Tbassar ir-rwol tal-LncRNA fit-tixjiħ tal-kliewi Ibbażat fuq is-sekwenzjar tal-RNA Ⅱ

Korrelazzjoni ta 'lncRNA Gm43360 u l-mRNAs fil-mira potenzjali tagħha

LncRNA Gm43360 intgħażlet għall-istudju minħabba li qabbad żewġ netwerks ta 'koespressjoni lncRNA-mRNA. Il-livell ta' espressjoni ta' Adra1a kien korrelatat b'mod pożittiv (rho=0.8650, p{=0.026) ma' dak ta' Gm43360, Csnk1a1 (casein kinase 1A1) kien korrelatat negattivament (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Fig. 5a). Biex tivverifika aktar il-korrelazzjoni ta 'lncRNA Gm43360 u l-mRNAs fil-mira potenzjali tagħha Adra1a u Csnk1a1, f'dan l-istudju ġie ddisinjat plasmid ta' espressjoni eċċessiva ta 'lncRNA Gm43360. L-espressjoni ta 'Csnk1a1 naqset kif mistenni, u l-espressjoni ta' Adra1a naqset ukoll, iżda mhux b'mod sinifikanti. Sussegwentement, neħħejna lncRNA Gm43360 bis-siRNA biex niskopru jekk l-espressjoni tal-mRNAs fil-mira tagħha kinitx affettwata. Kif mistenni, Csnk1a1 żdiedet fiċ-ċelloli knockdown lncRNA Gm43360 relattiva għall-grupp ta 'kontroll negattiv siRNA (Fig. 5b). Għaxar, skoprejna r-rwol ta 'lncRNA Gm43360 fiċ-ċiklu taċ-ċelluli. Ir-riżultati tal-kit tal-għadd taċ-ċelluli-8 (CCK-8) wrew li lncRNA Gm43360 ippromwova l-vijabbiltà taċ-ċelluli (Fig. 5c). Ir-riżultati wrew li lncRNA Gm43360 żied il-perċentwal ta 'ċelloli tal-fażi S u naqqas il-perċentwal ta' ċelloli tal-fażi G1 meta mqabbel mal-kontroll negattiv (Fig. 5d). Il-proteini p53 u p21 kienu involuti fir-regolazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli u għalhekk kienu l-marki tat-tixjiħ taċ-ċelluli. Il-livelli ta 'espressjoni ta' p53 u p21 naqsu b'mod sinifikanti fil-grupp ta 'espressjoni żejda relattiva għall-grupp ta' kontroll. Il-livelli ta 'espressjoni ta' p53 u p21 żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp siRNA relattiv għall-grupp ta 'kontroll siRNA (Fig. 5e). L-espressjoni żejda ta 'lncRNA Gm43360 naqqset in-numru ta' ċelluli SA - -gal-pożittivi, u ċelluli -gal-pożittivi żdiedu fil-grupp ta 'transfect Gm43360 (Fig. 5f). Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati indikaw li lncRNA Gm43360 inibixxi s-senescence taċ-ċelloli epiteljali tubulari tal-kliewi billijinibixxi l-espressjoni ta 'Csnk1a1.

Agħfas HAWN BIEX IKseb ESTRAT TA' CISTANCHE ORGANIKU NATURALI B'25% ECHINACOSIDE U 9% ACTEOSIDE GĦALL-FUNZJONI TAL-KLIEI

Diskussjoni

F'dan l-istudju, aħna evalwajna d-dejta tal-espressjoni tal-mRNA minn kliewi tal-ġrieden żgħar u qodma u wettaqna analiżi tal-bijoinformazzjoni li żvelaw il-funzjonijiet tal-mRNAs espressi b'mod aberranti. Aħna osservajna 347 mRNA regolati 'l fuq u 355 mRNA regolati 'l isfel kif ukoll 130 lncRNAs regolati 'l fuq u 91 lncRNAs regolati 'l isfel f'kliewi tal-ġurdien qodma meta mqabbla ma’ kliewi tal-ġurdien żgħar. Barra minn hekk, dawn l-mRNAs intwerew li huma involuti f'mogħdijiet relatati mat-tixjiħ, bħalfosforilazzjoni ossidattiva, il-passaġġ ta 'sinjalazzjoni AMPK, il-mogħdija ta' sinjalazzjoni Wnt, il-mogħdija ta 'sinjalazzjoni Rap1, u mard relatat ma' l-età, li wriet il-funzjonijiet ta 'mRNAs espressi b'mod differenzjat fil-patoġenesi tat-tixjiħ renali.

