Parti 1 Effetti Preventivi Ta' Phenylethanol Glycosides Minn Cistanche Tubulosa Fuq Fibrożi Epatika Indotta mill-Albumina tas-Serum Bovini fil-Firien

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Astratt

Sfond:Cistanche tubulosa hija mediċina tal-ħxejjex tradizzjonali Ċiniża li tintuża ħafna biex tirregola l-immunità.Phenyl ethanol glycosides minn cistanche(CPhGs) minn dan l-impjant huma l-materjali primarjament effikaċi. L-għan ta 'dan l-istudju kien li jevalwa l-effetti preventivi u terapewtiċi ta' CPhGs fuq fibrożi epatika indotta minn BSA fil-firien u mekkaniżmi molekulari relatati li jinvolvu ċelloli stellati epatiċi. Biejiarangan (BJRG), mediċina veġetali tradizzjonali Ċiniża oħra, intużat bħala kontroll pożittiv. Metodi: F'esperimenti in vivo, 75 firien SD ġew maqsuma b'mod każwali f'6 gruppi: normali (trattat bl-ilma distillat), mudell (trattat b'BSA), mediċina pożittiva (trattat b'BSA flimkien ma' BJRG 60{{29} } mg/kg/kuljum), u gruppi trattati b'BSA flimkien ma' CPhGs (125, 250, u 500 mg/kg/kuljum). L-indiċi tal-fwied u tal-milsa, il-livelli tas-serum ta’ aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), hexadecenoic acid (HA), laminin (LN), tip III procollagen (PCIII), tip IV collagen (IV-C), hydroxyproline ( Hyp), u l-fattur tat-tkabbir tat-trasformazzjoni 1 (TGF- 1) ġew imkejla fil-fwied tal-firien. Il-gradi istopatoloġiċi għall-fibrożi tal-fwied ġew ivvalutati għal kull grupp bl-użu tat-tbajja’ trikromju ta’ H&E u Masson. L-espressjoni ta 'TGF- 1, collagen I (Col-I), u collagen III (Col-III) ġew determinati b'metodu ta' tbajja immunoistokimiku. Dawn l-effetti ġew evalwati aktar in vitro billi ddeterminaw il-livelli ta 'espressjoni ta' NF-κB p65 u Col-I b'analiżi PCR kwantitattiva f'ħin reali. L-espressjoni tal-proteina Col-I ġiet eżaminata wkoll permezz ta 'western blotting. Riżultati: Il-gruppi kollha tad-doża (125, 250, u 500 mg/kg/jum) ta’ CPhGs naqqsu b’mod sinifikanti l-indiċi tal-fwied u tal-milsa, naqsu l-livelli ta’ ALT, AST, HA, LN, PCIII, IV-C fis-serum, Kontenut TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01,="" u="" p="">< 0.01),="" u="" kontenut="" hyp.="" cphgs="" ukoll="" itaffu="" b'mod="" notevoli="" n-nefħa="" taċ-ċelluli="" tal-fwied="" u="" effettivament="" ipprevjenu="" nekrożi="" tal-epatoċiti="" u="" infiltrazzjoni="" taċ-ċelluli="" infjammatorji.="" riżultati="" immunoistokimiċi="" wrew="" li="" cphgs="" naqqsu="" b'mod="" sinifikanti="" l-espressjoni="" ta="" 'tgf="" -="" 1="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.01,="" u="" p="">< 0.01),="" col-="" i,="" u="" col-iii.="" l-effetti="" in="" vitro="" ta="" 'cphgs="" (100,="" 75,="" 50,="" u="" 25="" ug/ml)="" fuq="" hsc-t6="" urew="" li="" cphgs="" naqqsu="" b'mod="" sinifikanti="" l-espressjoni="" tal-mrna="" ta'="" nf-κb="" p65="" u="" col-i,="" u="" cphgs="" irregolaw="" ukoll="" l-espressjoni="" tal-proteina="" col-i.="" konklużjonijiet:="" cphgs="" għandhom="" effett="" sinifikanti="" kontra="" l-fibrożi="" tal-fwied,="" u="" jistgħu="" jintużaw="" bħala="" aġenti="" epatoprotettivi="" għat-trattament="" tal-fibrożi="">

Kliem ewlieni: Fibrożi epatika, Cistanche tubulosa, Phenylethanol glycoside, Chemokine BSA, Prevenzjoni u terapija.

