ikkunsinnati 7 CSs li jikkonsistu minn tones puri ta '3 kHz ta' frekwenza (8 s ta 'tul kull wieħed, 80 dB, 22 s intervall inter-trial). L-aħħar 1 s ta 'kull ton kien imqabbel ma' US bl-uġigħ (0.5 mA, 1 s). Fl-aħħar tas-sessjoni ta 'kondizzjonament, il-firien tressqu lura fil-gaġġa tad-dar tagħhom.

Biża 'żamma tal-memorja. Iż-żamma tal-memorja tal-biża 'smigħ akkwistata reċentement lis-CS2 (3 kHz) ġiet ittestjata 4 ijiem wara. Għal esperimenti optogenetics, it-test tal-memorja reċenti sar bil-laser kunsinna 24 siegħa wara t-tagħlim CS2-US b'analoġija għall-intervall ta 'ħin li fih wettaqna inattivazzjoni kortikali permezz tal-amministrazzjoni tas-CNQX (jiġifieri, 24 siegħa wara taħriġ). Il-firien kienu abitwati għal apparat differenti minn dak użat għall-kondizzjonament u mqiegħda f'kamra differenti biex tiġi evitata mġiba ta 'biża' kondizzjonata għal indikazzjonijiet kuntestwali [10,62].

L-apparat il-ġdid kien jikkonsisti f'gaġġa tal-plastik trasparenti b'ġenb miżbugħ iswed magħluq f'kaxxa li ttaffi l-ħoss mgħammra b'fann tal-egżost, li elimina l-arja riħa mill-kompartiment u pprovda ħoss fl-isfond ta' 60 dB. L-annimali tħallew jesploraw il-gaġġa għal 5 minuti kuljum matul is-sessjoni ta 'abitazzjoni. Fil-jum tat-test taż-żamma tal-memorja tal-biża ', wara 2 min ta' esplorazzjoni b'xejn, ikkunsinnajna 4 CS2 ta '3 kHz (8 s—22 ITI) mhux segwit minn ebda US.

Jekk meħtieġ mid-domanda sperimentali, il-firien imbagħad ġew ittestjati għaż-żamma tal-memorja tal-biża remota, akkwistata ġimagħtejn qabel it-tieni prova ta 'kondizzjonament tal-biża' tas-smigħ. Għal dan il-għan, 7 ijiem wara t-test taż-żamma tal-memorja tal-biża' għat-ton 3-kHz, l-annimali tpoġġew f'ambjent ġdid (gaġġa strixxata iswed u abjad) u mbagħad ġew ippreżentati bit-ton 15-kHz. Erba 'tonijiet ġew ippreżentati f'intervalli ta' 36s.

Taħriġ kuntestwali: L-ewwel sessjoni ta 'mġieba. Grupp ta 'kondizzjonament tal-biża' kuntestwali (CtxA-CtxB). F'dan il-grupp, il-firien ttieħdu bil-mod mill-gaġġa tad-dar tagħhom, imqiegħda f'barmil, u nġarru mill-kamra tad-djar għall-kamra li ma tagħmilx ħsara lill-ħoss. Ladarba hemm, l-annimali tqiegħdu ġewwa l-apparat ta 'kondizzjonament li jikkonsisti mill-gaġġa sewda rettangolari msemmija qabel, mgħammra bil-grilja tal-vireg tal-istainless steel konnessa ma' setup ta 'kunsinna ta' xokk. Il-firien tħallew mhux disturbati għal minuta. Wara dan iż-żmien, 5 US (0.5 mA, 1 s) ġew amministrati b'intervalli ta 'ħin ta' 51 s. Fi tmiem is-sessjoni, l-annimali nġiebu lura fil-gaġġa tad-dar tagħhom.

Grupp ta' xokk biss (xokk-CtxB). Il-firien, ladarba jitpoġġew ġewwa l-apparat tal-kondizzjonament, immedjatament irċevew 5-xokkijiet tas-saqajn (1 s, 0.5 mA) wieħed immedjatament wara l-ieħor. Il-permanenza tal-ħin fil-gaġġa tal-kondizzjonament kienet inqas minn 7 sekondi. Studji preċedenti wrew li din il-proċedura tippermetti li jiġu evitati proċessi assoċjattivi bejn stimuli bl-uġigħ u stimuli sensorji [29,30].

