Parti 1: Effetti Renovaskulari Ta' Nitrat Inorganiku Wara Iskemija-riperfużjoni Tal-Kliewi

Għal aktar informazzjoni. kuntatttina.xiang@wecistanche.com

ASTRATT

Sfond: Korriment ta' iskemija-riperfużjoni renali (IR).hija kawża komuni ta 'korriment akut fil-kliewi(AKI), li hija assoċjata ma 'stress ossidattiv u bijoattività mnaqqsa ta' ossidu nitriku (NO), u riskju akbar li tiżviluppamard kroniku tal-kliewi(CKD) u mard kardjovaskulari (CVD). Strateġiji ġodda li jirrestawraw il-bilanċ redox jista 'jkollhom implikazzjonijiet terapewtiċi waqt AKI u kumplikazzjonijiet assoċjati.

Għan: Biex tinvestiga l-valur terapewtiku li tingħata spinta lill-mogħdija tan-nitrat-nitrite-NO matul l-iżvilupp ta 'disfunzjoni renali u kardjovaskulari indotta mill-IR.

Metodi: Ġrieden maskili C57BL/6 J ngħataw nitrat tas-sodju (10 mg/kg,ip) jew vettura 2 sigħat qabel iskemija sħuna tal-kliewi tax-xellug (45 min) segwit minn supplimentazzjoni ta’ nitrat tas-sodju fl-ilma tax-xorb (1 mmol/kg/ jum) għall-ġimagħtejn li ġejjin. Il-pressjoni tad-demm u r-rata ta 'filtrazzjoni glomerulari ġew imkejla u d-demm u l-kliewi ġew miġbura u użati għal analiżi bijokimiċi u istoloġiċi kif ukoll studji dwar ir-reattività tal-vini renali. Ċelluli endoteljali glomerulari esposti għal ipoksja-riossiġenazzjoni, b'angiotensin Ⅱ jew mingħajru, intużaw għal studji mekkanistiċi.

Riżultati: IR kien assoċjat ma 'funzjoni renali mnaqqsa u pressjoni tad-demm kemmxejn elevata, flimkien ma' korrimenti renali, infjammazzjoni, disfunzjoni endoteljali, livelli miżjuda ta 'An Ⅱ, u vasoreattività medjata minn Ang II, li kienu kollha mtejba bin-nitrat. Barra minn hekk, it-trattament bin-nitrat (in vivo) u n-nitrit (in vitro) irrestawra NO bijoattività u naqqas l-istress ossidattiv mitokondrijali u l-korrimenti.

Konklużjonijiet: Trattament akut b'nitrat inorganiku qabel iskemija renali jista' jservi bħala approċċ terapewtiku ġdid biex jipprevjeni AKI u CKD u r-riskju assoċjat li tiżviluppadisfunzjoni kardjovaskulari.

Ikklikkja biex tilħaq il-fornitur għall-esperjenza cistanche

1. Introduzzjoni

Iskemija-riperfużjoni (IR) korriment tal-kliewi, assoċjati ma 'trapjant, kirurġija ta' bypass kardijaku, u xokk, hija riskju kbir għall-iżvilupp ta 'korriment akut tal-kliewi (AKI) u mard tal-kliewi kroniku sussegwenti (CKD) [1]. Il-mekkaniżmi sottostanti huma kumplessi u jinvolvu stress ossidattiv assoċjat mar-riperfużjoni, defiċjenza ta 'ossidu nitriku, u attivazzjoni taċ-ċelluli immuni, li flimkien iwasslu għal disfunzjoni endoteljali [2, 3]. Ir-riċerka li għaddejja kienet iffukata fuq is-sejba ta’ terapiji ġodda u effettivi għall-prevenzjoni u t-trattament tal-AKI u l-progressjoni tagħha għal CKD, bħal prekondizzjonament iskemiku remot, ipotermja lokali temporanja kif ukoll interventi farmakoloġiċi ġodda [3,4].

