Il-Mutazzjonijiet tal-Parti 1 ERCC1 Impedixxu t-Tiswija tal-Ħsara tad-DNA u jikkawżaw Disfunzjoni tal-fwied u tal-kliewi fil-pazjenti

Kuntatt: ali.ma@wecistanche.com

Katja Apelt et al

Ikklikkja biex Cistanche estratt benefiċċji għall-funzjoni tal-kliewi

Introduzzjoni

Is-sitt biljun par bażi tal-ġenoma uman huma kontinwament esposti għal aġenti li jagħmlu ħsara lid-DNA, li jikkawżaw varjetà wiesgħa ta 'leżjonijiet tad-DNA ġenomika, inklużi prodotti tar-ritratti indotti mid-dawl UV, cross-links intra- u interstrand (ICLs), u DNA double- strand breaks (DSBs). Biex tiġi żgurata l-integrità ġenomika, dawn il-leżjonijiet tad-DNA jeħtieġ li jissewwew b'mod speċifiku u effiċjenti. Mekkaniżmi differenti ta 'tiswija tad-DNA evolvew li kull wieħed jaġixxi fuq subsett speċifiku ta' leżjonijiet tad-DNA. Filwaqt li ħafna proteini tat-tiswija tad-DNA huma involuti f'passaġġ wieħed, l-endonukleażi eterodimerikaERCC1-XPF huwa kondiviż bejn diversi mogħdijiet ta 'tiswija tad-DNA mekkanikament distinti (Manandhar et al., 2015).

XPF huwa instabbli u degradat malajr, li hija evitata mill-eterodimerizzazzjoni tagħha maERCC1(Biggerstaff et al., 1993). L-interazzjoni bejn dawn iż-żewġ proteini hija medjata minn motif doppju helix-hairpin helix (HhH)2 li jinsab fil-C-terminali rispettivi tagħhom, kif ukoll permezz tad-dominju ċentrali ta 'ERCC1, u d-dominju tan-nukleażi ta 'XPF (de Laat et al., 1998b; Jones et al., 2020; Tripsianes et al., 2005; Tsodikov et al., 2005). L-irbit mad-DNA b'linja doppja hija ffaċilitata minn ERCC1, filwaqt li XPF jimmedja l-assoċjazzjoni ma 'DNA b'linja waħda (ssDNA) permezz tad-dominju (HhH)2 tiegħu (Tsodikov et al., 2005). Ladarba jkun pożizzjonat, XPF juża l-attività katalitika tiegħu permezz tal-motif tan-nukleażi kkonservat ħafna biex jaqsam substrati tad-DNA differenti fid-59 junction ta’ bżieżaq u 39 overhangs single-stranded li jestendu minn helix doppja tad-DNA (de Laat et al., 1998a; Enzlin u Sch¨). huma, 2002; Matsunaga et al., 1996). Rwol ewlieni ta' ERCC1- XPF intwera għall-ewwel darba fit-tiswija ta' qtugħ ta' nukleotidi (NER), fejn jaqsam id-DNA 59 bil-ħsara mal-leżjoni (Sijbers et al., 1996a).

NER jirrikonoxxi varjetà wiesgħa ta 'leżjonijiet tad-DNA strutturalment mhux relatati, inklużi fotoprodotti indotti mill-UV, permezz taż-żewġ sub-mogħdijiet tiegħu: tiswija globali tal-ġenoma (GGR) u tiswija akkoppjata mat-traskrizzjoni (TCR). Il-biċċa l-kbira tal-attività NER tiddependi fuq GGR, fejn il-proteina XPC tagħraf fotoprodotti fil-ġenoma kollu u tirrekluta l-kumpless tal-fattur ta 'traskrizzjoni IIH (TFIIH) (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). Leżjonijiet tad-DNA li jikkawżaw waqfien tal-RNA polymerase II (RNAPII) waqt it-traskrizzjoni jqanqlu r-reklutaġġ ta' proteini speċifiċi għal TCR, bħal CSB, CSA, u UVSSA, li min-naħa tagħhom jirreklutaw il-kumpless TFIIH (Nakazawa et al., 2020; van der Weegen et al., 2020). Wara r-reklutaġġ tat-TFIIH għall-leżjoni tad-DNA, GGR u TCR jmexxu l-lembut f'mekkaniżmu molekulari komuni li jinvolvi l-assoċjazzjoni ta 'XPA u XPG (Marteijn et al., 2014), li jistimulaw l-attività helicase ta' TFIIH u jiffurmaw kumpless ta 'preċiżjoni stabbli flimkien ma' RPA ( Kokic et al., 2019; Riedl et al., 2003; Wakasugi u Sancar, 1998). Il-ERCC1-XPF eterodimer huwa rreklutat għall-kumpless NER minn XPA permezz tad-dominju li torbot XPA ta'ERCC1(Tsodikov et al., 2007; Volker et al., 2001). Inċiżjoni doppja mill-attività kkoordinata tal-endonucleases XPF (59 mill-leżjoni) u XPG (39 mill-leżjoni) tirrilaxxa medda ta 'ssDNA li fiha l-leżjoni tad-DNA (Li et al., 1995; Matsunaga et al., 1995; O "Donovan et al., 1994; Staresincic et al., 2009), wara li l-vojt iġġenerat jimtela u jingħalaq biex titlesta t-tiswija.

Minbarra NER, intwera liERCC1-XPF għandu wkoll rwol essenzjali fit-tiswija tal-ICL (Klein Douwel et al., 2014). Din il-mogħdija tat-tiswija tinbeda b'replikazzjoni waqfa u tinvolvi rikonoxximent tal-furketta ta 'replikazzjoni ICL-stalled mill-kumpless tal-anemija Fanconi (FA) multi-protein core, li jservi bħala kumpless E3 ubiquitin ligase għal FANCD2. Il-mono-ubikwitilazzjoni ta' FANCD2 tixpruna r-reklutaġġ ta' SLX4, li min-naħa tiegħu jimmiraERCC1-XPF għal ICLs (Abdullah et al., 2017; Klein Douwel et al., 2014; Walden and Deans, 2014; Wood, 2010). Ladarba jiġi rreklutat, ERCC1-XPF jimmedja t-tneħħija tal-ganċ tal-ICL billi jinċiża l-linja tad-DNA tal-ġenituri fuq kull naħa tal-leżjoni biex tippermetti bypass u tiswija sussegwenti tal-leżjoni (Kuraoka et al., 2000). Fl-aħħarnett, ERCC1-XPF ġie implikat ukoll fit-tiswija tad-DSB permezz ta 'rikombinazzjoni omologa (Ahmad et al., 2008), li matulha jista' jaqsam b'mod effiċjenti intermedji differenti ta 'rikombinazzjoni (Wyatt et al., 2017). Alternattivament, iċ-ċelloli jużaw il-mogħdija ta' ittemprar b'linja waħda li hija suxxettibbli għall-iżbalji RAD52-, li tinvolvi ttemprar ta' reġjuni b'mikroomoloġija u t-tneħħija sussegwenti tad-denb ssDNA 39 mhux omologu billiERCC1-XPF (Adair et al., 2000; Li et al., 2013, 2019). Madankollu, ir-rwol preċiż tal-ERCC1-XPF f'dawn il-mogħdijiet ta' tiswija tad-DSB mhuwiex mifhum bis-sħiħ.

L-importanza tal-mogħdijiet ta 'tiswija tad-DNA hija enfasizzata mill-fenotip kliniku ta' individwi b'disturbi ta 'defiċjenza ta' tiswija tad-DNA li ntirtu. L-inattivazzjoni ta' GGR tirriżulta f'Xeroderma pigmentosum (XP; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760, u 278780; DiGiovanna and Kraemer, 2012), li hija miżjuda, sensittiva u kkaratterizzata minn ritratti, sensittività u riskju akbar. tal-kanċer tal-ġilda. Newrodeġenerazzjoni, dewmien fit-tkabbir, u mard multisistemiku mingħajr kanċer tal-ġilda huma osservati fis-sindromu Cockayne (CS; MIM 216400 u 133540). Il-pazjenti CS għandhom difett ġenetiku selettiv fit-TCR li jipprevjeni l-ipproċessar ta’ RNAPII waqfa minn ħsara fid-DNA (Karikkineth et al., 2017; Nakazawa et al., 2020; Nakazawa et al., 2012; Ribeiro et al., 2018; Tufegdˇzi´ c Vidakovi´c et al., 2020). Mutazzjonijiet fil-ġeni tat-tiswija Essenzjali ICL jikkawżaw FA (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390, u 613951 , malformazzjonijiet tal-organi, u instabbiltà ġenomika (Auerbach, 2009). Ir-rwol taERCC1-XPF fit-tiswija ta 'l-ICL hija enfasizzata mill-eżistenza ta' mutazzjonijiet fl-XPF li jagħtu lok għall-fenotip FA (Bogliolo et al., 2013; Ceccaldi et al., 2016; Kashiyama et al., 2013). Difetti li jintirtu fit-tiswija tad-DSB jikkawżaw firxa wiesgħa ta 'disturbi assoċjati ma' radjusensittività, predispożizzjoni għall-kanċer, immunodefiċjenza u newrodeġenerazzjoni (Helfricht et al., 2020; McKinnon u Caldecott, 2007).

Disturbi ta' tiswija-defiċjenza tad-DNA huma rari u jseħħu bi frekwenza stmata ta' ~1 għal kull 200,000 twelid ħaj madwar id-dinja għal XP, CS, u FA. Madankollu, żewġ rapporti biss ta 'individwi b'mutazzjonijiet ERCC1 bi-allelic (MIM 126380) ġew deskritti sal-lum (Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Iż-żewġ individwi wrew karatteristiċi konsistenti ma 'CS u mietu f'14 mo u 2.5 yr. L-ewwel u l-aktar individwu affettwat b'mod sever (165TOR) ġarr kodon ta 'waqfien prematur (Q158X) fuq allele wieħed u varjant missense F231L fuq l-oħra (Jaspers et al., 2007). It-tieni individwu (CS20LO) kien omozigot għall-varjant missense F231L (Kashiyama et al., 2013). Ċelloli miż-żewġ individwi wrew sensittività għal ħsara fid-DNA indotta mill-UV, u 165TOR, b'mod partikolari, kien ukoll ħafif sensittiv għal aġenti li jinduċu l-ICL. Iż-żewġ individwi mietu fit-tfulija bikrija (1-2 sena; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). It-tielet individwu (XP202DC) b'mutazzjonijiet ERCC1 bi-alleliċi li miet f'età ta' 37 sena huwa kkwotat f'astratt tal-laqgħa (Imoto, K., et al. 2007. Pazjenti b'difetti fil-proteini tat-tiswija tal-esċiżjoni tan-nukleotidi li jinteraġixxu).ERCC1jew XPF juru xeroderma pigmentosum b'deġenerazzjoni newroloġika severa li tibda tard. [Astratt] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Dan l-individwu kien eterozigot kompost għal mutazzjoni bla sens (K226X) u mutazzjoni splice fiERCC1. Deskrizzjoni fenotipika dettaljata mhix disponibbli, u l-impatt ta’ dawn il-mutazzjonijiet ERCC1 mhux magħruf.

Il-fenotip taż-żewġ individwi msemmija hawn fuq huwa aktar sever minn dak mistenni mid-defiċjenza NER biss, konsistenti mal-involviment tal-ERCC1-XPF f'mogħdijiet multipli ta' tiswija tad-DNA. F'konformità ma' dan, jew ġrieden ERCC1 jew XPF-KO wrew letalità embrijonika għolja u naqsu l-ħajja u mietu minħabba insuffiċjenza severa tal-fwied (McWhir et al., 1993; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997), li mhux osservat fi ġrieden XPA-KO defiċjenti NER (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

Fl-istudju attwali, aħna niddeskrivu żewġ aħwa b'mutazzjonijiet bi-allelicERCC1 li għandhom fenotip uniku ta 'statura qasira, fotosensittività, mard tal-fwied kolestatiku progressiv, u tubulopatija renali. Iż-żewġ individwi żviluppaw indeboliment progressiv tal-fwied u kellhom bżonn trapjanti tal-fwied qabel l-età ta’ 10 snin. Studji funzjonali juru li l-livell ta' proteina fi stat fiss ta' ERCC1 u XPF tnaqqas b'mod drammatiku f'ċelluli inpatient u ċelluli epiteljali knock-in li jġorru l-varjant missense misjub fil-pazjenti. Barra minn hekk, il-proteina mutanti ERCC1 interaġixxa biss b'mod dgħajjef ma 'proteini oħra ta' tiswija NER u ICL. Nirrapportaw każ ġdid ta’ defiċjenza ta’ ERCC1 li taffettwa b’mod qawwi l-NER u li għandha impatt konsiderevoli fuq it-tiswija tal-ICL, li flimkien jirriżultaw f’fenotip uniku li jgħaqqad statura qasira, fotosensittività, u fwied progressiv udisfunzjoni tal-kliewi.

Riżultati

Żewġ aħwa b'fotosensittività, statura qasira, u disfunzjoni progressiva tal-fwied u tal-kliewi

L-aħwa 1 (PV50LD; Fig. 1 A) għandha 13-il sena, l-akbar minn tliet aħwa għal ġenituri b’saħħithom u mhux relatati ta’ etniċità mħallta inkluż wirt Indiġenu Awstraljan, Malti, u Anglo-Ċeltiku. Matul it-tqala, ommha kellha kardjomijopatija dilatata temporanja li rsolviet wara t-twelid. Hija twieldet f'39 ġimgħa tat-tqala, u l-piż tat-twelid tagħha kien 1.9 kg (Z=-3.8), tul 44 ċm (Z=-2.44), u ċ-ċirkonferenza tar-ras 29.5 ċm (Z {{{{ 17}} -3.8). Hija kellha tkabbir fqir fit-tfulija, u fl-età ta '18-il xahar, kienet innutata li kellha disfunzjoni tal-fwied b'mudell predominantement kolestatiku. Ultrasound tal-fwied u kolanġjopankreatografija b'reżonanza manjetika kienu normali. Il-funzjoni tal-fwied naqset progressivament, kif evidenti minn żidiet progressivi fil-livelli ta '-glutamyltransferase (GGT), alanine transaminase (ALT), u bilirubin (Fig. S1, A-C). F'bijopsija tal-fwied (fl-età ta '3.5 yr), il-parenkima lobulari wriet varjazzjoni fil-morfoloġija nukleari tal-epatoċiti, b'xi nuklei ħafna akbar u ċelloli b'nuklei doppji (Fig. S1 D) għal żoni fejn iċ-ċelloli għandhom nuklei żgħar u mhux notevoli. Kien hemm fibrożi portal ħafifa u espansjoni tal-portal fibruż ħafifa u infjammazzjoni ħafifa ta 'interface fokali mingħajr ductopenia jew fibrożi periductal (Fig. S1 E).

Hija esperjenzat numru kbir ta 'infezzjonijiet rikorrenti inklużi tonsillite, ġidri r-riħ, mard ta' l-idejn, is-saqajn u d-dwiefer, pnewmonja, bronkite, u episodji rikorrenti ta 'deni, uġigħ addominali, u ippurgar ċar mingħajr ebda kawża misjuba. Investigazzjonijiet immunoloġiċi ma identifikaw l-ebda immunodefiċjenza. Hija żviluppat episodji ta 'fotosensittività okulari u tal-ġilda. Fl-età ta' 6 snin, ġiet skoperta disfunzjoni renali, b'karatteristiċi li jissuġġerixxu disfunzjoni tubulari prossimali kkaratterizzata minn albuminurja (firxa sub-nefrotika) u iperkalċjurja. Il-funzjoni renali tagħha varjat, b'episodji intermittenti ta'korriment akut fil-kliewi, progressivaindeboliment tal-kliewib'żieda fil-livelli tal-krejatinina (Fig. S1 F), u rispons minimu għall-inibizzjoni tal-acetylcholinesterase. Ultrasound tal-kliewi wera żgħirkliewib'ekoġeniċità miżjuda u differenzjazzjoni kortikomedullari mnaqqsa. It-testijiet tal-funzjoni tal-pulmun urew mard restrittiv tal-pulmun minn ħafif sa moderat.

Tragwardi tal-iżvilupp kienu normali, iżda xi diffikultajiet fit-tagħlim kienu evidenti fl-età tal-iskola mingħajr ebda sinjal ta' rigressjoni. Il-vista u s-smigħ kienu normali. It-tkabbir baqa' bil-mod ħafna minkejja t-tmigħ supplimentari. Kienet relattivament stabbli sa 9.5 sena meta wriet evidenza ta 'dikumpens tal-fwied b'livell ta' bilirubin li qed jiżdied b'mod progressiv (Fig. S1 C) u proporzjon normalizzat internazzjonali. Hija għaddiet minn trapjant ortotopiku tal-fwied fl-età ta’ 9 snin 10 xhur. Wara trapjant tal-fwied, it-tubulopatija tagħha stabbilizzat, għalkemm il-krejatinina fis-serum tagħha tkompli tiżdied b'rata aktar bil-mod (Fig. S1 F). Hija klinikament stabbli. Fl-età ta' 12-il sena, ġiet iddijanjostikata insuffiċjenza tal-ovarji. Immaġini ta 'reżonanza manjetika tal-moħħ (MRI) fl-età ta' 12-il sena wera atrofija ċerebrali ħafifa b'atrofija ċerebellari moderata u atrofija ħafifa tal-brainstem. Fl-aħħar valutazzjoni (ta' 13.5 sena), it-tkabbir kien bil-mod (piż 22.4 kg [Z=-6.08] u għoli 134.7 ċm [Z=-3.72]). Hija kellha bini rqaq ħafna b'massa tal-muskoli fqira u skarsezza ta 'xaħam taħt il-ġilda. Hija kienet żviluppat freckling fuq żoni esposti għax-xemx (Fig. 1 A). Kellha għajnejn kemmxejn fil-fond, u xagħarha tal-qorriegħa kien irqiq. Ma kien hemm l-ebda anormalitajiet tar-raġġi radjali. Eżami newroloġiku wera dgħjufija ħafifa, atassja minima, u riflessi depressi.

Aħwa 2 (PV46LD; Fig. 1 A) għandha 11-il sena, oħt iżgħar għal aħwa 1. It-tqala kienet ikkumplikata minn plaċenta previa u kardjomijopatija materna temporanja, u aħwa 2 twieldet f'35 ġimgħa ta' tqala b'piż tat-twelid ta' 1.79 kg (it-tielet ċentile), tul ta '45 ċm (50 ċentile), u ċirkonferenza ta' quddiem ta '29 ċm (inqas mit-tielet ċentile). Kellha nuqqas ta’ xaħam taħt il-ġilda u karatteristiċi tal-wiċċ simili għal ħutha l-kbar. Hija wriet nuqqas li jirnexxu fl-ewwel sena tal-ħajja u indeboliment tal-fwied mill-età 2 yr, b'żieda sinifikanti fil-livelli ta 'GGT, ALT, u bilirubin (Fig. S1, A-C). Bijopsija tal-fwied fl-età ta '6 snin wriet ħsara lill-kanali tal-bili intrahepatic, li rriżultat f'fibrożi periductal. Bħal fil-bijopsija tal-fwied minn oħtha, deher numru moderat ta 'epatoċiti doppji nukleati, xi wħud b'nuklei kbar u nukleoli kbar.

Kellha episodji ta’ fotosensittività tal-għajnejn u tal-ġilda. Kellha sejbiet ta' tubulopatija renali b'indeboliment ħafif tal-kliewi, b'livelli ta' kreatinina li qed jiżdiedu progressivament (Fig. S1 F). Ultrasound tal-kliewi wera żgħirkliewib'nefrokalċinożi. Tragwardi tal-iżvilupp kienu normali, iżda diżabilità intellettwali ħafifa (IQ 66) ġiet iddijanjostikata fl-età tal-iskola. Kien hemm progress bil-mod 'il quddiem bi tragwardi tan-newrożvilupp u l-ebda rigressjoni definittiva. Il-vista u s-smigħ kienu normali. L-indeboliment tal-fwied kien progressiv, u fl-età ta' 8 snin, għaddiet minn trapjant tal-fwied. MRI tal-moħħ fl-età ta '5 snin kienet normali, iżda MRI ripetuta f'10 snin wera atrofija ċerebellari moderata u atrofija ċerebrali ħafifa. Fl-età ta '11-il sena, kejl ta' estroġenu, ormon li jistimula l-follikulu, u ormon luteinizing wera mudell li jissuġġerixxi insuffiċjenza tal-ovarji. Fl-aħħar valutazzjoni fl-età ta '11-il sena, it-tkabbir kien bil-mod (piż 20 kg [Z=-3.89] u għoli 120.7 ċm [Z=-3.17]). Hija kellha bini rqiq ħafna b'xaħam minimu taħt il-ġilda u massa tal-muskoli fqira, karatteristiċi tal-wiċċ familjari, għajnejn kemmxejn stabbiliti fil-fond, u freckling fuq żoni esposti għax-xemx (Fig. 1 A). Hija ma kellha l-ebda anormalitajiet tar-raġġi radjali. Eżami newroloġiku wera dgħjufija ħafifa b'atassja ħafifa u riflessi assenti.

L-analiżi molekulari tidentifika mutazzjonijiet ERCC1 bi-alleliċi ġodda

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>Il-varjant T missense ġie kkonfermat bis-sekwenzjar ta 'Sanger fiż-żewġ aħwa affettwati (Fig. 1 B). Is-sekwenzjar tal-ġenomu kollu żvela tħassir fl-exon 4 fuq l-allel matern (hg19: chr19:45,922,224- 45,924,375; Fig. S2 B), li kien ikkonfermat minn PCR kwantitattiv komparattiv (qPCR) ta 'exon 4 u exon 5 ta' ERCC1 kemm fl-aħwa kif ukoll fl-omm (Fig. 1, C u D). It-tħassir, li huwa mistenni li jkun allele null, la nstabet fil-missier u lanqas f'erba 'kampjuni ta' kontroll negattiv (Fig. 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) tinsab fid-dominju (HhH)2 (Fig. 1 E), il-varjant missense (p.R156W) jinsab fid-dominju ċentrali ta 'ERCC1 u jinsab viċin il-but tal-irbit XPA (110-154 aa) ta' ERCC1 (Fig. 1 E). Analiżi strutturali tad-dominju ċentrali ERCC1 żvelat but idrofobiku dejjaq f'forma ta 'V li jorbot motif qasir (67-80 aa) preżenti f'XPA (Fig. 1 F; Tsodikov et al., 2007). L-aċidi amminiċi li jgħaqqdu l-but li jgħaqqad l-XPA f'ERCC1 (Fig. 1 F) huma importanti għan-NER iżda dispensabbli għal mogħdijiet oħra ta' tiswija dipendenti ERCC1-(Orelli et al., 2010). Ir-residwu R156 li jiġi sostitwit fil-pazjenti jinsab eżatt taħt il-but li jgħaqqad l-XPA u jifforma pont tal-melħ bl-aċidu amminiku oppost D129 (Fig. 1 F). Is-sostituzzjoni R156W għalhekk x'aktarx taffettwa l-istabbiltà tal-but li torbot l-XPA. Huwa possibbli li din is-sostituzzjoni ddgħajjef ukoll l-interazzjoni bejn id-dominju ċentrali ta 'ERCC1 u d-dominju tan-nukleażi ta' XPF (Jones et al., 2020), u aħna nbassru li dan jista 'jwassal għal destabilizzazzjoni ħafifa għal moderata tal-interface heterodimer, li jirriżulta fi stabbiltà mnaqqsa tal-proteina.

Il-fibroblasti PV46LD u PV50LD juru difett sever ta' NER. Marka distintiva ta' defiċjenza ta' NER hija sensittività qawwija għall-irradjazzjoni UV-C. Biex nindirizzaw l-impatt tad-defiċjenza ERCC1 fuq il-funzjoni NER, ksibna fibroblasti primarji minn bijopsiji tal-ġilda taż-żewġ aħwa affettwati. Biex tippermetti analiżi ta 'sopravivenza klonoġeniċi, aħna immortalized ċelluli PV50LD bl-introduzzjoni hTERT (Fig. S3 A). Bħala kontroll, aħna ġġenerajna ċelloli ERCC1-KO sħaħ f'ċelloli RPE1-hTERT minn CRISPR-Cas9 (Fig. 2 A). L-assaġġ ta 'sopravivenza UV-C klonoġeniku wera li ċ-ċelloli PV50LD-hTERT huma ipersensittivi għall-irradjazzjoni UV-C, għalkemm mhux bl-istess mod bħal ċelluli ERCC 1-KO sħaħ (Fig. 2 B), li jissuġġerixxi difett sever fl-NER.

Il-leżjonijiet tad-DNA kkaġunati mill-UV li jiltaqgħu magħhom waqt it-traskrizzjoni huma msewwija minn TCR, li jista 'jitkejjel bl-irkupru tal-assaġġ tas-sintesi tal-RNA (RRS) (Nakazawa et al., 2010). Aħna mkejla RRS f'48BR fibroblasts (WT), fibroblasts tal-pazjent, u inkludejna fibroblasti primarji defiċjenti ta 'XPA (XP1PD) bħala kontroll. It-tikkettjar tat-traskrizzjonijiet li għadhom jibdew bl-inkorporazzjoni ta' 5-ethynyl-uridine wera tnaqqis qawwi kkaġunat mill-UV fit-traskrizzjonijiet li għadhom jibdew fil-linji taċ-ċelluli kollha fi 3 sigħat wara UV-C. Filwaqt li 48BR irkupra kompletament it-traskrizzjoni fi żmien 18-il siegħa wara l-irradjazzjoni UV-C, iż-żewġ fibroblasti tal-pazjent irkupraw saħansitra inqas miċ-ċelloli tal-pazjent XP-A defiċjenti NER (Fig. 2, C u D), li jissuġġerixxu li TCR huwa prattikament assenti taħt dawn il-kundizzjonijiet.

Biex neżaminaw l-attività tal-GGR, kejlna sintesi tad-DNA mhux skedata (UDS) f'ċelloli li ma jinqasmux (Nakazawa et al., 2010). Għal dan il-għan, fibroblasts primarji ġew irradjati lokalment b'dawl UV-C segwit minn tikkettjar tal-polz bl-analogu thymidine 5-ethynyl-deoxyuridine (EdU) biex titkejjel it-tiswija. Inkorporazzjoni EdU ċara ġiet skoperta f'ċelloli 48BR f'siti ta 'ħsara fid-DNA lokali kkaġunata mill-UV. Madankollu, livelli baxxi ħafna ta 'inkorporazzjoni EdU biss kienu skoperti fil-fibroblasts tal-pazjent f'livelli simili bħal fibroblasts defiċjenti ta' XPA (XP1PD; Fig. 2, E u F). Il-livelli UDS fiċ-ċelloli PV46LD u PV50LD kienu komparabbli ma', jew saħansitra aktar baxxi minn, il-livelli mkejla fl-ERCC1-defiċjenti 165TOR deskritti qabel (Jaspers et al., 2007) u CS20LO (Kashiyama et al., 2013) ċelluli, li aħna inklużi b'mod parallel (Fig. 2 G u Fig. S3 B). Importanti, l-espressjoni mill-ġdid ta 'ERCC1 b'tagged menus fiż-żewġ fibroblasti salvaw bis-sħiħ l-inkorporazzjoni ta' EdU (Fig. 2, E u F; u Fig. S3 C), li tikkonferma li d-difett qawwi ta 'UDS huwa dovut għal defiċjenza ta' ERCC1. Ksibna wkoll fibroblasts primarji mill-ġenituri, li wrew UDS normali f'siti ta 'ħsara UV lokali (Fig. 2 H), li jissuġġerixxi li d-difett ERCC1 eterozigot rispettiv fil-ġenituri huwa kkumpensat bis-sħiħ mill-allel WT.

Il-fibroblasti PV46LD u PV50LD għandhom livelli baxxi ħafna ta' proteini ERCC1 u XPF

NER jinvolvi l-assemblaġġ koordinat ħafna u sekwenzjali ta' kumplessi ta' tiswija tad-DNA, li matulu r-reklutaġġ ta' XPA iseħħ 'l isfel mit-TFIIH iżda 'l fuq mill-ERCC1-XPF (Volker et al., 2001). Biex tindirizza sa liema punt il-fibroblasts tal-pazjent għadhom jappoġġjaw l-assemblaġġ tal-kumpless NER, aħna irradjaw fibroblasti lokalment b'UV-C u mmonitorjajna r-reklutaġġ ta 'diversi proteini NER tal-qalba permezz ta' tikkettjar immunofluworexxenti (Fig. 3 A, kwantifikazzjoni, u Fig. S3 D). Reklutaġġ ċar ta 'TFIIH, XPA, u ERCC1 f'siti ta' ħsara lokali tad-DNA indotta mill-UV ġie skopert f'ċelluli 48BR, filwaqt li ċelluli XP1PD defiċjenti ta 'XPA naqsu milli jirreklutaw ERCC1 kif deskritt qabel (Fig. 3 A u Fig. S3 D; Volker et al., 2001). Iż-żewġ ċelluli PV46LD u PV50LD wrew reklutaġġ normali ta 'TFIIH u XPA, filwaqt li reklutaġġ ERCC1 għal siti ta' ħsara lokali tad-DNA indotta mill-UV ma kienx jinstab (Fig. 3 A u Fig. S3 D).

It-telf tal-lokalizzazzjoni ERCC1 jista 'jkun minħabba nuqqas ta' reklutaġġ ERCC1, tnaqqis ġenerali fil-livelli ta 'proteina ERCC1, jew taħlita tat-tnejn. Analiżi Western blot tabilħaqq żvelat li l-livelli ta 'stat fiss ta' kemm ERCC1 u XPF tnaqqsu b'mod drammatiku fiċ-ċelloli PV46LD u PV50LD (Fig. 3 B). L-espressjoni residwa ERCC1 kienet, madankollu, għadha skoperta meta mqabbla ma 'ċelluli ERCC 1-KO sħaħ (Fig. 3 B). It-tnaqqis fil-livelli tal-proteina ERCC1 u XPF fiċ-ċelloli PV46LD kien simili ħafna għal-livelli mnaqqsa misjuba jew fiċ-ċelloli CS20LO jew 165TOR (Fig. 3 C u Fig. S3, E u F), li jissuġġerixxi li l-fenotip aktar sever fl-individwu minn li dawn iċ-ċelloli ġew derivati ​​mhuwiex dovut għal impatt aktar qawwi fuq l-istabbiltà tal-proteini. F'konformità mar-riżultati UDS tagħna, skoprejna espressjoni normali ERCC1 u XPF fiċ-ċelloli mill-ġenituri, li jindika kumpens mill-allel WT (Fig. 3 D). L-ittikkettjar immunofluworexxenti kkonferma li l-livelli tal-proteina ERCC1 u XPF tnaqqsu b'mod sever, filwaqt li ċ-ċelloli mill-ġenituri ma setgħux jintgħarfu miċ-ċelloli WT (Fig. 3 E). Il-kwantifikazzjoni tad-dejta tal-Western blot turi li l-livelli tal-proteina ERCC1 tnaqqsu għal ~ 20 fil-mija fibroblasts inpatient, li rriżulta wkoll f'livelli mnaqqsa b'mod simili ta 'livelli XPF (~20 fil-mija; Fig. 3 F).

Id-dħul tal-varjant missense R156W iwassal għal instabbiltà tal-proteina ERCC1-XPF u difett sever tan-NER

Huwa jitħajjar li wieħed jispekula li l-livelli baxxi ta' proteina fi stat stabbli ta' ERCC1-XPF u d-difett qawwi ta' NER fil-fibroblasti tal-pazjent huma kkawżati mis-sostituzzjoni tal-aċidu amminiku R156W f'ERCC1. Madankollu, meta wieħed iqis li l-individwi affettwati huma aħwa, ma nistgħux neskludu li karatteristiċi ġenetiċi oħra kondiviżi bejniethom jistgħu wkoll jikkontribwixxu għal dan il-fenotip.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), li ġiet ikkonfermata permezz tas-sekwenzjar ta 'Sanger f'żewġ kloni individwali (Fig. 4 A). Il-mutazzjoni missense ikkawżat tnaqqis sever tal-livelli tal-proteina ERCC1 u XPF fiż-żewġ kloni KI (kloni 2-17 u 2-51; Fig. 4 B u Fig. S4, A u B). Il-kwantifikazzjoni tad-dejta tal-Western blot wriet li l-livelli tal-proteina ERCC1 u XPF kienu kważi baxxi daqs fiċ-ċelloli ERCC 1-KO (Fig. 4 C). Dawn is-sejbiet jistabbilixxu li s-sostituzzjoni tal-aċidu amminiku R156W għandha impatt qawwi fuq l-istabbiltà tal-ERCC1.

Biex nistabbilixxu aktar li d-difett NER fil-fibroblasti tal-pazjent huwa kkawżat mis-sostituzzjoni tal-aċidu amminiku R156W f'ERCC1, kejlna l-attività TCR billi nimmonitorjaw il-bidu mill-ġdid tat-traskrizzjoni wara l-irradjazzjoni UV. Filwaqt li ċ-ċelluli RPE 1-hTERT tal-ġenituri wrew bidu mill-ġdid normali fi 18-il siegħa wara UV, iż-żewġ kloni R156W-KI wrew difett TCR qawwi komparabbli ma 'ċelluli ERCC 1-KO sħaħ (Fig. 4, D u E). Bl-istess mod, esperimenti UDS żvelaw attività GGR normali fiċ-ċelloli RPE1-hTERT tal-ġenituri, li tnaqqset ħafna taħt l-10 fil-mija kemm fil-kloni R156W-KI kif ukoll fiċ-ċelloli ERCC1-KO (Fig. 4, F u G) . Fl-aħħarnett, kejlna s-sensittività UV ta 'klonu wieħed R156W-KI (2-51) meta mqabbel mal-fibroblast tal-pazjent immortalizzat bl-hTERT PV50LD. Iċ-ċelloli R156W-KI wrew fenotip qawwi sensittiv għall-UV, għalkemm mhux daqshekk sensittivi daqs iċ-ċelloli ERCC1-KO sħaħ (Fig. 4 H). Interessanti, il-fenotip sensittiv għall-UV tar-R156W-KI kien simili ħafna għal dak tal-fibroblasti tal-pazjent PV50LD-hTERT. Dawn is-sejbiet jistabbilixxu li l-livelli baxxi ta' proteina ERCC1-XPF u d-difett qawwi NER huma konsegwenza diretta tas-sostituzzjoni tal-aċidu amminiku R156W f'ERCC1.

Is-sostituzzjoni ERCC1R156W tikkawża lokalizzazzjoni ċitoplasmika parzjali

Il-fibroblasti tal-pazjent u ċ-ċelloli KI juru livelli ta 'proteini mnaqqsa b'mod drammatiku u attività NER mnaqqsa b'mod qawwi. Wara xtaqna nesploraw jekk id-difett NER huwiex ikkawżat biss minn livelli mnaqqsa ta' proteina ERCC1-XPF, jew jekk il-proteina ERCC1R156Wmutant naqqsetx attività bħala endonukleażi jew f'NER.

Biex nindirizzaw dan, aħna ġġenerajna ċelloli ERCC1-KO minn CRISPR Cas9 f'ċelloli U2OS mgħammra bis-sistema Flp-In/T-Rex. Bl-użu ta 'rikombinazzjoni diretta fuq is-sit ibbażata fuq Flp, immirajna cDNAs li jikkodifikaw ERCC1WT jew ERCC1R156W bit-tikketta GFP għas-sit tal-mira ta' rikonoxximent tal-FLP (FRT) ġenomika biex nippermettu espressjoni inducibbli minn promotur virali qawwi. Analiżi Western blot wriet li ERCC1WT u ERCC1R156W kienu espressi f'livelli simili u li l-espressjoni ta 'kwalunkwe proteina salvat il-livelli ta' proteina mnaqqsa ta 'XPF osservati fiċ-ċelloli ERCC1-KO (Fig. 5 A). Dawn iċ-ċelluli huma għalhekk sistema mudell eċċellenti biex tqaxxar l-impatt speċifiku tas-sostituzzjoni ERCC1R156W meta espressa f'livelli WT mill-impatt ta 'espressjoni ERCC1 aktar baxxa fil-fibroblasti tal-pazjent u ċelloli epiteljali KI.

Studji preċedenti wrew li mutazzjonijiet missense f'XPF jistgħu jikkawżaw lokalizzazzjoni ħażina ta' ERCC1-XPF fiċ-ċitoplasma (Ahmad et al., 2010). F'konformità ma 'dan, aħna skoprejna wkoll li ~ 40 fil-mija tal-grupp ta' proteini ERCC1R156W mislocalized għaċ-ċitoplasma, li kien biss ~ 15 fil-mija fiċ-ċelloli li jesprimu ERCC1WT (Fig. 5, B u C). Din il-lokalizzazzjoni ħażina ta 'ERCC1 żiedet ukoll il-frazzjoni ta' XPF ċitoplasmika (Fig. 5, B u C), li tindika li ERCC1R156W jista 'jkun parzjalment mitwija ħażin.

Biex nittestjaw din il-possibbiltà, għamilna esperimenti ta 'immunopreċipitazzjoni fuq ERCC1WT-GFP u ERCC1R156W-GFP segwiti minn spettrometrija tal-massa mingħajr tikketta kwantitattiva (MS) biex immappjaw interatturi differenzjali taż-żewġ proteini ERCC1. Importanti, l-SM kwantitattivi kkonfermaw li ammonti ugwali ta 'proteina ERCC1WT-GFP u ERCC1R156W-GFP ġew miġbuda 'l isfel (Fig. 5 D). B'mod impressjonanti, l-interatomi ta 'ERCC1R156W kien arrikkit għal proteini ta' xokk tas-sħana (HSPs), b'mod partikolari tal-familja HSPA, filwaqt li l-interazzjoni ma 'XPF kienet imnaqqsa kwantitattivament meta mqabbla ma' ERCC1WT (Fig. 5 D). Il-proteini HSPA huma chaperoni li jintwew tal-proteini li jipprevjenu l-aggregazzjoni ta 'proteini mitwija ħażin (Stetler et al., 2010). L-esperimenti ta 'Co-immunoprecipitation (Co-IP) tabilħaqq ikkonfermaw li ERCC1R156W-GFP interaġixxa b'mod qawwi ma' HSPA4 meta mqabbel ma 'ERCC1WT (Fig. 5 E), li jissuġġerixxi misfolding parzjali ta' ERCC1R156W.

Biex tindirizza sa liema punt ERCC1R156W-XPF għadu attiv bħala endonuclease, aħna purifikat il-kumpless rikombinanti minn ċelluli tal-insetti Sf9 (Fig. S4 C). Il-proċedura stabbilita preċedentement tagħna tinvolvi pass ta 'ġell-filtrazzjoni li jippermettilna nevalwaw jekk ERCC1-XPF huwiex fi stat dimeriku jew aggregat (Fig. 5 F, frazzjonijiet 2 u 1, rispettivament). Ir-rendiment tal-kumpless ERCC1R156W XPF rikombinanti kien aktar baxx u wera livell ogħla ta 'proteina aggregata. Barra minn hekk, aħna ndunat ukoll tnaqqis fil-frazzjoni ta 'proteina eterodimerika meta mqabbla ma' ERCC1WT-XPF (Fig. 5 F). Madankollu, l-ERCC1R156W-XPF eterodimeriku rikombinanti fil-frazzjoni 2 kien attiv bis-sħiħ meta inkubat b'substrat tad-DNA mudell ta' staminali linja, filwaqt li l-ERCC1-XPFD687A katalitikament inattiv, inkluż bħala kontroll negattiv, kien nieqes minn attività ta' inċiżjoni (Fig. . 5 G). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li ERCC1R156W-XPF huwa parzjalment mitwi u lokalizzat ħażin, iżda l-frazzjoni tal-proteina li tintewa sew għadha attiva bħala endonuclease.

Il-proteina mutanti ERCC1R156W tonqos milli jinteraġixxi b'mod effiċjenti mal-fatturi ewlenin NER

Imbagħad indirizzajna kif is-sostituzzjoni ERCC1R156W affettwat NER bl-użu taċ-ċelloli ERCC1-KO rikostitwiti. Minħabba li s-sostituzzjoni R156W tinsab eżatt taħt il-but li torbot l-XPA f'ERCC1 (Fig. 1 F), staqsejna jekk ERCC1R156W jistax għadu jinteraġixxi ma 'proteini NER bi tweġiba għall-irradjazzjoni UV. Biex nittestjaw dan, aħna immunoprecipitejna ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP, jew GFP mdewba ma 'sinjal ta' lokalizzazzjoni nukleari (GFP-NLS) bħala kontroll minn ċelloli irradjati bl-UV u sussegwentement wettaqna MS mingħajr tikketta. Billi qabbilna ERCC1-GFP ma' GPF-NLS, identifikajna interatturi kostituttivi kif ukoll indotti mill-UV ta' ERCC1. L-analiżi tagħna wriet li kemm ERCC1WT kif ukoll ERCC1R156W jinteraġixxu ma 'XPF u l-proteini scaffold speċifiċi għat-tiswija tal-ICL SLX4 u SLX4IP, għalkemm imnaqqsa kwantitattivament f'ċelloli li jesprimu ERCC1R156W (Fig. 6, A u B). B'mod impressjonanti, l-interazzjoni indotta mill-UV mas-subunità TFIIH XPB fiċ-ċelloli ERCC1WT intilfet kompletament fiċ-ċelloli ERCC1R156W (Fig. 6, A u B). Esperimenti Co-IP kkonfermaw li ERCC1R156W naqas milli jassoċja jew ma 'TFIIH jew XPA bi tweġiba għall-irradjazzjoni UV, filwaqt li interazzjonijiet robusti ġew skoperti wara pull-down ta' ERCC1WT (Fig. 6 C u Fig. S4, D u E).

Ir-reklutaġġ ta' ERCC1-XPF għal kumplessi NER jiddependi bis-sħiħ fuq XPA (Volker et al., 2001), u jqajjem il-mistoqsija dwar jekk ERCC1R156W għadux ingaġġat f'siti ta' ħsara fid-DNA kkaġunata mill-UV. Biex nindirizzaw dan, aħna mmonitorjajna r-reklutaġġ ta' ERCC1-GFP għal leżjonijiet tad-DNA indotti mill-UV bl-użu ta' immaġini ta' ċelluli ħajjin. Għal dan il-għan, iċ-ċelloli ġew irradjati b'lejżer UV-C (266-nm), li wassal għar-reklutaġġ rapidu ta 'ERCC1WT-GFP fl-ewwel 60 s wara l-irradjazzjoni, u laħaq plateau madwar 120 s (Fig. 6, D u E). B'kuntrast, reklutaġġ dgħajjef ħafna biss ta 'ERCC1R156W-GFP jista' jiġi skopert fuq irradjazzjoni UV-C bl-użu ta 'kundizzjonijiet identiċi (Fig. 6, D, u E). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-inabbiltà ta 'ERCC1R156W li jinteraġixxi ma' XPA tillimita serjament l-assoċjazzjoni tiegħu mal-kumpless NER.

Is-sejbiet tagħna fiċ-ċelloli ERCC1-KO rikostitwiti jissuġġerixxu li ERCC1R156W għadu jappoġġa attività ta 'tiswija residwa (~40 fil-mija) meta espressa f'livelli simili bħal ERCC1WT. Biex tipprova tkejjel it-tiswija residwa fil-fibroblasti primarji PV46LD u PV50LD, li wrew espressjoni mnaqqsa severament tal-proteina mutanti ERCC1R156W, għamilna esperimenti UDS li fihom ippermettejna liċ-ċelloli jinkorporaw EdU għal perjodi estiżi ta 'żmien (4 h) biex naqbdu tiswija residwa. . Filwaqt li UDS kien għadu taħt ~ 10 fil-mija fiċ-ċelloli XP1PD defiċjenti ta 'XPA, fiċ-ċelloli PV46LD u PV50LD UDS żdied minn ~ 10 fil-mija għal ~ 20 fil-mija UDS taħt dawn il-kundizzjonijiet (Fig. 6 J u Fig. S5 A). Dawn is-sejbiet juru li l-proteina mutanti ERCC1R156W, espressa f'livelli baxxi fiċ-ċelloli tal-pazjent, tappoġġja l-attività NER residwa, li x'aktarx tispjega l-karatteristiċi kliniċi ħfief li jixbhu lil XP li dehru fiż-żewġ aħwa. Taħt dawn il-kundizzjonijiet, skoprejna wkoll UDS residwu f'ċelluli ERCC1- defiċjenti deskritti qabel 165TOR (Jaspers et al., 2007) u CS20LO (Kashiyama et al., 2013) f'livelli saħansitra ogħla minn dawk skoperti fiċ-ċelloli PV46LD u PV50LD. (Fig. 6 J u Fig. S5 A).

L-impatt ta 'ERCC1R156W fit-tiswija ICL

Waqt it-tiswija tal-ICL, il-proteina tal-scaffold SLX4 tirrekluta ERCC1-XPF biex twettaq l-inċiżjonijiet ta' unhooking li jippermettu tiswija sussegwenti. L-analiżi tal-MS tagħna wriet li ERCC1R156W xorta interaġixxa ma 'SLX4, għalkemm f'livelli mnaqqsa meta mqabbla ma' ERCC1WT (Fig. 6, A u B). L-esperimenti ta 'Co-IP tabilħaqq ikkonfermaw interazzjoni qawwija ta' ERCC1WT ma 'SLX4, li ma kinitx affettwata mill-irradjazzjoni UV, filwaqt li l-interazzjoni ma' ERCC1R156W tnaqqset ħafna (Fig. 7 A). Biex tindirizza jekk din l-interazzjoni mnaqqsa affettwatx ir-reklutaġġ ta 'ERCC1 għal ICLs, aħna irradjaw lokalment ċelluli b'laser UV-A (365 nm) fil-preżenza ta' trioxsalen, li huwa derivattiv ta 'psoralen li jifforma ICLs fuq irradjazzjoni UV (Velimezi et al. , 2018). L-irradjazzjoni lokali bil-lejżer UV-A wassal għar-reklutaġġ ta 'FANCD2 endoġenu biss f'ċelloli sensitizzati bi trioxsalen, li juri li l-ICLs ġew indotti taħt il-kundizzjonijiet tagħna (Fig. S5 B). Nistgħu niskopru reklutaġġ qawwi ta 'GFP-ERCC1WT-GFP għal ICLs lokali, filwaqt li r-reklutaġġ ta' ERCC1R156W kien ħafna aktar dgħajjef (Fig. 7, B u C), li jissuġġerixxi li l-interazzjoni mnaqqsa ma 'SLX4 tnaqqas ukoll l-effiċjenza li biha ERCC1R156W jiġi reklutat biex ICLs. Madankollu, analiżi tas-sopravivenza klonoġenika wara espożizzjoni għall-aġent li jinduċi ICL mitomycin C (MMC) urew li ERCC1R156W salva l-sensittività eċċessiva taċ-ċelloli ERCC 1-KO għal MMC, għalkemm ftit inqas minn ERCC1WT (Fig. 7 D). Dawn l-esperimenti juru li l-proteina mutanti ERCC1R156W tappoġġja t-tiswija tal-ICL qrib il-livelli WT meta l-proteina mutanti hija espressa livelli kważi normali.

Biex tindirizza jekk il-fibroblasti tal-pazjent PV46LD u PV50LD, li wrew espressjoni sostanzjalment imnaqqsa ta 'ERCC1R156W, għadhomx appoġġjaw tiswija ICL effiċjenti, għamilna assaġġ ta' ksur tal-kromożomi indott minn MMC. Dan il-metodu jkejjel waqfiet tal-kromożomi kkaġunati mill-MMC fiċ-ċelloli tal-metafażi kkawżati minn defiċjenza fit-tiswija tal-ICL. Filwaqt li ċ-ċelluli 48BR (WT) akkumulaw ftit waqfiet wara MMC, kejlna ksur sinifikanti tal-kromożomi indott minn MMC fiċ-ċelluli WK8103 derivati ​​mill-pazjent Fanconi (Poll et al., 1984; Fig. 7 E). Kemm PV46LD kif ukoll PV50LD wrew fenotip intermedju b'żieda fil-formazzjoni ta 'waqfien b'rispons għal MMC, għalkemm mhux fl-istess punt bħaċ-ċelloli Fanconi (Fig. 7 E). F'konformità ma' dan, iċ-ċelloli PV50LD-hTERT u ċ-ċelloli RPE1-hTERT R156W-KI kienu sensittivi għal MMC f'assaġġi ta' sopravivenza klonoġenika, filwaqt li ċelloli VU121F-hTERT defiċjenti ta' FANCF (Joenje et al., 1997) u speċjalment ERCC{ {24}}Ċelloli KO kienu ipersensittivi għall-MMC (Fig. 7 F). Bħala konklużjoni, l-espressjoni aktar baxxa ta 'ERCC1R156W u l-interazzjoni mnaqqsa ma' SLX4 għandhom impatt konsiderevoli fuq it-tiswija tal-ICL, għalkemm iċ-ċelluli tal-pazjent mhumiex kważi sensittivi daqs ċelluli Fanconi jew ERCC1-KO sħaħ. Dan x'aktarx jispjega għaliex ma jidhru l-ebda karatteristiċi simili għall-FA fiż-żewġ aħwa.

L-impatt ta 'ERCC1R156W fit-tiswija tad-DSB

Minħabba r-rwol tal-ERCC1-XPF fit-tiswija tad-DSB, indirizzajna wkoll sa liema punt ERCC1R156W għadu jappoġġja dan il-proċess ta' tiswija. Għal dan il-għan, wettaqna immaġini ta 'ċelluli ħajjin wara irradjazzjoni bil-lejżer UV-A f'ċelloli sensitizzati b'BrdU biex jiġġeneraw DSBs lokali (Lukas et al., 2003). Ir-reklutaġġ ta 'XRCC4 endoġenu jista' jiġi skopert f'siti ta 'irradjazzjoni bil-lejżer UV-A lokali biss wara sensitizzazzjoni BrdU (Fig. S5 C), li turi li DSBs ġew indotti taħt il-kundizzjonijiet tagħna. Ir-reklutaġġ ta 'ERCC1WT-GFP għal siti ta' DSBs ġie skopert b'mod ċar, filwaqt li dan kien ħafna aktar dgħajjef għal ERCC1R156W (Fig. 8, A u B). Madankollu, analiżi tas-sopravivenza klonoġenika wara radjazzjoni jonizzanti (IR) ma wrew l-ebda differenza bejn iċ-ċelloli ERCC1-KO rikostitwiti jew b'ERCC1WT jew ERCC1R156W (Fig. 8 C), li jissuġġerixxu li l-proteina ERCC1 mutant tappoġġja t-tiswija DSB.

Biex nindirizzaw dan ukoll fiċ-ċelloli tal-pazjent, wettaqna analiżi ta 'sopravivenza klonoġenika f'fibroblasti immortalizzati b'hTERT wara esponiment għal dożi dejjem jiżdiedu ta' IR. Fibroblasts defiċjenti fl-XRCC4 (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) kienu sensittivi b'mod ċar għall-IR diġà fl-inqas doża (2 Gy). Madankollu, ċelluli PV50LD-hTERT ma kinux sensittivi ħafna f'2 Gy u wrew biss sensittività akbar f'dożi ogħla (Fig. 8 D). Fil-fatt, iċ-ċelloli ERCC1-KO sħaħ u ċ-ċelloli R156W-KI wrew biss sensittività marġinali għall-IR (Fig. S5 D), li jissuġġerixxi kontribut minuri ta' ERCC1-XPF biex jipproteġi ċ-ċelloli kontra l-IR. Metodu ieħor biex tiġi vvalutata l-kapaċità tat-tiswija tad-DSB huwa l-monitoraġġ tar-riżoluzzjoni tal-fokus H2AX indotti mill-IR fil-ħin. Kemm 48BR kif ukoll fibroblasti tal-pazjent urew tneħħija normali ta 'fokus H2AX fi żmien 24 siegħa wara l-irradjazzjoni b'doża fiżjoloġika ta' 2 Gy (Fig. 8, E u F; u Fig. S5 E). Madankollu, it-trattament ta 'ċelluli 48BR b'inibitur ta' proteina kinase dipendenti mid-DNA (DNA-PK) soppressa bis-sħiħ ir-riżoluzzjoni tal-foċi H2AX fil-punti kollha tal-ħin analizzati (Fig. 8, E u F). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li ċ-ċelloli PV46LD u PV50LD huma kompletament profiċjenti fit-tiswija tad-DSB taħt tagħbija ta 'ħsara baxxa.