Benefiċċju Terapewtiku Potenzjal Ta 'Doża Baxxa Cistanche fis-Sindrome ta' Għeja Kronika

Sindromu ta 'Għeja Kronika(ME/CFS) huwa multisistemiku debilitantikundizzjoni kronika ta etjoloġija mhux magħrufa classifified bħala disfunzjoni immunisindromu u disturb newroloġiku. L-iskoperta tal-Transitorju espress b'mod wiesa 'Riċettur Potenzjal Melastatin 3 (TRPM3) bħala kanal nociceptor immirat sostanzjalmentminn ċerti riċetturi tal-opjojdi, u l-implikazzjoni tagħha fil-kalċju (Ca2 plus)-dipendenti Natural Killer(NK) funzjonijiet immuni taċ-ċelluli qajmu l-possibbiltà li TRPM3 jista 'jkunimmirat farmakoloġikament biex jikkura sintomi karatteristiċi ta' ME/CFS. Naltrexonehydrochloride (NTX) jaġixxi bħala antagonist għall-mu (m)-riċettur tal-opjojdi għalhekk jiċħadil-funzjoni inibitorja tiegħu fuq TRPM3. Ibbażat fuq il-benefiċċjirrappurtati mill-pazjenti fuq tagħhomsintomi, doża baxxa NTX (LDN, 3.0–5. 0 mg/kuljum) it-trattament jidher li joffri xi benefiċċju potenzjalijissuġġerixxi li l-effett tiegħu jista’ jkun immirat lejn il-pathomechanism tal-ME/CFS. Peress li m'hemm l-ebda letteratura li tikkonfermal-effikaċjata' LDN għal pazjenti ME/CFSin vitro, dan l-istudju jinvestiga l-effett terapewtiku potenzjali ta 'LDN f'pazjenti ME/CFS. TRPM3L-attività tal-kanal tal-joni tkejjel wara l-modulazzjoni bi Pregnenolone sulfate (PregS) u xejn fiĊelloli NK fuq 9 pazjenti ME/CFS li jieħdu LDN u 9 imqabbla skont l-età u s-sesskontrolli b'saħħithom bl-użu tat-teknika tal-garża ta 'ċellola sħiħa. Nirrapportaw li pazjenti ME/CFSit-teħid ta' LDN irrestawraw TRPM3-bħal kurrenti joniċi fiċ-ċelloli NK. Kurrenti joniċi żgħar b'aTRPM tipiku3-bħal rettifika esternaġew imkejla wara l-applikazzjoni ta 'PregS, aTRPM3-agonist, fiċ-ċelloli NK minn pazjenti li jieħdu LDN. Barra minn hekk, PregS-evokat jonikukurrenti permezz TRPM3 kienu sinifikantimodulat minn ħadd fi, antagonist ta' TRPM3-,f'ċelluli NK minn pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN. Din id-dejta tappoġġja l-ipoteżi liLDN jista' jkollu potenzjal bħala trattament għal ME/CFS billi jikkaratterizza s-sottostanti mekkaniżmi regolatorji ta 'trattament LDN li jinvolvu TRPM3 u riċetturi opjojdi f'NKċelloli. Fl-aħħarnett, dan l-istudju jista 'jservi għall-użu mill-ġdid ta' drogi kkummerċjalizzati, kif ukoll bħala appoġġl-approvazzjoni ta 'studji kliniċi randomised prospettivi dwar ir-rwol u d-doża ta' NTX fikura ta' pazjenti ME/CFS.

Kliem ewlieni:cistanche b'doża baxxa, riċettur temporanju potenzjali melastatin 3, kalċju, riċettur opjojdi, mialġikuenċefalomjelite/sindromu ta 'għeja kronika, ċelluli qattiel naturali, elettrofiżjoloġija tal-garża-morsa taċ-ċelluli kollha