Sfond

Il-fibrożi tal-fwied hija rispons għall-fejqan tal-feriti għal ħsara severa fil-fwied li sseħħ fil-patoġenesi tal-epatite kronika indotta minn diversi fatturi. Dawn il-fatturi huma infezzjoni virali, abbuż mill-alkoħol, kolestasi, u mard metaboliku u awtoimmuni [1-3]. Akkumulazzjoni progressiva ta 'matriċi extraċellulari (ECM) u tnaqqis ta' remodeling ifixklu l-arkitettura normali tal-fwied, li jirriżultaw f'fibrożi epatika [4]. Il-fibrożi epatika hija kritika f'mard kroniku tal-fwied u ħafna drabi tiżviluppa f'ċirrożi irriversibbli u karċinoġenesi. Fil-preżent, m'hemm l-ebda metodi jew mediċini effettivi għat-trattament tal-fibrożi epatika. Għalhekk, huwa urġenti li tinstab mediċina kontra l-fibrożi tal-fwied li ttaffi l-progressjoni tal-ħsara fil-fwied għal fibrożi u kanċer.Cistanche tubulosaW (tal-familja Orobanchaceae) hija pjanta parassitika li titkabbar ħafna fir-reġjun tan-Nofsinhar ta 'Xinjiang fiċ-Ċina [5]. In-nies normalment jużawha biex isaħħu l-kliewi, irawmu d-demm, jirrilassaw il-musrana, u jdewmu s-senescence. Huwa elenkat uffiċjalment fil-Farmakopea Ċiniża [6]. C. tubulosa fih varjetà ta 'komponenti attivi. Dawn jinkluduPhenyl ethanol glycosides minn cistanche(CPhGs), iridojdi, u polisakkaridi. Bħala wieħed mill-ħafna komponenti attivi fiC. tubulosa, CPhGs urew effetti antiossidanti konvinċenti, kontra l-għeja, newroprotettivi u anti-infjammatorji kemm fi studji in vivo kif ukoll in vitro [7]. F'dawn l-aħħar snin, ġie rrappurtat li CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche) għandhom effetti epatoprotettivi. Mekkaniżmi potenzjali sottostanti dawn l-effetti huma t-tneħħija ta 'radikali ħielsa, protezzjoni ta' membrani epatiċi, immunoregolazzjoni, inibizzjoni ta 'apoptosis, inibizzjoni tal-espressjoni ta' HBsAg u HBeAg, u inibizzjoni ta 'replikazzjoni tad-DNA HBV u oħrajn [8-11]. Madankollu, ftit studji fil-letteratura jindirizzaw l-effett tal-fibrożi kontra l-fwied tal-grafika. Għalhekk, dan l-istudju kellu l-għan li jinvestiga l-effett tal-fibrożi kontra l-fwied ta 'GPhCs billi juża mudell ta' fibrożi epatika indotta ta 'albumina tas-serum bovin (BSA) fil-firien. Mekkaniżmi molekulari relatati ġew investigati fiċ-ċelloli HSC-T6.

Metodi

Kimiċi u reaġenti

Kit Hydroxyproline (idrolisi alkalina) (Lott: 20140616) inxtara minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Ċina). Rat TGF- 1 sandwich ELISA kits (Lot: 238240615) inxtraw minn Lianke Biotech Co., Ltd. (Ċina). Antikorp tal-Fenek Anti-Collagen I (Lott: 140619), Antikorp tal-Fenek Anti-Collagen III (Lott: 980788 W), u Antikorp tal-Fenek Anti-TGF- 1 (Lott: 140619) ġie pprovdut minn Beijing Biosynthesis Biotechnology Co., LTD (Ċina). Magħluq b'serum normali tan-nagħaġ (fluwidu tax-xogħol) (Lott: WP141214), PV-6000 (Lott: WK141225), u kit DAB (Lott: K136621D) inxtraw minn Zhongshan Golden Bridge Biotech Co., Ltd. (Ċina) . L-iskoperta ta 'antikorpi primarji twettqet bl-użu ta' 2. Soluzzjoni ta 'antikorpi (Alk-Phos. Konjugat, Anti-fenek) u 2. Soluzzjoni ta' antikorpi (Alk-Phos. Konjugat, Anti-ġurdien) (lott: 272387) mixtrija minn Invitrogen Company (USA) ). L-albumina tas-serum bovin (BSA) (Lott: SLBG8239V) inxtrat minn Sigma (USA). Qabel l-użu, il-BSA tħejja fi 18 g/L f'salina normali, il-batterja tneħħiet permezz ta 'filtrazzjoni, u BSA ġiet maħżuna f'4 gradi. L-adjuvant mhux komplut ta 'Freund li fih 1 g ta' lipid minn xagħar tan-nagħaġ (Lott: AF0220LA14, Shanghai wan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Ċina,) kien imħallat ma '2 g paraffin likwida (Lott: 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd (Ċina,), sterilizzat f'awtoklavi tal-fwar, u maħżun fi gradi 4. Il-mediċina pożittiva BJRG inkisbet bħala pilloli Biejiarangan minn Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Ċina). Ħażniet tad-droga BJRG ġew ippreparati billi tħoll Pilloli BJRG f'ilma distillat f'konċentrazzjoni ta '600 mg/kg.