Grupp ta' xokk biss (xokk-CtxB). Il-firien, ladarba jitpoġġew ġewwa l-apparat tal-kondizzjonament, immedjatament irċevew 5-xokkijiet tas-saqajn (1 s, 0.5 mA) wieħed immedjatament wara l-ieħor. Il-permanenza tal-ħin fil-gaġġa tal-kondizzjonament kienet inqas minn 7 sekondi. Studji preċedenti wrew li din il-proċedura tippermetti li jiġu evitati proċessi assoċjattivi bejn stimuli bl-uġigħ u stimuli sensorji [29,30].

Kundizzjonament ġdid tal-biża' kuntestwali u żamma reċenti tal-memorja tal-biża '. Ġimagħtejn wara l-proċeduri deskritti fil-paragrafu ta 'hawn fuq, il-gruppi kollha ġew imħarrġa biex jassoċjaw ambjent kuntestwali ġdid (il-modulu tal-kaxxa tal-ġilda, imqiegħed f'kamra differenti) ma' US bl-uġigħ (0.5 mA, 1 s) . Kull annimal tpoġġa ġewwa l-kamra l-ġdida u tħalla mhux disturbat għal 2 min. Imbagħad, kien espost għal 5 US separati b'intervalli ta '30 s.

Iż-żamma tal-memorja tal-biża' kuntestwali ġiet ittestjata 4 ijiem wara l-proċedura ta 'kondizzjonament tal-biża' billi reġgħu poġġew il-firien fil-kamra tal-kaxxa Skinner għal 3 min. Għal esperimenti optogenetics, it-test tal-memorja reċenti sar bil-laser kunsinna 24 siegħa wara t-tagħlim CtxB-US b'analoġija għall-intervall ta 'żmien li fih wettaqna inattivazzjoni kortikali permezz tal-amministrazzjoni tas-CNQX (jiġifieri, 24 siegħa wara t-taħriġ). Jekk meħtieġ mid-domanda sperimentali, il-firien imbagħad ġew ittestjati għaż-żamma tal-memorja tal-biża 'remota billi tpoġġi l-annimali fil-kuntest imqabbla mal-Istati Uniti ġimgħatejn qabel l-assoċjazzjoni l-ġdida.

L-annimali nġarru f'2 bramel differenti lejn il-kmamar tal-kondizzjonament skont il-proċeduri kuntestwali differenti.

Miżura tal-iffriżar. Fil-proċeduri sperimentali kollha, il-valutazzjoni taż-żamma tal-memorja tal-biża 'kienet iddeterminata bħala rispons tal-iffriżar [10], analizzat bħala n-nuqqas sħiħ ta' mobilità somatika ħlief għal movimenti respiratorji. Għal kull annimal, l-ammont ta 'ħin (f'sekondi) mqatta' fl-iffriżar tkejjel offline minn 2 osservaturi indipendenti li kienu blinded għall-gruppi ta 'annimali.

Proċeduri kirurġiċi

Biex jiġu amministrati s-sustanzi magħżula fis-siti fil-mira, il-firien ġew anestetizzati b'isoflurane: L-induzzjoni saret f'4% [vol/vol] f'2 L/min arja medika u estiża għal espożizzjoni kontinwa f'2% [vol/vol]) meta l-firien kienu mmuntati fl-apparat stereotassiku.

Saret inċiżjoni tal-kranju, u ġew imtaqqbin toqob żgħar tal-burr biex jippermettu l-penetrazzjoni ta' labra tal-infużjoni ta' 28-gauge. Intużat siringa 10-ul Hamilton immuntata fuq pompa tal-infużjoni biex iwasslu s-sustanzi. Wara l-infużjonijiet, il-labra tħalliet f'postha għal 3 minuti oħra. L-inċiżjoni mbagħad ingħalqet bi klipps tal-feriti tal-istainless steel, u l-annimal ingħata injezzjoni taħt il-ġilda tal-ketoprofen analġeżiku/anti-infjammatorju (2 mg/kg piż tal-ġisem), u l-annimal inżamm sħun u taħt osservazzjoni sakemm irkupru mill-anestesija.

