Parti Ⅱ Defiċjenza Smad3 Ittejjeb Terapija bbażata fuq Gżejjer Għad-Dijabete U Korriment Dijabetiku fil-Kliewi Billi Tippromwovi l-Proliferazzjoni taċ-Ċelloli Permezz tal-Mekkaniżmu dipendenti E2F3-

Metodi

1. Annimali

Il-ġrieden Smad3-null (Smad3KO) huma rigal ġentili mill-Prof. Chuxia Deng u miżmuma f'eterozigoti (Smad3 plus /- ) fi sfond C57BL/6 [20]. Ġrieden Smad3KO ġew iġġenerati minn intercrossing ta 'ġrieden Smad3 plus /-. Il-ġrieden db/db b'mutazzjoni ta 'Lepr (riċettur ta' Leptin) fl-isfond C57BLKS inxtraw miċ-Ċentru Sperimentali tal-Annimali tal-Università Ċiniża ta 'Hong Kong (CUHK). L-annimali kollha nżammu f'faċilità speċifika mingħajr patoġeni (SPF) b'aċċess ħieles għall-ikel u l-ilma f'ċiklu ta' ġurnata/lejl ta' 12/12-il siegħa. Il-manipulazzjonijiet kollha tal-annimali f'dan l-istudju saru wara r-regolamenti ta 'u approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Esperimenti tal-Annimali ta' CUHK bir-Ref. Le 18-177-MIS.

2. Mudell ta 'ġurdien dijabetiku indott minn Streptozocin (STZ).

Ġrieden maskili C57BL/6 fl-età ta' 8-10 ġimgħat ġew injettati intraperitonealment b'50 mg/kg/jum STZ kuljum għal 5 ijiem kontinwi. 5 ijiem wara l-injezzjoni STZ finali, ġrieden b'glukożju fid-demm stabbli b'mod każwali ta 'aktar minn 16 mM għal jumejn konsekuttivi kienu meqjusa bħala l-istabbiliment b'suċċess tad-dijabete u użati bħala l-ġrieden riċevituri għat-trapjant tal-gżejjer.

3. Islet iżolament, trapjant, u valutazzjoni tal-fenotip dijabetiku

Gżejjer ġew iżolati minn ġrieden Smad3 knockout (KO) jew wild-type (WT) maskili jew femminili fl-età ta' 8-10 ġimgħat kif deskritt qabel [21]. Biex twettaq it-trapjant tal-gżejjer, indika diversi gżejjer ġew trapjantati taħt il-kapsula renali ta 'ġrieden db / db maskili fl-età ta' ġimgħa 4 jew ġrieden dijabetiċi indotti minn STZ f'jum 7 wara l-injezzjoni STZ finali wara l-protokoll deskritt minn Szot et al. 22]. Fil-qosor, il-ġurdien riċevitur kien anestetizzat mill-anestesija Combo (1.5 fil-mija ketamine u 0.15 fil-mija xylazine, 6 μL/g piż tal-ġisem). Wara t-telf tas-sensi, saret inċiżjoni ta '1 ċm fuq il-ġilda li tkopri l-kilwa tax-xellug. Iġbed il-kilwa bil-mod u żommha niedja b'salina sterili waqt l-operazzjoni. B'labra 25G, agħmel scratch żgħir fuq il-kapsula biex toħloq laqa. Numri indikati ta' gżejjer ġew mogħtija fil-kapsula renali permezz ta' tubi PE50. Wara kollox, il-gżejjer ġew trapjantati, issiġilla l-laqa b'kawterizzazzjoni b'sħana baxxa. Ibdel il-kliewi u agħlaq il-peritoneum b'suturi. Issiġilla l-ġilda bi stejpils. Soluzzjoni ta '100 μL Peniċillina-streptomycin (Gibco, cat# 15140122, USA) ġiet injettata intraperitonealment biex tevita l-infezzjoni. 100 μL Tegmic ġie injettat ġol-muskoli biex itaffi l-uġigħ. L-annimal tpoġġa f'ambjent sħun sal-irkupru sħiħ. L-istess proċedura ta’ operazzjoni saret ukoll fi ġrieden tal-kontroll sham iżda mingħajr infużjoni ta’ gżejjer. Kemm il-livelli ta' glucose fid-demm bl-addoċċ kif ukoll f'6 sigħat ta' sawm (RBG u FBG) tad-demm tat-tarf tad-denb ġew iċċekkjati kull ġimgħa b'miter tal-glukożju li jista' jinġarr (Roche, ACCU-CHEK® Performa). It-test tar-reżistenza għall-insulina (IPITT), it-test tat-tolleranza tal-glukożju (IPGTT), il-livelli ta 'HbA1c, u l-insulina fis-serum ġew imkejla kif deskritt qabel [9].

Ikklikkja hawn biex tiksebil-benefiċċji Cistanche

4. Proteina urinarja totali u krejatinina fis-serum

L-awrina ta' 24 siegħa nġabret f'gaġġa metabolika. Il-proteina totali tal-awrina ta '24 siegħa ġiet ikkalkulata bil-multiplikazzjoni tal-volum tal-awrina u l-konċentrazzjoni tal-proteina tal-awrina li kienet ikkwantifikata mill-Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, cat# 5000201, USA). Il-krejatinina fis-serum ġiet determinata bil-kit tal-kwantifikazzjoni tal-krejatinina (Laboratorju Stanbio, qattus # 0430-120, USA).

5. Istopatoloġija

Bidliet istopatoloġiċi renali ġew eżaminati f'sezzjonijiet imwaħħla fil-paraformaldehyde, inkorporati fil-paraffin (4 µm) b'reaġent Periodic Acid-Schiff (PAS) kif deskritt qabel [23]. L-espansjoni tal-matriċi mesanġjali ġiet ikkalkulata bl-użu tal-programm ta 'immaġni kwantitattiva (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) kif deskritt qabel [23].

6. Immunoistokimika

Il-kliewi jew il-frixa li jġorru l-gżejjer ġew iffissati f'4 fil-mija paraformaldehyde, inkorporati fil-paraffin, u sezzjoni f'4 μm. Wara r-riidratazzjoni, is-sezzjonijiet ġew ittrattati bl-irkupru tal-antiġen medjat mill-microwave f'0.{01 M ċitrat (pH 6.{0) għal 10 minuti u imblukkar f'5 fil-mija BSA għal siegħa . L-inkubazzjoni primarja tal-antikorpi saret matul il-lejl f'4 gradi. Għal tbajja fluworexxenti, ġie applikat antikorp sekondarju fluworexxenti f'temperatura tal-kamra (RT) għal siegħa. Għal termoġenesi medjata mid-DAB, pass addizzjonali ta 'imblukkar ta' 3 fil-mija H2O2 għal 15-il minuta ġie inkluż qabel l-irkupru tal-antiġen. Wara l-inkubazzjoni primarja tal-antikorpi, ġie miżjud polimeru konjugat HRP (Envision plus System, Dako, USA). Għat-tbajja ta 'E2F3, l-irkupru ta' l-antiġen sar f'soluzzjoni EDTA-Tris (pH 9.0). L-antikorpi użati fl-immunoistokimika ġew iddettaljati fit-Tabella S2. Iż-żona pożittiva tat-tbajja ġiet ikkwantifikata b'softwer Image J (v1.47, NIH, USA).

Estratt ta' Cistanche

7. Kejl tal-massa taċ-ċelluli mlaqqma fil-kliewi li jġorru l-gżejjer

Intuża indiċi ta 'żona medja taċ-ċelluli għal kull sezzjoni biex jikkwantifika b'mod semi-kwantitattiv il-massa taċ-ċelluli fit-tilqim tal-gżira. Fil-qosor, il-kliewi li jġorru l-gżejjer (inkorporati fil-paraffin) inqatgħu suċċessivament f'4 μm tul l-assi sagittali. Sezzjonijiet kontinwi f'intervalli ta '160 μm kienu immunostained b'mod fluworexxenti għall-insulina. Mill-inqas 6 sezzjonijiet bi tbajja pożittiva għall-insulina ġew użati għall-kalkolu tal-erja taċ-ċelluli għal kull sezzjoni f'kull ġurdien. Iż-żona taċ-ċelluli pożittivi għall-insulina f'kull sezzjoni ġiet ikkwantifikata b'softwer Image J (v1.47, NIH, USA). L-indiċi tal-erja medja taċ-ċelluli għal kull sezzjoni f'kull ġurdien ġie kkalkulat billi l-erja totali pożittiva għall-insulina tiġi diviża fis-sezzjonijiet kollha bin-numru ta' sezzjonijiet pożittivi għall-insulina.

8. Kultura primarja taċ-ċelloli tal-gżejjer

Il-gżejjer iżolati ġew dissoċjati f'ċelluli singoli u miżrugħa fil-pjanċa tal-{0}}bir f'200 μL ta' RPMI 1640 (Gibco, USA) flimkien ma' 10 fil-mija FBS (Gibco, USA) flimkien ma' 1 fil-mija Peniċillina-streptomycin (Gibco, USA) supplimentat b'20 mM glukożju. Iċ-ċelloli tal-gżejjer ġew ikkultivati ​​għaż-żmien indikat f'inkubatur stabbilit f'37 grad, 5 fil-mija CO2, u 100 fil-mija umdità. Għal knockdown ta 'E2F3 medjat minn adenovirus, ċelluli tal-gżejjer dissoċjati ġew ikkultivati ​​f'mezz li fih adenovirus li jesprimi żżejjed RNA qasir ta' hairpin (shRNA) immirat lejn il-ġurdien E2F3 (shE2F3) jew kontroll shRNA mhux speċifiku (muri) f'titru ta '10 pfu għal kull ċellula għal 2 jiem segwiti minn sostituzzjoni medju. Is-sekwenza taz-zokk tad-duplex shE2F3 kienet 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Ċelloli mxerrda minn 50 gżejjer ġew miżrugħa għal kull bir għal immunostaining u RT-PCR, u 100 gżejjer għal kull bir għal Western blot, li twettqu kif deskritt qabel [9].

9. Tikkettar BrdU in vivo u in vitro

Biex iwettqu tikkettjar BrdU in vivo, il-ġrieden ġew injettati intraperitonealment b'50 mg/kg/jum BrdU (f'PBS) għal 7 ijiem mit-2 jum wara t-trapjant tal-gżejjer u sagrifikati 2 sigħat wara l-aħħar injezzjoni. Għal tikkettar BrdU in vitro, iċ-ċelluli tal-gżejjer imxerrda ġew ikkultivati ​​għal 48 siegħa segwiti minn sostituzzjoni b'medja friska li fiha 10 μM BrdU u kkultivati ​​għal 24 siegħa addizzjonali. L-immunostaining fluworexxenti kontra BrdU fit-tessuti u ċ-ċelloli kkultivati ​​twettqet kif deskritt qabel [9].

Trab Cistanche

10. RNA-Seq

Gżejjer kienu iżolati mill-ġrieden Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m, u Smad3KO-db/m. Għal kull ġenotip, gżejjer minn aktar minn 5 ġrieden ġew miġbura għal iżolament ta 'RNA. L-RNA ġie ppreparat bil-miRNeasy Mini Kit (Qiagen, il-Ġermanja). RNA-seq u l-analiżi tad-dejta downstream kienu deskritti qabel [9]. Il-livell ta 'espressjoni ta' ġene partikolari ġie ppreżentat bħala l-frammenti għal kull kilobase ta 'traskrizzjoni għal kull miljun qari mappjati (FPKM). Il-ġene espress b'mod differenzjali (DEG) kien definit bħala varjanza akbar minn jew ugwali għal 2 darbiet ta' FPKM bejn żewġ gruppi. DEGs upregulated u downregulated ġew ikkombinati u użati għall-analiżi tal-passaġġ tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) u l-Enċiklopedija ta' Kjoto tal-Ġeni u l-Ġenomi (KEGG) bir-riżorsi tal-bijoinformatika DAVID onlajn (v6.8) b'settings default. Is-sottokategorija GOTERM_BP_DIRECT ġiet impjegata għall-analiżi GO.

11. Immunopreċipitazzjoni

Biex twettaq immunopreċipitazzjoni fi gżejjer tal-ġrieden, madwar 500 gżejjer iżolati friski ġew lysed f'500 mL ta 'buffer RIPA. Antikorp anti-Smad3 tal-fenek (2 ug) jew iżotip IgG tal-fenek ġie miżjud u inkubat f'4 gradi matul il-lejl b'rotazzjoni ġentili. Imbagħad, 20 μL ta 'żibeġ tal-proteina A agarose (Beyotime, qattus # P2051, iċ-Ċina) ġew miżjuda u inkubati għal 2 sigħat f'4 gradi. Wara l-ħasil b'mod robust b'buffer RIPA frisk, il-proteina mdawra ġiet rilaxxata permezz ta 'denaturazzjoni fil-buffer tat-tagħbija 1xSDS u soġġetta għal analiżi Western blot. Biex tiġi evitata l-influwenza tal-katina tqila tal-IgG, intużat IgG anti-fenek tal-ġurdien speċifiċi għall-katina ħafifa (HRP konjugat, Abmart, cat # M21006, iċ-Ċina) biex tirrikonoxxi l-proteina Smad3 preċipitata.

12. Kromatin immunopreċipitazzjoni-ChIP

Biex twettaq ChIP fi gżejjer tal-ġrieden, inġabru madwar 2000 gżejjer minn ġrieden C57BL/6 ta' 8-10 ġimgħat u ntużaw bħala preparazzjoni waħda ta' ChIP. Il-gżejjer iżolati friski ġew stimulati b'10 ng/mL TGF - 1 (Gibco, USA) għal 15-il minuta f'RPMI 1640 flimkien ma '1 fil-mija FBS flimkien ma' 1 fil-mija Peniċillina-streptomycin. ChIP sar bis-SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, USA) wara l-istruzzjoni rakkomandata. Antikorpi u primers użati fl-assaġġ ChIP huma dettaljati fit-Tabella S1 u S2.

Cistanche standardizzat

13. Assaġġ ta' reporter dual-luciferase

Il-promotur E2F3 tal-ġurdien (-1000 għal plus 451 bp) ġie kklonat fil-vettur bażiku pGL3-(pGL3-E2F3.Pro). Fl-istess ħin, saret mutazzjoni puntwali tas-sit ta' rbit ta' Smad3 biex tiġġenera l-pGL3- E2F3.Pro. Mut. Biex twettaq l-assaġġ ta' reporter dual-luciferase, iċ-ċelluli HEK293T ġew miżrugħa fil-pjanċa tal-24-bir b'densità ta' 5 x 104 ċelluli/bir. L-għada, iċ-ċelloli ġew trasfettati b'500 ng pGL3-Bażiku jew pGL3-E2F3.pro jew pGL{3-E2F3.pro.mut flimkien ma' pcDNA3.1-Smad3, li jesprimi żżejjed il-ġurdien Smad3, jew le (kif indikat fil-Figura 10F) bil-metodu tal-fosfat tal-kalċju. Il-vettur pEGFP-C1 ġie supplimentat biex jibbilanċja d-doża tat-trasfezzjoni f'kull trattament. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vettur li jesprimi renilla luciferase kien inkluż f'kull trattament biex tiġi normalizzata l-effiċjenza tat-trasfezzjoni. 6 sigħat wara t-trasfezzjoni, il-medium inbidel segwit minn inkubazzjoni għal 48 siegħa addizzjonali. Iċ-ċelloli ġew lysed, u l-attività tal-luċiferażi ġiet iddeterminata bis-Sistema ta' Assaġġ ta' Reporter Dual-Luciferase ® (Promega, USA) u kkwantifikata f'luminometru (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). L-attività tat-traskrizzjoni tal-promotur E2F3 kklonat ġiet ippreżentata bħala l-proporzjon tal-valur ta 'luċiferażi firefly għal luciferase renilla. Kull trattament sar fi tliet kopji.

14. Statistika

Id-dejta ġiet ippreżentata bħala medja ± SD u analizzata b'softwer SPSS (16.0). In-normalità tad-dejta ġiet iċċekkjata bit-test Kolmogorov-Smirnov b'Kampjun Wieħed. L-omoġeneità tal-varjazzjonijiet fost il-gruppi ġiet ittestjata mill-istatistika Levene. Għat-tqabbil bejn iż-żewġ gruppi, intuża t-test ta' Student. Għat-tqabbil fost gruppi multipli, intuża ANOVA one-way b'test LSD jekk kienet preżunta varjanza ugwali. Għall-varjanza ugwali li ma kinitx preżunta, intużat statistika tat-test ta' Welch alternattiva segwita minn paraguni multipli mat-test T2 ta' Tamhane. P < 0.05 tqieset statistikament sinifikanti.

Supplimenti ta' Cistanche

Konklużjonijiet

Id-defiċjenza ta 'Smad3 ttejjeb ħafna t-terapija ta' sostituzzjoni tal-gżejjer kemm għal T1DM kif ukoll għal T2DM u tipproteġi kontra ħsara fil-kliewi dijabetiċi. Il-proliferazzjoni msaħħa taċ-ċelluli dipendenti mill-E2F3-tista' tkun mekkaniżmu ewlieni tat-terapija tal-gżejjer Smad3KO kemm f'T1DM kif ukoll f'T2DM. Għalhekk, it-terapija ta 'sostituzzjoni taċ-ċelluli Smad3KO tista' tkun strateġija terapewtika aħjar għad-dijabete klinikament.

Referenzi

1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Trapjant kliniku tal-gżejjer tal-frixa. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.

2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Differenzjazzjoni taċ-ċelloli staminali pluripotenti tal-bniedem għal ċelloli tal-frixa funzjonali għat-terapiji tad-dijabete: Innovazzjonijiet, sfidi u direzzjonijiet futuri. J Biol Eng. 2017; 11:21.

3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, et al. Valutazzjoni istoloġika tat-tilqim wara trapjant kliniku ta' gżejjer. Trapjant. 2009; 88: 1286-93.

4. Lan HY. Rwoli diversi ta 'TGF-beta/Smads fil-fibrożi renali u l-infjammazzjoni. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.

5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Sinjali TGF-beta/Smad fil-fibrożi renali. Quddiem Physiol. 2015; 6:82.

6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K, et al. Netwerk ta 'sinjalazzjoni smad jirregola l-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-gżejjer. Dijabete. 2014; 63: 224-36.

7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. L-inibizzjoni tas-Sinjali TGF-beta Tippromwovi r-Replikazzjoni taċ-Ċelloli Beta tal-Pankrea tal-Bniedem. Dijabete. 2016; 65: 1208-18.

8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V, et al. L-Inibizzjoni Magħquda tal-Pathways DYRK1A, SMAD, u Trithorax Jissinerġizza biex Induċi Replikazzjoni Robusta f'Ċelloli Beta tal-Bniedem Adulti. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.

9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH, et al. Id-defiċjenza ta' Smad3 tippromwovi l-proliferazzjoni u l-funzjoni taċ-ċelluli beta fil-ġrieden db/db permezz tar-restawr tal-espressjoni Pax6. Teranostiċi. 2021; 11: 2845-59.

10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Metodu għall-iżolament tal-gżejjer murini u t-trapjant tal-kliewi subkapsulari. J Vis Exp. 2011.

11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH, et al. It-trapjant tal-isograft tal-islet itejjeb is-sensittività għall-insulina f'mudell murini tad-dijabete tat-tip 2. Endokrinali. 2021; 72: 660-71.

12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. L-induzzjoni ta 'p16ink4a u p19ARF minn TGFbeta1 tikkontribwixxi għall-arrest tat-tkabbir u r-rispons tas-senescence f'keratinoċiti tal-ġrieden. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.

13. Dyer MA, Cepko CL. Jirregola l-proliferazzjoni matul l-iżvilupp tar-retina. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.

14. Dyson N. Ir-regolamentazzjoni ta 'E2F minn proteini tal-familja pRB. Ġeni Dev. 1998; 12: 2245-62.

15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J, et al. Is-Soppressjoni Transitorja tas-Sinjali tar-Riċettur TGFbeta Jiffaċilita t-Trapjant tal-Gżejjer tal-Bniedem. Endokrinoloġija. 2016; 157: 1348-56.

16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Tfixkil SMAD2 fiċ-ċelluli beta tal-frixa tal-ġurdien iwassal għal iperplażja tal-gżejjer u sekrezzjoni indebolita tal-insulina minħabba l-attenwazzjoni tal-attività tal-kanal K plus sensittiva għall-ATP. Diabetologia. 2014; 57: 157-66.

17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salamun P, et al. L-espressjoni żejda ta 'E2F3 tippromwovi l-proliferazzjoni ta' ċelluli beta tal-bniedem funzjonali mingħajr induzzjoni ta 'apoptożi. Ċiklu taċ-Ċellola. 2013; 12: 2691-702.

18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Sinjali tal-Familja TGF-beta fil-Kontroll tal-Proliferazzjoni taċ-Ċelloli u s-Sopravivenza. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.

19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Id-dijabete mellitus--avvanzi u sfidi fil-proliferazzjoni taċ-ċelluli beta tal-bniedem. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.

20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H, et al. Tħarbit immirat ta 'SMAD3 jirriżulta f'immunità mukuża indebolita u tnaqqis fir-rispons taċ-ċelluli T għal TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.

21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokoll għall-iżolament tal-gżejjer mill-frixa tal-ġrieden. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.

22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Trapjant ta 'gżejjer tal-frixa fil-kapsula tal-kliewi ta' ġrieden dijabetiċi. J Vis Exp. 2007: 404.

23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q, et al. It-tħassir ta 'Smad3 jipprevjeni fibrożi renali u infjammazzjoni fin-nefropatija dijabetika tat-tip 2. Metaboliżmu. 2020; 103: 154013.

Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2, u Hui-Yao Lan2,7

1 Ċentru ta 'Riċerka għall-Mediċina Integrata u Dipartiment tan-Nefroloġija, Isptar Affiljat tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża tal-Università Medika tal-Lbiċ, Luzhou, Sichuan, 646000, iċ-Ċina.

2. Dipartiment tal-Mediċina u Terapewtika, u Li Ka Shing Istitut tax-Xjenzi tas-Saħħa, l-Università Ċiniża ta 'Ħong Kong, Ħong Kong, 999077, iċ-Ċina.

3. Laboratorju Konġunt ta 'Guangdong-Ħong Kong dwar il-Mard tal-Kliewi Immunoloġiku u Ġenetiku, l-Isptar Popolari Provinċjali ta' Guangdong, l-Akkademja tax-Xjenzi Mediċi ta 'Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, iċ-Ċina.

4. Laboratorju Ewlenin tal-Istat tal-Bijoelettronika, Laboratorju Ewlenin ta 'Jiangsu għal Bijomaterjali u Apparati, Skola tax-Xjenzi Bijoloġiċi u Inġinerija Medika, Università tax-Xlokk, Nanjing, iċ-Ċina.

5. Laboratorju Ewlenin ta 'Prevenzjoni u Ġestjoni ta' Mard Kronika tal-Kliewi tal-Belt ta 'Zhanjiang, Istitut ta' Nefroloġija, Sptar Affiljat ta 'Guangdong Medical University, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Ċina.

6. Bażi Nazzjonali ta 'Riċerka Klinika tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża, Sptar Affiljat tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża tal-Università Medika tal-Lbiċ, Luzhou, Sichuan, 646000, iċ-Ċina.

7. Laboratorju Konġunt tar-Riċerka tal-Isptar Popolari Provinċjali ta 'CUHK-Guangdong dwar il-Mard tal-Kliewi Immunoloġiku u Ġenetiku, l-Università Ċiniża ta' Ħong Kong, Ħong Kong, 999077, iċ-Ċina.