Il-molekula ta 'sinjalazzjoni gassuża nitric oxide (NO) tikkontribwixxi b'mod importanti għar-regolamentazzjoni tal-omeostasi kardjovaskulari u renali u ntwera li għandha rwol protettiv waqt il-korrimenti IR [5,6]. Madankollu, matul l-avveniment iskemiku, in-nuqqas ta 'ossiġnu jikkomprometti l-funzjoni ta' endoteljali NO synthase (eNOS), li jista 'jikkontribwixxi għall-"fenomenu ta' no-reflow" fit-tessut iskemiku matul il-fażi ta 'riperfużjoni. Dan imbagħad jippropaga korrimenti taċ-ċelluli epiteljali endoteljali u tubulari [7], li jikkontribwixxu għall-iżvilupp ta 'funzjoni tal-kliewi mnaqqsa. Minbarra l-ipoksja matul il-perjodu iskemiku, il-produzzjoni eċċessiva ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) iġġenerat f'eċċess minn nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase u mitokondrija matul il-fażi ta 'riperfużjoni scavenges NO [8]. Approċċi ġodda li jnaqqsu l-istress ossidattiv u jżommu NO bijoattività jista 'jkollhom valur terapewtiku fil-ġlieda kontra l-insuffiċjenza tal-kliewi indotta mill-IR.

Nitrat inorganiku (NO3) u nitrite (NOZ) qabel kienu meqjusa bħala prodotti relattivament inerti derivati ​​mill-metaboliżmu NO. Madankollu, riċerka mwettqa għal aktar minn għoxrin sena wriet li dawn l-anjoni jistgħu jgħaddu minn bijokonverżjoni, permezz ta 'tnaqqis serjali, u għal darb'oħra jiffurmaw NO u speċi oħra ta' ossidu tan-nitroġenu bijoattiv [9]. L-attività ta 'din il-mogħdija alternattiva tan-nitrat-nitrit-NO hija msaħħa waqt kundizzjonijiet b'ipoksja u pH baxx meta s-sistema NOS klassika tista' ssir ma tiffunzjonax [10].

Id-dieta, minbarra s-sistema NOS, hija sors importanti ta’ nitrat u nitriti li jiċċirkolaw, minħabba livelli għoljin ta’ nitrat pereżempju f’ħxejjex bil-weraq ħodor. Is-supplimentazzjoni b'nitrat u nitrit inorganiċi ġiet assoċjata ma 'effetti kardjovaskulari favorevoli, inkluż tnaqqis fil-pressjoni tad-demm, kemm fi studji sperimentali kif ukoll kliniċi [11]. Intwerew ukoll effetti protettivi ta 'organi f'mudelli sperimentali ta' korriment IR tal-fwied [12], moħħ [13], pulmun [14], u qalb [12,15]. Madankollu, il-valur terapewtiku potenzjali tan-nitrat u n-nitrit inorganiċi fil-korriment tal-IR tal-kliewi għadu kontroversjali. Kif rivedut reċentement [5], riżultati varjabbli f'mudelli IR, bl-użu ta 'terapija tan-nitrit, forsi minħabba differenzi fid-dożaġġ użat, ir-rotta ta' amministrazzjoni, it-tul ta 'trattament, kif ukoll il-mudell sperimentali innifsu [16,17]. Diversi studji sperimentali wrew l-effetti protettivi ta’ supplimentazzjoni ta’ nitrat fid-dieta f’mudelli ta’ mard kardjorenali, permezz ta’ mekkaniżmi li jinvolvu t-tnaqqis ta’ stress ossidattiv u titjib tal-bijoattività NO kif ukoll modulazzjoni ta’reazzjonijiet infjammatorji[5]. Sal-lum, hemm għarfien limitat dwar l-effetti tat-terapija tan-nitrat inorganiku fil-ħsara renali IR. Preċedentement urejna li trattament minn qabel tad-dieta kroniku bin-nitrat attenwa korrimenti renali sussegwenti kkaġunati mill-IR [18]. Madankollu, hemm inqas għarfien dwar il-valur potenzjali li tingħata spinta lill-mogħdija tan-nitrat-nitrit-NO fil-bidu tal-IR biex jitnaqqas ir-riskju li tiżviluppa AKI u CKD. Jekk protettiv, dan jista' jkollu applikazzjonijiet kliniċi wiesgħa f'pazjenti f'riskju li jiżviluppaw AKI pereżempju dawk li jkunu għaddejjin minn kirurġija maġġuri.