Bħal fi studji preċedenti [10,32-34], il-kannulazzjoni tal-annimali ma kinitx meħtieġa, bil-komposti attivi jiġu amministrati direttament b'mod stereotassiku. Din il-proċedura hija vantaġġuża minħabba li t-trawma kirurġika inerenti għall-proċedura ta 'kannulazzjoni permanenti hija evitata, u b'hekk tirrestrinġi t-trawma għal penetrazzjoni waħda ta' labra [10,32-34]. Tabilħaqq, l-anestesija ġenerali ma taffettwax b'mod sinifikanti l-konsolidazzjoni tal-memorja [10,32-34]. Biex jiġi żgurat li l-ħin tal-amministrazzjoni tal-komposti relatat mal-prova tat-tagħlim kien preċiż sabiex il-firien irċevew il-komposti magħżula madwar siegħa u madwar jum wara t-taħriġ, l-anestesija tal-isoflurane ġiet indotta 5 min qabel iż-żmien tal-injezzjoni ppjanata, eż. f'55. min fil-firien ittrattati 60 min wara t-taħriġ u 23 siegħa u 55 min f'annimali injettati f'24 siegħa wara t-taħriġ. Kull far kien ikkundizzjonat u mbagħad operat separatament. Annimali li jappartjenu għall-gruppi differenti ta 'mġieba ġew manipulati b'mod interleaved.

L-inibitur selettiv tar-riċetturi AMPA/kainate glutamate CNQX ({{0}}Cyano-7-nitroquinoxaline{-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] ġie maħlul f'soluzzjoni salina sterili (NaCl, 0.9%) u aġġustat għal pH 7.4 b'HCl. L-inibitur tas-sintesi tal-proteini anisomycin (Merck, 125 ug/ul) ġie maħlul f'HCl ekwimolari, dilwit b'salina sterili, u aġġustat għal pH 7.4 b'NaOH. Salina sterili (0.9% NaCl) intuża bħala kontroll tal-vettura. Dawn is-sustanzi ġew injettati b'mod bilaterali b'rata ta' 0.1 ul/min u volum ta' 0.5 ul għal kull sit fil-koordinati sterjotassiċi li ġejjin meħuda minn Paxinos u Watson atlas [26], bil-kamp kortikali Te2 rreferut għall-atlas ta' Zilles [25]:

Kortiċi tas-smigħ sekondarju (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Cortex cingulate anterjuri (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) AP: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Il-volum ta 'injezzjoni (0.5 ul għal kull sit) intgħażel abbażi ta' studji preċedenti fejn komposti attivi ġew injettati f'Te2 [10,34] u ACC [55,63] fi firien adulti.

Biex jiġi inattivat l-ippokampus dorsali, il-komposti attivi ġew injettati f'volum ta' 0.6 ul għal kull sit fil-koordinati stereotassiċi li ġejjin:

Hippokampus dorsali: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Il-leżjonijiet irriversibbli tal-ippocampal dorsali ġew indotti bl-amministrazzjoni ta' NMDA (Tocris, 18 ug/ul, maħlul f'soluzzjoni salina sterili, 0,4 ul għal kull sit) b'rata ta' 0.1 ul/ min f'punti fil-koordinati msemmija hawn fuq. L-istess koordinati ntużaw għal kontrolli injettati bis-salina u annimali mħaddma b'mod falz.

Retrobeads ħomor (Lumafluor, dilwizzjoni 1:2 fis-salina, 0.6 ul) ġew injettati f'BLA skont il-koordinati li ġejjin: AP: -2.8; L: ±5.4; DV: −8.3.

Fl-aħħar ta 'l-esperimenti, il-binarji tal-labra fil-każ ta' injezzjonijiet ta 'CNQX, anisomycin, jew salina jew l-estensjoni tal-leżjonijiet fil-każ ta' injezzjonijiet NMDA ġew verifikati istoloġikament. Il-firien kienu anestetizzati profondament u mxerrda intrakardjalment b'4% formaldehyde. L-imħuħ tagħhom tqassmu fi 30 μm fuq kriostat. Sezzjonijiet serjali mtebbgħin b'Nissl ġew ippreparati bl-użu tal-proċedura konvenzjonali u s-sezzjonijiet ġew verifikati istoloġikament taħt mikroskopju eżaltat f'2.5 ×.