Materjali tal-pjanti

C. tubulosa(familja Orobanchaceae) inxtara mir-reġjun ta 'Minfeng ta' Xinjiang taċ-Ċina. Il-materjal ġie awtentikat mir-riċerkatur Jun Zhao, Laboratorju Ewlenin għall-Mediċina Uighur, Istitut ta 'Materia Medica ta' Xinjiang. Kampjuni ta 'vawċers ġew depożitati fl-Istitut tal-Materia Medica ta' Xinjiang.

Preparazzjoni ta 'CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche)

Riżomi imnixxfin u mqatta'C. tubulosa(6.0 kg) ġew estratti konsekuttivament taħt rifluss tliet darbiet b'70 fil-mija etanol, u s-solvent tneħħa biex jagħti l-estratt tal-etanol. L-estratti tal-etanol ġew ippurifikati bl-użu tar-reżina AB-8 biex jinkisbu l-phenyl ethanol glycosides (CPhGs). Soluzzjonijiet ta 'ħażna ta' CPhGs użati għal gruppi ta 'doża differenti fi studji fuq l-annimali (500 mg / kg, 250 mg / kg, u 125 mg / kg, rispettivament) ġew maħlula f'0.5 fil-mija (5 g / L) carboxymethyl cellulose (melħ tas-sodju).

Kwantifikazzjoni ta 'CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche)

Il-kontenut ta' żewġ komponenti (echinacoside u acteoside) fis-CPhGs ġew determinati mill-HPLC bl-użu ta' metodu rrappurtat qabel (Zhang et al. 2004) [12]. L-HPLC twettqet bl-użu ta' Shimadzu LC-10A HPLC mgħammar b'ditekter UV. Il-kolonna HPLC kienet kolonna Phenomenex Gemini ODS (250 × 4.6 mm, 5 μm). Il-fażi mobbli iżokratika kienet tikkonsisti f'metanol-acetonitrile-1 fil-mija aċidu aċetiku (15:10:75, v/v/v). L-eluzzjoni kienet għal 40 min u r-rata tal-fluss inżammet f'0.6 mL/min. It-temperatura tal-kolonna nżammet kostanti fi 30 grad. L-iskoperta tal-UV kienet f'334 nm.

Annimali u linja taċ-ċelluli HSC-T6

[Grad SPF] firien irġiel adulti b'saħħithom Sprague–Dawley (SD) (180–220 g) inxtraw minn Xinjiang Medical University Animal Center, Liċenzja Nru: SCXK (Ġdid) 2011–0004. Il-firien ġew mitmugħa chow mingħajr patoġenu speċifiku (SPF). Il-proċeduri kollha relatati mal-esperimenti fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Ewwel Sptar Affiljat tal-Università Medika ta 'Xinjiang. Il-firien kienu miżmuma f'gaġeġ taħt kundizzjonijiet ambjentali kkontrollati (25 grad u ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12-il siegħa) u kellhom aċċess liberu għal ikel standard tal-gerbubi tal-firien u ilma tal-vit. Il-firien ġew akklimatizzati qabel it-trattament. Linja taċ-ċelluli stellate tal-fwied immortalizzata tal-far, HSC-T6, inkisbet minn Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, iċ-Ċina). Iċ-ċelluli HSC-T6 ġew ikkultivati ​​f'Dulbecco's Modified Eagle's Medium (High Glucose) (DMEM, Beijing, China) supplimentat b'10 fil-mija serum bovin tal-fetu (Gibco, Amerika t'Isfel), 100 IU/ml peniċillina, u 100 ug/ml streptomycin (Beijing). , iċ-Ċina) f'inkubatur umidifikat f'37 grad b'5 fil-mija CO2.