F'dan l-istudju, użajna mudell tal-ġurdien ta 'korriment IR renali biex ninvestigaw il-benefiċċji potenzjali ta' trattament akut tan-nitrat immedjatament qabel l-avveniment iskemiku. Dan kien ikkombinat ma 'studji mekkanistiċi ex vivo tal-bastimenti u esperimenti ta' kultura taċ-ċelluli in vitro bi trattament ta 'nitritu. Aħna ipoteżijna li t-tisħiħ tal-mogħdija tan-nitrat-nitrit-NO jippromwovi l-protezzjoni tal-kliewi kontra l-ħsara IR permezz tal-modulazzjoni tal-istress ossidattiv u l-bijoattività NO kif ukoll il-funzjoni mitokondrijali.

2. Metodi

2.1.Reaġenti

Sakemm ma jingħadx mod ieħor, ir-reaġenti kollha nkisbu minn Sigma-Aldrich, l-Isvezja.

2.2. Annimali u mudell iskemija-riperfużjoni tal-kliewi

Ġrieden C57BL/6 J (Irġiel, 10 ġimgħat) inkisbu minn Janvier Lab-oratories (Franza) u miżmuma fil-faċilitajiet tal-annimali tagħna fil-Karolinska Institutet taħt kundizzjonijiet ikkontrollati mill-klima b'ċiklu ta' 12-h dawl/dlam u pprovduti b'chow standard tal-gerriema u ilma tal-vit. Il-proċeduri kollha tal-annimali ġew approvati mill-Kumitat Etiku Reġjonali għall-Esperimenti tal-Annimali (ID tal-Protokoll: N139/15) u twettqu skont il-linji gwida tal-Istituti Nazzjonali tas-Saħħa (NIH) u mad-Direttiva tal-UE 2010/63/UE għat-tmexxija ta’ esperimenti fl-annimali.

Wara ġimgħa ta' akklimatizzazzjoni, il-ġrieden ingħataw plaċebo (NaCl) jew nitrat tas-sodju (NaNO3) intraperitonealment (10 mg/kg) 2 sigħat qabel iskemija unilaterali tal-kilwa tax-xellug. Il-kilwa tal-lemin ġiet spezzjonata iżda inkella tħalla intatta. Kirurġiji fittizji saru bl-istess mod, iżda mingħajr ma kklampjat il-kilwa tax-xellug. Il-ġrieden ġew anestetizzati bl-isoflurane u t-temperatura tal-ġisem inżammet f'37 ± 0.5 grad bl-użu ta 'lampa tat-tisħin u kuxxinett tas-sħana mmonitorjat waħdu matul il-kirurġija. Wara l-kirurġija, il-ġrieden ġew ittrattati jew b'nitrat tas-sodju (1 mmol/kg/jum) jew plaċebo għal ġimgħatejn sat-terminazzjoni.

2.3. Kejl tal-pressjoni tad-demm

Il-pressjoni tad-demm kienet imkejla fil-ġrieden bl-użu ta 'metodu mhux invażiv tal-pulzieri tad-denb qabel it-terminazzjoni. Il-ġrieden ġew ikkundizzjonati fuq pjanċa sħuna f'temperatura ta' 35 grad C għal 10 min u mbagħad imqiegħda f'trażżin tal-plastik. Cuff b'sensor tal-polz pnewmatiku kien imwaħħal mad-denb, u l-valuri tal-pressjoni tad-demm ġew irreġistrati bis-sistema CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). L-annimali ġew imħarrġa bit-trażżin fuq il-pjanċa tat-tisħin mill-inqas tlett ijiem qabel ir-reġistrazzjonijiet tal-pressjoni tad-demm. Il-pressjoni sistolika, dijastolika u arterjali medja nġabru fuq 3 ijiem konsekuttivi u l-medjan individwali tal-valuri aċċettati kollha ġew ikkompilati għall-valutazzjoni.

2.4.Ħsad tat-tessuti

Qabel it-terminazzjoni, il-ġrieden tpoġġew f'gaġeġ metaboliċi biex jiġbru l-awrina għall-kalkolu tar-rata ta 'filtrazzjoni glomerulari (GFR). L-annimali mbagħad ġew anestetizzati bl-isoflurane u nġabru kampjuni tad-demm mill-vina cava inferjuri. Il-kampjuni kollha ġew ċentrifugati immedjatament f'6000 × g, 4 gradi C għal 5min fil-preżenza ta 'EDTA (Sigma-Aldrich, Stokkolma, Svezja), il-konċentrazzjoni finali ta' 2 mM. Kampjuni tal-plażma ġew trasferiti f'tubi ġodda u immedjatament snap-ffriżati fis-silġ niexef u finalment maħżuna fi grad -80. Il-kliewi ġew estratti u maqtugħin f'diversi partijiet għal esperimenti ex vivo tal-funzjoni vaskulari (arterji interlobar u arterioli afferenti), istoloġija ( Tbajja ta' HE u PAS), u kwantifikazzjoni ta' apoptożi u infjammazzjoni (inkorporazzjoni ta' komposti tat-temperatura ottimali tat-tqattigħ tat-Tessut-Tek (OCT) u ffriżati għal tbajja' TUNEL u F4/80).