Esperimenti optoġenetiċi

Injezzjoni tal-virus. Il-virus adeno-assoċjat AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-ċirasa u l-vettur ta' kontroll AAV5:CaMKII -cherry nkisbu mill-Università ta' North Carolina Vector Core (Chapel Hill, North Carolina, l-Istati Uniti tal-Amerika). Is-sentenzaViraltiter kien 5:8 Titer virali kien 5.8 × 10^12 vg/ml għaż-żewġ viruses. L-użu tal-promotur CaMKII jippermetti espressjoni transġene li tiffavorixxi newroni piramidali. Il-viruses kienu miżmuma fi friża ta’ −80˚C. Infużjonijiet virali mmirati lejn it-Te2 jew l-ACC saru fil-koordinati stereotassiċi ta 'hawn fuq fil-volumi ta' 0.5 ul għal kull toqba. Il-virus ġie injettat b'rata ta '0.1 ul/min, u l-labra tħalliet f'postha għal 5 min addizzjonali. Injezzjonijiet virali saru 4 ġimgħat qabel l-esperimenti tal-optoġenetika.

Illuminazzjoni.

Il-fibri ottiċi (Plexon, 200/230 μm qalba; 10 mm tul) ġew impjantati bilateralment fil-BLA (AP=-2.8, L=± 5.4, V=-8.2 mm minn bregma). L-inibizzjoni ottoġenetika ta 'projezzjonijiet Te2 għal BLA jew ta' projezzjonijiet ACC għal BLA inkisbet bl-użu tas-Sistema ta 'Stimolazzjoni Optoġenetika PlexBright akkoppjata ma' diode tal-laser (Teknoloġiji Laserglow). Dawl isfar (589 nm) jiġi ġġenerat u mgħoddi minn fibra ottika. Id-densità tal-qawwa stmata fil-ponta tal-fibra ottika kienet 10 sa 15 mW għall-illuminazzjoni ta 'siti ta' projezzjoni. Matul iż-żamma tal-memorja tal-biża ', l-emissjoni tad-dawl inbdiet 4 s qabel il-bidu tat-ton, ppersistiet matul it-ton, u twaqqaf 4 s wara l-offset tat-ton. Annimali li jappartjenu għal gruppi ta 'kondizzjonament tal-biża' kuntestwali rċevew stimulazzjoni ħafifa matul l-esplorazzjoni tal-kuntest kollu (3 min). Il-firien ġew familjari mal-korda tal-garża għal jumejn qabel il-prova taż-żamma tal-memorja.

Immunoistokimika. Mat-tlestija tal-esperimenti tal-optoġenetika, il-firien ġew anestetizzati profondament u mxerrda intrakardjalment b'4% PAF biex jeżaminaw it-tixrid tal-virus. L-imħuħ ġew dissected, maħżuna matul il-lejl f'4˚C, u finalment trasferiti għal 30% sukrożju. Sezzjonijiet koronali (30 μm) inqatgħu fuq kriostat u nġabru f'PBS. Sezzjonijiet li jżommu f'wiċċ l-ilma ġew inkubati f'soluzzjoni ta 'imblukkar għal siegħa f'RT. Imbagħad, ġew inkubati f'antikorp tal-ġurdien monoklonali primarju anti mCherry (dilwizzjoni 1:500, Abcam) fis-soluzzjoni ta 'imblukkar matul il-lejl f'RT. Sussegwentement, is-sezzjonijiet ġew maħsula b'PBS u inkubati għal siegħa f'RT b'antikorp fluworexxenti sekondarju AlexaFluor-568 kontra l-ġurdien (1:600, Invitrogen) dilwit f'PBS. Is-sezzjonijiet ġew maħsula f'PBS, immuntati b'mezzi ta 'immuntar li fihom DAPI (Vector), u l-coverslipped.

