Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 1

Il-ħaxix tal-Cistanche għandu effett newroprotettiv tajjeb ħafna

2.6. Effetti Anti-Apoptotic ta' Cytokinins Determinati minn Caspase-3/7 Kejl ta' Attività

Kif muri mill-analiżi tat-tbajja 'PI deskritti hawn fuq, SAL indotta żidiet fir-rati tal-mewt taċ-ċelloli SH-SY5Y. Peress li SAL huwa assoċjat kemm ma 'apoptożi kif ukoll ma' nekrożi [51] aħna investigajna wkoll l-attivazzjoni ta' caspase-3 u 7 (casp-3/7) bħala markatur speċifiku ta 'apoptożi (il-fażi ta' eżekuzzjoni) [52] wara li jesponu ċ-ċelloli għal CKs. L-attivitajiet ta' Caspase-3/7 irreġistrati wara t-trattament b'kull wieħed mill-komposti tat-test ġew normalizzati fir-rigward ta' dawk irreġistrati wara t-trattament b'50{{3{0}} uM SAL (sett bħala 100 fil-mija). Kif muri fil-Figura 4, l-inibitur magħruf tal-caspase Ac-DEVD-CHO (inkluż bħala kontroll speċifiku relatat mal-apoptożi) inibixxi b'mod qawwi l-attività ta' caspase-3/7 f'konċentrazzjonijiet sub-mikromolari (għal 36.3 ± 2.66 u 25.2). ± 2.69 fil-mija tal-livelli fiċ-ċelloli ttrattati b'SAL waħdu f'0.05 u 0.5 uM, rispettivament). Livelli simili ta' inibizzjoni ġew osservati qabel [53] f'mudelli ta' newrodeġenerazzjoni bbażati fuq iċ-ċelluli SH-SY5Y differenti in vitro. Il-kontroll pożittiv NAC naqqas ukoll b'mod sinifikanti l-attività ta' caspase-3/7, għal 88.7 ± 1.87 fil-mija u 78.5 ± 2.56 fil-mija tal-livelli indotti minn SAL f'100 uM u 1000 uM, rispettivament. Is-CKs ittestjati kellhom firxa wiesgħa ta' effetti fuq l-attivitajiet ta' caspase-3/7. Interessanti mir-ribosidi CK, cZR biss kellu effetti sinifikanti fuq l-attivitajiet f'0.1 uM (naqqashom għal 83.3 ± 4.33 fil-mija tal-livelli indotti minn SAL, rispettivament), filwaqt li iPR f'1 uM ma kienx tnaqqis sinifikanti ta' casp-3 ,7. Fl-aħħarnett, K3G naqas l-attività ta 'caspase-3/7 b'effett massimu f'10 uM (għal 81.7 ± 4.31 fil-mija tal-livell indott minn SAL). B'mod ġenerali, SAL indotta żieda ta' 1.6-darbiet fl-attività ta' caspase-3/7 meta mqabbla ma' ċelloli ta' kontroll b'saħħithom (CTR, Figura 4), skont ir-riżultati ta' studju preċedenti, li fih Intużaw konċentrazzjoni SAL (400 uM) u l-istess linja taċ-ċelluli [54]. NAC huwa magħruf li jinfluwenza l-attività tal-caspase-3/7 f'diversi mudelli ta'newronalimewt [55–58]. Madankollu, ir-riżultati ppreżentati hawn jipprovdu l-ewwel turija tal-caspase-3/7 tagħhom f'mudell indott minn SAL ibbażat fuq iċ-ċelluli SH-SY5Y ta'newronalimewt. Il-kontroll pożittiv naqqas l-attività ta' caspase-3/7 indotta minn 500 uM SAL b'mod simili għal CKs, iżda cZR u K3G kienu effettivi anke f'konċentrazzjonijiet sub-mikromolari jew mikromolari. Studji oħra b'mudelli ta' stress assoċjati ma' PD (inibitur tal-proteasome MG 132- jew H2O{2-ikkaġunat tossiċità fiċ-ċelloli SH-SY5Y [17] u fibroblasti [15]) u l-marda ta' Huntington (mudell ta' ġuħ fis-serum f' Ċelloli PC12 [19]) urew ukoll li s-CKs K u tZR jista’ jkollhom attivitajiet anti-apoptotic (caspase-3) [17], u li kemm K kif ukoll tZR jista’ jkollhom attivitajiet anti-senescence [17,19] . Barra minn hekk, assoċjazzjonijiet bejn tnaqqis fil-casp-3,7 attivazzjoni unewroprotettivattività ġew irrappurtati għal mudelli SAL u relatati ma' SAL [54,59,60].