L-RNA NEAT1 twil mhux kodifikanti huwa fattur protettiv fil-progressjoni tal-fibrożi tal-kliewi fiċ-ċelloli epiteljali tubulari tal-kliewi [21]. B'kumbinazzjoni, fir-riżultati tas-sekwenzjar tagħna, lncRNA NEAT1 kien espress f'livelli aktar baxxi fil-kliewi ta 'ġrieden età milli fil-ġrieden żgħar, li huwa konsistenti ma' sejbiet preċedenti. LincRNA-Gm4419 jaċċellera l-infammazzjoni u l-fibrożi b'mekkaniżmi medjati minn inflammasome NF-kB/NLRP3 fin-nefropatija dijabetika [22]. Fir-riżultati tas-sekwenzjar tagħna, sibna wkoll li l-espressjoni ta 'Gm4419 kienet ogħla fil-kliewi ta' ġrieden età milli fil-ġrieden żgħar, iżda ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti. LncRNA Gm43360 jinsab fuq il-kromożoma 5 (Chr5:122494022–122,494,908, 2887 bp). Skont il-Browser tal-Ġenoma tal-UCSC, Gm43360 jinsab fl-intron tal-ġene li jikkodifika l-proteini Atp2a2. Madankollu, sal-lum ma kien hemm l-ebda rapporti dwar l-involviment ta 'lncRNA Gm43360 f'mard. F'dan l-istudju, il-knockdown ta 'lncRNA Gm43360 ippromwova s-senescence taċ-ċelluli epiteljali tubulari renali. Barra minn hekk, identifikajna ħafna lncRNAs espressi b'mod differenzjat fir-riżultati tas-sekwenzjar u investigajnahom.

LncRNAs ġew ikklassifikati f'cis-regolament jew trans-regolament ibbażat fuq mekkaniżmi regolatorji lncRNA. LncRNAs li jaġixxu cis jistgħu jinfluwenzaw l-espressjoni ta 'ġeni ġirien billi jiddependu fuq elementi li jaġixxu cis, bħal promoturi, enhancers, u sekwenzi regolatorji, li huma distanzi bejn lncRNAs u mRNAs ta' inqas minn 100 kb. LncRNAs li jaġixxu trans jirreferu għal lncRNAs li jħallu s-sit tat-trasfezzjoni u joperaw f'siti imbiegħda (jiġifieri, id-distanza bejn lncRNAs u mRNAs hija aktar minn 100 kb) [23]. L-lncRNA MAAT iżid l-espressjoni tal-ġene ġirien Mbnl1 permezz ta 'modulu regolatorju cis [24]. L-lncRNA Pnky għandu rwol bħala regolatur li jaġixxi trans fl-iżvilupp kortikali [25]. F'dan l-istudju, kien hemm relazzjoni transregolatorja bejn lncRNA Gm43360 u Csnk1a1. Csnk1a1 huwa ġene li jrażżan it-tumur [26] li jikkodifika proteina li tipparteċipa fiċ-ċiklu taċ-ċelluli u l-proċess tad-diviżjoni taċ-ċelluli [27]. Csnk1a1 downregulation jinduċiinfjammatorji assoċjati mas-senescencerispons b'arrest tat-tkabbir f'tumuri tal-kolorektum [26]. Csnk1a1 kien regolat 'l isfel meta Gm43360 kien regolat 'il fuq; għalhekk, huwa probabbli li lncRNA Gm43360 tipparteċipa fitixjiħ tal-kliewiminntirregola l-espressjoni Csnk1a1.