L-imħuħ tal-firien li għaddew minn injezzjonijiet NMDA inġabru bl-istess mod. Sezzjonijiet li jżommu f'wiċċ l-ilma, wara diversi tlaħliħ, ġew inkubati b'antikorp primarju tal-ġurdien monoklonali anti-Neun (1:1, 000 dilwizzjoni, Merck) fis-soluzzjoni ta 'imblukkar matul il-lejl f'temperatura tal-kamra. Sussegwentement, is-sezzjonijiet ġew maħsula bil-PBS u inkubati għal siegħa f'temperatura tal-kamra b'antikorp taż-żwiemel bijotinilat kontra l-ġurdien (dilwizzjoni 1:200, Vector). Il-kumpless avidin-biotin (kumpless ABC 1:100, Vector, 2 sigħat u nofs ta 'inkubazzjoni) kien akkoppjat ma' diaminobenzidine (0.03%, Merck) biex itebba lil Neun. It-taqsimiet imbagħad ġew laħlaħ fil-PBS u ttrasferiti għal slides miksija bil-ġelatina, deidrati, u mgħottija b'coverslip.

Sezzjonijiet Te2 ta 'firien injettati b'żibeġ retro għaddew minn inkubazzjoni b'antikorp primarju tal-fenek poliklonali anti-Fos (1:2, 000, Sinjali taċ-Ċelloli) fis-soluzzjoni ta' mblukkar matul il-lejl f'RT. Sussegwentement, il-flieli ġew maħsula b'PBS u inkubati għal siegħa f'RT b'Alexa 488 kontra l-fenek (1:1, 000, Invitrogen, f'PBS). Fl-aħħarnett, sezzjonijiet immunotikkettati ġew maħsula f'PBS, immuntati fuq slides miksija bil-ġelatina, u mgħottija b'mezz ta 'immuntar supplimentat b'DAPI.

Mikroskopija

It-tikkettar ta' mCherry ġie eżaminat bl-użu ta' mikroskopju konfokali Zeiss Airyscan: Intużaw żewġ lejżers (405 u 561 nm), kull wieħed jikkorrispondi għall-ogħla spettru ta' emissjoni għal DAPI (tebgħa Nissl għan-nuklei taċ-ċelluli) u Alexa 568 (mCherry). ), rispettivament. Biex tanalizza d-diffużjoni tal-virus fis-siti tal-injezzjoni, mikrografi ta 'Te2 u ACC ġew akkwistati bħala stampi tal-mużajk (kull waħda ġiet akkwistata bl-użu ta' objettiv 10 ×). Terminali Axon f'BLA ġew analizzati bl-użu ta 'objettiv 40 × bħala z-munzell ta' 10 sezzjonijiet, spazjati 1 μm 'il bogħod minn xulxin (159 μm kwadru; frazzjoni taż-żum, 1.0).

Għal annimali injettati b'retrobeads li għaddew minn immunotikkettjar cFos, immaġini ġew akkwistati b'ingrandiment ta' 40× (159 μm kwadru; frazzjoni taż-żum, 1.0) bi 3 lejżers differenti, li jikkorrispondu għall-ogħla spettru ta' emissjoni għal DAPI (tebgħa Nissl għal nuklei taċ-ċelluli), AlexaFluor 488 (cFos), u Texas Red (Retrobeads), rispettivament. Sezzjonijiet ta '0.7 μm ġew akkwistati tul 10-μm z-munzell. In-numru ta 'nuklei li jesprimu cFos, żibeġ ittikkettjati, u doppju pożittiv (cFos + żibeġ ittikkettjati) ġie kkwantifikat għal kull annimal fir-reġjun Te2 fil-koordinati anteroposterji minn 6.7 sa 7.3 mm mill-bregma [10]. Imbagħad ingħatat medja tad-dejta biex tiġi prodotta l-medja ta’ kull annimal u r-riżultati tqabblu statistikament. Immaġini ta 'sezzjonijiet bi tbajja DAB ta' Neun ġew analizzati bl-użu ta 'softwer Neurolucida konness ma' mikroskopju permezz ta 'kamera CCD bil-kulur [10].