Figura 4. Attività ta' Caspase-3/7 fil-mudell ta' PD indott minn SAL. Triplikati f'mill-inqas erbat ijiem indipendenti. * P meta mqabbla mal-vettura b'500 uM SAL, # P meta mqabbla mal-vettura mingħajr 500 uM SAL.

2.7. Identifikazzjoni tal-Attività Neuroprotettiva taċ-Ċitokinin fil-Mudell taċ-Ċelluli Indotti mill-Glutamate

Peress li ċ-ċelloli SH-SY5Y ma jesprimux is-subunitajiet kollha tar-riċetturi NMDA [61], il-mekkaniżmu l-aktar probabbli tat-tossiċità tal-glutamate (Glu) huwa l-imblukkar taċ-ċistina/glutamate Xc-antiporter b'induzzjoni massiva ta 'stress ossidattiv [62]. Awturi preċedenti diġà wrew assoċjazzjoni bejn il-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-glutamate u n-nekroptosi fiċ-ċelluli SH-SY5Y [63], u l-importanza tal-attivazzjoni tal-caspase-3 fit-tossiċità kkaġunata mill-glutamate lejhom [62,64]. Diversi studji wrew ukoll l-okkorrenza ta 'mewt taċ-ċelluli mmexxija mill-ħadid (ferroptosis) wara intossikazzjoni tal-glutamate [62,65,66], u indikaw l-okkorrenza ta' tliet tipi ta 'mewt taċ-ċelluli (necroptosis, apoptosis, u ferroptosis) wara l-imblokk tal-Xc -sistema antiporter. Sabiex tlesti evalwazzjoni komprensiva tal-newroprotettivpotenzjal tal-ittestjatċitokinini, is-sistema ta 'assaġġ tal-mewt taċ-ċelluli indotta mill-glutamate kienet inkluża f'panel analitiku bil-magħrufnewroprotettiviron chelator deferoxamine (DFO) u inibitur ta' necroptosis necrostatin-1 (NEC-1) [67] bħala kontrolli pożittivi. Hawnhekk, iċ-ċelloli SH-SY5Y ġew differenzjati għal 48 siegħa, imbagħad ittrattati b'160 mM Glu jew f'ko-trattament tagħhom b'diversiċitokininakonċentrazzjonijiet ({{0}}.1–10 uM) għal 24 siegħa u mtebbgħin minn PI. F'dan il-mudell, l-effett ta 'Glu fuq il-mewt taċ-ċelluli kien 100 fil-mija sinjal PI, għalhekk it-tnaqqis fil-mewt taċ-ċelluli mill-komposti tat-test ġie evalwat. Glu indotta kważi żieda ta' 4-darbiet fil-mewt taċ-ċelluli meta mqabbla ma' kontrolli SH-SY5Y b'saħħithom (26.1 ± 0.42 fil-mija). Screening ta’ kontrolli pożittivi uċitokininiżvelat li ż-żewġ kontrolli pożittivi NEC-1 (50 uM,76.6 ± 2.51 fil-mija) u DFO (10 uM, 84.2 ± 4.54 fil-mija) naqqsu l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-glutamate. Kif muri fil-Figura 5A, mill-pannell ta 'ċitokinini, tlieta bissċitokininikienu kapaċi jipproteġunewron-bħal ċelloli SH-SY5Y b'mod simili bħal kontrolli pożittivi. L-aktar attivċitokininikienu trans-zeatin (tZ) (0.1 uM, 79.5 ± 2.91 fil-mija; 1 uM, 81.3 ± 2.77 fil-mija) u cis-zeatin (CZ) (0.1 uM, 82.1 ± 3.29 fil-mija; 1 uM, {{20}}.2 ± 2.89 fil-mija) u kinetin (K) (1 uM, 88.0 ± 3.76 fil-mija; 1{0 uM, 79.9 ± 3.44 fil-mija). Biex tiġi kkonfermata l-attività promettenti tagħhom, intuża assaġġ ortogonali biex jiċċara f'aktar dettall l-effetti bijoloġiċi tas-CKs f'dan il-mudell: A lactate dehydrogenase (LDH)-release assay [68], li wera wkoll drammatika ({36}}darbiet) żieda fit-tossiċità wara trattament Glu. Interessanti, id-determinazzjoni tar-rilaxx tal-LDH ippermettietna niddifferenzjaw bejn l-attivitajiet tas-CKs u l-kontrolli pożittivi (NEC-1 u DFO). Is-CKs kellhom attività protettiva moderata iżda sinifikanti (tZ naqqas ir-rati tal-mewt għal 91.9 ± 1.40 fil-mija f'0.1 uM; cZ naqqashom għal 92.3 ± 1.15 fil-mija f'0.1 uM u 91.7 fil-mija ± 1.56 fil-mija f'1 uM; K naqqashom għal 1 uM; 1.06 fil-mija f'1 uM). Il-kontrolli pożittivi NEC-1 u DFO kellhom effetti protettivi aktar b'saħħithom iżda kienu effettivi f'konċentrazzjonijiet ferm ogħla (inaqqsu r-rati għal 76.9 ± 2.94 fil-mija u 81.6 ± 3.74 fil-mija f'50 u 10 uM, rispettivament) (Figura 5B). L-assaġġ LDH ivvalida l-indikazzjonijiet miksuba bit-tbajja 'PI u l-effetti osservati tal-kontrolli pożittivi kienu konsistenti mad-dejta ppubblikata [69,70]. Is-sejbiet dwar l-effetti ta’ K fil-mudell ta’ mewt taċ-ċelluli indotti minn Glu fiċ-ċelloli HT22 [18] u l-osservazzjonijiet tagħna ta’ effetti ta’ CKs rappreżentattivi bħal tZ, cZ, u K juru li CKs huma kandidati promettenti għat-trattament ta’ mard newrodeġenerattiv assoċjat ma’ stress ossidattiv. 71]. Fl-aħħarnett, tZ u cZ kienu preferuti minħabba li kienu effettivi f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi u ġew magħżula, flimkien ma' K, għal aktar studji tal-effetti tagħhom fuq il-livelli ta' stress ossidattiv u attivazzjoni ta' caspase-3,7.

