Parti 1:Verbascoside Jipproteġi ċ-Ċelloli tal-Frexa Kontra ER-Stress
Mar 05, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 u Carla Perego 1,*
Astratt:
Evidenza epidemjoloġika sostanzjali tindika li dieta b'ħafna polifenoli tipproteġi kontra l-iżvilupp tad-dijabete tat-tip 2. Il-phenylethanoid glycosideverbascoside/acteoside, kompost ta 'pjanti polifenoliċi mifruxa, għandu diversi proprjetajiet bijoloġiċi inklużi attivitajiet antiossidanti qawwija, anti-inflammatorji u newroprotettivi. L-għan ta’ din ir-riċerka kien li tittestja l-effetti possibbli ta’verbascosidefuq ċelluli tal-frixa, mira qatt ma ġiet ittestjata qabel. Ġurdien u ċelluli umani ġew inkubati bihomverbascoside(0.8–16 uM) għal sa ħamest ijiem u taħlita ta 'tekniki bijokimiċi u ta' immaġini ġew użati biex jevalwaw is-sopravivenza u l-funzjoni taċ-ċelluli taħt kundizzjonijiet li jinduċu stress normali jew retikulu endoplasmiku (ER). Sibna effett protettiv dipendenti mid-doża taverbascosidekontra l-istress ossidattiv fiċ-ċelloli klonali u umani. Studji mekkanistiċi wrew li l-polifenol jipproteġi -ċelluli kontra disfunzjonijiet medjati mill-istress ER, li jimmodula l-attivazzjoni tal-fergħa tal-proteina kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) tar-rispons tal-proteini mhux mitwija u jippromwovi d-dinamika mitokondrijali. Bħala riżultat, ġew skoperti aktar vijabbiltà, funzjoni mitokondrijali u kontenut ta 'insulina f'dawn iċ-ċelloli. Dawn l-istudji jipprovdu l-evidenza liverbascosideisaħħaħ il-kapaċità taċ-ċelluli - biex ilaħħqu mal-istress ER, kontributur importanti ta 'disfunzjoni taċ-ċelluli u falliment f'kundizzjonijiet dijabetiċi u jappoġġja l-potenzjal terapewtiku ta' verbascoside fid-dijabete.
Kliem ewlieni:
verbascoside; polifenoli; Ċelloli li jipproduċu l-insulina; dijabete; UPR; stress ossidattiv; ER-istress; PERK; kontra l-infjammazzjoni; mitokondrija
1. Introduzzjoni
Id-dijabete hija disturb kroniku li jaffettwa mijiet ta’ miljun ruħ [1]. Etjoloġija differenti tikkaratterizza d-dijabete tat-Tip 1 (T1D) u tat-Tip 2 (T2D) it-tnejn li huma fihom nuqqas ta’ insulina [2]. L-insulina tirregola l-konċentrazzjoni tal-glukożju fil-plażma tistimula l-assorbiment tal-glukożju fiċ-ċelloli tal-muskoli u tax-xaħam u timmodula l-metaboliżmu tal-glukożju tal-fwied. Id-disponibbiltà tan-nutrijenti, l-ormoni u l-inputs newrali jirregolaw is-sekrezzjoni tal-insulina tal-frixa u jżommu l-konċentrazzjonijiet tal-glukożju fid-demm f'medda fiżjoloġika [3-5]. Għalhekk, -disfunzjoni taċ-ċelluli twassal għal dijabete kkaratterizzata minn ipergliċemija sawm.
T2D hija kundizzjoni progressiva li fiha r-reżistenza għall-insulina u l-funzjonament ħażin taċ-ċelluli huma marbuta flimkien u l-evidenza reċenti żdiedet l-interess fir-rwol primarju kritiku taċ-ċelluli għall-istatus ipergliċemiku [6,7]. F'suġġetti obeżi mhux dijabetiċi -ċelluli jikkumpensaw ir-reżistenza għall-insulina b'żieda ta 'sekrezzjoni ta' l-ormon. Madankollu, f'xi suġġetti, hekk kif il-kundizzjonijiet tagħhom jiddeterjoraw, l-insulinemija tonqos u l-livell tal-glukożju jitla' għal ipergliċemija [8,9].