Konklużjonijiet

L-investigazzjoni tagħna tan-netwerk tal-koespressjoni lncRNA-mRNA fitixjiħ tal-kliewiżvela lncRNA, lncRNA Gm43360, jista' jkollu rwol protettiv fit-tixjiħ tal-kliewi u wessa' l-fehim tagħna tal-mekkaniżmi involutitixjiħ tal-kliewi

materjali u metodi

Kampjuni Ġrieden maskili C57BL/6J żgħar (3-ta' xahar) u qodma (24-ta' xahar) inxtraw miċ-Ċentru Sperimentali tal-Annimali tal-Università ta' Xiamen u tkabbru f'ambjent standard. Il-ġrieden kollha kellhom aċċess liberu għall-ikel u l-ilma. Il-ġrieden ġew akklimatizzati mal-faċilità l-ġdida għal xahar qabel ma ġew sagrifikati. Il-ġrieden ġew anestetizzati bl-urethane b'injezzjoni intraperitoneali f'doża ta '750 mg/kg qabel il-ġbir tal-kampjun. Ġrieden żgħar u qodma ġew sagrifikati fl-istess jum.Kilwa tal-ġurdien residwutessut intuża għas-sekwenzjar f'kull assaġġ. Saru fuq l-RNA-seq u l-istopatoloġijakliewi separatimill-istess maws. It-tessut tal-kliewi inġabar mill-ġrieden. Kilwa waħda kienet immedjatament mgħaddsa f'formalin buffered newtrali ta '10% għal inkorporazzjoni ta' sezzjoni sussegwenti, u l-kilwa l-oħra kienet maqsuma f'diversi tessuti u immedjatament imqiegħda f'nitroġenu likwidu u mbagħad maħżuna fi grad -80. L-istudju kien appoġġjat mill-Kumitat tal-Etika tal-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università Xi'an Jiaotong (Shaanxi, iċ-Ċina) (Nru 2018-G-164). Il-metodi kollha twettqu mil-linji gwida u r-regolamenti tal-etika tal-annimali. Dan l-istudju sar f'konformità mal-linji gwida ARRIVE.

Istopatoloġija tal-kliewi

Kampjuni tat-tessut renali ta' ġrieden żgħar u qodma ġew iffissati f'soluzzjoni ta' paraformaldehyde 10% matul il-lejl. Għaxra, mit-taqsimiet kienu deidrati, inkorporati fil-paraffin, u mqassma bi ħxuna ta' 4-µm. PAS u t-tbajja trikromatika ta 'Masson saru bl-użu ta' protokolli standard. L-immaġini nqabdu mill-kamera, u tkejjel iż-żona pożittiva tat-tebgħa. Iż-żona għall-immaġini tal-kamera tal-istopatoloġija ġiet ikkalkulata b'Image-Pro Plus 6.0.

Tbajja SA‑‑gal

L-attività SA{{0}}gal ġiet analizzata bl-użu ta 'kit tat-tbajja' SA{- -gal (Cell Signaling Technology #9860) skont il-protokoll tal-manifattur. L-erja tat-tebgħa pożittiva ġiet imkejla, u ċ-ċelloli pożittivi SA- -gal ġew ikkalkulati bl-użu ta 'Image-Pro Plus 6.0.

Kostruzzjoni u sekwenzar tal-librerija tal-estrazzjoni tal-RNA

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 intużaw biex tinbena librerija ta' sekwenzar. Wara l-estrazzjoni ta 'RNA totali, mRNA ġie ppurifikat mill-RNA totali (5ug) bl-użu ta' Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) b'żewġ rawnds ta 'purifikazzjoni. Wara l-purifikazzjoni, l-mRNA inqasam fi frammenti qosra bl-użu ta’ katjoni divalenti f’temperaturi għoljin (Modulu ta’ Frammentazzjoni tal-RNA tal-Magnesium (NEB, cat. e6150, USA) taħt 94 grad 5-7 min). Imbagħad il-frammenti tal-RNA maqsumin ġew traskritti b'lura biex jinkiseb is-cDNA permezz ta' SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, cat. 1,896,649, USA), li mbagħad intużaw biex jissintetizzaw DNAs second-stranded ittikkettjati b'E. coli DNA polymerase I ( NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) u Soluzzjoni dUTP (Termo Fisher, cat.R0133, USA). Imbagħad ġiet miżjuda bażi A mat-truf skaffi ta 'kull linja, u tħejjihom għal ligation mal-adapters indiċjati. Kull adapter kien fih Sporġenza T-base biex jgħaqqad l-adapter mad-DNA frammentat ta 'denb A. Adapters b'indiċi doppju ġew ligated mal-frammenti, u l-għażla tad-daqs saret bi żibeġ AMPureXP. Wara t-trattament ta 'l-enzima UDG labile għas-sħana (NEB, cat.m0280, USA) tad-DNAs tat-tieni stranded ittikkettjati b'U, il-prodotti ligati ġew amplifikati b'PCR bil-kundizzjonijiet li ġejjin: denaturazzjoni inizjali f'95 grad għal 3 min; 8 ċikli ta 'denaturazzjoni fi 98 grad għal 15 s, ittemprar f'60 grad għal 15 s, u estensjoni fi 72 grad għal 30 s; u mbagħad estensjoni finali fi 72 grad għal 5 min. It-tul medju ta 'inserzjoni għal-libreriji ta' cDNA finali kien 300±50 bp. Fl-aħħarnett, wettaqna 2 × 150 bp paired-end sequencing (PE150) fuq Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, China) skont il-protokoll tal-manifattur [28].