cistanchereviżjonijietfuq l-effetti tanewroprotezzjoni

2.8. Effetti taċ-Ċitokinini fuq Stress Ossidattiv indott minn Glu fiċ-ċelloli SH-SY5Y

B'differenza mill-mudell preċedenti, Glu jista 'jikkaġuna stress ossidattiv fiċ-ċelloli SH-SY5Y permezz ta' mogħdijiet differenti. Wieħed huwa bbażat fuq l-imblukkar tal-antiporter Cystine/glutamate (Xc-), li jwassal għal tnaqqis tal-glutathione (GSH) u effetti negattivi fuq l-attività tas-superoxide dismutase (SOD) [62]. Il-mewt taċ-ċelluli medjata minn Glu tinvolvi wkoll formazzjoni ta' ROS immexxija minn Rac-NADPH-oxidase (partikolarment superoxide radical) fiċ-ċelloli SH-SY5Y [72]. Dawn is-sejbiet jindikaw li l-kawża primarja tal-mewt taċ-ċelluli fil-mudell indott minn Glu hija OS. Fi ħdan il-mudell,newronċelluli simili ġew ko-trattati ma 'Glu u komposti ttestjati, imtebba minn DHE, u osservati permezz ta' mikroskopija ta 'fluworexxenza. Kif jidher fil-Figura 6A, ġiet osservata żieda drammatika fil-fluworexxenza tad-DHE ħamra f'ċelloli ttrattati bil-Glu, li ġiet imtejba mis-sustanzi ta 'kontroll pożittiv u CKs ittestjati. Ibbażat fuq l-osservazzjoni tal-mikroskopija, il-kwantifikazzjoni tal-livelli ta 'superossidu saret f'ċelloli indotti minn Glu b'mod simili, mill-assaġġ DHE, għal dawk f'ċelloli indotti minn SAL. Ir-riżultati ġew normalizzati fir-rigward tal-livelli indotti minn Glu waħdu (sett bħala 100 fil-mija), li kkawża żieda drammatika, kważi 3-darbiet fil-livelli ta' superossidu fi żmien 4 sigħat biss f'newron-bħal ċelloli SH-SY5Y relattivi għal-livelli f'ċelloli ta 'kontroll b'saħħithom (CTR: 33.79 ± 1.45 fil-mija). Kif muri fil-Figura 6B, CKs bħal tZ, cZ, u K naqqsu b'mod sinifikanti l-livell ta' superossidu fiċ-ċelloli intossikati bil-Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM, u 10 uM K naqqasha għal 81.0 ± 4.03, 80.6 ± 3.89, 81.8 ± 3.39 u 83.8 ± 2.32 fil-mija tal-livelli f'ċelloli ttrattati b'Glu waħdu. Dawn il-livelli huma komparabbli ma 'dawk miksuba bl-inibitur tan-necroptosis NEC-1 (80.5 ± 3.19 fil-mija f'5 uM u 80.4 ± 2.70 fil-mija f'50 uM) u ħadid-chelator DFO (80.2 ± 3.80 fil-mija f'10 uM). Ir-riżultati miksuba bil-mudell ta 'mewt taċ-ċelluli indotti minn Glu, partikolarment l-effetti ta' kontrolli pożittivi, huma konsistenti mar-rapporti preċedenti [70,73]. Evidenza preċedenti li CKs għandhom effetti li jnaqqsu l-OS f'mudelli indotti minn Glu jew simili hija limitata għal dimostrazzjoni li K huwa aġent qawwi li jnaqqas l-OS (b'madwar 23 uM) fil-mudell ta' mewt taċ-ċelluli indotti minn Glu bbażat fuq iċ-ċelluli HT22 [18 ]. Sibna li K kellu effett li jnaqqas l-OS f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi (1-10 uM) fiċ-ċelloli SH-SY5Y tagħna. Barra minn hekk, ġew osservati effetti benefiċjali fit-tul ta 'tZ fuq fibroblasts umani, inkluża attività ta' dekompożizzjoni tal-perossidu tal-idroġenu [15], li jissuġġerixxu li tZ u cZ jista 'jkollhom effetti indiretti li jnaqqsu l-OS f'mudelli ta' mewt taċ-ċelluli indotti minn Glu. Barra minn hekk, rapporti oħra indikaw l-assoċjazzjonijiet bejn l-effett li jnaqqas l-OS medjat minn CKs u l-attività protettiva [22,74-76]. Meħuda flimkien, tZ, cZ, u K wrew effetti sorprendentement qawwija li jnaqqsu l-OS, komparabbli ma’ dawk ta’ kontrolli pożittivi, minkejja saħħiet differenti b’mod ġeneralinewroprotettiveffett.