Analiżi tad-dejta u kriterji ta' esklużjoni

L-n għal kull grupp ġie stabbilit a priori skont l-istudji preċedenti tagħna [10,16,17], xogħlijiet ippubblikati qabel fil-qasam (ara bħala referenzi għal ACC [6,22,55] u Te2 [10,59]), u permezz ta' stimi tal-qawwa G, skont it-tabella li ġejja (Tabella 1):

Għal kull analiżi, aħna stmat numru medju finali ta '8 sa 10 annimali għal kull grupp. Gruppi tmexxew b'kontrolli interni fl-istess sessjoni sperimentali (Tabella S1). Minħabba l-varjabbiltà tal-proċeduri kirurġiċi u tal-imġieba, aħna inkludew a priori numru akbar ta 'suġġetti sperimentali (sa 15% aktar) li f'xi każijiet issodisfaw il-kriterji sperimentali u ġew inklużi, u b'hekk nevitaw esklużjoni arbitrarja. Fil-każ ta 'studji tal-hippocampal, biex nivvalutaw l-effetti ta' injezzjonijiet NMDA u CNQX f'intervalli ta 'ħin distinti, ibbilanċjaw in-numru totali ta' annimali ta 'kontroll bejn firien vetturi u sham-mħaddma fost il-gruppi differenti.

L-analiżi tal-imġieba, l-ispezzjonijiet istoloġiċi, u l-għadd taċ-ċelluli saru bl-addoċċ. Annimali b'lokalizzazzjoni inadegwata tal-mogħdija tal-labra jew il-leżjoni fil-każ ta 'leżjonijiet irriversibbli NMDA ġew esklużi mill-analiżi tad-dejta (Tabella S1). Fi studji farmakoloġiċi, eskludejna 57 annimal fuq total ta' 465 annimal minħabba tqegħid mhux korrett tal-labra (22/255 għal Te2, 31/179 għal ACC, u 4/31 għall-hippocampus). Fi studji ta 'traċċar, fuq 21 annimal, eliminajna 3 suġġetti li fihom l-injezzjoni ta' retrobeads tilfet il-BLA. Fi studji optogenetics Te2, fuq total ta '30 annimal, eskludejna 1 far minħabba li t-tqegħid tal-fibri ottiċi ma kienx 'il fuq mir-reġjun fil-mira, 1 far. Wara kollox, il-virus kien assenti f'Te2, u firien 2 minħabba li d-diffużjoni tal-virus kienet rispettivament inqas minn 4.7% u 5.3% taż-żona Te2 fis-siti tal-injezzjoni. Fil-firien inklużi fl-analiżi statistika, id-diffużjoni minima tal-virus kienet 39.6% fil-koordinat stereotassiku aktar anterjuri u 50.2% fil-koordinat stereotassiku aktar posterjuri.

Bl-istess mod, fl-esperimenti tal-optoġenetika ACC, fuq total ta '32 annimal, ġew eliminati 2 firien minħabba li t-tqegħid ta' fibri ottiċi ma kienx 'il fuq mir-reġjun fil-mira. Żewġ firien ġew esklużi minħabba li l-virus fl-ACC kien assenti, annimal 1 minħabba li l-virus kien fil-kortiċi tal-mutur sekondarju maġenb, u far 1 minħabba li t-tixrid tal-virus kien inqas minn 2.3% taż-żona ACC fis-siti tal-injezzjoni. Fil-firien li fadal, id-diffużjoni minima tal-virus kienet 33.3% fil-koordinat stereotassiku aktar anterjuri u 42.2% fil-koordinat aktar posterjuri.

Fl-istudji tal-leżjonijiet NMDA, il-leżjonijiet immiraw l-aktar lejn ir-reġjun CA1 tal-hippocampus dorsali. L-estensjoni minima (aħmar) u massima (roża) tal-leżjonijiet tal-hippocampal fuq iż-żona kollha tal-hippocampus dorsali kienu rispettivament 23.2% u 53.5% fil-koordinata stereotaxic aktar anterjuri u 28.3% u 62.3% fil-koordinat aktar posterjuri. Fuq total ta' 73 annimal, 4 firien ġew eliminati minħabba li l-leżjoni kienet assenti, filwaqt li 3 annimali addizzjonali ġew mormija minħabba li l-estensjoni tal-leżjonijiet kienet inqas minn 5.0% (jiġifieri 4.8%, 4.3%, 3.1). %) li tikkonċerna ż-żona tal-hippocampal fit-2 koordinati.