INTRODUZZJONI

Enċefalomielite Mialġika/Sindromu ta 'Għeja Kronika(ME/CFS) hija kundizzjoni multisistemika severa kkaratterizzata minngħeja persistenti debilitanti akkumpanjata minn firxa tasintomi li jiddiżabilitaw inkluż telqa wara l-isforz, irqaddisfunzjoni, uġigħ mifrux, kif ukoll newro-konjittivi,awtonomiku, kardjovaskulari, newroendokrinali u immunimanifestazzjonijiet (1, 2). Hemm severità differenti ta' ME/CFS(ħafif sa sever ħafna) (3), fejn sinifikantiu konsistentidisfunzjoni immuni u anormalitajiet fil-qattiel naturali (NK)funzjonijiet taċ-ċelluli ġew irrappurtati abbażi tas-severità (4). Mingħajrtest dijanjostiku klinikament stabbilit, id-dijanjosi hija kumplessa uimpreċiż. Id-dijanjosi bħalissa tiddependi fuq sintomi differenti bbażati fuqdefinizzjonijiet tal-każijiet, magħrufa bħala l-Kriterji tal-Kunsens Kanadiż(CCC, 2003) u l-Kriterji Internazzjonali tal-Każ (2011), lijindirizzaw il-karatteristiċi kliniċi tal-ME/CFS (2, 5, 6). Il-etjoloġija u speċifiċipatofiżjoloġija tal-kundizzjoni, litaffettwa 17 sa 24 miljun ruħ madwar id-dinja (7), jibqgħu mhux magħrufa.ME/CFS potenzjalment tiżviluppa minħabba indeboliment fiPotenzjal tar-Riċettur Transitorju (TRP) katjoni mhux selettivakanali kkawżati jew minn fatturi ġenetiċi jew akkwistati (8–13). Studji preċedenti ssuġġerew l-importanza ta 'TRP Melastatin 3(TRPM3), kalċju espress ħafna (Ca2 plus)-permeabblikanal ta 'katjoni mhux selettiv, fil-patofiżjoloġija ta' ME/CFS(8–10). Riċentement, investigazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi indipendentiwera telf ta 'funzjoni tal-kanal tal-joni TRPM3 warastimulazzjoni b'żewġ agonisti potenti ta' TRPM3-, pregnenolonesulfat (PregS) u nifedipine, u inibizzjoni ma selettivu imblokkatur qawwi, id-deoxybezoin ononetin, fiċ-ċelloli NK minntliet koorti differenti ta' pazjenti ME/CFS (11–13). TRPM3 ġie identifikat qabelbħala kimo- ukanal nociceptor termosensittiv fis-somatosensorysistema u hija implikata fl-iskoperta ta 'sħana noċivi u infjammatorjiiperalġeżja tas-sħana kif ukoll fit-trażmissjoni tal-uġigħ(14). Letteratura reċenti tissuġġerixxi li sinjalazzjoni mogħdijietassoċjati ma 'attivazzjoni ta' ċerti proteini G akkoppjatiriċetturi (GPCRs), imsejħa riċetturi tal-opjojdi, jistgħu jinibixxu TRPM3attività tal-kanal tal-joni permezz ta' rbit dirett tal-Gbgsubunità tal-proteini G trimeriċi għall-kanal tal-joni (15–18). Fiżjoloġikament,riċetturi opjojdi huma attivati ​​minn peptidi opjojdi endoġeni biexjimmodulaw mekkaniżmi ta 'uġigħ u infjammatorjimogħdijiet (19). Drogi opjojdi jew opiates jipproduċu kemm analġeżija ueffetti sekondarji mhux mixtieqa billi jitwaħħlu mal-istess GPCRs (19). L-evidenza tindika li r-riċetturi tal-opjojdi mhumiex espressi bissmis-sistema nervuża ċentrali (CNS) iżda huma mqassma ħafnafuq tessuti u sistemi ta’ organi barra s-CNS, bħall-ċelluli immuni (20). Attivazzjoni ta' riċetturi ta' opjojdi lewkoċititwassal għas-sekrezzjoni ta 'peptidi opjojdi endoġeni, lisussegwentement jattiva r-riċetturi newronali tal-opjojdi u ttaffiuġigħ (21). Intwera wkoll li l-opjojdi għandhom immunosoppressivieffetti fuq is-sistema immuni intrinsika u adattattiva (22). ME/Il-patoloġija tas-CFS tista' titqies bħala disturb tal-kanali tal-joni jewkanalopatija (8–13) kif ukoll disfunzjoni immunisindromu u disturb newroloġiku (23, 24). Għalhekk, huwa vitalibiex tinvestiga l-mekkaniżmi regolatorji sottostanti l-TRPM3-interazzjoni tar-riċetturi tal-opjojdi fiċ-ċelloli NK minn ME/CFSpazjenti biex jifhmu aħjar il-patoġenesi.L-iskoperta ta 'TRPM3 bħala kanal nociceptorimmirat sostanzjalment minn ċerti riċetturi tal-opjojdi, kif ukoll tiegħuimplikazzjoni f'Ca2 plus-funzjonijiet immuni taċ-ċelluli NK dipendentijissuġġerixxi li l-kanal tal-joni TRPM3 jista 'jkun farmakoloġikamentimmirati biex jittrattaw ME/CFS. Naltrexone hydrochloride (NTX) huwa aantagonist opjojdi fit-tul speċifikamentjimmira l-mu-opioidriċettur (MOR) u, sa ċertu punt, id-delta-opioidriċetturi (dJEW) (25, 26). L-irbit ta 'NTX fuqmORs jiċħduil-funzjoni inibitorja ta’ dawn ir-riċetturi tal-opjojdi fuq TRPM3 (15, 17, 18, 26). Preċedentement irrappurtajna danin vitrotrattamentta 'ċelluli NK minn pazjenti ME/CFS b'NTX għal 24 siegħa, jirrestawral-attività tal-kanal tal-joni TRPM3 (13). Restawr tal-jone TRPM3l-attività tal-kanal min-naħa tagħha reġgħet stabbilixxiet il-Ca xieraq2 plussinjali uper seĊelloli NK' attivazzjoni u funzjonijiet effettur(13). NTX huwa komunement użat fit-trattament ta 'opjojdi udipendenza fuq l-alkoħol f'doża ta' 50-100 mg/jum (25). Fl-għolidożaġġ, NTX huwa maħsub li jimblokka s-sentimenti ewforiċi ta 'beta-endorphinsli huma involuti f’ċirkwiti ta’ premju naturali ugħalhekk jista' jsostni l-vizzju (27). Doża baxxa (3.0–5.0 mg/kuljum,doża baxxa NTX, LDN) jidher li għandu effett oppost,ittejjeb l-effett tal-endorphin biex tnaqqas l-uġigħ u tingħata spintapjaċir (28). Dan huwa maħsub ligħandhom rilevanza fil-mardbħal ME/CFS, fejn insuffiċjentisekrezzjoni ta endoġenupeptidi opjojdi jaffettwaw ir-rispons immuni jew il-kontroll tal-uġigħ (29, 30), jew ir-rilaxx ta 'pro-infjammatorjiċitokini (25, 31). A riċentistudju rrapporta li LDN huwa sigur u effettiv biex itaffi l-ME/CFSsintomi b’eżami retrospettiv tal-pazjent klinikurekords ta’ 218-il pazjent ME/CFS li ngħataw LDN (27). Anke jekkevidenza ġdida tindika li LDN jista 'jtejjeb il-funzjoni ta' kuljum ukwalità tal-ħajja f'pazjenti ME/CFS, aktarin vitroinvestigazzjoni hijameħtieġa biex jifhmu l-mekkaniżmi regolatorji sottostantili jinvolvi TRPM3 u riċetturi tal-opjojdi fiċ-ċelloli NK biex jgħinujifhmu l-pathomechanism tal-ME/CFS u jidentifikawmiri terapewtiċi.Dan l-istudju preżenti investiga l-effett terapewtiku potenzjalita 'LDN f'pazjenti ME/CFS billi jirrestawra l-kanal tal-joni TRPM3funzjoni fiċ-ċelloli NK bl-użu ta 'tekniki ta' patch-clamp b'ċellula sħiħa.Ir-riżultati tagħna jindikaw li pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN għandhomTRPM restawrat3-bħal kurrenti joniċi fiċ-ċelloli NK. Restawr ta'Il-funzjoni TRPM3 hija meħtieġa biex tippromwovi Ca2 plusremodeling tas-sinjalifiċ-ċelloli NK uper seAttivazzjoni taċ-ċelluli NK u funzjonijiet effettur.Dan huwa l-ewwelstudju biex jirrapporta l-effikaċjata' LDN għal ME/CFSpazjentiin vitro, għalhekk tikkonfermail-potenzjal tagħha għall-użu bħala atrattament għall-marda.