Analiżi bijoinformatika Sekwenza u filtrazzjoni ta 'Nadif Qari

Librerija cDNA mibnija bit-teknoloġija mill-RNA miġbura minnkampjuni tal-kliewital-ġrieden ġie sekwenzat u mmexxi bil-pjattaforma ta 'sekwenza Illumina NovaseqTM 6000. Bl-użu tal-approċċ tal-RNA-seq tat-tarf paired Illumina, aħna sekwenzajna t-traskriptoma, u ġġenera total ta 'mil lon 2 × 150 bp qari tat-tarf paired. Qari miksuba mill-magni tas-sekwenzjar jinkludu qari mhux ipproċessati li fihom adapters jew bażijiet ta 'kwalità baxxa li jaffettwaw l-assemblaġġ u l-analiżi li ġejjin. Għalhekk, biex tikseb qari nodfa ta 'kwalità għolja, qari ġew iffiltrati aktar minn Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Il-parametri kienu kif ġej:

1) it-tneħħija tal-qari li jkun fihom adapters;

2) it-tneħħija ta 'qari li jkun fihom polyA u poly;

3) it-tneħħija ta' qari li jkun fihom aktar minn 5% ta' nukleotidi mhux magħrufa (N);

4) it-tneħħija ta 'qari ta' kwalità baxxa li jkun fihom aktar minn 20% ta 'bażijiet ta' kwalità baxxa (valur Q Inqas minn jew ugwali għal 20).

Għaxar kwalità ta 'sekwenza ġiet ivverifikata bl-użu ta' FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). inkluż il-kontenut Q20, Q30, u GC tad-dejta nadifa. Wara dan, total ta 'G bp ta' qari mnaddfa, paired-end ġew prodotti. Id-dejta tas-sekwenza mhux maħduma ġiet sottomessa lis-settijiet tad-dejta tal-NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) bin-numru ta 'adeżjoni GSE154223.

Il-ġenoma/annotazzjoni ta' referenza kienet Mus_musculus.GRCm38. Is-sors u l-verżjoni tal-annotazzjoni tal-ġene użata għall-analiżi kienet Ensembl_v88.

Traskrizzjonijiet assemblaġġ

L-ewwelnett, Cutadapt [29] intuża biex jitneħħew il-qari li kien fihom kontaminazzjoni tal-adapter, bażijiet ta 'kwalità baxxa, u bażijiet mhux determinati. Għaxar kwalità ta 'sekwenza kienet mitmugħa ħafna bl-użu ta' FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Aħna użajna Bowtie2 [31] u Hisat2 [32] biex nimmappjaw il-qari mal-ġenoma tal-ġurdien. Il-qari mapep ta 'kull kampjun ġew assemblati bl-użu ta' StringTie [33]. Għaxar, traskrizzjonijiet kollha minnkampjuni tal-kliewiġew magħquda biex jibnu mill-ġdid transcriptome komprensiv bl-użu ta 'skripts Perl. Wara li ġie ġġenerat it-traskriptome finali, StringTie [33] u edgeR [34] intużaw biex jistmaw il-livelli ta 'espressjoni tat-traskrizzjonijiet kollha.

Identifikazzjoni LncRNA

L-ewwelnett, traskrizzjonijiet li kienu jikkoinċidu ma 'mRNAs magħrufa u traskrizzjonijiet iqsar minn 200 bp ġew mormija. Imbagħad użajna CPC [35] u CNCI [36] biex inbassru traskrizzjonijiet b'potenzjal ta 'kodifikazzjoni. It-traskrizzjonijiet kollha bil-punteġġ CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analiżi ta' ġeni ta' analiżi espressi b'mod differenti (DGEs).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 tqiesu ġeni espressi b'mod differenzjali.