2.5. Kejl tan-nitrat, nitrit, cGMP, krejatinina, nitroġenu urea fid-demm (BUN), u angiotensin II

In-nitrit u n-nitrat ġew analizzati bl-HPLC(ENO-20) kif deskritt qabel 【19】. Kampjuni tal-plażma (10 ul ġew injettati fis-sistema HPLC b'siringa Hamilton. Sussegwentement, in-nitrat u n-nitrat ġew isseparati permezz ta' kromatografija ta' skambju ta' fażi inversa/jone segwita minn tnaqqis ta' nitrat għal nitrat permezz ta' kadmju u ram imnaqqas. In-nitrit ġie derivatizzat bl-użu ta 'reaġent ta' Griess biex jifforma komposti diazo u skopert f'540 nm. Biex tipprevjeni d-degradazzjoni tas-cGMP, il-plażma ġiet trasferita għal tubi li fihom inibitur PDE, BMX(3-Isobutyl-1methylxanthine; Sigma-Aldrich #I5879) biex tagħti konċentrazzjoni finali (10 μM). Il-kampjuni kienu wara ffriżat u maħżun fi grad-80 qabel ma tanalizza cGMP b'kit ELISA (GE Healthcare #RPN226), skont l-istruzzjonijiet tal-manifatturi.

Il-livelli tal-krejatinina fil-plażma u fl-awrina ġew skoperti bl-użu ta' Kits ta' Assaġġ Kolorimetriku tal-Kreatinina (Cayman Chemical, #700460 u #500701). Formula tat-tneħħija tal-krejatinina (CLcr =Urinecrx Fluss tal-awrina/Plasmacr) intużat biex jiġi stmat GFR. Il-livelli ta 'BUN fil-plażma ġew skoperti bl-użu ta' Kit ta 'Sejbien Kolorimetriku BUN (Invitrogen, #EIA-BUN). Il-livelli ta' Ang fil-plażma u fit-tessuti tal-kliewi tkejlu bl-użu ta' kit ELISA Ang ⅡI (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) skont l-istruzzjonijiet tal-manifatturi. Madankollu, il-preparazzjoni tal-estratt tat-tessuti kienet kemmxejn differenti mir-rakkomandazzjoni.10 vol 50 mM HCl f'50 fil-mija EtOH ġie miżjud mat-tessut u msaħħna għal 10 min f'100 grad, ċentrifugat 10 000×g 10 min. Minn hemm 'il quddiem il-kampjuni ġew iffriżati u maħżuna fi grad-80 qabel ma ġew analizzati. Il-qari kollu tal-assorbenza sar fi SpextraMax iD3 minn Apparat Molekulari.

2.6. Iżolament u perfużjoni ta 'arterji interlobar

Il-kliewi nħasdu wara s-sagrifiċċju u nżammu f'soluzzjoni tal-melħ fiżjoloġiku kiesaħ bis-silġ (PSS) sakemm jiġu iżolati l-arterji interlobari. L-arterji interlobar renali ġew dissected (2 mm fit-tul) u mmuntati f'a

kamra tal-mijografu (Mudell 620 M, Danish Myo Technology, id-Danimarka) b'PSs kif deskritt qabel [20]. It-tensjoni isometrika ġiet irreġistrata b'sistema Powerlab (Powerlab 4/30, AD Instruments, Awstralja). Wara li ġew immuntati, il-bastimenti ġew ekwilibrati għal 20 min f'PSs tbaqbieq b'karboġen (95 fil-mija O2; 5 fil-mija CO2) f'37 grad, pH 7.4. Imbagħad it-tensjoni ta 'mistrieħ tal-arterji ġiet issettjata kif deskritt qabel [21], li hija skond il-proċedura ta' normalizzazzjoni ta' Mulvany [22]. Wara t-tieni ekwilibrazzjoni, ġie applikat 0.1 mol/L KCl biex tiġi vvalutata l-vijabbiltà taċ-ċirku arterjali.