L-analiżi tal-kontorn taż-żona saret permezz ta' spezzjoni viżwali u kwantifikazzjoni manwali bl-użu tal-għodda tal-kontorn tar-reġjun tas-softwer ZEN 3.0. Il-valuri taż-żona mbagħad ġew normalizzati fuq l-erja totali tar-reġjun. Il-koordinati stereotassiċi ta 'Te2, ACC, u hippocampus kienu bbażati fuq l-atlas Paxinos [26] u, fil-każ ta' Te2, b'kamp kortikali rreferjat għal Zilles atlas [25].

Analiżi statistika

Id-dejta kollha hija ppreżentata bħala medja ± SEM. Id-dejta kollha għaddiet mit-test ta' Levene għall-ugwaljanza tal-varjanzi. Għalhekk, l-istatistika parametrika ġiet impjegata matul l-esperimenti kollha. Dejta minn 2 gruppi tqabblet bl-użu ta' 2-test t-test tal-Istudenti ta' denbu. Paraguni ta' gruppi multipli ġew ivvalutati bl-użu ta' test ANOVA ta' 1-mod bit-test post hoc ta' Tukey. Biex nindirizzaw id-differenzi bejn u fi ħdan il-gruppi, aħna kkalkulajna mudell ANOVA ta' disinn imħallat 3 × 2 bi grupp (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) bħala l-bejn- varjabbli tas-suġġetti u kundizzjoni (qabel u wara kondizzjonament reċenti + injezzjoni) bħala l-varjabbli fi ħdan is-suġġetti. Fejn l-interazzjoni tal-grupp × kundizzjoni kienet sinifikanti, għamilna analiżi tal-effetti prinċipali sempliċi u aġġustajna kull valur p bil-korrezzjoni Bonferroni. Għal kull mudell ta 'ANOVA imħallat, aħna vvalutajna s-suppożizzjoni ta' Sphericity permezz tat-Test ta 'Sphericity ta' Mauchly.

Il-parametri statistiċi (jiġifieri, il-valur eżatt ta 'n għal kull grupp, SEM, it-test statistiku, id-daqs tal-effett, u l-valur p eżatt) huma rrappurtati fil-leġġendi. Għal daqsijiet ta 'kampjuni ugwali, id-daqsijiet tal-effett għal testijiet t mhux imqabbda ġew determinati billi kkalkola d-d ta' Cohen jew tal-ħġieġ d skond ix-xebh ta 'SDs filwaqt li, għal daqsijiet ta' kampjuni differenti, Hedges'g. Korrelazzjonijiet bejn l-għadd taċ-ċelluli u l-iffriżar ġew ikkalkulati bl-użu tal-koeffiċjent ta 'Pearson. Biex tiddetermina jekk id-dejta laħqitx is-suppożizzjonijiet tal-approċċ statistiku, irrifjutajna l-ipoteżi nulla fil-livell P <0.05. L-analiżi statistiċi kollha saru bl-użu ta' SPSS Statistics 22 (IBM).

