Parti 1: Omoarginine Ittejjeb in-Nefropatija Dijabetika Indipendenti Miċ-Nitric Oxide Synthase-3

Kuntatttina.xiang@wecistanche.com

Astratt

Riċentement urejna li s-supplimentazzjoni ta 'l-omoarginine tagħti protezzjoni tal-kliewi f'mudelli ta' ġrieden dijabetiċi. F'dan l-istudju, aħna ttestjajna jekk l-effett protettiv ta 'homoarginine huwiex nitric oxide synthase-3 (NOS3)-indipendenti fin-nefropatija dijabetika (DN). Saru esperimenti fuq ġrieden defiċjenti ta' NOS3(NOS3-7) u l-mifrex tat-tip selvaġġ tagħhom bl-użu ta' dożi baxxi multipli ta' vettura jew streptozotocin u ttrattati b'homoarginine permezz ta' ilma tax-xorb għal 24 ġimgħa. Supplimentazzjoni ta' omoarġinina għal 24 ġimgħa f'NOS3-/ġrieden dijabetiċi attenwaw b'mod sinifikanti l-albuminurja, żieda fin-nitroġenu tal-urea fid-demm, bidliet istopatoloġiċi u fibrożi tal-kliewi, markaturi fibrotiċi tal-kliewi, u reklutaġġ ta' makrofagi tal-kliewi meta mqabbla ma' NOS dijabetiċi kkurati bil-vettura3- / ġrieden. Barra minn hekk, is-suppliment tal-omoarginine rrestawra l-funzjoni mitokondrijali tal-kliewi wara d-dijabete. Importanti, ma kien hemm l-ebda tibdil sinifikanti fl-espressjoni tal-mRNA tal-kliewi NOS1 jew NOS2 bejn il-gruppi kollha. Barra minn hekk, is-supplimentazzjoni tal-omoarginine tejbet il-funzjoni kardijaka u naqqset il-fibrożi kardijaka wara d-dijabete. Din id-dejta turi li l-effett protettiv ta 'homoarginine huwa indipendenti minn NOS3, li fl-aħħar mill-aħħar se jibdel il-fehim tagħna tal-mekkaniżmu(i) li bihom homoarginine jinduċi protezzjoni renali u kardijaka fid-DN. L-effett protettiv ta 'l-omoarginina fid-DN jista' jiġi medjat permezz tat-titjib tal-funzjoni mitokondrijali.

Kliem ewlieni: funzjoni kardijaka, nefropatija dijabetika, omoarġinina, NOS3

Ikklikkja biex titgħallem għal xiex tintuża s-cistanche

1 INTRODUZZJONI

Dijabetehija kawża serja u dejjem aktar prevalenti ta' morbożità u mortalità fl-Istati Uniti, bi stima ta' 12-14 fil-mija tal-adulti huma dijabetiċi, b'rati saħansitra ogħla fost il-minoranzi etniċi (Gao et al, 2016; Menke et al, 2015) . It-telf ekonomiku u ta’ produttività minħabba kumplikazzjonijiet dijabetiċi huwa ta’ aktar minn $245 biljun u jwassal għal effetti fiżjoloġiċi u psikoloġiċi inklużi sistemiċi.infjammazzjoni, disfunzjoni tal-kliewi u tal-qalb, depressjoni, u ansjetà soċjali (Jha et al.,2018; Menke et al, 2015; Moreno et al.,2018; Tao et al.2015; Vanstone et al., 2015). Nefropatija dijabetika (DN) hija disturb progressiv kroniku li jwassal għal tnaqqis rapidu u insuffiċjenza tal-kliewi fl-aħħar stadju. Matul l-aħħar għaxar snin, l-inċidenza ta 'insuffiċjenza tal-kliewi minħabba d-dijabete rdoppjat. It-terapiji tradizzjonali, inkluż il-pressjoni tad-demm u l-kontroll tal-glukożju u bidliet oħra fl-istil tal-ħajja, kellhom suċċess modest biss biex idewmu l-progressjoni tal-insuffiċjenza renali. Għalhekk, huwa importanti li jiġu identifikati l-mekkaniżmi involuti fl-iżvilupp u l-progressjoni tad-dijabetemard tal-kliewi. Cistanche deserticolajappartjeni għall-mediċina tradizzjonali Ċiniża u hija droga li tonifika l-kliewi. Jintuża prinċipalment għal defiċjenza tal-kliewi-yang, bħal uġigħ fid-dahar, uġigħ fid-dahar, impotenza, eċċ. Madankollu, il-biċċa l-kbira tal-pazjenti dijabetiċi għandhom defiċjenza ta 'yin, u jekk ikollhom defiċjenza ta' yang, jistgħu jeħduha b'mod xieraq. Madankollu, għandu jintuża b'kawtela fil-manifestazzjonijiet ta 'sħana negattiva bħal biża' ta 'sħana u għaraq bil-lejl, u ħalq xott. Ikkonsulta tabib l-ewwel, xorta waħda.