Figura 5. (A) Rata tal-mewt tanewron-bħal ċelluli SH-SY5Y f'mudell indott minn glutamate (Glu) ta 'mewt taċ-ċelluli; (B) Tossiċità indotta minn Glu (rilaxx ta 'LDH) ta'newron-bħal ċelloli SH-SY5Y. Triplikati f'mill-inqas tlett ijiem indipendenti.* P meta mqabbla mal-vettura b'160 uM Glu, # P meta mqabbla mal-vettura mingħajr 160 uM Glu.

Figura 6. (A) Stress ossidattiv indott mill-Glu (OS) u attività li tnaqqas l-OS ta’ komposti indikati fil-bniedemnewron-bħal ċelluli SH-SY5Y viżwalizzati b'mikroskopija tal-fluworexxenza wara t-tikkettar tad-dihydroethidium (DHE). Bars=50 um. L-istampi jurunewron-bħal ċelluli SH-SY5Y ttrattati b'DMSO (Kontroll), 160 mM glutamate (Glu) waħdu, u flimkien ma': 10 uM deferoxamine (flimkien ma' DFO), 50 uM necrostatin{{6} } ( plus NEC-1), 0.1 uM tZ ( plus tZ) u 0.1uM cZ ( plus cZ) għal 4 sigħat, imbagħad imtebba minn DHE. (B) Formazzjoni radikali superoxide indotta minn Glu finewron-bħal ċelloli SH-SY5Y wara 4 sigħat. Il-graff turi l-kwantifikazzjoni taċ-ċelloli mtebbgħin DHE bl-użu tal-qarrej tal-mikroplate Infinite M200 Pro (Tecan, l-Awstrija). Triplikati f'ħamest ijiem indipendenti.

* P meta mqabbel mal-vettura b'160 uM Glu, # P meta mqabbel mal-vettura mingħajr 160 uM Glu.

2.9. Effetti taċ-Ċitokinini fuq l-Attività ta' Caspase-3/7 fil-Mudell ta' Mewt taċ-Ċelloli Indotti minn Glu

Glu għandu effetti tossiċi simili fuq iċ-ċelloli SH-SY5Y għal effetti rrappurtati qabel fuq iċ-ċelloli HT22 assoċjati ma 'l-imblukkar ta' Xc-antiporter. Għalhekk, mekkaniżmi ta’ mewt taċ-ċelluli mhux apoptotiċi (ferroptożi, nekroptożi, eċċ.) huma involuti fiż-żewġ każijiet [62] għalkemm l-espressjoni ta’ caspase-3 u sa ċertu punt, is-subunità NMDA ta’ NR1 tista’ sseħħ b’mod aktar qawwi f’SH -Ċelloli SY5Y [61]. Għalhekk, l-istadji finali tal-mewt taċ-ċelluli fiż-żewġ linji taċ-ċelluli jistgħu jvarjaw. Rwol kontributorju tal-attività ta' caspase-3 ġie osservat f'ħafna studji fil-mudell ta' mewt taċ-ċelluli kkaġunat minn Glu taċ-ċelloli SH-SY5Y [62,77–79]. F'dan l-assaġġ,newron-Ċelloli SH-SY5Y bħal dawn ġew ittrattati hawn b'160 mM Glu, li jwassal għal elevazzjoni ta 'attività ta' caspase-3/7. Fi sforzi biex jiġi eluċidat ir-rwol tal-apoptożi fil-mewt indotta minn Glu taċ-ċelloli SH-SY5Y, inibitur speċifiku ta' caspase-3/7, Ac-DEVD-CHO, ġie applikat u nstab li kellu effett inibitorju qawwi: F'50. nM naqqas l-attività ta' caspase-3,7 għal 23.70 ± 1.01 fil-mija tal-livell fiċ-ċelloli ttrattati

bi Glu waħdu u bi 0.5 uM imblukkat kważi kompletament l-attività (naqqasha għal livell normalizzat ta' 7.22 ± 1.05 fil-mija biss; komparabbli mal-livell osservat f'ċelloli b'saħħithom:

7.8 ± 0.39 fil-mija), kif muri fil-Figura7. L-applikazzjoni ta' kontrolli pożittivi rriżultat fi tnaqqis gradwali li jiddependi mid-doża fl-attività ta' caspase-3,7. Interessanti, NEC-1 kellu effett żgħir b'effett massimu f'50 uM u DFO kellu attività inibitorja aktar robusta f'10 uM (naqqas l-attività għal 80.5 ± 1.85 u 75.8 ± 3 .00 fil-mija , rispettivament). Min-naħa l-oħra, effetti ħfief iżda sinifikanti biss fuq casp-3,7 inkisbu b'tZ f'1 uM (89.5 ± 2.50 fil-mija), cZ f'0.1 uM (87.4 ± 1.62 fil-mija) u K f'1 uM ( 91.0 ± 2.06 fil-mija). Meħuda flimkien, ir-riżultati juru li ż-żewġ kontrolli pożittivi kellhom attività li tnaqqas l-attività tal-caspase-3/7 aktar b'saħħitha mis-CKs ittestjati, iżda s-CKs kellhom effetti f'konċentrazzjonijiet ħafna aktar baxxi. B'mod ġenerali, ir-riżultati jindikaw li l-modulazzjoni tal-attività ta' caspase-3/7 għandha rwol ewlieni fil-qawwa qawwijanewroprotettivattività ta 'aġenti bħal DFO [58] fil-mudell ta' mewt taċ-ċelluli indott minn Glu [79,80]. Madankollu, kif muri f'din it-taqsima, NEC-1 kellu wkollnewroprotettivattività, li tissuġġerixxi li tipi oħra ta 'mewt taċ-ċelluli jistgħu jkunu involuti fil-mewt indotta minn Glu ta' ċelloli SH-SY5Y simili għan-newroni [63,67,81]. Indikazzjonijiet li mekkaniżmi indipendenti mill-caspase huma involuti fil-mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn Glu nkisbu wkoll f'analiżi tal-effetti ta' NEC-1 [70], DFO [69], u K [18] fuq ċelluli HT22.

Figura 7. Caspase-3/7 attività fil-mudell Glu ta 'ħsara ossidattiva ta'newron-bħal ċelloli SH-SY5Y. Triplikati f'mill-inqas erbat ijiem indipendenti. * P meta mqabbel mal-vettura b'160 uM Glu, # P meta mqabbel mal-vettura mingħajr 160 uM Glu.

3. Konklużjonijiet

Fil-qosor, l-istudju tagħna żvela li CKs u l-metaboliti tagħhom għandhomnewroprotettivattivitajiet fil-mudell indott mis-SAL ta'marda ta' Parkinsonu ħsara ossidattiva indotta mill-Glu f'SH-SY5Y differenzjat mill-bniedemnewronaliċelloli. K3G, cZR, u iPR instabu li kienu bijoloġikament sinifikantinewroprotettivattivitajiet. Barra minn hekk, is-CKs attivi kienu effettivi f'konċentrazzjonijiet aktar baxxi (sub-mikromolari u mikromolari) mis-sustanza ta 'kontroll pożittiv NAC. K3G, cZR, u iPR kellhom ukoll effetti pożittivi fuq il-vijabbiltà, ċitotossiċità, stress ossidattiv, u attività ta' caspase-3,7 (ħlief iPR). Id-dimostrazzjonijiet ortogonali jindikaw bil-qawwa li l-attività ta 'stress anti-ossidattiv għandha rwol ewlieni fl-effetti protettivi tas-CKs fil-mudell ta' mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn SAL. Tliet metaboliti biss fil-pannell ittestjat ta 'CKs (tZ, cZ, u K) protettinewron-bħal ċelloli SH-SY5Y fil-mudell indott minn Glu ta 'ħsara ossidattiva b'mod simili għall-kelatur tal-ħadid NEC1 u l-inibitur tan-necroptosis DFO. Biex nikkonfermaw l-attività promettenti tagħhom, aħna ttestjajna l-effetti tagħhom f'assaġġ tar-rilaxx tal-lactate dehydrogenase (LDH) ortogonali. Is-CKs kellhom attività protettiva moderata iżda sinifikanti. Dan kien aktar dgħajfa mill-attivitajiet korrispondenti tas-sustanzi ta 'kontroll, iżda minkejja d-differenzi fil-modulazzjoni ta'newronalisaħħa, it-tliet CKs ittestjati stimolaw tnaqqis qawwi fil-formazzjoni radikali tas-superossidu, bl-istess mod għas-sustanzi ta 'kontroll pożittiv. Is-CKs kellhom ukoll effetti komparabbli fuq l-istress ossidattiv indott minn Glu fiċ-ċelloli SH-SY5Y għal dawk ta 'NEC1 u DFO, iżda dawn il-komposti kellhom effetti inibitorji aktar b'saħħithom fuq l-attività ta' caspase-3/7 mis-CKs. Billi l-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-Glu ma tiddependix fuq mogħdija dipendenti fuq il-kaspasi, kif muri fi studji tal-effetti tad-DFO u NEC-1 fuq ċelluli HT-22 [70], CKs apparentement jistgħu jimmodulaw iż-żewġ caspase- mewt taċ-ċelluli dipendenti u -indipendenti billi tnaqqas l-istress ossidattiv [18,82]. Fi studji li għadhom għaddejjin, il-mekkaniżmu dettaljat ta’ azzjoni tas-CKs u/jew l-effetti mitokondrijali tagħhom fuqnewronalijew ċelluli astroċiti se jiġu investigati.