Il-glukożju huwa l-aktar modulatur importanti tal-funzjonijiet taċ-ċelluli. L-istimulazzjoni tal-glukożju taffettwa r-regolamentazzjoni tal-ġeni u l-espressjoni tal-proteini involuti f'ħafna funzjonijiet taċ-ċelluli bħall-glikolisi, is-sintesi u t-tnixxija tal-insulina [10]. Is-sekrezzjoni ta 'l-insulina indotta mill-glukożju tiddependi fuq il-metaboliżmu ossidattiv biex tipproduċi adenosine triphosphate (ATP) u livell baxx ta' speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) huwa prodott fiżjoloġikament. Madankollu, -ċelluli mhumiex mgħammra tajjeb ħafna b'enzimi kennies u din id-dgħufija tagħmilhom suxxettibbli ħafna għall-istress ossidattiv [11,12]. Hekk kif l-istress ossidattiv jitla '-ċelluli l-produzzjoni ta' l-insulina tonqos, u -ċelluli jipproduċu ċitokini li jaqbdu l-ħsara taċ-ċelluli permezz ta 'infjammazzjoni u apoptożi [13]. Interessanti, għalkemm il-massa taċ-ċelluli mnaqqsa kienet preċedentement attribwita għall-mewt taċ-ċelluli, studji reċenti jissuġġerixxu rwol ewlieni ta 'didifferenziazzjoni taċ-ċelluli [14,15]. Deher ċar li diversi stadji jmexxu lejn T2D. L-insulti metaboliċi u ossidattivi jikkawżaw stress tar-retikulu endoplasmiku (ER) li jwassal għal tnaqqis fis-sintesi u s-sekrezzjoni tal-insulina, il-proċessi ta 'infjammazzjoni jsegwu r-rilaxx ta' ċitokini u t-telf taċ-ċelluli jista 'jseħħ permezz ta' apoptożi u dedifferenzi. Dan l-għarfien huwa fundamentali sabiex jiġu żviluppati strateġiji xierqa ta’ trattament, peress li l-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni jistgħu jiġu kkontrobattati, u l-plastiċità taċ-ċelloli tal-frixa tippermetti l-possibbiltà li ċelloli staminali jerġgħu lura għal -ċelluli kif ippruvat fil-ġrieden [16].
Riċentement, il-vulnerabbiltà ta '-ċelluli għall-istress ossidattiv wasslet b'suċċess l-użu ta' antiossidanti tad-dieta biex jipprevjenu d-dijabete [17]. Fost l-aktar ikel antiossidanti interessanti, iż-żejt taż-żebbuġa huwa magħruf għall-proprjetajiet benefiċjali tiegħu mill-Griegi tal-qedem. Iż-żejt taż-żebbuġa fih ammont tajjeb ta 'aċidi grassi mono-insaturati (MUFA) u diversi polifenoli bħal tyrosol, hydroxytyrosol, oleuropein, u verbascoside.
Verbascoside, magħruf ukoll bħala acteoside, huwa phenylethanoid glycoside estratt minn Olea europea, pjanti tal-ispeċi Verbascum, u 23 familja ta 'pjanti oħra [18-20]. Jista' jinkiseb ukoll minn prodotti sekondarji taż-żejt taż-żebbuġa (huwa arrikkit fl-ilma tad-drenaġġ tal-mitħna taż-żebbuġa derivat mill-ipproċessar tal-frott taż-żebbuġa) jew jiġi prodott b'approċċi ta' inġinerija metabolika u bijoloġija sintetika [21].
S'issa ma ġiet irrappurtata l-ebda dejta dwar il-bijodisponibilità ta' verbascoside fil-bnedmin. Studji li saru fuq ġrieden, ċelluli SKBR3 u Caco-2 jissuġġerixxu li jista' jkun fattibbli għal verbascoside mhux metabolizzat li jaqsam il-barriera intestinali, jiċċirkola fil-plażma tad-demm, u jeżerċita effetti antiossidanti [20,22,23]. B'differenza mill-biċċa l-kbira tal-polifenoli tal-pjanti, verbascoside jaġixxi prinċipalment fuq iċ-ċelloli permezz tal-modulazzjoni tat-traskrizzjoni tal-ġeni ta 'varjetà ta' enżimi u fatturi regolatorji, b'effetti antiossidanti u anti-infjammatorji [24-30].