2.7. Iżolament u mikro-perfużjoni ta 'arterioles afferenti

Il-ġrieden C57BL/6 J ġew anestetizzati b'isoflurane li jittieħed man-nifs u l-kliewi tneħħew u tqattgħu malajr kif deskritt qabel [23-25]. Flieli tal-kliewi tpoġġew f'Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM) kiesaħ bis-silġ. Arteriola afferenti waħda bi glomerulus imwaħħal ġiet mikro-dissezzjonata taħt stereomikroskopju u ttrasferita għal

kamra regolata bit-temperatura fuq l-istadju ta 'mikroskopju maqlub. Il-glomerulus ġie ffissat b'mikropipetta li żżomm u l-arteriola afferenti ġiet ikkanulata u mxerrda b'sett ta 'mikropipetti. Il-pressjoni intraluminali ta 'l-arteriole afferenti mxerrda nżammet f'60 mmHg waqt l-esperimenti. Il-ħin għad-dissezzjoni u l-mikro-perfużjoni li ġejja kien limitat għal 120 min wara li l-ġurdien ġie sagrifikat kif deskritt qabel [26]. Wara perjodu ta' ekwilibrazzjoni ta' 30 min f'37 grad, inkisbu kurvi kumulattivi ta' doża-rispons għal Ang II (10-12 sa 10-8 mol/L). Kull konċentrazzjoni ta 'Ang II ġiet imxerrda għal 2 min, ir-rispons konstrittiv ġie rreġistrat u mbagħad tkejjel id-dijametru ta' l-arteriola afferenti.

2.8. Eżami istoloġiku

Il-kampjuni tal-kliewi ġew maħsuda u ffissati f'soluzzjoni ta 'paraformaldehyde ta' 4 fil-mija. Tessuti tal-kliewi fissi ġew inkorporati fil-paraffin u wara jitqattgħu u mtebbgħin b'Ematossilin-Eosin (H&E) jew Aċidu Perjodiku Schiff (PAS) għal valutazzjoni istoloġika. Erba' annimali magħżula b'mod każwali minn kull grupp sperimentali ġew użati għall-analiżi. Għaxar oqsma magħżula bl-addoċċ minn kull taqsima nqabdu taħt ingrandiment ta '400×. L-analiżi morfometriċi kollha saru b'mod blinded.

2.9. Tbajja 'TUNEL

Kampjuni tal-kliewi inkorporati fl-OCT intużaw għat-tbajja’ ta’ TUNEL. 6-Sezzjonijiet ħoxnin μm ġew inkubati b'20ug/mL proteinase K għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra, u r-reazzjonijiet TUNEL saru bl-użu tal-Click-iTTM Plus TUNEL Assay (Invitrogen C10618, USA) wara l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fl-aħħar tal-protokoll, sar id-DAPIstaining. Għall-kwantifikazzjoni, tliet annimali u tliet oqsma tal-immaġini (200 ×) ntgħażlu b'mod każwali u ġew fotografati bl-użu tal-mikroskopju konfokali ta 'Zeiss LSM800-Airy, is-sinjali pożittivi ġew ikkwantifikati bl-użu ta' softwer ImageJ/Fiji, u ġew ikkalkulati bħala l- proporzjon tas-sinjali pożittivi għal DAPI.

2.10. Tbajja ta' immunofluworexxenza tat-tessuti u mikroskopija konfokali (F4/80)

Il-kliewi ġew iffriżati f'OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) u t-taqsimiet (6 μm) ġew ippreparati u pproċessati aktar. Is-sezzjonijiet iffriżati ġew maħsula b'1 × PBS u mblukkati b'2 fil-mija BSA f'PBS għal 30 min u mbagħad inkubati b'anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl: A3-1) matul il-lejl f'4 gradi kamra kiesħa, u sussegwentement b'antikorp sekondarju (1:200 Cell signaling Tech #4417) f'temperatura tal-kamra għal siegħa, segwit minn kontrotebgħa b'300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-phenyl -indol, dihydrochloride, Invitrogen) għal 3 min. Is-sinjali ta' l-immunofluworexxenza ġew viżwalizzati taħt il-mikroskopju konfokali Airy ta' Zeiss LSM800-. tliet annimali u tliet qasam tal-immaġini (200 ×) ġew magħżula b'mod każwali. Is-sinjali pożittivi F4/80 ġew ikkwantifikati bl-użu ta 'softwer ImageJ/Fiji u ġew ikkalkulati bħala l-proporzjon tas-sinjali pożittivi għal DAPI.