Homoarginine, analogu ta 'arginine endoġenu, mhux involut fis-sintesi tal-proteini, ħareġ bħala attur ġdid fis-saħħa u l-mard (Pilz et al., 2015). Homoarginine huwa sintetizzat minn arginine mitokondrijali: glycine amidinotransferase (AGAT) fil-kliewi bl-użu ta 'L-arginine u L-lysine bħala sottostrati (Choe et al., 2013; Ryan & Wells, 1964), u katabolizzat bl-użu ta' alanine: glyoxylate aminotransferase 2 (AGXT2) (Rodionov et al.2016). Konċentrazzjonijiet fil-plażma ta 'omoarginine huma inversament korrelatati mar-riskju ta' mard kardjovaskulari u mortalità ġenerali (Jud et al., 2018; Marz et al, 2010), riskju akbar għal puplesiji fatali (Haghikia et al., 2017), insuffiċjenza tal-qalb konġestiva, u ipertrofija ventrikulari tax-xellug(Atzler et al.,2013,2017; Bahls et al., 2018; Pilz, Edelmann, et al.,2014), tixjiħ (Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Marz et al., 2010) , tipjip (Atzler, Gore, et al, 2014; Sobczaket al.,2014; Vogler al,2015; Zwan et al.,2013), indiċi tal-massa tal-ġisem (Atzler, Gore, et al.,2014; Marz et al.2010) ; Pilz, Teerlink, et al., 2014), u t-tqala (Valtonen et al, 2008). Livelli baxxi ta' omoarginine jaġixxu bħala indikatur ta' disfunzjoni kardijaka, b'livelli għoljin assoċjati ta' dimethylarginine (ADMA) asimmetriku (Atzler, Schwedhelm, et al.,2014; Jud et al.,2018; Kayacelebiet al.,2014; Pilzet al.,2015; ; Vogler al, 2015). L-effetti ta 'homoarginine baxx fuq il-produzzjoni / azzjoni ta' ossidu nitriku (NO) ġew marbuta ma 'riskju akbar ta' puplesija u aterosklerożi (Haghikia et al, 2017). Endothelial nitric oxide synthase (NOS3) huwa espress b'mod kostituttiv fiċ-ċelloli endoteljali, u jiffunzjona biex jaġġusta l-livelli intraċellulari ta 'NO b'rispons għal-livelli ta' kalċju (Zanchi et al., 2000). Homoarginine jista 'jikkontribwixxi għas-sintesi NO billi jservi bħala sottostrat għal NOS minħabba li l-omoarginine, anke bl-affinità aktar dgħajfa tagħha għal NOS meta mqabbla ma' arginine, tista 'tiġi metabolizzata għal NO u omoċitrulina (Drechsler et al., 2011). Fil-kliewi, homoarginine baxx. huwa fattur ta 'riskju qawwi għal mewt kardijaka f'daqqa u mewt minħabba insuffiċjenza tal-qalb f'pazjenti bl-emodijalisi (Drechsler et al.,2011). Barra minn hekk, livelli baxxi ta' omoarginine huma assoċjati ma' żieda fir-riskju kardjovaskulari f'pazjenti bi trapjant tal-kliewi (Kayacelebi et al.,2017). Fiż-żewġ annimali (Banchaabouchi et al.,2001; Tofuku et al., 1985) u bnedmin (Drechsler et al., 2017). 2013) b'korrimenti kroniċi fil-kliewi, il-livelli ta 'omoarginine huma mnaqqsa u livelli baxxi ta' omoarginine fil-plażma kienu relatati b'mod sinifikanti ma 'rata ta' filtrazzjoni glomerulari mnaqqsa (GFR) u proteinurja (Ravani et al., 2013). Għalkemm id-dejta epidemjoloġika wriet li livelli mnaqqsa ta' omoarginine kienu assoċjati ma' żieda fil-mortalità fil-mard tal-kliewi u kardjovaskulari (Drechsler et al.,2015; Jud et al.,2018; Marz et al, 2010; Ravani et al.,2013), il- il-mekkaniżmu(i) fiżjoloġiku(i) dirett(i) ta' homoarginine jibqa' mhux ċar. Preċedentement urejna li l-omoarginine hija trattament effettiv għal DN (Wetzel et al., 2019). Madankollu, il-mekkaniżmu ta 'azzjoni omoarginine fil-kliewi u disfunzjoni kardijaka mhux magħruf.