Korriment u trattamenti tal-fwied ikkaġunati mill-BSA

Ħamsa u sebgħin firien SD kienu mqassma b’mod każwali f’sitt gruppi: Normali (trattati bl-ilma distillat), mudell (trattati b’BSA), mediċina pożittiva (trattati b’BSA flimkien ma’ BJRG 600 mg/kg/jum), u ttrattati b’BSA flimkien ma’ CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche)(125, 250, 5{{20}}0 mg/kg/jum) gruppi. Gruppi ttrattati b'BSA flimkien ma' CPhGs (125, 250, 500 mg/ kg/jum) kellhom 13-il firien f'kull grupp, u l-grupp l-ieħor kellu 12-il firien f'kull grupp. Il-mudell ta 'korriment tal-fwied ikkawżat mill-BSA huwa maqsum f'sensitizzazzjoni primarja segwita minn attakk immunoloġiku) [13]. Ħlief għall-grupp normali, il-gruppi l-oħra ngħataw injezzjonijiet taħt il-ġilda multipli b'0.5 ml (9 mg/ml) BSA Freund's adjuvant mhux komplut fil-jum 1, jum 15, jum 22, jum 29, u jum 36 għal sensitizzazzjoni primarja. Sebat ijiem wara l-ħames injezzjoni, inkiseb demm mill-plexus tal-vini tar-retina tal-firien u ġie ttestjat għall-anti-korpi tal-albumina tas-serum. Antikorp BSA fis-serum tal-firien ġie skopert b'metodu ta 'diffużjoni ta' agar doppju. L-injezzjoni attakk saret bl-amministrazzjoni ta '0.4 ml ta' BSA fis-salina normali kien permezz tal-vina kawdali fil-firien BSA pożittivi għall-antikorpi darbtejn fil-ġimgħa għal għaxar darbiet. Il-konċentrazzjonijiet u l-ħinijiet tal-injezzjonijiet kienu 5.00, 5.50, 6.00, 6.50, 7.00, 7.50, 8.50, 9.00, 9.50 u 10.00 g/L f'jum 46, jum 50, jum 53, jum 57, jum 60, jum 64, jum 67, jum 71, jum 74 u jum 78, rispettivament. Fil-grupp normali, salina normali ntużat għal injezzjonijiet immunoloġiċi primarji (sensibilizzazzjoni) u sekondarji (attakk) minflok BSA, u kundizzjonijiet oħra kienu l-istess bħal dawk fil-grupp mudell. Il-grupp normali ngħata bil-fomm ilma distillat b'doża ta '10 ml/kg/jum. Il-grupp mudell ġie amministrat oralment 10 ml/kg/jum 0.5 fil-mija soluzzjoni CMC-Na. Il-grupp pożittiv tad-droga ngħata mill-ħalq 600 mg/kg/jum BJRG. Is-CPhGs trattati b'BSA flimkien (125,

250, u 500 mg/kg/kuljum) gruppi ngħataw mill-ħalq 125, 250, u 500 mg/kg/jum CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche), rispettivament. Il-firien ta' dożaġġ ta' kuljum komplew għal ġimagħtejn wara l-aħħar injezzjoni. Wara l-perjodu sperimentali, il-firien kienu sajmu għal 12-il siegħa qabel 10 fil-mija chloral hydrate u mbagħad immedjatament ewtanizzati. Inġabru kampjuni tas-serum minn kull far u ntużaw immedjatament. Il-fwied inħasdu għal żewġ skopijiet: (1) preservazzjoni fin-nitroġenu likwidu għal kits Hyp u (2) iffissar f'10 fil-mija formaldehyde għal eżamijiet istoloġiċi u immunoistokimiċi. It-tul kollu tal-istudji fuq l-annimali kien ta' 93 jum.