Tbassir tal-ġeni fil-mira u analiżi funzjonali tal-lncRNAs

Biex tesplora l-funzjoni tal-funzjoni tal-lncRNAs, aħna mbassra l-ġeni cis-target tal-lncRNAs. LncRNAs jista 'jkollhom rwol cis fl-azzjoni fuq ġeni fil-mira ġirien. F'dan l-istudju, il-ġeni ta' kodifikazzjoni f'100,000 upstream u downstream ġew magħżula permezz ta' skript Perl. Imbagħad, urejna analiżi funzjonali tal-ġeni fil-mira għal lncRNAs billi nużaw l-iskripts il-BLAST2GO [39]. Il-kmandi sħaħ link għad-dominju pubbliku kien Jie-Li/README.md fuq main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Kategoriji tal-ontoloġija tal-ġeni (GO) u analiżi tal-Enċiklopedija ta' Ġeni u Ġenomi (KEGG) ta' Kyoto

L-analiżi tal-bijoinformatika għas-sekwenzjar tal-RNA saret bl-użu tal-għodod OmicStudio (http://www.omicsudio. cn/tool). L-analiżi tal-arrikkiment funzjonali tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) u l-analiżi tal-arrikkiment tal-Enċiklopedija ta 'Kyoto tal-Ġeni u l-Ġenomi (KEGG) [37-39] intużaw biex janalizzaw il-funzjonijiet bijoloġiċi tal-ġeni fil-mira mbassra. L-analiżi GO tiċċara l-proċessi bijoloġiċi ewlenin permezz ta 'tliet aspetti: il-kompożizzjoni taċ-ċelluli, funzjonijiet molekulari, u proċessi bijoloġiċi (http://www.geneontology. org/). L-analiżi l-ewwel tpoġġi l-ġeni kollha espressi b'mod differenzjali u l-ġeni tal-isfond fid-database GO. Kull oġġett huwa mmappjat, in-numru ta 'ġeni f'kull oġġett huwa kkalkulat, u d-distribuzzjoni iperġeometrika tintuża biex twettaq l-ittestjar tal-ipoteżi biex tikseb il-valur P tar-riżultat tal-arrikkiment. Aktar ma jkun baxx il-valur P, iktar ikun sinifikanti r-riżultat tal-arrikkiment. KEGG hija riżorsa tad-database li tanalizza l-mRNAs espressi b’mod differenzjat mill-bijoloġija ġenetika biex tesplora mogħdijiet importanti relatati mal-ġeni fil-mira (https://www.genome.jp/kegg/). Ir-riżultati huma espressi b'valuri p; iktar ma jkun baxx il-valur p, iktar ikun sinifikanti r-riżultat ta' arrikkiment.

qRT–PCR

GAPDH intuża bħala l-kontroll endoġenu. Imbagħad, ġew ikkalkulati l-livelli ta 'espressjoni relattivi ta' ġeni mhux magħrufa. Il-primers kollha ġew iddisinjati u sintetizzati speċifikament għal dan l-esperiment. Primers għal GAPDH ġew ikkummerċjalizzati. L-ispeċifiċità tal-primers Adra1a u Csnk1a1 ġiet identifikata mill-quċċata waħda tal-kurva tat-tidwib.

Ibni netwerk ta' koespressjoni mRNA-lncRNA

It-transregolazzjoni kienet ibbażata fuq ir-riċerka, u mbagħad ġiet ikkalkulata l-enerġija trans. Iktar ma kienet żgħira l-enerġija trans, iktar tkun għolja l-possibbiltà li torbot. Imbagħad, ġie kkalkulat ukoll il-koeffiċjent ta 'korrelazzjoni ta' mRNA-lncRNA. In-netwerk mRNA-lncRNA inbena billi għażel koeffiċjent ta' korrelazzjoni Spearman li jaqbeż 0.9. In-netwerk ta 'koespressjoni mRNA-lncRNA inbena bl-użu ta' softwer Cytoscape (v3.7.1).