Fl-istudju attwali, ittestjajna l-ipoteżi li l-effett protettiv ta 'homoarginine fil-funzjonijiet renali u kardijaċi fid-dijabete huwa indipendenti minn NOS3. Ir-riżultati tagħna jindikaw li l-omoarginine jimmedja l-protezzjoni renali u kardijaka fil-ġrieden dijabetiċi NOS3-一 li fl-aħħar mill-aħħar se jibdlu l-fehim tagħna tal-mekkaniżmu(i) li bihom l-omoarginine ittejjeb il-ħsara fil-kliewi dijabetiċi. L-effett protettiv ta 'homoarginine fid-DN jista' jiġi medjat permezz tat-titjib tal-funzjoni mitokondrijali.

2. MATERJALI U METODI

2.1 Mudell tal-ġurdien dijabetiċi

L-esperimenti kollha fuq l-annimali twettqu fi ġrieden maskili ta' ġimgħa 6-(The Jackson Laboratory, Bar C57BL/6J jew NOS3-1-Harbor, ME). Il-ġrieden inżammu fi 23 grad C u ċiklu dawl-dlam 12:12 b'aċċess liberu għal chow standard u ilma. Id-dijabete ġiet indotta b'injezzjoni intraperitoneali ta' 50 mg/kg streptozotocin (STZ) jew kontroll tal-melħ wara sawm ta' 6-siegħa għal 5 ijiem konsekuttivi. Il-proċeduri kollha saru filgħodu matul l-istudju. Il-livelli tal-glukożju fid-demm tkejlu minn ġrieden li ma jsawmx bl-użu ta’ glukometru Contour Next EZ bi strixxi Contour Next mill-vina tad-denb tal-ġrieden, bil-ġrieden dijabetiċi jiġu definiti bħala li għandhom livell ta’ glukożju fid-demm ta’ aktar minn 350 mg/dl.L-Homoarginine(Sigma, St. Louis MO, Cat #: H1007) ġie supplimentat fl-ilma tax-xorb f'konċentrazzjoni ta '50mg/L kif deskritt qabel (Wetzel et al., 2019) u mibdul kull 4 ijiem. Fl-aħħar tal-istudju (24 ġimgħa), 24-h inġabru kampjuni tal-awrina, ġrieden ġew ewtanizzati bl-użu ta 'injezzjoni intraperitoneali ta' cocktail ketamine/xylazine; plażma nkisbet permezz tat-titqib tal-qalb, u l-kliewi u l-qlub tneħħew għal aktar studji. Għall-ġbir tal-awrina, il-ġrieden tqiegħdu individwalment f'gaġeġ metaboliċi għal 16-il siegħa b'aċċess ħieles għall-ilma tax-xorb, u l-awrina nġabret f'tubi tal-ġbir li fihom 200 ul ta 'żejt minerali li jipprevjeni l-evaporazzjoni tal-awrina. Id-demm inġabar permezz ta 'titqib kardijaku u ċentrifugat fi 3000 g għal 3 min f'4 gradi biex tissepara l-plażma. Wara l-ġbir il-kampjuni kollha ġew maħżuna fi -80 grad Ċ sal-analiżi. In-numru ta 'ġrieden għal kull grupp huwa mogħti fit-Tabella 1. Kampjuni derivati ​​minn ġrieden Ins2Aita nkisbu kif deskritt qabel (You et al., 2015). L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati miċ-Ċentru tax-Xjenza tas-Saħħa tal-Università ta 'Texas f'San Antonio Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali.