Għalkemm ħafna effetti ta 'benefiċċju ta' verbascoside għas-saħħa tal-bniedem huma magħrufa, m'hemm l-ebda dejta dwar l-effett tiegħu fuq iċ-ċelluli tal-frixa. Peress li l-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni huma fil-bażi tal-patoġenesi T2D, investigajna jekk it-trattament ta’ verbascoside jistax itejjeb il-vijabbiltà taċ-ċelluli u
jiffunzjonaw f'kundizzjonijiet li jinduċu l-istress ER u kkaratterizzajna l-mekkaniżmi molekulari tal-azzjoni tiegħu. Id-dejta tagħna tiżvela li l-verbascoside jipprevjeni l-istress ossidattiv taċ-ċelluli u l-infjammazzjoni li jimmodula l-attivazzjoni tar-rispons tal-proteini mhux mitwija u jippromwovi d-dinamika mitokondrijali, u b’hekk jirriżulta f’vijabbiltà akbar taċ-ċelluli u kontenut ta’ insulina.
2. Materjali u Metodi
2.1. Ċelloli Kultura u Materjali
Ċelloli tc3 tal-ġrieden (ġentilment ipprovduti mill-Prof. Hanahan—Dipartiment tal-Bijokimika u Bijofiżika, Università ta' Kalifornja, San Francisco, CA [31]) ġew ikkultivati f'medja RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, l-Italja) supplimentat b'10 fil-mija (v/v) serum tal-għoġol tal-fetu inattivat bis-sħana (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italja), 1 fil-mija (v/v) penicillin-streptomycin (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, l-Italja) u 1 fil-mija (v/v) L-glutamina (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, l-Italja). Gżejjer umani ta' Langerhans ġew iżolati f'Milan (Niguarda Ca' Granda) minn donaturi ta' multiorgani kadavri skont il-proċedura deskritta minn Ricordi et al. [32]; kienu kkultivati f'medja ta 'kultura RPMI li fiha 5.5 mmol / L glucose, 10 fil-mija serum bovin fetali inattivat bis-sħana, 0.7 mM Glutamine, 50 unità / mL penicillin u 50 ug / mL streptomycin (EuroClone, SpA, Pero MI, Italja). Intużaw erba 'preparazzjonijiet ta' gżejjer differenti, il-purità tal-gżejjer kienet 80 ± 10 fil-mija. L-iżolament tal-gżejjer u l-istudji tal-gżejjer ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-isptar Niguarda Ca' Granda f'Milan (11.12.2009). Iċ-ċelluli tc3 ġew ittrattati b'verbascoside 0.8, 1.6 u 16 uM (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), aċidu cafeic u hydroxytyrosol (rigal tip ta 'Prof. Dell'Agli, Dipartiment tax-Xjenzi Farmakoloġiċi u Bijomolekulari, Università degli Studi di Milano, Milan, l-Italja) f'medja RPMI kompluta għal 5 ijiem, filwaqt li gżejjer umani b'16 uM verbascoside. Ċelloli ttrattati metanol/etanol intużaw bħala kontrolli. Sabiex jinduċi stress ossidattiv, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM f'medja RPMI kompluta għal 20 min qabel l-analiżi, filwaqt li t-trattament b'tunicamycin 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) għal 7 h sar biex jinduċi stress ER.
2.2. Sejbien tal-Vijabilità taċ-Ċelloli permezz tat-Test MTT
Iċ-ċelloli ġew ibbanjati f'96 pjanċi b'ħafna reċipjenti, u ħamest ijiem wara t-trattament ta' verbascoside ġew inkubati b'0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimethyltiazol{{7} }yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) għal 4 sigħat f'atmosfera umidifikata li fiha 5 fil-mija ta' CO2 f'37 oC. Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelluli ġew sospiżi mill-ġdid bil-mod f'100 uL DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, l-Italja) u l-assorbiment f'540 nm instabet b'qarrej tal-mikroplate (Benchmark, qarrej tal-mikroplate, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA) [33]. L-esperimenti saru fi tliet kopji u d-dejta ġiet espressa bħala darbiet żieda fuq il-kampjuni ta 'kontroll.