Indiċi tal-fwied u tal-milsa

Il-fwied u l-milsa ġew dissected b'laparotomija u maħsula b'salini normali ta '4 gradi. Wara li assorbi l-ilma żejjed b'karta tal-filtru, il-fwied u l-milsa ġew miżuna biex jiġu kkalkulati l-indiċi korrispondenti: Piż relattiv tal-organu=massa tal-organi (g)/massa tal-ġisem individwali (g) × 100 fil-mija [14].

Esperimenti taċ-ċelluli

Iċ-ċelluli HSC-T6 ġew ibbanjati fi 96-pjanċa tal-bir. Inizjalment, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​b'DMEM li kien fih 10 fil-mija FBS għal 48 siegħa. Il-medju mbagħad ġie sostitwit b'DMEM mingħajr FBS biex iċ-ċelluli jitneħħew bil-ġuħ għal 12-il siegħa. Iċ-ċelloli mbagħad ġew ikkultivati ​​b'DMEM li kien fih 5.0 ng/mL TGF - 1 (mingħajr FBS) għal 24 siegħa. Fl-aħħarnett, konċentrazzjonijiet differenti ta 'CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche)(100ug/ml, 50ug/ml, u 25ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, u 1.5 ug/ml), u echinacoside (500ug/ml, 250ug/ml, u 125ug/ml) twettqu fil-pjanċa fi bjar kwadruplikati u inkubati għal 48 siegħa.

Analiżi PCR f'ħin reali

Il-livell ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'NF-κB, p65, u kollaġen I kien determinat minn PCR f'ħin reali. Biex tiddetermina l-espressjonijiet tal-mRNA fiċ-ċelloli HSC-T6, iċ-ċelloli (4 × 105 ċelluli) ġew miżrugħa fi pjanċi ta 'sitt bir bi 3 mL DMEM b'10 fil-mija FBS u inkubati matul il-lejl f'37 grad u 5 fil-mija CO2, wara li l-midja tal-kultura taċ-ċelluli ġew mibdula għal DMEM mingħajr serum. Sussegwentement, CPhGs(Phenyl ethanol glycosides minn cistanche)(100 ug/ml, 50 ug/ml, u 25 ug/ml), acteoside (6 ug/ml, 3 ug/ml, u 1.5 ug/ml), u echinacoside (500 ug/ml) , 250 ug/ml, u 125 ug/ml) ġew miżjuda mal-bjar. Wara 48 siegħa ta 'inkubazzjoni b'CPhGs jew kompożizzjonijiet monomeriċi, RNA totali ġie estratt bl-użu ta' reaġent TRIzol (Invitrogen, USA) u aġitat b'mod vigoruż bil-kloroform għal 15 s. Wara li qagħad f'temperatura tal-kamra għal 3 min, il-lisat ġie ċentrifugat fi 12,000 × g għal 15 min f'4 gradi. L-RNA fil-fażi milwiema ġie preċipitat bl-isopropanol, u l-fażi milwiema ta 'fuq ġiet trasferita għal tubu mikroċentrifugu ġdid. RNA kien preċipitat billi żżid 0.75 fil-mija etanol, wara li t-tubu mikroċentrifuga u ċentrifugati fi 12,000 × g f'4 gradi għal mhux aktar minn 5 min. Is-supernatant tneħħa u l-RNA ġie mnixxef f'temperatura tal-kamra għal 5-10 min. Settijiet speċifiċi ta' primers (Sangon, Shanghai, iċ-Ċina) li ntużaw għall-amplifikazzjoni tal-far -actin [GenBank: NM_031144.3], Collagen I [GenBank: NM_ 053304.1], u NF -κB p65 [GenBank: NM_199267.2] ġeni ġew iddisinjati bl-użu tal-Lott Primer 3. Il-primers forward (fw) u reverse (rv) kienu kif ġej: Collagen I (fw: GGA GAG AGC ATG ACC GAT GG , rv: GGG ACT TCT TGA GGT TGC CA), NF-κB p65 (fw: CAT ACG CTG ACC CTA GCC TG, rv: TTT CTT CAA TCC GGT GGC GA), -actin (fw: TAA GGC CAA CCG TGA AAA GAT) G, rv: AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Ir-riżultati ġew normalizzati għall-mRNA tal-ġene housekeeping -actin bħala kontroll intern u huma ppreżentati bħala livelli relattivi tal-mRNA. Ir-reazzjonijiet saru bi 8 μL iQ SYBR Green Supermix, 1 μL 10 pM primer par, 8.5 μL ilma distillat, u 2.5 μL cDNA. Kull reazzjoni katina tal-polimerażi twettqet taħt il-kundizzjonijiet li ġejjin: 95 grad għal 3 min, imbagħad 40 ċiklu ta '10 s f'95 grad, 30 s f'55 grad, u 10 s f'55 grad - 95 grad għall-estensjoni, segwiti minn kejl ta' fluworexxenza waħda . Ir-riżultati finali ġew deskritti bil-valuri relattivi (2-ΔΔCt). Il-kalkolu u l-analiżi twettqu mis-Sistema ta' Rilevazzjoni tal-PCR Real-Time iQ5.