2.2 Immunoistokimika

It-tessuti tal-kliewi tal-ġurdien ġew iffissati f'formalin ta '10 fil-mija u inkorporati fil-paraffin, u sezzjonijiet 3-μm inqatgħu. L-immunoistokimika saret fuq sezzjonijiet inkorporati fil-paraffin b'antikorp Mac-2 kontra l-ġurdien (klonu M3/38; Cedarlane, Burlington, NC) kif deskritt qabel (Youet al.,2013,2014). L-immaġini ttieħdu b'mikroskopju Olympus BX60 u kamera diġitali Olympus Q-Color3 bl-użu tas-softwer tal-immaġni Q-capture Pro 7. In-numru ta 'makrofaġi glomerulari kien magħdud f'20 glomeruli/sezzjoni (nru ta' makrofaġi fil-glomeruli di-diviż bin-numru ta 'glomeruli) b'mod blinded taħt ingrandiment 40 × u medja kif deskritt qabel (Morris et al.,2011; Wetzel et al., 2019; You et al., 2013, 2014).

2.3 Istopatoloġija renali u kardijaka

Il-kliewi u l-qlub ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde, inkorporati fil-paraffin, u sezzjonijiet 5-μum inqatgħu. Is-sezzjonijiet kienu mtebbgħin bit-tbajja tat-trikromju jew perjodiku ta' l-aċidu Schiff (PAS) ta' Masson, eżaminati b'mod blinded, u l-punteġġi ġew medjati. Biex tiddetermina l-erja perċentwali ta 'fibrożi, l-istampi trikromiċi ta' Masson inkisbu f'10x u analizzati f'ImageJ biex titkejjel iż-żona perċentwali ta 'fibrożi. Immaġini rappreżentattivi ttieħdu b'mikroskopju Olympus BX60 u kamera diġitali Olympus Q-Color3 bl-użu tas-softwer tal-immaġni Q-capture Pro 7. Il-karatteristiċi glomerulari ġew imkejla bl-użu ta 'softwer Bioquant Osteo (Bioquant Image Analysis Corporation, Nashville, TN), u l-indiċi ta' korriment fil-mija ġie kkalkulat kif deskritt qabel (Mohan et al.,2008). Għal kull kilwa, ksibna 12-il immaġini u analizzajna glomerulus għal kull qasam li għandu jsir medja għal kull annimal għal analiżi statistika.

2.4 Metodoloġija analitika

Il-konċentrazzjoni tal-albumina tal-awrina tkejjel b'ELISA bl-użu ta' kit Albuwell M (Excell, Philadelphia, PA) kif deskritt qabel (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015). Il-krejatinina ta 'l-awrina tkejjel bl-użu ta' Diazyme Creatinine Assay (Diazyme Laboratories, Poway, CA) (Awad et al, 2011; Awad, You, Gao, Cooper, et al., 2015). In-nitroġenu ta 'l-urea tad-demm (BUN) ġie determinat bl-użu ta' kit ta 'assaġġ ta' l-urea QuantiChrom (BioAssay Systems, Hayward, CA) kif deskritt qabel (You et al.,2017). Pressjonijiet sistoliċi tal-ġrieden tkejlu bl-użu tas-sistema CODA tal-Pressjoni tad-Demm Mhux Invażiva (Kent Scientific Corporation, Torrington CT) kif deskritt qabel (Awad, You, Gao, Gvritishvili, et al.,2015). Il-ġrieden ġew akklimatizzati għal 10 minuti f'26 grad qabel ma beda l-qari. Il-qari ttieħed fl-istess ħin tal-ġurnata għall-gruppi kollha biex jipprevjenu kwalunkwe varjazzjonijiet matul il-ġurnata.