Ikklikkja hawn biex tkun taf aktar informazzjoni dwar il-funzjoni ta' kontra l-għeja ta' cistanche

MATERJALI U METODIReklutaġġ ta' Parteċipanti

Disa' pazjenti ME/CFS u disa' b'saħħithom għall-età u s-sesskontrolli (HC) ġew ingaġġati bl-użu taċ-Ċentru Nazzjonali għallPazjent Newroimmunoloġija u Mard Emerġenti (NCNED).database bejn Settembru 2019 u Frar 2021.Il-parteċipanti kellhom bejn 18 u 60 sena. Kollha ME/CFSpazjenti qabel kienu rċevew konferma kkonfermatadijanjosi medikau ġew skrinjati permezz ta’ kwestjonarju komprensiv onlajnli jikkorrispondu maċ-Ċentri għall-Kontroll tal-Mard uDefinizzjonijiet ta' każijiet ta' Prevenzjoni (CDC), CCC u ICC. Id-disa' ME/Pazjenti CFS ġew definitimis-CCC. Id-disa' pazjenti kollha ME/CFSġew reklutati mill-NCNED peress li qabel kienu bdew LDNtrattament (3.0–5.0 mg/kuljum) għal mill-inqas 4 ġimgħat bħala parti minn tagħhompjan ta’ ġestjoni wara riċetta mit-tabib ġenerali tagħhom.HC irrapporta l-ebda inċidenza ta 'għeja u kien f'saħħtumingħajr evidenza ta’ mard. Il-parteċipanti ġew esklużi minn danjistudjaw jekk kinux tqal jew qed ireddgħu, jew irrapportati astorja preċedenti ta’ tipjip, abbuż mill-alkoħol jew mard kroniku(pereżempju, mard awtoimmuni, mard kardjovaskulari,dijabete, sindromu metaboliku, mard tat-tirojde, tumuri malinni,nuqqas ta’ rqad, għeja kronika, u disturbi psikoloġiċi primarji)jew kienu obeżi (BMIAkbar minn jew ugwali għal30). L-ebda parteċipant ma rrapporta użu ta 'opjojdijew xi killers oħra għall-uġigħ fit-3 xhur preċedenti kif ukollaġenti farmakoloġiċi li direttament jew indirettament jinfluwenzaw TRPM3 jew Ca2 plussinjalar. Il-parteċipanti ġew ipprovduti bil-għażla li tieqaf kwalunkwe konfliġġentimediċini għal minimu ta’ 14jiem qabel l-għoti tad-demm bl-approvazzjoni tat-tabib tagħhom.Il-parteċipanti kollha lestew kwestjonarju onlajn biex jipprovdusfond soċjodemografiku, storja medika, mediċini, ustorja tas-sintomi għal pazjenti ME/CFS (Tabella 1). L-{0}}oġġettstħarriġ dwar is-saħħa b'forma qasira (SF-36) u l-Organizzazzjoni Dinjija tas-Saħħa(WHO) Skeda ta' Valutazzjoni tad-Diżabilità (DAS) kienet użata biextiddetermina l-livell ta' diżabilità u l-kwalità tal-ħajja (Tabella 2) (32, 33). Fl-aħħarnett, pazjenti ME/CFS ġew mitluba jirrappurtaw lilhom infushom is-severità ta'sintomi qabel u wara li tieħu LDN (Tabella 3). Daninvestigazzjoni kienet approvata mill-GriffithUniversità BniedemKumitat tal-Etika tar-Riċerka (GU2019/1005) u Gold CoastKumitat tal-Etika tar-Riċerka Umana tal-Isptar Universitarju(HREC/2019/QGC/56469).

Ċellula Mononukleari tad-Demm PeriferaliIżolament u Naturali Killer Cell iżolament

B’kollox inġabru 85 ml ta’ demm sħiħtubi ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).viavenepunctureminn kwalifikatphlebotomist minn kull parteċipant bejn it-8:30 amu 10:30 am f’postijiet ta’ ġbir inkluż GriffithUniversità,Royal Brisbane u Nisa's Sptar, Isptar Robina, SunshineL-Isptar tal-Università tal-Kosta, l-Isptar John James tal-Kalvarju,