Analiżi Western blot

Collagen I (Abcam, Cambridge, UK, Art No: ab34710) il-livelli ta' espressjoni tal-proteini ġew determinati permezz ta' Western blotting [b'-actin (Lott: 60008-1-lg; Proteintech, iċ-Ċina) bħala kontroll tad-dar. Estratti taċ-ċelluli kollha ġew ippreparati bl-użu ta 'assaġġ ta' Radioimmunoprecipitation (RIPA) (Thermo Scientific, USA) buffer b'1 fil-mija Halt protease inhibitor cocktail (Thermo Scientific, USA) u 1 fil-mija Halt phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Scientific, USA). Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla u kkwantifikata bil-metodu Bradford [18]. Proteina (10-50 ug) ġiet separata fuq ġel SDS-PAGE ta '10 fil-mija u ttrasferita għal membrani PVDF (Millipore, USA). Il-membrani ġew imblukkati għal siegħa f'temperatura tal-kamra b'5 fil-mija BSA, u l-antikorpi primarji (antikorp Anti-Colla gen I, dilwizzjoni 1:200 jew mAb tal-ġurdien ta '-actin, dilwizzjoni 1:5000) ġew inkubati f'4 grad matul il-lejl. L-Alk-Phos korrispondenti. antikorpi sekondarji konjugati ġew inkubati f'temperatura tal-kamra. Fl-aħħarnett, il-membrani ġew maħsula tliet darbiet b'1 × Tris–HCl salina b'0.1 fil-mija Tween 20, u s-sinjali ġew skennjati u viżwalizzati minn GEL DOC XR Imaging System (Bio-Rad). Twettqet analiżi densitometrika fuq il-proteini ta 'interess u normalizzata għal -actin bis-softwer GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). -actin intuża bħala l-kontroll intern.

Analiżi statistika

It-test ta 'normalità Shapiro-Wilk u t-test ta' omoġeneità tal-varjanza ta 'Levene ġew applikati biex jivverifikaw in-normalità u You et al. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences (2015) 23:52 Paġna 4 minn 13omoġeneità tal-varjanza. Analiżi tal-varjanza (ANOVA) segwita mit-test post hoc ta 'Tukey intużat biex jiġu identifikati differenzi statistiċi mhux omoġenji, dejta normalment distribwita. It-test mhux parametriku Kruskal-Wallis intuża biex janalizza data mhux distribwita normalment jew omoġenja. Ir-riżultati ġew espressi bħala medja ± SD. Is-sinifikat ġie stabbilit għal P < 0.05.="" id-dejta="" kollha="" ġiet="" analizzata="" minn="" softwer="" spss="" 16.0="" (università="" medika="" ta="">

Riżultati

Determinazzjoni kwantitattiva ta 'CPhGs

CPhGs f'C. tubulosa fihom żewġ phenylethyl alcohol glycosides, echinacoside, u acteoside, u l-kontenut tagħhom fis-CPhGs ġew determinati b'analiżi HPLC (Fig. 1) li huma 42.71 ± 0.42 fil-mija u 14.27 ± {{7. }}.18 fil-mija , rispettivament.