cistancheesperjenzaghalPDumemorja

4. Materjali u Metodi

4.1. Kimiċi u Reaġenti

Ċitokininstandards inkisbu minn OlChemIm (Olomouc, ir-Repubblika Ċeka). Calcein AM (soluzzjoni ta '1 mg/mL), u kit ta' rilaxx ta 'LDH, u kit ta' tkabbir ta 'Neurite inxtraw minn ThermoFisher. Propidium iodide, dihydroethidium, komponenti ta 'caspase- 3/7 assay buffer, DMEM/F{12 1:1 medium, serum tal-fetu tal-bovini, tripsina, ATRA, salsolinol hydrobromide, glutamate monosodium melħ, deferoxamine, N-acetylcysteine , Ac-DEVD-CHO, u DMSO għall-kulturi taċ-ċelluli nxtraw minn Sigma Aldrich (Merck). Substrat Ac-DEVD-AMC ġie fornut minn Enzo Life Science.

4.2. ORAC Radical Scavenging Attività Assays

Il-kapaċità tal-komposti li jneħħu r-radikali ħielsa in vitro ġiet iddeterminata mill-assaġġ tal-Kapaċità ta 'Assorbenza Radikali tal-Ossiġenu (ORAC). Fil-qosor, fluorescein (100 uL, 500 mM), u 25 uL tas-soluzzjoni komposta ttestjata ġew miżjuda ma' 96-mikroplate sew inkubat minn qabel f'37oC. Sussegwentement, 25 uL ta '250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. SH-SY5Y Kultura taċ-Ċelloli

Il-linja taċ-ċelluli tan-newroblastoma umana SH-SY5Y mixtrija minn ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) tkabbret fil-Medju ta' l-Ajkla ta' Dulbecco u t-Taħlita ta' Nutrijenti F12 tal-Perżut (DMEM: F-12, 1:1). ), supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (FBS) u 1 fil-mija peniċillina u streptomycin f'37 oC f'atmosfera umidifikata ta' 5 fil-mija CO2. Iċ-ċelloli tgħaddew sa 20 darba u l-midja nbidlu darbtejn jew tliet darbiet fil-ġimgħa. Id-densità taċ-ċelluli ġiet issettjata kif xieraq għall-assaġġ ippjanat (5000, 7000, 10,000, jew 20,000 ċellula għal kull bir) fi 96-pjanċi b'ħafna reċipjenti f'100 uL volumi totali ta' medju għal kull esperiment. L-għada taż-żrigħ, ATRA f'1 fil-mija FBS DMEM/F12 medium ġiet miżjuda maċ-ċelloli għal konċentrazzjoni finali ta '10 uM, u l-inkubazzjoni kompliet għal 48 siegħa oħra biex tinduċi differenzjazzjoni, tippermetti l-formazzjoni ta' neuriti itwal, u tnaqqas proliferazzjoni.

4.4. Mikroskopija

Mikrografi ta'newronĊelloli simili SH-SY5Y nkisbu bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti LED DM IL (Leica Microsystems, Mannheim, il-Ġermanja) b'filtru ta' eċċitazzjoni xieraq għall-assaġġ, jew setup ta' kamp qawwi b'kamera diġitali ta' prestazzjoni għolja DP73 (Olympus, Tokyo, Ġappun ). Peress li l-proporzjon tas-sinjal għall-ħoss għat-tbajja' kien moderat, il-kuntrast ġie aġġustat kemmxejn fis-softwer ImageJ (Fiġi) mingħajr ma affettwa l-osservazzjoni li tirriżulta. Immaġini oriġinali huma inklużi fil-Materjali Supplimentari.

4.5. Tbajja tal-Membrana taċ-Ċellula (kit ta' Neurite Outgrowth, Invitrogen™)

NewronĊelluli SH-SY5Y bħal SH-SY5Y (5000 ċellula għal kull bir) miksuba bil-proċedura ta 'divrenzjar ta' 48 siegħa kienu mtebbgħin b'kit ta 'tkabbir ta' Neurite (Invitrogen™) skond ir-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur b'modifikazzjoni minuri. Iċ-ċelloli ġew maħsula bil-PBS, ittikkettjati b'soluzzjoni taż-żebgħa tal-membrana tat-tbajja' fornuta mal-kit (segwu l-protokoll għal 96 multiwell plates) f'PBS għal 20 min f'37 oC, maħsula mill-ġdid b'PBS, u jarahom taħt mikroskopju tal-fluworexxenza ( b'tul ta' mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta' 533 u 585 nm, rispettivament).

4.6. Trattament taċ-Ċelloli

Wara l-proċedura ta' differenzjazzjoni, il-midja ta' differenzjazzjoni nbidlet għal medja ta' 1 fil-mija DMEM/F12 supplimentata b'komposti tat-test f'konċentrazzjonijiet ta' 0.1, 1, u 10 uM (b'7000 ċelluli għal kull bir għal testijiet ta’ ċitotossiċità), jew flimkien mat-tossina SAL f’500 uM (b’7000–10,000 ċellula kull bir) jew 160 mM Glu (b’20,000 ċellula għal kull bir) għal tul ta’ żmien xieraq għat-tip ta’ analiżi (vijabbiltà, mewt taċ-ċelluli, eċċ.). Iċ-ċelloli ta 'kontroll ġew ittrattati b'mezz li fih .0.1 fil-mija ta' DMSO.

4.7. Il-Vijabilità taċ-Ċelloli u l-Mewt taċ-Ċelloli

Il-vijabbiltà ta'newronĊelluli bħal SH-SY5Y li qed jikbru fi 96-mikroplates sew (b'madwar 7000 ċelluli kull bir) wara 24 siegħa ta' trattamenti ġew evalwati mill-assaġġ Calcein AM b'modifikazzjoni minuri [31]. Is-soluzzjoni Calcein AM fil-PBS użata kellha konċentrazzjoni ta '0.75 uM u l-ħin ta' inkubazzjoni kien issettjat għal 50 min. In-numru ta 'ċelluli ħajjin f'kull bir kien iddeterminat bl-użu ta' qarrej tal-mikroplate Infinite M200 Pro (Tecan, l-Awstrija), b'tul ta 'mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta '495 u 517 nm, rispettivament.

Mewt taċ-ċelluli ta'newron-ċelluli simili (mudell SAL: 10,000 ċelluli għal kull bir; Glu-mudell: 20,000 ċelluli għal kull bir) kien determinat permezz ta 'assaġġ PI kif irrappurtat minn Stone et al. 2003 b'modifikazzjoni żgħira [83]. Fil-qosor, il-medju tal-mudell indott minn SAL ġie aspirat u mibdul għal soluzzjoni 1 ug/mL ta’ PI fil-PBS, iżda ċ-ċelloli soġġetti għal induzzjoni Glu għandhom aderenza aktar dgħajfa u għalhekk ġiet miżjuda soluzzjoni ta’ 1 mg/mL ta’ PI fil-PBS ma’ agħti konċentrazzjoni finali ta' 1 ug/mL. Fiż-żewġ każijiet, iċ-ċelloli ġew inkubati għal 15-25 minuta oħra f'temperatura tal-kamra imbagħad il-fluworexxenza PI ġiet imkejla minn qarrej Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Awstrija) b'535 u 617 wavelengths ta 'eċċitazzjoni u emissjoni, rispettivament. Il-fluworexxenza PI li tirriżulta miksuba bit-tossini waħedhom ġiet stabbilita bħala 100 fil-mija mewt taċ-ċelluli.

4.8. Kejl ta' Stress Ossidattiv bl-assaġġ Dihydroethidium (DHE).

Iċ-ċelloli ġew differenzjati u ttrattati kif deskritt fit-taqsima preċedenti għall-induzzjoni SAL (10,000 ċelluli għal kull bir, 24 siegħa jew induzzjoni Glu (20,000 ċelluli għal kull bir, 4 sigħat). it-trattamenti, iċ-ċelluli ġew ċentrifugati f'500 xg għal 330 s, imbagħad il-midja tal-kultura ġiet sostitwita (wara l-aspirazzjoni) b'soluzzjoni 10 uM DHE f'PBS. 96- pjanċi b'ħafna reċipjenti biċ-ċelloli ġew inkubati fid-dlam għal 30 min fil-kamra temperatura, imbagħad il-fluworexxenza DHE kienet imkejla minn qarrej tal-mikroplate Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, l-Awstrija) b'tul ta' mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta' 500 u 580 nm, rispettivament. Il-fluworexxenza DHE li tirriżulta miksuba b'SAL jew Glu waħedha ġiet issettjata bħala 100 fil-mija ta' radikali superossidu Mikrofotografi ta' fluworexxenza illustrattiv ta' ċelloli mtebbgħin bid-DHE nkisbu wara kejl tad-DHE bil-qarrej tal-mikroplate.

L-impjant ta 'Cistanche għandu effett newroprotettiv tajjeb ħafna

4.9. Kejl ta' Caspase-3/7 Attività

Twettqu analiżi ta' caspase-3/7 f'pass wieħed skont proċedura ppubblikata qabel [84]. Għal kulturi soġġetti għal induzzjoni SAL u induzzjoni Glu, it-taħlitiet ta' reazzjoni (caspase-3,7 buffer u komponenti b'ċelluli fi 96-multiwell plates) ġew inkubati għal sagħtejn u 3 sigħat f'37 oC, rispettivament. L-attività ta' Caspase-3/7 kienet imbagħad imkejla minn qarrej tal-mikroplate Infinite M200 Pro (Tecan, l-Awstrija) b'tul ta' mewġ ta' eċitazzjoni u emissjoni ta' 346 u 438 nm, rispettivament.

4.10. Analiżi Statistika

L-esperimenti saru fi tliet kopji u ġew ripetuti fi tlieta sa ħames (n {{0}}-5) ijiem indipendenti. Id-dejta kollha hija espressa bħala medja ± SEM. Il-valuri għall-varjabbli kollha mkejla huma espressi bħala mezzi ± SEM, li ġew ikkalkulati bl-użu ta' Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), li ntuża wkoll biex jiġġenera l-figuri. L-analiżi statistika twettqet mill-pakkett tas-softwer PAST (ver. 1.97) [85]. Għall-esperiment tad-divrenzjar, intuża t-test Student. Il-bqija tal-esperimenti ġew evalwati b'test Kruskal–Wallis mhux parametriku b'test post hoc Mann–Whitney b'korrezzjoni sekwenzjali ta' Bonferroni. Valur ta' p < 0.05="" kien="" ikkunsidrat="">

Materjali Supplimentari: Immaġini oriġinali huma disponibbli onlajn.

Kontribuzzjonijiet tal-Awtur: Il-kontribuzzjonijiet tal-awturi kienu kif ġej: Investigazzjoni, metodoloġija, validazzjoni, analiżi tad-dejta, GG, CWD, u JG; kitba—preparazzjoni ta' abbozz oriġinali GG, CWD, u MS; kurazzjoni tad-dejta, akkwist ta 'finanzjament, superviżjoni, kitba—reviżjoni u editjar, CWD, MS, u PK L-awturi kollha qraw u qablu mal-verżjoni ppubblikata tal-manuskritt.

Finanzjament: Dan ix-xogħol kien appoġġjat finanzjarment parzjalment minn għotjiet mill-Aġenzija tal-Għotjiet Interna tal-Università Palacky f'Olomouc, ir-Repubblika Ċeka (IGA{{0}}PrF_2020_021), l-Aġenzija Ċeka tal-Għotjiet ({{ 2}}S), u l-Fond Ewropew għall-Iżvilupp Reġjonali—Proġett ENOCH (Nru CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) u għotja għall-istudenti mill-Fond ta’ Dotazzjoni ta’ Palacky University.

Dikjarazzjoni tal-Bord ta' Reviżjoni Istituzzjonali: Mhux applikabbli.

Dikjarazzjoni ta' Kunsens Informat: Mhux applikabbli.

Dikjarazzjoni tad-Disponibbiltà tad-Data: Id-dejta tinsab fl-artikolu jew fil-materjal supplimentari.

Rikonoxximenti: L-awturi jirringrazzjaw lil Dita Jordovd, Jana Hrubešovd, u Lucie Koplikovd għall-assistenza teknika eċċellenti. Barra minn hekk, l-awturi jirringrazzjaw lil Sees-editing Ltd., ir-Renju Unit għall-editjar bl-Ingliż tal-manuskritt.

Kunflitti ta' Interess: L-awturi jiddikjaraw l-ebda kunflitt ta' interess.

Disponibbiltà tal-Kampjuni: Kampjuni tal-komposti mhumiex disponibbli mill-awturi.