Informazzjoni ta' appoġġ

S1 Fig. Tkabbir tal-binarji tal-labra ta 'Te2 (A) u kortiċi ACC (B) injettati b'CNQX, magħżula bħala eżempji. (C) Meta rrappreżentati bl-istess kuntest ġimagħtejn wara l-proċedura, annimali ta 'xokk biss wrew rispons ta' biża 'baxx, li juri li l-proċedura ma qanqletx iffriżar ikkundizzjonat fil-kuntest fejn ingħata x-xokk. (D) Riżultati simili bħal f'Fig 1 inkisbu billi jiġu kkontrobilanċjati t-2 tones użati bħala CSs (CS1, 3 kHz u CS2, 15 kHz) (Student t test, t(14)=3.44, p {{{ 13}}.0040, Ħġieġ d=4.14). (E) Fil-firien kundizzjonati ta 'riħa-CS li jiffriżaw għar-riħa, ġimgħatejn wara l-kondizzjonament, kien għoli anki jekk ittestjat f'ambjent differenti dwar il-kuntest tal-kondizzjonament, u b'hekk juri li l-biża' kienet assoċjata speċifikament ma 'din il-kunsinna ta' sinjal. Skala bars, 300 μm. ��P < 0.01. Id-dejta kollha hija medja u SEM. Id-dejta fil-qosor għal S1 Fig tista 'tinstab f'informazzjoni ta' appoġġ fil-fajl bl-isem S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. Injezzjoni CNQX imfixkla ż-żamma ta 'memorji riċenti tal-biża' tas-smigħ fil-firien fejn il-ġeneralizzazzjoni tal-biża' tbaxxiet b'ton waħdu qabel l-espożizzjoni jew billi uża ton ta 'ħoss abjad bħala CS1. ANOVA ta' disinn imħallat 3 × 2 (effett ewlieni tal-grupp: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, effett ewlieni tal-kundizzjoni: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, grupp × interazzjoni tal-kundizzjoni F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) wera li l-iffriżar għat-ton ta’ 3 kHz qabel l-assoċjazzjoni tiegħu mal-Istati Uniti kien aktar baxx f'annimali li rċevew it-ton ta' 15-il kHz qabel l-espożizzjoni qabel il-parir ta' 15-il kHz-US (n=10, p=0.001) jew fil-firien kundizzjonati għal ħoss abjad (n=13 , p=0.008) meta mqabbla ma' annimali CS{1-CS2 (n=22) li wrew rispons varjabbli ta' ġeneralizzazzjoni tal-biża'. Madankollu, wara tagħlim CS-US u injezzjonijiet cnqx fil-kortiċi Te2, il-memorja tal-biża' reċenti kienet imfixkla fil-gruppi kollha (p> 0.05). Effett ewlieni sempliċi fi ħdan il-gruppi (qabel u wara t-tagħlim CS-US segwit minn injezzjoni cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Ton-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0.05, ��P < 0.01. Id-dejta kollha hija medja u SEM. Id-dejta fil-qosor għal S2 Fig tista 'tinstab fl-Informazzjoni ta' Appoġġ fil-fajl bl-isem tad-Data tal-Figura ta 'Appoġġ S1. (TIF)

S3 Fig. (A) Eżempju każwali ta 'injezzjoni ta' retrobeads mmirata lejn BLA. (B u C) Eżempji ta 'tqegħid ta' fibra ottika 'l fuq mill-BLA ta' annimali injettati b'vettori AAV f'Te2 (B) u kortiċi ACC (C). Vireg tal-iskala, 500 μm.

Rikonoxximenti

Nirringrazzjaw lil Dr E. Manassero għall-appoġġ u l-pariri kontinwi tagħhom.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur

Kunċettwalizzazzjoni: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Kurazzjoni tad-dejta: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analiżi formali: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Akkwist ta' finanzjament: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Investigazzjoni: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodoloġija: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Superviżjoni: Benedetto Sacchetti.

Validazzjoni: Benedetto Sacchetti.

Kitba – abbozz oriġinali: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Kitba – reviżjoni u editjar: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Referenzi
1. Frankland PW, Bontempi B. L-organizzazzjoni ta’ memorji riċenti u remoti. Nat Rev Neurosci. 2005; 6:119–130. https://doi.org/10.1038/nrn1607 PMID: 15685217

2. Dudai Y. In-newrobijoloġija tal-konsolidazzjonijiet, jew, kemm hi stabbli l-engram? Ann Rev Psychol. 2004; 55:51–86. https://doi.org/10.1146/annurev.psych.55.090902.142050 PMID: 14744210

3. Squire LR, Genzel L, Wixted JT, Morris RG. Konsolidazzjoni tal-memorja. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015; 3:7. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021766 PMID: 26238360

4. Alvarez P, Squire LR. Konsolidazzjoni tal-memorja u l-lobu temporali medjali: mudell ta 'netwerk sempliċi. Proc Natl Acad Sci US A. 1994; 91:7041–7045. https://doi.org/10.1073/pnas.91.15.7041 PMID: 8041742

5. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Għaliex hemm sistemi ta 'tagħlim komplementari fl-ippokampus u n-neokortiċi: għarfien mis-suċċessi u l-fallimenti ta' mudelli konnessjonisti ta 'tagħlim u memorja. Psychol Rev 1995; 102:419–457.

For more information:1950477648nn@gmail.com