2.5 Kejl tal-funzjoni tal-qalb

Ekokardjografija Serial B-Mode u M-Mode saret bl-użu ta' Vevo 2100 Imaging Platform (VisualSonics, Toronto, Kanada) bl-użu ta' transducer lineari 30-MHz biex jimmonitorja b'mod preċiż il-parametri emodinamiċi kardijaċi u jevalwa l-istruttura tal-qalb tal-ġrieden wara 22 ġimgħa ta 'trattament omoarginine. Il-frazzjoni tal-ejection ventrikulari tax-xellug (EF) u t-tnaqqis frazzjonali tal-ventrikul tax-xellug (FS) ġew ikkwantifikati bl-użu tal-modalità M kif deskritt qabel (lorga et al., 2016,2018).

2.6 Iżolament ta 'RNA u PCR f'ħin reali

L-RNA ġie iżolat permezz ta 'estrazzjoni ta' Trizol minn sezzjonijiet sħaħ tal-kliewi u traskritt b'lura għal cDNA bl-użu tal-kit ta 'sintesi tad-DNA ta' Bio-Rad (Hercules, CA). PCR f'ħin reali twettqet fuq sistema CFX384 f'ħin reali (Bio-Rad, Hercules, CA) bl-użu ta' primers Tagman għal MCU tal-ġurdien (Mm0116873_m1), fibronectin (Mm{01256744_m1), tkabbir tat-tumur fattur (TGF , Mm01178820_m1), NOS1(Mm00435175_m1), NOS2(Mm{00440502_m1),u Rn18S (Mm{03928990_gl)(Thermo Fisher, Waltham, MA). Il-valuri Ct ġew normalizzati għal 18S u mqabbla ma' NOS3samples.Primers għal actin tal-muskoli lixxi(FW:5'-CTGCCGTTTTCCCCCTTCCTG-3', RV:5'-TTGCTTCCTCCTCCTTTG-3'),E-cadherin (FW: 5'-TGAGTGTGGGTGCTGA-3',RV:5'-CGGTTTC AATGGCTTACCTTTTCC-3'), u -actin (FW:5'-GC TGGTTGTGTAAGGTAAGGTGTGC-3',RV: 5'-GAGG GGGTTGAGGTGTTGAGG-3) inkisbu minn Teknoloġiji tad-DNA Integrati (Coralville, IA). Kampjuni ta’ cDNA ġew analizzati bl-użu ta’ SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Rockford IL), kif deskritt qabel (Morris et al.,2011), u normalizzati għal -actin għal tqabbil mal-kampjuni NOS3-/-.

2.7 Western blotting

It-tessut tal-kliewi kien omoġenizzat f'RIPA buffer li kien fih {{0}}.1 fil-mija Triton X{-100 supplimentat b'inibituri tal-protease (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) u mneħħija permezz ta' ċentrifugazzjoni f'10,{{4} } g għal 10 min fi 4 gradi , u s-supernatant inġabar. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata permezz ta 'assay ta' Bicinchonic Acid (BCA) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Kampjun ta’ 50 ug ta’ lisat tal-kliewi ġie separat fuq 4-12 fil-mija Bis-Tris gel(Life Technologies, Carlsbad, CA) u ttrasferit fuq membrani PVDF qabel ma jimblokka b’5 fil-mija ħalib niexef. Western blots saru bl-użu tal-antikorpi li ġejjin: antikorpi MiCU1(0.4 ug/ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) u -actin(1:1000; Cell Signaling, Danvers, MA). Western blots ġew kwantifikati bl-użu ta 'softwer ImageJ (NIH, Bethesda, MD) u normalizzati għall-espressjoni tal-proteina -actin.

2.8 Analiżi statistika

Il-paraguni bejn il-gruppi kollha saru bl-użu tas-softwer GraphPad Prism (verżjoni 7.04, San Diego, CA). Ir-riżultati huma espressi bħala medja ± SEM. ANOVA f'direzzjoni waħda segwita mit-test tad-differenza ta' l-inqas sinifikat ta' Fisher intuża biex iqabbel is-sinifikat bejn il-gruppi. Valur ta' p<0.05 represented="" a="" significant="">