Part1: L-Effett ta' Asċiti Kontra l-Malinn Ta' Diterpenojdi Totali Minn Euphorbiae Ebracteolatae Radix Huwa Attribwibbli għal Tibdil fl-Aquaporins permezz tal-inibizzjoni tal-attività PKC fil-kliewi

Għal aktar informazzjoni. Kuntatttina.xiang@wecistanche.com

Astratti: Dan l- istudju evalwa l- effett anti- axxite tad- diterpenojdi totali estratti minn Euphorbiae ebracteolate Radix(TDEE) fuq ġrieden axxitiċi malinni u eluċida l- mekkaniżmu sottostanti tiegħu. TDEE ġie estratt mid-diklorometan u soġġett għall-kromatografija tal-kolonna. Il-purità ta' sitt diterpenojdi iżolati minn TDEE kienet determinata li tkun 77.18% mill-HPLC. TDEE (3 u 0.6 g ħwawar mhux maħduma/kg, p.o.) naqqas l-axxites u żied il-produzzjoni tal-awrina. Sadanittant, analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli tat-tumur, iċ-ċiklu, u l-apoptożi indikaw li TDEE ma kelluxantitumorAttività. Barra minn hekk, il- livelli ta ' espressjoni ta ' aquaporins (AQPs) u l- livelli ta ' traslokazzjoni tal- membrana ta ' proteina kinase C (PKC) α u PKCβ f'Kliewiu ċ-ċelloli tkejlu. TDEE naqqas il- livelli ta ' AQP1- 4 u impedixxa l- espressjoni PKCβ fil- frazzjoni tal- membrana. Erba ' diterpenojdi ewlenin, ħlief kompost 2, naqqsu l- livelli ta ' AQP1 fiċ- ċelluli umani tal- kliewi- 2. Komposti 4 u 5 espressjoni inibita AQP2-4 fiċ-ċelloli tal-kanal tal-ġbir tal-medjlarju ta 'ġewwa tal-ġrieden. L- inibizzjoni kkaġunata mid- diterpenojd ta ' l- espressjoni AQP1- 4 kienet imblukkata minn phorbol- 12- myristate- 13- acetate (PMA; agonist ta ' PKC). Id-diterpenojdi minn TDEE huma l-komponenti ewlenin kontra l-axxites. L- effett ta ' kontra l- axxiti tad- diterpenojdi jista ' jkun assoċjat ma ' alterazzjonijiet fl- AOPs fil- kliewi biex jippromwovi d- dijuresi. L- inibizzjoni ta ' espressjoni AOP1- 4 minn TDEE hija relatata ma ' l- inibizzjoni ta ' l- attivazzjoni PKCβ.

Kliem ewlieni: Euphorbia ebracteolate Hayata; dijuresi; komponenti bijoattivi; terpenojdi; ċelluli tal-kliewi; Inibitur pkc

Ikklikkja biex titgħallem il-benefiċċji tal-ħwam cistanche

1. Introduzzjoni

Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) hija membru tal-ġeneru Euphorbia fil-familja Euphorbiaceae u tintuża ħafna fit-trattament ta 'distensjoni addominali u edema, infezzjoni parassitika, tuberkulożi, u mard ieħor fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża (TCM)[1]. L-għerq tal-EEH (EER) fih diversi terpenojdi, li huma kkunsidrati bħala komponenti effettivi. Saru studji reċenti dwar terpenojdi biex jiġu ddeterminati l-anti-infjammatorji,antivirali, kontra t-tuberkulożi, u effetti oħra in vitro [2-5]. Madankollu, l-investigazzjonijiet bażiċi tar-riċerka dwar l-effetti tradizzjonali tal-EER fit-trattament tad-distensjoni addominali u l-edema huma limitati. Skont it-teorija tat-TCM, l-EER jista' jelimina malajr id-distensjoni addominali u l-edema billi jippromwovi l-awrina u d-dijarea [6]. L-istudji preċedenti tagħna wrew li d-diterpenojdi totali mill-EER (TDEE) jistgħu jikkawżaw dijarea billi jirregolaw l-espressjoni tal-aquaporin (AQP)-1 u l-AQP3 [7]. Madankollu, sal-lum, is-sustanzi effettivi tal-anti-axxiti fl-EER għadhom mhux ċari.