2.3. Sejbien ta 'Mewt taċ-Ċelloli permezz taċ-Ċitometrija tal-Fluss
Ħames ijiem wara l-inkubazzjoni b'16 uM verbascoside, iċ-ċelluli - inqalgħu b'inkubazzjoni ta '7 min bi trypsin/EDTA, miġbura u ċentrifugati; il-pellet ġie sospiż mill-ġdid b'ġentilezza f'melħ baxx ta' phosphate buer saline. Iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'għadd ta' MuseTM u reaġent tal-vijabbiltà (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) skond il-protokoll tal-manifattur u analizzati permezz ta' ċitometrija tal-fluss. L-esperimenti saru fi tliet kopji u d-dejta ġiet espressa bħala perċentwal ta 'ċelluli mejta fuq it-total.
2.4. Ġenerazzjoni ROS
ROS intraċellulari ġew evalwati b'DCFDA (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), sonda permeabbli tal-membrana li ssir fluworexxenti meta marbuta ma 'ROS [34]. Iċ-ċelloli tc3 ġew mgħobbija minn qabel bi 15 uM DCFDA fi Krebs–Ringer buer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7.4 u 2 mM CaCl2)
supplimentat bi 11 mM glukożju għal siegħa f'37 oC. Il-kontenut ta 'ROS ġie skopert għal 30 min kemm f'kundizzjonijiet bażali kif ukoll ta' stress b'qarrej tal-mikroplate (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, l-Isvizzera). Il-valuri medji u d-devjazzjonijiet standard kienu bbażati fuq tliet esperimenti indipendenti.
2.5. Western Blotting
Iċ-ċelloli tc3 inġabru u ssolubilizzati f'RIPA buer (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7.6, 1 mM EDTA, 1 fil-mija TERGITOLw NP40, 0.5 fil-mija deoxycholate) miżjuda ma 'aprotinin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) u inibituri Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) għal 40 min f'4 oC. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet iddeterminata b'assaġġ Bradford [35] bl-użu ta' Bradford Reagent (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug ta' proteini ġew solvuti b'10 fil-mija SDS-PAGE u ttrasferiti fuq membrani tan-nitrocellulose (Millipore, Burlington). MA, l-Istati Uniti). Antikorpi primarji ġew applikati għal 2 sigħat f'buer imblukkar b'5 fil-mija ħalib mingħajr xaħam jew 5 fil-mija soluzzjonijiet BSA; intużaw l-antikorpi primarji li ġejjin: ġrieden anti- -actin (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), ġurdien anti-acrolein (Abcam, ab48501, Cambridge, UK), ġrieden anti-BIP (rigal tip tal-Prof. Borgese Nica, Istitut tan-Newroxjenza, CNR, Milan, Italja), fenek anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), ġurdien anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), fenek anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), ġurdien anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, USA), fenek anti-phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), fenek anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), nagħaġ anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), fenek anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), fenek anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, USA) u fenek anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, USA). L-antikorpi sekondarji HRP-konjugati (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) intużaw f'dilwizzjoni 1:5000. Proteini ġew skoperti bl-użu tas-sistema ta 'skoperta ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, l-Italja) bl-użu tas-sistema Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, il-Ġermanja) u d-densità tal-banda ġiet kwantifikata permezz tas-softwer Image Studiow Lite (LI). -COR Biosciences, Lincoln, NE, USA) [36]. L-esperimenti saru fi tliet kopji u d-dejta ġiet espressa bħala darbiet żieda fuq il-kampjuni ta 'kontroll.
2.6. Potenzjal tal-Membrana Mitokondrijali
ċelluli tc3 u gżejjer umani ta 'Langerhans ġew inkubati b'100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italja) jew 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde at 3 730 min, Milan, Italy) Srl, Milan, Italy oC; Intensitajiet tal-fluworexxenza ġew skoperti bil-qarrej tal-mikroplate TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em għal MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em għal MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Männedorf Group Ltd., Isvizzera). Iċ-ċelloli ġew inkubati b'500 uM H2O2 għal 20 min u l-intensità tal-fluworexxenza ġiet skoperta kif deskritt qabel. Il-valuri medji u d-devjazzjonijiet standard kienu bbażati fuq tliet esperimenti differenti.
2.7. Morfoloġija u Dinamika mitokondrijali
Iċ-ċelloli tc3 ġew mgħobbija minn qabel b'100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italja) f'11 mM glucose Krebs–Ringer buer f'37 oC għal 30 min. Il-kampjuni ġew pożizzjonati f'kamra tal-immaġini u oqsma każwali ġew immaġini bl-użu tal-filtru rhodan tal-mikroskopju Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Ġermanja). Biex tiġi evalwata l-morfoloġija mitokondrijali, il-parametri li ġejjin ġew analizzati bl-użu tas-softwer tal-analizzatur tal-partiċelli ImageJ: żona (um2), ċirkolarità (4mArea2/Perimeter2) u d-dijametru massimu ta 'Feret (um) [37].
Għal esperimenti ta 'time-lapse, immaġni ta' ċellula waħda twettqet f'qafas 1 kull sekonda għal 30 s taħt kundizzjonijiet ta 'kontroll jew stress ossidattiv. Biex titkejjel id-distanza kumulattiva mitokondrijali (um2), l-immaġini l-ewwel ġew ikkoreġuti għall-ibbliċjar tar-ritratti, imbagħad vidjows ġew analizzati bl-użu ta’ Image-Pro Plus Plug-in eżistenti (traċċar tal-oġġett) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Sa tnax
ċelluli ġew immaġini fi tliet esperimenti indipendenti u d-dejta ġiet ippreżentata bħala valuri medji u devjazzjonijiet standard.
2.8. Sekrezzjoni ta' l-insulina
Gżejjer iżolati tal-bniedem ta' Langerhans ġew miżrugħa fi 96-platt ta' bir f'densità ta' 20 gżejjer għal kull bir u, wara 5 ijiem ta' trattament, il-kontenut u t-tnixxija ta' l-insulina tkejlu f'bażali (glukożju 3.3 mM) u stimulati (glukożju 16.7 mM). ) kundizzjonijiet permezz ta' immunoassay ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, l-Isvezja).
2.9. Analiżi Statistiċi
L-analiżi statistiċi kollha saru bi GraphPad Prism 8.0 fuq repliki bijoloġiċi indipendenti. Il-medji bejn żewġ gruppi ġew evalwati bl-użu tat-test t ta' Student b'żewġ denbu u p-valur < 0.05="" ittieħed="" bħala="" evidenza="" ta'="" sinifikat="" statistiku.="" il-medji="" fost="" tliet="" gruppi="" jew="" aktar="" tqabblu="" b'analiżi="" tal-varjanza="" (anova),="" segwita="" minn="" test="" ta'="" tqabbil="" multiplu="" post-hoc="" (tukey's).="" it-test="" statistiku="" użat,="" il-valuri="" p="" eżatti="" u="" n-numru="" ta'="" replika="" (n)="" huma="" indikati="" fil-leġġendi="" tal-figuri="" individwali.="" il-vireg="" tal-iżbalji="" fil-figuri="" juru="" l-medja="" ±="" sd="" jew="" il-medja="" ±="" se,="" kif="">
3. Riżultati
3.1. Verbascoside Ittejjeb il-Vijabilità taċ-Ċelloli
Peress li ma kien hemm l-ebda dejta dwar l-effett verbascoside fuq -ċelluli, għamilna test MTT biex nevalwaw il-vijabbiltà taċ-ċelluli u kif muri fil-Figura 1A, ġiet osservata tendenza pożittiva dipendenti fuq id-doża. Għalhekk, għal aktar studji, għażilna l-konċentrazzjoni ta' 16 uM li statistikament kienet ippruvata effettiva biex ittejjeb il-vijabbiltà taċ-ċelluli. Permezz ta' ċitometrija tal-fluss studjajna l-impatt ta' ħamest ijiem inkubazzjoni ta' verbascoside fuq is-sopravivenza taċ-ċelluli f'kundizzjonijiet bażali u wara 2{{21} } min ta' trattament minn qabel b'500 uM H2O2. Fil-kundizzjoni bażali, verbascoside ma affettwax is-sopravivenza taċ-ċelluli, li jissuġġerixxi li ż-żieda fil-vijabbiltà taċ-ċelluli osservata fl-assaġġ MTT tista' tkun dovuta għal attività mitokondrijali mtejba. Billi, wara l-espożizzjoni ta 'H2O2, trattament minn qabel ta' verbascoside 16 uM naqqas b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-istress ossidattiv (Figura 1B, C). Biex jiġi ttestjat jekk il-metaboliti tal-verbascoside setgħux ikunu responsabbli għall-effett protettiv osservat, iċ-ċelluli tc3 ġew ittrattati b'hydroxytyrosol u aċidi kafejiċi (0.8 u 16 uM) għal 5 ijiem. Iż-żewġ metaboliti ma saħħewx il-vijabbiltà taċ-ċelluli, għall-kuntrarju effett ċitotossiku, aktar rilevanti wara espożizzjoni H2O2, ġie skopert għall-konċentrazzjoni ta '16 uM (Figura S1). Din is-sejba turi li verbascoside u mhux il-metaboliti tiegħu jeżerċitaw l-effett protettiv għat-trattament H2O2.
3.2. Verbascoside Jimmodula l-Omeostażi Redox u Jeżerċita Effett Anti-Infjammatorju fiċ-Ċelloli
L-ewwel ikkonfermajna fiċ-ċelloli tc3 l-effetti anti-infjammatorji u anti-ossidanti ta' verbascoside osservati f'tipi oħra ta' ċelluli [24,29,34]. L-attività ta' tneħħija ta' verbascoside ROS ġiet evalwata b'ċelluli tc3 ttikkettjati bis-sonda permeabbli ċellulari DCFDA speċifika għal ROS (2/,7/-dichlorofuorescein diacetate). Kif muri fil-Figura 2A, ġie skopert tnaqqis sinifikanti tal-kontenut ta 'ROS wara trattament minn qabel ta' verbascoside, kemm taħt kundizzjonijiet ta 'stress bażali kif ukoll ossidattiv.
L-analiżi tal-Western blot wrew tnaqqis sinifikanti tal-markers tal-istress ossidattiv tal-acrolein u tal-espressjoni ta' 4-hydroxynonenal (HNE) f'ċelluli trattati b'verbascoside. Barra minn hekk, sibna żieda ta 'espressjoni ta' superoxide dismutase (SOD1), li tissuġġerixxi li verbascoside jeżerċita l-attività antiossidant tiegħu probabbilment b'żewġ mekkaniżmi differenti, direttament bħala kennies ROS u indirettament billi jinduċi l-espressjoni ta 'enzimi antiossidanti (Figura 2B, C).
L-effett anti-infjammatorju ta 'verbascoside fuq -ċelluli ġie vvalutat billi tiġi evalwata l-attivazzjoni tal-mogħdija NFKB, l-aktar mogħdija pro-infjammatorja importanti f'dawn iċ-ċelloli [38]. Permezz ta’ analiżi tal-western blot sibna espressjoni mnaqqsa ta’ inibitur ta’ fattur nukleari kappa B (IKB) u fattur nukleari kappa-light-chain-enhancer (NFKB), u tnaqqis sinifikanti ta’ fosforilazzjoni ta’ NFKB f’ċelloli ttrattati minn qabel, li jsostnu l-ipoteżi ta’ l-effettività tal-verbascoside biex titnaqqas l-infjammazzjoni ċellulari (Figura 2D, E).
3.3. Verbascoside jimmodula r-rispons tal-proteini mhux mitwija ta '-Ċelloli
Imbagħad analizzajna fil-fond il-mekkaniżmu molekulari li bih il-verbascoside jeżerċita rwoli antiossidanti u anti-infjammatorji, filwaqt li niffukaw fuq ir-retikulu endoplasmiku li qed joħroġ bħala sensor ewlieni ta 'sinjali metaboliċi u ta' stress fiċ-ċelloli. Taħt kundizzjonijiet ta 'stress, l-organelle munta rispons omeostatiku, magħruf bħala r-rispons tal-proteini mhux mitwija (UPR), immirat li jirkupra l-funzjoni ER; madankollu, l-attivazzjoni eċċessiva ta 'din il-mogħdija tirriżulta f'apoptożi [39,40].
Markers ta 'żieda fl-istress ER huma l-upregulation tal-proteini chaperones u l-attivazzjoni tar-rispons UPR. Analiżi Western blotting ta 'ċelluli ttrattati b'verbascoside żvelat livelli mnaqqsa taż-żewġ chaperonins proteina ta' xokk tas-sħana 70 (HSP70) u proteina ta 'immunoglobulina li torbot (BIP) (Figura 3A, B). Barra minn hekk, ġew skoperti tnaqqis sinifikanti tal-espressjoni ER kinase (PERK) bħal proteina kinase RNA u tnaqqis fil-fosforilazzjoni tal-efector downstream tiegħu, il-fattur 2 tal-bidu tat-traduzzjoni ewkarjotika (eIF2).