Royal Melbourne Hospital, l-Awstralja. Analiżi ta' rutina tad-demm sħiħsar fi żmien erba’ sigħat mill-ġbir għaċ-ċelluli ħomor tad-demmgħadd, għadd taċ-ċelluli bojod tad-demm u għadd taċ-ċelluli tal-granuloċiti għal kull wieħedparteċipant fl-Isptar tal-Università Gold Cost jew ir-Royal MelbourneSptar, l-Awstralja.Ġew ipprovduti kampjuni lil-laboratorju u ġew de-identifikatibl-użu ta' akodiċi uniku minn kollettur tad-demm indipendenti. Demm periferaliċelluli mononukleari (PBMCs) ġew iżolati minn 80 ml ta 'sħaħdemm permezz ta’ ċentrifugazzjoni fuq medja ta’ gradjent ta’ densità (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, l-Isvezja) bħal qabeldeskritt (34, 35). Il-PBMCs kienu mtebbgħin bi trypan blue(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) biex jiddetermina l-għadd taċ-ċelluli uvijabbiltà taċ-ċelluli. PBMCs ġew aġġustati għal afifikonċentrazzjoni nal ta5x107 ċelluli/ml għall-iżolament taċ-ċelluli NK.Iċ-ċelloli NK ġew iżolati b'għażla immunomanjetika bl-użu ta' anEasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (Ċellola StemTeknoloġiji, Vancouver, BC, Kanada). Purifikazzjoni taċ-ċelluli NK ġie determinat bl-użuflflow ċitometrija. Iċ-ċelloli NK ġew inkubatigħal 20 minuta f'temperatura tal-kamra fil-preżenza ta 'CD56FITC ({{0}}.25µg/5µl) u CD3 PE Cy7 (0.25µg/20µl) monoklonaliantikorpi (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) bħal qabeldeskritt (10). 7-amino-actinomycin (7-AAD) (2.5µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, USA) intużat biex tiddetermina ċ-ċellulavijabbiltà. Iċ-ċelloli ġew maħsula u sospiżi mill-ġdid f'200ml tastain buffer (BD Bioscience, New Jersey, USA) u akkwistatfl-10,000 avvenimenti bl-użu tal-LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, CA, l-Istati Uniti). Bl-użu tat-tifrix 'il quddiem u tal-ġenb, il-Il-popolazzjoni tal-limfoċiti kienet gated waqt l-akkwist tal-kampjun.Il-popolazzjoni taċ-ċelluli NK imbagħad ġiet identifikatabħala CD3− CD56plusċelloli.

Reġistrazzjoni Elettrofiżjoloġija taċ-Ċellula Sħiħa

Ir-reġistrazzjonijiet elettrofiżjoloġiċi saru bil-borosilikatelettrodi kapillari tal-ħġieġ b'dijametru ta' barra ta' 1.5 mm u andijametru ta' ġewwa ta' 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,L-ISTATI UNITI). Reżistenza tal-pipetta meta timtelabis-soluzzjoni tal-pipetta kienet 8-12 MW. Il-pipetti ġew immuntati fuq head-stage CV203BU(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) konness ma' 3-modmanipulatur oħxon u mikromanipulatur (Narishige, Tokyo,Ġappun). Sinjali elettriċi ġew amplifikatiu rreġistrati bl-użu ta' anAmplifikatur Axopatch 200Bu softwer PClamp 10.7 (MolecularApparati, Sunnyvale, CA, USA). Id-dejta ġiet iffiltrataf'5 kHz ukampjun diġitalment f'10 kHzviaa Digidata 1440A analog tokonvertitur diġitali (Apparat Molekulari, Sunnyvale, CA, USA). Il-protokoll ta 'rampa ta' vultaġġ kien pass minn potenzjal ta 'żamma ta' plus 10mV biex−90 mV, segwit minn rampa ta' 0.1 s għal aktar 110 mV, qabeljirritorna għal plus 10 mV (ripetuti kull 10 s). Il-junction likwidapotenzjal bejn is-soluzzjonijiet tal-pipetta u tal-banju (−10 mV) kienikkoreġut. Komponent ta 'kurrent ta' tnixxija ma ġiex imnaqqas minnil-kurrenti rreġistrati. L-elettrodu kien mimlimal-intraċellularisoluzzjoni tal-pipetta li fiha 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2, 110 mMAċidu L-Aspartiku, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP,0.1 mM GTP, pH aġġustat għal 7.2 b'CsOH u osmolalità ta'

290 mOsm/L b'D-mannitol. Is-soluzzjoni tal-pipetta ġiet iffiltrata bl-użu ta' 0.22mm filtru tal-membrana(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,USA), maqsuma f'alikwoti u maħżuna fi−20 grad. Soluzzjoni tal-banjuli jinsabu: 130 mM NaCl, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl2, 1.5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, pH aġġustat għal 7.4 b'NaOH uosmolalità 300 mOsm/L b'D-glucose. Ir-reaġenti kollha kienumixtrija minn Sigma-Aldrich, ħlief għal ATP u GTP liinxtraw minn Sapphire Bioscience. TRPM3 jonikukurrenti fuq ċelluli NK ġew stimulati billi żżid 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, UK) għas-soluzzjoni tal-banju, billiIl-kurrenti TRPM3 indotti minn PregS ġew imblukkati billi żiedu 10mM ononetin (Tocris Bioscience, Bristol, UK). Għal kull parteċipant,Saru 10 reġistrazzjonijiet differenti. Għalhekk, N jirreferi għan-numru ta 'parteċipanti f'kull grupp (ME/CFS pazjenti jew HC) u n, lill-numru ta' qari jew daqs tal-kampjun. Il-kejl kollu kienmwettqa f'temperatura tal-kamra. L-awturi neħħew il-possibbiltà ta' involviment tal-kurrent tal-klorur fit-TRPM3valutazzjoni billi tuża L-Aspartic acid fil-pipetta intraċellularisoluzzjoni. Ċelloli li għandhom kurrenti instabbli ġew esklużi wkollmill-analiżi.Analiżi StatistikaĠew identifikati popolazzjonijiet ta' limfoċitiminn sħabiċitometrija bl-użutferrex 'il quddiem u fil-ġenb dot plots. Il-purità ta 'CD3- CD56pluslimfoċiti ġie determinat. Id-dejta taċ-ċitometrija ġiet esportata minnFacsDiva v8.1 u analizzati bl-użu ta' SPSS v24 (IBM Corp, Verżjoni24, Armonk, NY, USA) u GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., Verżjoni 7, La Jolla, CA, USA). Elettrofiżjoloġiċiid-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ softwer pCLAMP 10.7 (MolecularApparati, Sunnyvale, CA, USA). Oriġini 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, USA) u GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., Verżjoni 7, La Jolla, CA, USA) kienuużati għall-analiżi statistika u l-preżentazzjoni tad-dejta. Viżwali umetodi kkalkulati ntużaw biex tiġi determinata n-normalità tadata indipendenti.

Speċifikament, plots tal-istogramma u l-Intużaw test ta' normalità Shapiro-Wilk, skewness u kurtosisbiex jiddetermina d-distribuzzjoni tad-data u n-normalità. Jiddependifuq in-normalità, sar paragun statistiku bl-użu tal-test U Mann-Whitney mhux parametriku indipendenti, jewt-test parametriku indipendenti. Test eżatt tas-sajjieda kien użat biexiddetermina s-sensittività taċ-ċelluli NK għall-ononetin. Sinifikatġie stabbilitfil-p<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">iddikjarat mod ieħor.RIŻULTATIKaratteristiċi tal-Parteċipant uParametri tad-DemmĠew inklużi tmintax-il parteċipant imqabbla skont l-età u s-sess għaldin l-investigazzjoni. Dejta demografika għall-pazjenti humamiġbura fil-qosor fiTabella 1. Ma kien hemm ebda sinifikantidifferenza fietà jew sess bejn pazjenti ME/CFS u HC. L-SF-36 uStħarriġ WHODAS intuża biex jiddetermina s-saħħa tal-parteċipantikwalità tal-ħajja relatata (Tabella 2) (36, 37). 

Kif mistenni, kien hemm sinifikantidifferenza fil-punteġġi SF-36 u WHODAS bejnPazjenti ME/CFS u HC. Barra minn hekk, għadd sħiħ tad-demmparametri ġew imkejla għal kull parteċipant b'saħħtu uPazjenti ME/CFS (Tabella 2). Filwaqt li aħna rrapportaw sinifikanti differenza għall-eosinophils bejn parteċipanti b'saħħithom u ME/Pazjenti CFS, ir-riżultati kollha kienu fi ħdan dak speċifikatreferenzafirxiet kif ipprovdut mill-Isptar Università Gold CoastUnità tal-Patoloġija, laboratorju akkreditat tan-NATA. Ebda sinifikanti differenzi ġew irrappurtati f'parametri oħra. Fl-aħħarnett, ME/CFSpazjenti rrappurtaw titjib fil-ħsieb indebolit,konċentrazzjoni u tagħbija żejda konjittiva kif ukoll immuni oħradisturbi sintomi (uġigħ fil-griżmejn, limfa mkabbra jew teneranodi, u suxxettibilità għall-irjiħat/influwenza) wara trattament biLDN (Tabella 3), kif deskritt qabel (27, 38). 

Purità Naturali taċ-Ċelluli Killer

Ċellula NKpurità (CD3- /CD56plus) kien 92.42 fil-mija ± 1.849 għal HC u82.20 fil-mija ± 9.409 għal pazjenti ME/CFS li jieħdu LDN kif determinatminnflflow ċitometrija (Figura 1A). Ma kien hemm ebda sinifikanti differenza fil-purità taċ-ċelluli NK f'pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDNmeta mqabbel ma' HC (Figura 1B).

TRPM3 Ion Channel Attività WaraStimulazzjoni ta 'Pregnenolone fiċ-Ċelloli NKMinn Pazjenti ME/CFS Li Jieħdu LDNMeta mqabbel maċ-Ċelloli NK Minn HC

L-attività tal-kanal tal-joni TRPM3 ġiet irreġistrata f'NK uman iżolatċelluli minn pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN (3.0–5.0 mg/jum) umeta mqabbla ma 'ċelluli NK umani iżolati minn età u sess mqabblaHC, bl-użu tat-teknika tal-garża-morsa taċ-ċelluli kollha.Funzjoni tal-kanal tal-joni TRPM3 endoġenu kien malajr uattivat b'mod riversibbli bl-applikazzjoni ta' 100mM PregS, asterojdi newronali. Stimulazzjoni bi PregS ppermettiet kejlta 'kurrent żgħir li jirrettifika barra taħt vultaġġ-morsakondizzjonijiet u osservazzjoni ta 'forma tipika tal-vultaġġ tal-kurrent TRPM3relazzjoni (I–V) (Figura 2). Aħna, għalhekk,imkejjel kurrent joniku żgħir bi TRPM3-tip tipikurettifika esternaf'ċelluli NK iżolati minn HC wara l-żieda ta' PregS (Figuri 2A, B). Interessanti, PregSapplikazzjoni fiċ-ċelloli NK minn pazjenti ME/CFS li jieħdu LDNimita ż-żieda indotta minn PregS fiċ-ċelloli NK minn HC(Figuri 2C, D). Għalhekk, l-istimulazzjoni PregS indotta żiedatal-barra rettifikataamplitudnijiet kurrenti fiċ-ċelloli NK minnPazjenti ME/CFS li jieħdu LDN għall-istess livell bħaċ-ċelloli NK minnHC (Figura 2E). Barra minn hekk, il-kurrenti evokati minn PregS jippreżentaw atipikuI–V ta' TRPM3 (Figura 2D). Id-dejta tissuġġerixxi li ME/Pazjenti tas-CFS li qed jieħdu LDN m'għadhomx ikollhom indebolimentAttività tal-kanal TRPM3 kif irrappurtat qabel (11–13), ugħalhekk LDN jista' jkollu benefiċċju terapewtiku potenzjaligħalil-patoloġija.