Kultura taċ-ċelluli

Ċelluli epiteljali tubulari prossimali renali tal-ġurdien (MRPT-EpiCs) ġew ikkultivati ​​f'annimali medji taċ-ċelluli epiteljali (EpiCM-a, Cat. #4131) li kien fihom 2% serum bovin tal-fetu (FBS, Cat. #0010) u Suppliment tat-Tkabbir taċ-Ċelluli Epiteljali-annimal (EpiCGS-a, Cat. #4182) mingħajr antibijotiċi f'inkubatur umidifikat f'37 grad u 5% CO2. Il-medju tal-kultura nbidel kull 2-3 ijiem. Iċ-ċelloli fil-fażi tat-tkabbir logaritmiku ġew sub-kultivati ​​meta t-tkabbir laħaq 90%. Is-sospensjoni taċ-ċelluli diġerita bit-tripsin ġiet miżrugħa fi 6-pjanċi bir-bir b'2*104 -5*104 ċelluli f'kull bir. Iċ-ċelloli użati għat-trasfezzjoni kienu kollha bejn il-ġenerazzjonijiet 2 u 5.

Kostruzzjoni tal-plażmidi u trasfezzjoni taċ-ċelluli

Il-plasmid ta 'espressjoni żejda lncRNA Gm43360 inbena minn GeneChem (Shanghai, iċ-Ċina). Is-sinsla tal-plasmid kienet GV658, u l-promotur tas-CMV saq l-espressjoni tal-lncRNA. Is-sekwenza tan-nukleotide kklonata hija pprovduta fil-materjal supplimentari. Għal knockdown tal-lncRNA Gm43360, tliet lncRNA ENS GĦANDHOM00000197656-mira siRNAs (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; u lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAACUCAAUGGGTT{-3') ġew iddisinjati u sintetizzati f'GenePharma (Shanghai, iċ-Ċina). Skont il-protokoll tal-manifattur, iċ-ċelloli ġew trasfettati b'2500 ng ta' plasmid jew 100 pmol ta' siRNA b'6 µl ta' Reaġent ta' Trasfezzjoni Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA) għal kull bir. Il-livelli ta 'espressjoni ta' RNA u proteina ġew skoperti fi 48 siegħa wara t-trasfezzjoni, u kull esperiment ġie ripetut mill-inqas tliet darbiet. PCR kwantitattiv f'ħin reali ntużat biex tivvalida l-effiċjenza ta 'lncRNA Gm43360 overexpression u knockdown.

Analiżi Western blot

Ċelloli kkultivati ​​ġew maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ, żdiedu 120 µl ta 'buffer RIPA (Qalb, iċ-Ċina), u inibitur tal-protease u PMSF (Qalb, Ċina) ġew miżjuda għal 30 min fuq is-silġ. Wara li nġabru ċ-ċelloli f'tubi mikroċentrifugali differenti, il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet kwantifikata. Buffer tat-tagħbija ġie miżjud ma 'kull kampjun u mbagħad mgħolli għal 7 min. Tletin mikrogramma tal-kampjun ġew separati bi 12% SDS-PAGE (Beyotime, iċ-Ċina) u elettrotrasferiti għal membrani PVDF (Thermo Fisher, USA). Imbagħad, il-membrani ġew imblukkati b'5% ħalib. Il-membrani ġew inkubati b'antikorpi primarji speċifiċi: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP), u anti-GAPDH (1:3000, Profintech). , 60004-1-Ig) matul il-lejl f'4 gradi . Wara l-ħasil bit-TBST, il-membrani ġew inkubati b'antikorp sekondarju għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-meded tal-proteini ġew osservati bl-użu ta 'kit ta' kimiluminixxenza (Millipore, USA). L-espressjoni ta 'GAPDH intużat biex jiġu normalizzati l-livelli tal-proteini.

Assaġġ tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli

Il-kapaċità tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet iddeterminata mill-assaġġ tal-kit tal-għadd taċ-ċelluli-8 (CCK-8). Tmienja u erbgħin siegħa wara t-trasfezzjoni, 90 µl ta' medium ġdid u 10 µl ta' soluzzjoni CCK-8 ġew miżjuda ma' kull bir (Beyotime, C0042). Iċ-ċelloli ġew inkubati għal 1-4 sigħat f'37 grad f'5% CO2 u mkejla f'450 nm minn qarrej tal-mikroplate universali (Bio-Tek, USA).