Id-distensjoni addominali u l-edema huma deskritti bħala axxites fil-mediċina moderna. L-axxites huma akkumulazzjoni patoloġika ta' fluwidu peritoneali [8]. Hemm ħafna kawżi ta 'formazzjoni ta' axxites, bħal ċirrożi, tumur, insuffiċjenza tal-qalb, u sindromu nefrotiku [9]. L- okkorrenza ta ' axxite hija relatata ma ' pressjoni għolja portal, li twassal għal vażodilatazzjoni arterjali splanchnic, tnaqqis fil- volum effettiv li jiċċirkola, attivazzjoni ta ' sistemi ta ' vażokostritturi endoġeni, u żamma ta ' l- ilma akkanit fil- kliewi [10]. Il-AQPs huma trasportaturi rapidi tal-membrana tal-ilma għall-qsim tal-ostakli epiteljali u endoteljali u b'hekk għandhom rwol fundamentali fiż-żamma tal-bilanċ tal-ilma [11]. Bosta studji wrew li l-AQPs għandhom rwol ewlieni fil-formazzjoni u d-diżordni tal-axxites [12-15]. Hemm ħafna tipi ta ' AQPs fil- kliewi, bħal AQP1, AQP2, AQP3, u AQP4[16]. Minħabba li t-TDEE jista 'jirregola l-espressjoni tal-AQPs fl-imsaren [7], nipproponu li TDEE jista' jintuża fit-trattament ta 'axxiti billi jirregola l-AQPs fil-kliewi.

Il-pjanijiet dwar il-kwalità tal-arja għandhom rwol kritiku fil-formazzjoni tal-awrina, madankollu, il-mekkaniżmi ta' regolamentazzjoni tal-espressjoni tal-AQPs fil-kliewi ma ġewx iċċarati. Bħalissa, għadd limitat biss ta' rapporti jindikaw li l-AQPs huma rregolati permezz ta' passaġġi tal-proteina kinase C(PKC) u protein kinase A(PKA) [17-20]. Xi terpenojdi iżolati minn Euphorbia (eż., isostnu u ingenol 3-angelate) għandhom effetti regolatorji fuq PKC. TDEE jista ' jirregola l- espressjoni tal- AQPs fil- kliewi mill- passaġġ PKC.

F'dan l-istudju, estrattajna TDEE u evalwajna l-effett anti-axxites tiegħu kif ukoll l-espressjoni tal-AQPs lissija ana, attivitajiet PKC, u PKA fil-kliewi ta 'ġrieden ascitic. Imbagħad, aħna iżolati u ppurifikajna d-diterpenojdi ewlenin mit-TDEE biex ninvestigaw l-effetti tagħha fuq il-livelli tal-proteina tal-AQPs u tal-espressjoni mRNA f'żewġ tipi ta 'ċelluli tal-kliewi(ċelloli tal-kliewi-2 tal-bniedem (HK-2) u ċelloli tal-kanali tal-ġbir ta' midillarji ta' ġewwa tal-ġrieden (mIMCD3)). Fl-aħħarnett, aħna nagħżlu kompost diterpenoid (euphebracteolatin A), bl-użu ta 'phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA; agonist ta' PKC) biex jattiva l-passaġġ PKC, biex nidentifikaw jekk l-espressjoni tal-AQPs fil-kliewi hijiex regolata mill-mogħdija PKC. Dan l-istudju kellu l-għan li jiddetermina l-effett anti-axxit tat-TDEE fl-EER u jipprovdi bażi għall-applikazzjoni klinika tal-EER u l-identifikazzjoni ta' mediċini kandidati għad-dijuresi u l-effetti anti-axxitiċi.

2. Riżultati

L-Effetti ta 'TDEE fuq il-Piż Fluwidu Ascitic, il-Piż ta' l-Awrina, u l-Kontenut ta 'Ilma Fekali

It-trattament ta' ġrieden aċitiċi b'estratt totali tal-EER (TEER) u TDEE (3 u 0.6 g ħwawar mhux maħduma/kg, p.o.) u furosemide (mediċina pożittiva) naqqas b'mod sinifikanti ż-żieda fil-piż tal-fluwidu aċitiku meta mqabbel mal-grupp mudell (Il-Figura 1A). Figura 1C uriet li l-piżijiet tal-awrina huma sinifikanti (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">

2.2. Effetti ta' TDEE fuq il-Livelli tal-Albumina tas-Serum fil-Ġrieden Ascitic

L-albumina tas-serum hija l-aktar proteina abbundanti fil-plażma vertebrata u tista' żżomm il-pressjoni osmotika tad-demm u tirregola t-trasport tal-ilma. Il- Figura 1B uriet li l- produzzjoni ta ' axxit fil- ġrieden mudell ikkawżat tnaqqis sinifikanti fl- albumina tas- serum meta mqabbla mal- grupp normali. Wara trattament b' furosemide, TEER, u TDEE (3 u 0. 6 g ħxejjex aromatiċi mhux maħduma/ kg, p.o.), il- livelli ta ' albumina fis- serum ġew effettivament irkuprati meta mqabbla mal- grupp mudell. Ma ġie osservat l- ebda titjib f' dan l- indiċi fil- gruppi ta ' NTDEE.

2.3.Effetti ta 'TDEE fuq il-Vijabbiltà taċ-Ċelloli tat-Tumur, Iċ-Ċiklu, u l-Apoptożi fil-Ġrieden Ascitic

F'axxite malinni, iċ-ċelloli tat-tumur jitilgħu fil-fluwidu ascitic. Aħna evalwajna jekk it-tnaqqis fl-axxites huwiex relatat mal-attività kontra l-kanċer tat-TEER u t-TDEE. Ir-riżultati wrew li dawn il-mediċini ma inibixxux il-vijabbiltà taċ-ċelluli tat-tumur (Figura 2A)u ma wasslux għal arrest taċ-ċiklu taċ-ċelloli (Figura 2B) u apoptożi (Figura 2C, D).

2.4.Effetti ta' TDEE fuq l-Espressjoni tal-AQPs fil-Kliewi tal-Ġrieden Aċitiċi

Il-kliewi hija organu importanti għar-assorbiment mill-ġdid tal-ilma u l-konċentrazzjoni tal-awrina. Il-kanali tal-ilma AQP jimmedikaw it-trasport rapidu tal-ilma fil-kliewi. Għalhekk, aħna eżaminajna l-espressjoni tal-AQPs fil-kliewi. Il- Figura 3 wriet li t- titjib ta ' l- axxit kellu ftit effett fuq l- AQPsespressjoni fil- kliewi meta mqabbel mal- grupp normali. Meta kkurati b' proteini TEER u TDEE, l- espressjoni ta ' proteini AQP1, AQP2, AQP3, u AQP4 kienet ferm inqas milli fil- grupp mudell fil- biċċa l- kbira tad- dożi. TEER irriżulta fi tnaqqis sinifikanti fl-espressjoni AQP2, AQP3, u AQP4 f'dożi ta '3.0 u 0.6g ħxejjex aromatiċi mhux maħduma / kg, filwaqt li l-espressjoni AQP1 tnaqqset biss b'doża baxxa (0.6g ħxejjex aromatiċi mhux maħduma / kg). Notevolment, TDEE kellu l- istess effetti inibitorji fuq l- espressjoni AQP3 u AQP4 bħal TEER f' żewġ dożi. Id-differenza bejn TDEE u TEER hija li TDEE impedixxa l-espressjoni ta' AQP1 u AQP2 biss f'doża għolja (3g ħxejjex aromatiċi mhux maħduma/kg). NTDEE kellu effetti dgħajfa fuq il-livelli tal-AQPs fil-kliewi, u rregola biss l-espressjoni tal-proteina AQP4 f'doża ta' 3g ħxejjex aromatiċi mhux maħduma/kg.

2.5.Effetti ta' TDEE fuq l-Attivazzjoni PKC u PKA fil-Kliewi ta' Ġrieden Aċitiċi

Studji preċedenti indikaw li l-espressjoni tal-AQPs tista' tiġi rregolata mill-attivazzjoni PKC u PKA. Aħna eżaminajna l-effetti ta' TDEE fuq l-attivazzjoni PKC-a, PKC-β, u PKA. L- attivazzjoni PKC tkejlet bit- traslokazzjoni tagħha miċ- ċitosol sal- membrana taċ- ċellula. Kif muri fil- Figuri 4A, u B, il- livell ta ' espressjoni ta ' proteina ta ' PKC- β fil- frazzjoni tal- membrana tnaqqas b' mod sinifikanti fil- gruppi TDEE, filwaqt li ma kien hemm l- ebda effett sinifikanti fuq il- livell ta ' espressjoni ta ' proteina tal- membrana α PKC. Phospholipase C(PLC) hija molekula importanti ta 'sinjalar upstream li timmedja l-attivazzjoni ta' PKC. Il- kura b' TDEE ma kellha l- ebda effett fuq il- livelli ta ' fosforilati u PLC totali (Figura 4D). Il-PKA hija eterotetramer li tikkonsisti f'żewġ subunitajiet katalitiċi marbuta ma' żewġ subunitajiet regolatorji. Ir-rilaxx ta 'subunits katalitiċi huwa karatteristika ta' attivazzjoni PKA. Fil-Figura 4C, TDEE ma affettwax l-espressjoni ta' subunitajiet katalitiċi PKA.