2.11. Kultura taċ-ċelluli

Ċelloli endoteljali glomerulari tal-firien (GECs) (DSMZ ACC262, Ġermanja) ġew ikkultivati ​​f'medja RPMI1640(Gibco 21870-076) b'10 fil-mija serum tal-fetu bovin u 2 m ML-Glutamine (Gibco 25030-082), peniċillina u streptomycin (50 mg/L, Gibco 15140-122). Iċ-ċelloli nżammu f'37 grad f'atmosfera umidifikata ta '5 fil-mija CO2. F'esperimenti ta' ipoksja, iċ-ċelluli ġew inkubati f'HBSS(Gibco 14025-092) minflok il-medium mingħajr serum f'kamra b'1 fil-mija ossiġnu f'37 grad C għal sagħtejn. Iċ-ċelloli ġew inkubati minn qabel b'nitritu (10 μM, bi/mingħajr l-impeditur xanthine oxidoreductase (XOR) febuxostat (100 nM), għal 30 min qabel hyp-oxia. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata permezz ta' analiżi PrestoBlue⑧ (Invitrogen, A13261, u A13262), u l-mortalità taċ-ċelluli ġiet evalwata permezz ta' analiżi ta' esklużjoni Trypan Blue (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Sejbien ta 'ROS mitokondrijali

Il-livelli ta 'superossidu mitokondrijali ġew skoperti b'żebgħa fluworoġenika (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Wara t-trattament, iċ-ċelloli endoteljali ġew inkubati b'2 μmol/L MitoSox f'medja ta 'kultura f'37 grad għal 10 min. Imbagħad iċ-ċelloli ġew maħsula b'1 × HBSS darbtejn u s-sinjal fluworexxenti ġie mkejjel (qarrej SpectraMax iD3, Apparat Molekulari, USA) u normalizzat għall-vijabbiltà taċ-ċelluli.

2.13. Analiżi ta' immunoblotting

Kampjuni tal-kliewi ffriżati jew ċelluli endoteljali ġew lysed f'buffer li kien fih 10 mmol/L Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 60 mmol/L N-octyl-glucoside, 1 fil-mija Triton X{{9 }}, cocktail inibitur tal-protease, u inibituri tal-fosfatażi tal-proteina. Iċ-ċelluli jew it-tessuti lisati ġew ċentrifugati għal 5 min f'10,000xg f'4 gradi. Is-supernatanti/proteini ġew trasferiti f'tubi ġodda u kkwantifikati bl-użu tal-Bio-Rad

assaġġ tal-proteini. Estratti ta' proteini li fihom ammont ekwivalenti ta' proteini ġew analizzati bl-użu ta' {{0}} fil-mija ta' elettroforesi tal-ġell ta' sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE). Proteini ġew trasferiti għal membrana immobilon polyvinylidene difluoride għal siegħa f'300 mA. Il-membrani ġew imblukkati f'20 mM Tris-HCl (pH7.4), 150 mM NaCl, u 0.1 fil-mija Tween 20 (TBS-T) li fihom 5 fil-mija mingħajr xaħam trab tal-ħalib għal siegħa u immunodetected b'antikorpi għall-anti-TFAM(1:2000, ab131607), anti-OXPHOS(1:1000, ab110413), anti-vinculin(1:5000, ab129002)(Abcam Cambridge, UK) u kontra -Caspase maqsuma-3 (1:1000,#9664)(Teknoloġija tas-Sinjali taċ-Ċelloli, Beverly, MA, USA). L-antikorpi sekondarji kollha għall-analiżi immunoblot kienu minn Cell Signaling Technology. Għal Western blots, im-etajiet mhux maqtugħin, annotati, ta 'tul sħiħ b'markaturi MW huma murija fil-Fajl Supplimentari.

2.14. Analiżi statistika

Paraguni multipli fost il-gruppi ġew analizzati b'ANOVA wieħed jew żewġ direzzjonijiet segwit minn test post-hoc rakkomandat. Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± SEM. Il-kalkoli statistiċi kollha saru bl-użu ta' Graphpad Prism 8.0. Is-sinifikat statistiku ġie definit bħala p<>