Modulazzjoni ta' Kurrenti Evokati PregSB'Ononetin fiċ-Ċelloli NK Minn ME/CFSPazjenti li jieħdu LDN meta mqabbla ma 'NKĊelloli Minn HC

Ca indott minn PregS2 plus-influssu kurrenti joniċi permezz TRPM3kanali tal-joni jistgħu jiġu inibiti b'mod effettiv minn kompost naturali,deoxybezoin ononetin (39). Għalhekk, biex tikkonfermadak TRPM3attività hija involuta f'kurrenti joniċi evokati minn PregS fiċ-ċelloli NK, aħnali jmiss użat 10mM ononetin biex jimmodula l-kanal tal-joni TRPM3attività (Figura 3). Kif muri qabel (11–13), l-jonikukurrenti evokati mill-applikazzjoni ta 'PregS kienu effettivamentinibit mill-applikazzjoni simultanja ta 'xejn f'iżolatiċelluli NK minn HC (Figuri 3A–C). Barra minn hekk, il-I–V takurrenti sensittivi ononetin kien esternament-rettifikatu tipikugħal TRPM3 (Figura 3B). Interessanti, il-kurrenti joniċi evokatimill-applikazzjoni PregS kienu wkoll effettivament inibiti millapplikazzjoni simultanja ta' 10mM ononetin f'NK iżolatċelluli minn pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN (Figuri 3D–G). Tabilħaqq, TRPM3-kurrent joniku dipendenti qabelrapportati li huma reżistenti għall-ononetin f'ċelluli NK iżolati minnPazjenti ME/CFS (11–13). Madankollu, ċelluli NK minn ME/CFSpazjenti li qed jieħdu LDN huma sensittivi għal ononetin fl-istess meddabħala ċelluli NK minn HC (Figura 3G). Barra minn hekk, il-I–V ta 'ononetinkurrenti sensittivi kien esternament-rettifikatu tipiku għal TRPM3

(Figura 3E). Fl-aħħarnett,Figura 3Hjirrapporta TRPM3 kurrentiamplitudnijiet wara stimulazzjoni PregS u modulazzjoni ononetinfi ħdan il-gruppi HC u ME/CFS li jieħdu LDN u biss ilreġistri sensittivi għall-ononetin ġew inklużi. A sinifikanti tnaqqis tal-amplitudni tal-kurrent TRPM3 ġie rrappurtat waramodulazzjoni b'ononetin kemm f'pazjenti ME/CFS li qed jieħduGruppi LDN (p{0}}.0336) u HC (p{2}}.0205). Din il-grafika tikkonfermaIl-kanal tal-joni TRPM3 jaħdem bl-istess mod f'ME/CFSpazjenti li jieħdu LDN meta mqabbla ma 'HC bħala l-istess kurrentfirxiet ta' amplitudni huma rrappurtati (Figura 3H). Kollettivament, dawnir-riżultati jikkonfermawli pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN ma jkollhomx anattività tal-kanal tal-joni TRPM3 indebolita, li hija rrappurtata li hijakaratteristika tal-marda (11–13). Bħala konklużjoni, trattamentb'LDN jippermetti li tirrestawra l-funzjoni tal-kanal tal-joni TRPM3 f'ME/pazjenti CFS u għandu, għalhekk, effett terapewtiku potenzjali.

DISKUSSJONI

Fl-istudju preżenti, użajna l-morsa tal-garża taċ-ċelluli kollhateknika biex tkejjel il-kanal tal-joni TRPM3 endoġenufunzjoni fiċ-ċelloli NK minn pazjenti ME/CFS li jieħdu LDN. Aħnarapport għall-ewwelħin li għandhom pazjenti ME/CFS li jieħdu LDNTRPM restawrat3-bħal kurrenti joniċi fiċ-ċelloli NK. Tabilħaqq, il-applikazzjoni ta 'PregS ippermettiet il-kejl ta' joniċi żgħarkurrenti b'TRPM tipiku3-bħal rettifika 'l barraf'NKċelluli minn pazjenti li jieħdu LDN. Barra minn hekk, PregS-evokat joniċikurrenti permezz TRPM3 kienu sinifikantimodulata minnononetin fiċ-ċelloli NK minn pazjenti ME/CFS li jieħdu LDN bħaladeskritt bl-istess mod fl-HC. Dawn ir-riżultati jirriflettuis-sejbiet preċedenti tagħnatirrapporta restawr tal-funzjoni tal-kanal tal-joni TRPM3fiċ-ċelloli NK minn pazjenti ME/CFS warain vitrotrattament maNTX (13). Dawn ir-riżultati huma wkoll konsistenti ma 'qabel tagħnainvestigazzjonijiet li jissuġġerixxu ME/CFS jistgħu jitqiesu bħala achannelopathy indotta minn TRPM3 telf ta 'funzjoni uikkaratterizzat minn tnaqqis tal-kurrenti joniċi indotti minn PregSkif ukoll reżistenza għall-ononetin fiċ-ċelloli NK minn ME/CFSpazjenti (8–13). It-telf tal-funzjoni TRPM3 jista' jkun responsabbligħal Ca indebolit2 plussinjali u Ca2 plus-funzjonijiet taċ-ċelluli medjati,inklużi funzjonijiet immuni taċ-ċelluli NK (11–13). L-istudju ġdid tagħna preżenti huwa l-ewwel in vitrostudju li jikkonferma l-effikaċjau benefiċċju terapewtikuta' LDN għal pazjenti ME/CFSbilli tikkaratterizza l-mekkaniżmi regolatorji sottostanti tal-LDNtrattament li jinvolvi TRPM3 u l-interazzjoni tar-riċettur tal-opjojdifiċ-ċelloli NK. LDN ġie rrappurtat qabel li kien ta' benefiċċjughaltrattament ta 'varjetà ta' mard, bħal sklerożi multipla,Crohn's marda, fibromyalgia, kanċer, infjammatorjimusranamard u ME/CFS (40–44). B'mod aktar speċifiku, ġolstudju preliminari mwettaq minn Polo et al. dwar is-sigurtà ueffettività tat-trattament LDN, 73.9 fil-mija tal-pazjenti ME/CFSirrapporta rispons pożittiv għat-trattament (27). Ħafna mill-pazjentiesperjenza viġilanza/viġilanza mtejba u fiżika mtejbau l-prestazzjoni konjittiva. Xi pazjenti rrappurtaw ukoll inqas uġigħu deni, li juri li LDN jista 'juri xi potenzjal għalittaffi firxa wiesgħa ta' sintomi ta' ME/CFS (27). Bl-istess mod,Bolton et al. iddeskriva tliet rapporti ta’ każijiet miġbura minn ME/CFSpazjenti li qed jieħdu LDN u rrappurtaw il-firxa ta’ reazzjonijiet,minn tibdil fil-ħajja għal tnaqqis f'xi sintomi biss (38).

Ibbażat fuq il-benefiċċjirrappurtati mill-pazjenti dwar is-sintomi tagħhom,It-trattament LDN jista' jintuża bħala trattament potenzjali u jista'jimmira l-pathomechanism tal-ME/CFS.Il-patoġenesi ta' ME/CFS mhix magħrufa iżda jone anormalikanali u aktar speċifikamentfunzjoni TRPM3 indebolita għandhomreċentement deher bħala karatteristika tal-marda (8–13). Preċedentement irrappurtajna TRPM3 telf ta 'funzjoni waramodulazzjoni b'agonisti u antagonisti potenti tat-TRPM3-f'NKċelluli minn tliet koorti differenti ta’ pazjenti ME/CFS (11–13). TRPM3 ġie deskritt bħala attur ċentrali ta 'Ca2 plus- mogħdijiet ta' sinjalar dipendenti, kemm f'eċitabbli kif ukoll f'dawk mhux eċċitantiċelluli, fejn Ca2 plussinjali jsuqu l-ċellulari differentiproċessi (45). Papanikolaou et al, identifikatiTRPM3 bħala ankomponent importanti tal-'Ca2 plussett ta' għodda' li tirfed imħaddma minn maħżenCa2 plusdħul u s-sostenibbiltà ta' Ca2 plussinjalar inCNS materja bajda glia (46). Bl-istess mod, TRPM3 intwera li jwassalgħal żieda ta’ Ca2 plus influssfiċ-ċelloli beta tal-frixa li jirriżultaw firilaxx sussegwenti tal-insulina (47). Kull tip ta 'ċellula tippreżenta unikafenotip tas-sinjalar kapaċi jwassal regolat sewwaspazjotemporali Ca2 plussinjali biex jimmodula l-funzjoni partikolari tiegħu(48). Konsegwentement, kwalunkwe dysregulations sottili ta 'Ca2 plussinjali jistgħuimpatt kbir fuq il-funzjonijiet taċ-ċelluli u jirriżulta f'mard (48, 49). Iċ-ċelloli NK jeħtieġu wkoll Ca2 plusgħal effiċjentistimulazzjoni ufunzjonijiet inkluż iċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli NK (50–53). KompromessIl-funzjoni ċitotossika taċ-ċelluli NK hija dokumentata sew u konsistentikaratteristika ta' ME/CFS (54). Għalhekk, TRPM3 telf ta 'funzjoni jista'tikkontribwixxi għas-sintomatoloġija tal-ME/CFS billi taffettwaCa2 plussinjali u Ca2 plus-funzjonijiet taċ-ċelluli medjati, inkluż NKfunzjonijiet immuni taċ-ċelluli.Funzjoni karatterizzata tajjeb ta 'TRPM3 fil-letteratura hija tagħharwol fl-iskoperta ta 'sħana noċiva (uġigħ akut) kif ukoll infjammatorjiiperalġeżija (uġigħ akut u kroniku) (14). Opjojdi endoġeni huma sintetizzatiin vivobiex jimmodula l-risponsi analġeżiċi fiżjoloġiċi f'infjammatorjiuuġigħ newropatiku. Opjojdi endoġeni u eżoġeni jorbtu ma 'l-ORs, misjuba fil-periferija, fil-presynaptic u postsynapticsiti fil-ħorn dorsali tas-sinsla tad-dahar, u fiż-zokk tal-moħħ,thalamus, u kortiċi, f'dak li jikkostitwixxi l-uġigħ axxendentisistema ta' trażmissjoni (55). Studji riċenti rrappurtaw danriċetturi opjojdi huma wkoll espressi minn ċelluli immuni biex iwettquanalġeżija opjojdi medjata minn ċelluli immuni billi tipproduċi endoġenapeptidi opjojdi, li jinvolvu Gai/o–Gbg–fosfolipasi C(PLC)–inositol 1,4,5-riċettur tat-trifosfat (IP3R)– intraċellulariCa2 plusmogħdija. Il-peptidi opjojdi rilaxxati sussegwentement jattivawriċetturi tal-opjojdi newronali periferali u ttaffi l-uġigħ (21). Intwera wkoll li l-opjojdi jimmodulaw direttament il-funzjonijiet ta 'limfoċiti u ċelloli oħra involuti fid-difiża tal-ospitanti uimmunità li tirriżulta f'effetti immunosoppressivi (56, 57). B'mod aktar speċifiku, attivazzjoni ta 'OR minn alkalojdi opjojdi upeptidi bħall-morfina u l-peptidi endoġeni,inklużi beta-endorphin u l-peptidi dynorphin, li jwasslu għal anumru mnaqqas ta 'makrofaġi, lewkoċiti mnaqqsaproliferazzjoni u migrazzjoni lejn infjammatorjisiti, naqsuattività fagoċitotika tal-makrofaġi, tnaqqis fil-kimotassi uproduzzjoni ta’ superossidu minn newtrofili u makrofaġi,apoptożi aċċellerata tal-makrofaġi, mikrobijoloġika mdgħajfaprotezzjoni, u adeżjoni mnaqqsa ta 'lewkoċiti u endoteljaliċelloli (58). Effetti negattivi oħra ġew deskritti wkoll firelazzjoni maċ-ċelloli mast, ċelloli dendritiċi, u ċelloli NK b'atnaqqis fiċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli NK u l-produzzjoni taċ-ċitokini (22, 56, 59, 60). Iċ-ċelloli immuni, glia, u newroni jiffurmaw għalhekk annetwerk integrat li jikkoordina r-risponsi immuni ujimmodula l-eċitabbiltà tal-mogħdijiet tal-uġigħ (61). Timmira l-riċetturi tal-opjojdi fuq iċ-ċelluli immuni jistgħu jirriżultaw f’bidliet fitweġibiet immuni biex jippromwovu r-riżoluzzjoni ta inflflammazzjoni bħalakif ukoll il-modulazzjoni tal-uġigħ f'pazjenti ME/CFS.Interessanti, molekuli li jorbtu ma 'u jattivaw l-opjojdiriċetturi b'mod sinifikantitnaqqas l-uġigħ dipendenti fuq TRPM3-. Filrispons għal attivazzjoni akuta minn agonisti, riċetturi opjojdikoppja lill-Gi/o proteini, li jiddissoċjaw fi Gai/o u Gbgsubunitajiet biex jinteraġixxu ma’ effetturi intraċellulari (62). TRPM3attività hija inibita bil-qawwa mill-attivazzjoni ta 'µOR permezzl-interazzjoni diretta ma 'Gbgbħala CA dipendenti minn TRPM3-2 plusentrati huma inibiti b'mod qawwi u riversibbli meta ċ-ċellulamembrana hijaflflushed ma purifikat Gbg(15–18). NTX huwa fit-tulantagonist tal-opjojdi speċifikamentjinibixximORs, għalhekkjiċħdu l-funzjoni inibitorja ta 'dan ir-riċettur opjojdi fuqTRPM3 (22, 26). Fl-istudju preċedenti tagħna, irrappurtajna danin vitrotrattament b'NTX jirrestawra l-kanal tal-joni TRPM3attività fiċ-ċelloli NK iżolati minn ME/CFS (13). Bl-istess mod, fil-istudju attwali, ċelluli NK iżolati minn pazjenti li jieħdu LDN għamluma juru l-ebda attività tal-kanal tal-joni TRPM3 indebolita. LDNtrattament f'pazjenti ME/CFS jidher li jirrestawra l-jone TRPM3funzjoni tal-kanal fiċ-ċelloli NK, li tirriżulta f'Ca2 plussinjaliremodeling biex tikkontribwixxi għar-restawr tal-integritàu l-istabbiltà taċ-ċelluli NK speċifiċisistemi tas-sinjalar (10–13). Interessanti, ġie rrappurtat li l-effett ta 'antagoniżmuNTX mixgħulamJEW tfixkel ukoll ir-regolament dwar ir-rispons negattiv fuqdJEW, u b'hekk tiżdieddJEW funzjoni.

Titjib ta'dJEWl-attività tippromwovi ċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli NK b'reazzjoni għal beta-endorphins in vitrofuq splenoċiti tal-firien, li jissuġġerixxi l-potenzjalużu ta 'NTX fit-trattament ta' defiċjenza immuni (63). Il-mekkaniżmu sottostanti LDN's effikaċjagħall-għeja,Crohn's marda, fibromyalgia, u sklerożi multipla, għalhekk,jinvolvi imblokk intermittenti tar-riċetturi tal-opjojdi segwit minnCa2 flimkien mal-produzzjoni dipendentiu upregulation ta 'endoġenuopjojdi. Ludwig et al. irrapporta li serum [Met5 ]-enkephalinlivelli kienu aktar baxxi fil-bnedmin bi sklerożi multipla relattiva għalpazjenti mhux ta 'sklerożi multipla, u LDN restawraw il-livelli tagħhom.Bl-istess mod, fil-ġrieden sperimentali tal-enċefalomielite awtoimmuni,[Met5 Il-livelli ta' ]-enkephalin kienu depressi qabel id-dehrata’ mard kliniku u ġew restawrati bi trattament LDN(28). Għalhekk, jidher li t-trattament LDN jirriżulta fil-titjib tal-effetti analġeżiċi u jistgħu jkunu rilevanti fiME/CFS, fejn insuffiċjentisekrezzjoni ta 'peptidi opjojdi taffettwarispons immuni jew kontroll tal-uġigħ (29, 30), jew ir-rilaxx ta 'proinflammatoryċitokini (25, 31). Tabilħaqq, beta-endorphins imnaqqsakonċentrazzjoni ġiet irrappurtata f'ME/CFSpazjenti li jbatu minn disregolazzjoni ta 'termoregolatorjureazzjonijiet u uġigħ ġeneralizzat qawwi jew fit-tul (64). Bħala konklużjoni, dan l-istudju għall-ewwelħin evalwat u identifikatl-effett ta 'LDN fuq il-funzjoni tal-kanal tal-joni TRPM3 fiĊelloli NK f'pazjenti ME/CFS. Dan l-istudju ġdid jirrapporta l-restawr sottostanti tal-kanal tar-riċettur tal-opjojdi TRPM3-interazzjoni fiċ-ċelloli NK minn pazjenti ME/CFS li qed jieħdu LDN.Barra minn hekk, id-distribuzzjoni wiesgħa ta 'kanali tal-joni TRPM3 fil-korp jissuġġerixxi li l-funzjoni kompromessa tagħhom tista 'tikkontribwixxi għalsinjali u sintomi ta’ ME/CFS u għalhekk kura b’LDN jista' jkollu rwol terapewtiku. Fl-aħħarnett, dan l-istudju jservi biextappoġġja l-ippjanar u l-approvazzjoni ta 'prospettivi randomisedstudji kliniċi dwar ir-rwol u d-doża ta 'NTX fit-trattament ta' ME/Pazjenti CFS.