Determinazzjoni tal-Kontenut ta' Sitt Diterpenojdi fit-TDEE permezz ta' Kromatografija Likwida ta' Prestazzjoni Għolja (HPLC)

Ir-riżultati tal-esperimenti fuq l-annimali wrew li TDEE kienet il-frazzjoni effettiva ewlenija tal-EER. Aħna iżolati sitt diterpenojdi (l-istrutturi tal-komposti 1 sa 6 huma murija fil-Figura 5; id-dejta spettrali ġiet miżjuda mal-Materjal Supplimentari) minn TDEE u użajna dawn il-komposti bħala standards biex jiġi ddeterminat il-kontenut tad-diterpenojdi fit-TDEE. Il-kromatogrammi HPLC għat-TDEE u s-sitt standards tad-diterpenojdi huma ppreżentati fil-Figura 6. Il-kontenut tal-komposti 1 sa 6 kien 1.07%,12.00%,12.69%,9.15%, 39.26% u 3.02%, rispettivament, li jammontaw għal 77.18% ta 'TDEE.

2.7.Effetti ta' Diterpenoids minn TDEE fuq AQPs Espressjoni fiċ-Ċelloli tal-Kliewi

TDEE kienet il-frazzjoni attiva tal-EER li inibixxiet l-axxiti billi naqqset l-espressjoni AQP1, AQP2, AQP3, u AQP4 fil-kliewi. Fl-istess ħin, TDEE naqqas ukoll b'mod sinifikanti l-proteina u l-espressjoni mRNA ta 'AQP1, AQP2, AQP3, u AQP4 f'ċelloli tal-kliewi-2 tal-bniedem (HK-2) u ċelloli tal-kanali tal-ġbir tal-medjljarju ta' ġewwa tal-ġrieden (mIMCD3)( Figura 7). Il-komponenti ewlenin ta 'TDEE huma diterpenoids. Aħna qabbilna l-effetti bejn it-taħlita TDEE u d-diterpenojdi (sitt diterpenojdi iżolati tħalltu skont il-kontenut tagħhom f'TDEE). Ir- riżultati wrew li l- effetti inibitorji tat- taħlita tad- diterpenojdi u TDEE fuq l- espressjoni AQP1, AQP2, AQP3, u AQP4 kienu simili (Figura 7). L- attivitajiet ta ' erba ' diterpenojdi ewlenin minn TDEE ġew evalwati in vitro. Il- Figuri 8 u 9 urew li l- livelli ta ' espressjoni ta ' proteini u mRNA ta ' AQP1 fiċ- ċelloli HK- 2 tnaqqsu b' mod sinifikanti b' komposti 3, 4 u 5. Il- kura b' kompost 2 ma kkawżax tnaqqis notevoli fl- AOP1 fil- livelli tal- proteina u l- mRNA. Għal dawn il-komposti, kompost 3(diterpenoid tat-tip ent-abietane) kien aktar attiv mill-komposti l-oħra. F'ċelluli mlMCD3, erba' komposti tad-diterpenojdi kkawżaw gradi differenti ta' inibizzjoni tal-espressjoni AQP2, AQP3 u AQP4. Ir-riżultati tal-espressjoni tal-proteina u tal-ġeni huma ppreżentati fil-Figuri 8 u 9. Komposti 4 u 5possessed effetti inibitorji qawwija ta ' AQP2, AQP3, u AQP4 meta mqabbla mal- grupp ta ' kontroll fil- livelli tal- ġene u tal- proteini. Komposti 2 u 3 wrew biss effetti differenti fuq l-espressjoni Aqp2, Aqp3, u Aqp4 mRNA.

2. 8. Effetti ta ' l- Attivazzjonitur tal- PKC fuq Inibizzjoni ikkaġunata minn Diterpenoid tal- AQPs

Ir- riżultati mill- esperiment ta ' l- annimali indikaw li TDEE inibixxi fl- istess ħin l- attività PKCβ u l- espressjoni tal- AQPs fil- kliewi ta ' ġrieden li jġorru ċ- ċelluli tat- tumur H22. Biex jiġi ċċarat aktar jekk il- PKC irregolax l- espressjoni tal- AQPs fiċ- ċelloli tal- kliewi, l- agonist PKC (PMA) kienx ittrattat minn qabel fiċ- ċelluli HK- 2 u mIMCD3 f' 1. Il-bidla fl-espressjoni PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3 u AOP4 tal-membrana ġiet osservata. Ir-riżultati tal-Western Bolt urew li l-euphebracteolatin A jista 'jnaqqas l-espressjoni tal-proteina tal-membrane PKCβ, AOP1, AOP2, AOP3, u AOP4, u l-effetti jistgħu jiġu attenwati mit-trattament minn qabel tal-PMA (Figura 10).