Analiżi ċitometrika tal-fluss

Iċ-ċelloli ġew ibbanjati fi 6-pjanċi tal-bir il-ġurnata qabel it-trasfezzjoni. Tmienja u erbgħin siegħa wara t-trasfezzjoni, iċ-ċelloli ġew trypsinized u ċentrifugati f'1000 rpm għal 5 min. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew iffissati f'70% etanol f'4 gradi għal mill-inqas 4 sigħat. Wara ċ-ċentrifugazzjoni, ġiet miżjuda soluzzjoni tat-tbajja ta 'RNase A u propidium iodide (PI) maċ-ċelloli, u ċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati għal 30 minuta f'temperatura tal-kamra fid-dlam. Iċ-ċelloli mtebbgħin Te ġew analizzati bl-użu ta 'ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

Analiżi statistika

Id-dejta tal-kejl bid-distribuzzjoni normali hija ppreżentata bħala l-medja±SD. Id-differenza bejn iż-żewġ gruppi differenti ġiet determinata bl-użu tat-testijiet t ta' Student mhux imqabbda b'żewġ denbu, u valur p < 0.05 kien ikkunsidrat bħala statistikament sinifikanti. Il-kalkoli kollha twettqu bl-użu ta’ GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

Referenzi

1. Docherty MH, O'Sullivan ED, Bonventre JV, Ferenbach DA. Senescence Ċellulari fil-Kliewi. J Am Soc Nephrol. 2019;30(5):726–36.

2. Partridge L, Deelen J, Slagboom PE. Niffaċċjaw l-isfidi globali tat-tixjiħ. Natura. 2018;561(7721):45–56.

3. Pan JX. LncRNA H19 jippromwovi l-aterosklerożi billi jirregola l-mogħdijiet tas-sinjalar MAPK u NF-kB. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2017;21(2):322–8.

4. Wasson CW, Abignano G, Hermes H, Malaab M, Ross RL, Jimenez SA, Chang HY, Feghali-Bostwick CA, Del Galdo F. Long non-coding RNA HOTAIR imexxi EZH 2-attivazzjoni ta' myofibroblast dipendenti f'sistemi sistemiċi sklerożi permezz ta 'attivazzjoni dipendenti fuq miRNA 34a ta' NOTCH. Ann Rewmatika Dis. 2020;79(4):507–17.

5. Luo J, Wang K, Yeh S, Sun Y, Liang L, Xiao Y, Xu W, Niu Y, Cheng L, Maity SN, et al. LncRNA-p21 jibdel id-divrenzjar newroendokrinali tal-kanċer tal-prostata indott mill-enzalutamide antiandroġenu permezz tal-modulazzjoni tas-sinjalar EZH2/STAT3. Nat Commun. 2019;10(1):2571.

6. Wang Y, Yang L, Chen T, Liu X, Guo Y, Zhu Q, Tong X, Yang W, Xu Q, Huang D, et al. LncRNA ġdid MCM3AP-AS1 jippromwovi t-tkabbir tal-karċinoma epatoċellulari billi jimmira l-assi miR-194-5p/FOXA1. Mol Kanċer. 2019;18(1):28.

7. Wu YY, Kuo HC. Rwoli funzjonali u netwerks ta 'RNAs mhux kodifikanti fil-patoġenesi ta' mard newrodeġenerattiv. J Biomed Sci. 2020;27(1):49.

8. Li Z, Wang Z. Aging Kidney u Mard Relatat mat-Tixjiħ. Adv Experiment Med Biol. 2018;1086:169–87.

9. Wang X, Vrtiska TJ, Avula RT, Walters LR, Chakkera HA, Kremers WK, Lerman LO, Regola AD. L-età, il-funzjoni tal-kliewi, u l-fatturi ta 'riskju huma assoċjati b'mod differenti mal-volumi kortikali u medullari tal-kliewi. Kidney Int. 2014;85(3):677–85.

10. Lin Q, Hou S, Dai Y, Jiang N, Lin Y. LncRNA HOTAIR jimmira miR-126-5p biex jippromwovi l-progressjoni tal-marda ta 'Parkinson permezz ta' RAB3IP. Biol Chem. 2019;400(9):1217–28.

Servizz ta 'Appoġġ Ta' Wecistanche-L-akbar esportatur ta' cistanche fiċ-Ċina:

Email:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Shop Għal Aktar Speċifikazzjonijiet Dettalji:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop