Parti 4: L-immappjar tal-Interazzjoni Epiġenomika U Traskriptomika Waqt il-Formazzjoni tal-Memorja U t-Tifkira fl-Ensem tal-Engram Hippocampal

ali.ma@wecistanche.com

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 3

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 5

RNA-seq

ul ilma mingħajr nukleażi), għal 30 min f'37c bi tbandil ġentili. Frammenti tad-DNA miżjuda ġew amplifikati u barcoded bl-użu ta 'reazzjoni PCR (ċiklu 1; 5min - 72c, 30sec - 98c, 10 ċikli; 15sec - 98c, 30sec - 60c, 3min - 72c). Wara l-protokoll tal-manifattur, id-DNA amplifikat ġie mnaddaf u purifikat bl-użu ta 'żibeġ AMPure 1.8x (żibeġ AmpureXP, Beckman Coulter, A63880). Wara l-QC tal-bijoanalizzatur għad-daqs u d-distribuzzjoni tal-libreriji, il-libreriji ġew sekwenzati fuq il-pjattaforma Illumina Nextseq 550 fiċ-Ċentru BioMicro tal-MIT.

Cistanche u Cistanches għat-titjib tal-memorja

Analiżi ATAC-seq—Id-dejta mhux ipproċessata tal-fastq ta' 40-bp paired-end sequencing qari kienet allinjata mal-ġenoma ta' referenza tal-maws mm9 bl-użu ta' Bowtie 2.0 f'mod paired-end50. Il-kollezzjoni Samtools51 intużat biex issolvi, tneħħi duplikati tal-PCR (rmdup), indiċi fajls BAM (indiċi), u tikkalkula l-istatistika tal-librerija (flagstat, ara Tabella Supplimentari 13). Il-fajls BAM ġew ikkampjunati minn qari allineati sew, imqabbda u uniċi għal 50M. Il-qċaċet tal-kromatina miftuħa ġew analizzati bl-użu ta 'softwer MACS252. Reġjuni aċċessibbli b'mod differenzjali (DARs) ġew identifikati minn Diffbind v1.16.353 b'parametri u settings awtomatiċi biex jużaw DESeq2 (cutoff; FDR <0.01; darbiet="" bidliet=""> 1.5). Il-matriċi sħiħa tal-għadd normalizzat (RPKM54) ġiet irkuprata mill-pakkett DiffBind. Għal ġenerazzjoni ta 'bigwig tracks, inbnew fajls ta' sinjali pileup (framment pileup għal kull miljun qari) f'format ta 'bijografija bl-użu tal-funzjoni tal-quċċata tas-sejħa MACS2 bil-bnadar -B -SPMR. Imbagħad, l-arrikkiment normalizzat darbiet (FE) fuq binarji lambda input ġew iġġenerati bl-użu tal-funzjoni bdgcmp ofMACS2 bl-issettjar - m FE. Imbagħad bedGraph fajls ġew konvertiti għall-format bigwig.

Għodod IGV55 intużaw għall-viżwalizzazzjoni ta 'fajls bigwig. ChromHMM56 intuża biex jistabbilixxi mudell tal-istat tal-kromatin minn żewġ studji indipendenti li użaw tessut tal-ippokampus bl-ingrossa qabel u wara x-xokk tas-sieq21,22 u biex jiddetermina li jintewa l-arrikkiment tad-DARs fuq il-mudell tal-istat. L-analiżi tal-arrikkiment tal-motivi57,58 u l-annotazzjoni tal-qċaċet twettqu minn għodod HOMER59. Il-kodiċijiet kollha huma disponibbli fil-fajl tas-softwer supplimentari Estrazzjoni tal-RNA u preparazzjoni tal-librerija — Immedjatament isegwu l-fissazzjoni u l-issortjar (ara l-preparazzjoni tat-tessuti), 4 ul ta 'protease ġew miżjuda mal-buffer tad-diġestjoni (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit għal FFPE, Life Technologies, AM1975) . Il-kampjuni ġew inkubati fi blokki tas-sħana għal 15-il minuta fi 50 gradi, imbagħad 15-il minuta fi 80 grad. Sussegwentement, 0.75 mL ta' Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) u 0.2 mL ta' fenol: Soluzzjoni ta' kloroform (Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol, 1 Phase, VWR International, K169) ġew miżjuda ma' kull kampjun segwit minn tħawwad qawwi għal 5 min f'temperatura tal-kamra (RT). Is-sospensjoni tqiegħdet f'tubi tqal tal-ġel Phase lock (PLG, 5 Prime, 2302830) u mibrumin 'l isfel fi 13,000rpm għal 5 min. Il-fażi akkwatika bl-aċidi nuklejċi ġiet estratta mit-tubi għal tubu Eppendorf frisk b'ammont ugwali ta 'etanol 100 fil-mija. Il-purifikazzjoni tal-RNA twettqet permezz tal-kit Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) għall-purifikazzjoni tal-RNA, skont l-istruzzjoni tal-manifattur. L-RNA ġie eluwit (10 ul, DEPC) u mbagħad maħżun f'-80 grad. SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian (Clontech, 635006) intuża għall-preparazzjoni u l-amplifikazzjoni tal-librerija. Intużaw 3 repliki bijoloġiċi (N=3) għall-preparazzjoni tal-librerija. Il-libreriji ġew ippreparati skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur mingħajr l-ebda pass ta 'frammentazzjoni żejda (FFPE, għażla 2, ara l-manwal), bi tnaqqis ta' cDNA ribosomali u amplifikazzjoni finali tal-PCR (15-il ċiklu). Il-libreriji ġew sekwenzati fuq il-pjattaforma Illumina HiSeq 2000 fiċ-Ċentru BioMicro tal-MIT.

Analiżi RNA-seq — Id-dejta tal-fastq mhux ipproċessata kienet allinjata mar-referenza mm9 tal-ġurdien

genoma bl-użu ta' Bowtie 2.0. Il-qari mapep minn korpi tal-ġeni (inklużi l-qari tal-esons u l-introni) ġew ipproċessati minn Cufflinks 2.260 u DEseq261 b'annotazzjoni tal-ġeni ta 'referenza UCSC mm9 biex jiġu stmati l-abbundenzi tat-traskrizzjoni. L-espressjoni tal-ġeni differenzjali u l-analiżi downstream twettqu bl-użu ta 'skripts DEseq2 u R personalizzati. Abbundanza relattiva ta 'traskrizzjonijiet ġiet imkejla minn frammenti għal kull kilobase ta' exon għal kull miljun framment immappjati (FPKM).

Għall-analiżi ta 'programmi ta' traskrizzjoni, l-espressjoni ta 'kull ġene ġiet ivvalutata għal differentimemorjafażijiet (Attivat - kmieni, Attivat - tard, Riattivat) bil-bidla tagħhom log2 darbiet (log2FC) mill-istat bażali. 1095 ta 'ġeni espressi b'mod differenzjali (DEGs) għaddew mill-kriterji ta' qtugħ, li fihom osservajna mill-inqas f'paragun wieħed tal-valur P ta '< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">

Cistanche jista 'jtejjeb il-memorja

Qbid tal-konformazzjoni tal-kromożomi (Hi-C)

Nuklei minn ċelluli fissi (ara l-preparazzjoni tat-tessuti) ġew magħżula f'tubi Eppendorf ta' 1.5 mL li kien fihom 500 ul frisk tas-silġ lysis buffer (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0.2 fil-mija Igepal CA{{{ 9}}, ilma tal-grad Pi u PCR) u ffriżat fuq silġ niexef u maħżun f'-80c sakemm intużaw. Il-libreriji Hi-C ġew ippreparati minn 100,000 ċellula/kull grupp (miġbura minn żewġ annimali) f'żewġ repliki bijoloġiċi, bl-użu tal-manwal tal-kit Dovetail™ Hi-C (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Is-sitt libreriji Hi-C ġew sekwenzati (paired-end) fuq il-pjattaforma Illumina Nextseq 500. Il-pipeline HOMER Hi-C intuża biex jiffiltra artifatti sperimentali bħal ċirkolarizzazzjoni, self-ligations u duplikati tal-PCR. Qari ffiltrati ġew allinjati mal-ġenoma tal-ġurdien ta 'referenza (mm9) u pproċessati aktar bl-użu ta' pipeline HOMER HI-C.

L-għodod Hi-C ta ​​'HOMER intużaw biex iwettqu analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) fuq id-dejta Hi-C biex jidentifikaw kompartimenti sub-nukleari (A u B) f'riżoluzzjoni ta' 50 Kb (ara s-softwer supplimentari). Għall-analiżi tal-iswiċċ tal-kompartiment, l-ewwel naqqasna l-valuri PC1 bejn il-gruppi. Sussegwentement identifikajna l-ogħla transizzjonijiet BtoA bħala reġjuni b'PC1 jinbidlu 'l fuq mid-90 perċentil u t-tranżizzjonijiet ta' fuq AtoB bħala reġjuni b'PC1 jinbidlu taħt l-10 perċentil. Peress li l-kompartimenti subnukleari huma regolati bħala unitajiet ta 'diversi mijiet ta' kilobases, aħna kkonsolidajna segmenti konsekuttivi ta '50 Kb AtoB jew BtoA li kienu f'distanza ta' 100 Kb minn xulxin. Dominji konsolidati li kienu inqas minn 200 Kb fid-daqs totali li warrabna. Is-swiċċ tal-kompartiment kien ikkunsidrat biss jekk valur negattiv ġie trasformat għal valur pożittiv (u viċi versa). Fl-aħħarnett, valuri pożittivi u negattivi tal-ewwel komponent tqabblu bejn it-tliet popolazzjonijiet kollha ta 'newron (Bażali, Attivat - kmieni u Attivat - tard).

Qbid promotur Hi-C

Segwi l-iffissar u l-issortjar (ara l-preparazzjoni tat-tessuti) iċ-ċelluli ġew magħżula f'tubi Eppendorf ta' 1.5 mL li fihom 500 ul frisk ta' lysis buffer kiesaħ (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0.2 fil-mija Igepal CA{{ {9}}, ilma tal-grad Pi u PCR), iffriżat fuq silġ niexef u maħżun f'-80c sakemm intużaw. Il-libreriji Hi-C ġew ippreparati minn 10,000 ċelluli / kull grupp (N{=3-4), kif deskritt qabel62, b'xi modifika. Il-kampjuni ġew mibrumin 'l isfel (4 gradi, 1,600 g għal 20 min) u l-pellet ġie sospiż mill-ġdid f'400 ul ta' 1.2x Cutsmart buffer (New England Biolabs,

L-ISTATI UNITI). L-ewwel diġestjoni ta 'restrizzjoni saret kif deskritt fil-protokoll oriġinali b'1,500 U ta' HindIII (R3104L, New England Biolabs, USA), bħala l-{3}}cutter bażi (minflok BglII fil-protokoll oriġinali). Wara l-ittikkettar tal-Bijotin u l-ligazzjoni matul il-lejl (ara l-protokoll oriġinali għad-dettalji), il-kampjuni ġew mibrumin 'l isfel (4 gradi, 1,600 × g għal 15-il minuta) u l-pellet ġie sospiż mill-ġdid f'25 ul ta' PBS. Is-sospensjoni ġiet inkubata f'65c bi 3 ul ta' proteinase K għal 12-16h. Il-purifikazzjoni tad-DNA Hi-C saret kif deskritt fil-protokoll oriġinali b'100 ul ta 'żibeġ ta' streptavidin (Dynabeads M-280-streptavidin, Life Technologies, 11205D). Għat-tieni enzima ta 'restrizzjoni, użajna l-4-base cutter Hpych4V (10 U / kull kampjun, R0620S, New England Biolabs, USA). Wara reazzjoni A-tailing (ara l-protokoll oriġinali għad-dettalji), il-kampjuni ġew amplifikati bl-użu ta 'PCR (17-il ċiklu) u ppurifikati bi żibeġ AMPure XP. Il-libreriji Hi-C ġew elużi f'20 ul ta' 10 mM Tris-HCl (pH 8.5). Disinn tas-sistema tal-qbid tal-lixka għal Promoter Capture Hi-C - Lista ta '5000 promotur tal-ġeni tal-ġurdien inkisbet mill-protokoll ippubblikat qabel f'Schoenfelder. Et al.29. Il-lista fiha biss traskrizzjonijiet b'bijotip ta' reġjuni li jikkodifikaw il-proteini, b'siti ta' frammenti ta' restrizzjoni HindIII. Ġew iddisinjati żewġ sondi ta' qbid ta' 120 bp, waħda għal kull tarf tal-framment. Is-sondi ġew sintetizzati minn Agilent Technologies skont is-sistema ta 'arrikkiment fil-mira SureSelect (Agilent Technologies).

Preparazzjoni u sekwenzar tal-librerija Hi-C tal-qbid tal-promotur - Biex taqbad prodotti ta 'ligazzjoni Hi-C li fihom sekwenzi promoturi, użajna l-protokoll ippubblikat qabel29. Fil-qosor, imblokkaturi tal-ibridizzazzjoni (Teknoloġiji Agilent) ġew miżjuda mal-libreriji tad-DNA Hi-C. Il-buffer tal-ibridizzazzjoni u l-RNA tal-lixka tal-qbid ġew ippreparati skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Sussegwentement, l-imblokkaturi tad-DNA/ibridizzazzjoni tal-librerija Hi-C ġew imsaħħna għal 5 min f'95 grad, qabel ma tbaxxiet it-temperatura għal 65 grad. Id-DNA tal-librerija Hi-C tħallat ma' buffer ta' ibridizzazzjoni (imsaħħan minn qabel għal 5 min sa 65 grad), u sussegwentement mas-sistema ta' lixka tal-qbid iddisinjata apposta (imsaħħan minn qabel għal 3 min sa 65 grad), li tikkonsisti minn 10,000 bijotinilati RNAs li jimmiraw it-truf tal-framment ta 'restrizzjoni HindIII ta' promotur tal-ġeni tal-ġrieden 5000 (Teknoloġiji Agilent, ara Materjal Supplimentari għad-disinn tal-lixka tal-qbid). Wara 24 siegħa f'65 grad fil-magna PCR, twettqu pulldown tal-bijotina (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) u ħasliet wara l-protokoll ta 'arrikkiment tal-Mira SureSelect (Teknoloġiji Agilent). Wara l-ħasil finali, żibeġ ġew sospiżi mill-ġdid fi 30 μL NEBuffer 2 mingħajr elużjoni tad-DNA minn qabel, u PCR wara l-qbid (erba’ ċikli ta’ amplifikazzjoni bl-użu ta’ primers universali illumine) saret fuq DNA marbut maż-żibeġ permezz ta’ RNA bijotinilat. Il-libreriji Capture Hi-C kienu sekwenzati f'pari (Nextseq 500, Illumina).

Analiżi Hi-C tal-qbid tal-promotur - il-pipeline HiCUP63 intuża biex jipproċessa l-qari mhux ipproċessat tas-sekwenza fastq. Dan il-pipeline intuża biex immappja l-pari tal-qari kontra l-ġenoma tal-maws (mm9), biex jiffiltra l-artefatti sperimentali (bħal qari ċirkularizzati u re-ligations) u biex jitneħħew qari duplikati. Għad-dejta tal-pc-HiC, il-fajls BAM li rriżultaw ġew kampjunati u pproċessati bl-użu tal-verżjoni CHiCAGO 1.2.064, wara s-settings default biex isejħu interazzjonijiet sinifikanti. Dettalji sħaħ ta 'dan il-pipeline huma disponibbli minn Babraham Bioinformatics

Cistanche jista 'jtejjeb il-memorja

Injezzjoni tal-Virus Stereotaxic Adeno-assoċjat

Il-ġrieden ArcCreERT2 ġew anestetizzati b'avertin u għal infużjoni tal-virus AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (Serotype5, miksub minn UNC viral core). L-ewwel, saret toqba żgħira fil-kranju 'l fuq mill-ippokampus dorsali (relattivament għal Bregma: anterjuri-posterior −2.0 u medjolaterali ± 1.5), siringa Hamilton b'labra ta' 33-gauge ġiet imniżżla għal -1.8 DV u 500 ηl ta 'virus kien infuż b'rata ta' fluss ta '50 ηl kull minuta fiż-żewġ ippocampi. Il-labra ġiet irtirata, wara perjodu ta' 10 minuti wara l-injezzjoni u l-ġrieden tħallew jirkupraw għal 4 ijiem.