Indiċi tal-fwied u tal-milsa

Kif intweriet it-Tabella 1, l-indiċi tal-fwied u l-milsa tal-grupp mudell kienu elevati b'mod sinifikanti [P <0.01, p=""><0.05]. l-indiċi="" tal-fwied="" u="" tal-milsa="" tal-mediċina="" pożittiva="" bjrg="" u="" cphgs="" fi="" gruppi="" ta'="" doża="" differenti="" tnaqqsu="" b'mod="" sinifikanti="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" mudell="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0." 004,="" pliver="0.005;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," rispettivament].="" l-indiċi="" tal-fwied="" u="" tal-milsa="" kienu="" aktar="" baxxi="" minn="" dawk="" tal-grupp="">

Effetti ta 'CPhGs fuq ALT, attivitajiet AST, u markaturi tal-fibrożi tal-fwied

Fl-istudju preżenti, il-livelli tas-serum tal-enzimi epatiċi AST u ALT żdiedu b'mod sinifikanti fil-grupp mudell, li jirriflettu ħsara epatoċellulari fil-firien tal-fibrożi tal-fwied ikkawżati minn BSA. Madankollu, l-esperimenti.

wera li t-trattament b'BJRG (600 mg/kg) u CPhGs (125, 250, u 5{{10}}0 mg/kg) AST imnaqqas b'mod sinifikanti [PASSAT < 0.0{{{60}}1,="" passat="">< 0.001,="" passat="">< 0.001,="" passat="">< 0.001="" ,="" rispettivament]="" u="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189," palt="0.255," rispettivament]="" fil-firien="" tal-fibrożi="" epatika="" .="" (tabella="" 2).="" il-livelli="" ta="" 'ha,="" ln,="" pc="" u="" iv-c="" fil-firien="" mudell="" żdiedu="" b'mod="" sinifikanti="" [pha=""><0.001, pln=""><0.001, ppciii="0.002," piv-c=""><0.001, rispettivament].="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" mudell,="" il-livelli="" ta="" 'ha="" [pha="0.009," pha="0.007," pha="0.009," pha="0.023," rispettivament],="" ln="" [pln="0.011," p="" ln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," rispettivament],="" pc="" iii="" [p="" pciii="" {{="" {47}}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," rispettivament],="" u="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" p="" iv-c="">< 0.001,="" rispettivament]="" fil-firien="" naqsu="" b'mod="" notevoli="" b'bjrg="" (600="" mg/kg)="" u="" cphgs="" fi="" gruppi="" ta'="" doża="" differenti="" (125,="" 250,="" u="" 500="" mg/kg)="" (tabella="" 3).kontenut="" hyp="" u="" tgf-="" 1="" il-kontenut="" ta'="" kollaġen="" ġie="" skopert="" ukoll="" billi="" tkejlu="" l-livelli="" ta'="" hyp="" fit-tessut="" tal-fwied.="" kif="" muri="" fit-tabella="" 4,="" il-medja="">il-livell fil-grupp mudell kien ogħla b'mod sinifikanti mill-grupp normali, iżda naqas b'mod notevoli fil-grupp BJRG u l-gruppi ta 'doża CPhGs differenti. Il-konċentrazzjoni epatika ta' TGF{{0}} tal-grupp mudell fil-firien żdiedet b'mod sinifikanti [P <0.001]. meta="" mqabbel="" mal-grupp="" mudell,="" il-livelli="" ta'="" tgf-="" 1="" tal-mediċina="" pożittiva="" u="" l-gruppi="" ta'="" doża="" ta'="" cphgs="" differenti="" naqsu="" b'mod="" notevoli="" [p="" tgf-="" 1=""><0.001, p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf="" -="" 1="">< 0.001,="" ptgf="" -="" 1="">< 0.001,="" rispettivament].="" ir-riżultati="" huma="" miġbura="" fil-qosor="" fit-tabella="">

Eżami istopatoloġiku

Osservazzjonijiet ta 'sezzjonijiet normali tat-tessut tal-fwied imtebba' b'H&E u trikromju ta' Masson juru lobuli epatiċi distinti u sinusojdi epatiċi. L-istruttura tat-tessut tal-fwied fil-firien mudell kienet diżordinata, u t-tessut tal-fwied u s-sinusojdi epatiċi ġew sostitwiti b'ammont kbir ta 'tessut konnettiv. Madankollu, aktar ċitoarkitettura normali u inqas tessut konnettiv ġew skoperti fil-grupp ta 'trattament minn dawk fil-grupp mudell.

Tbajja H&E

Fil-grupp normali, ġew osservati integrità strutturali tal-lobuli tal-fwied mingħajr żoni portali anormali u sinusojdi epatiċi. Il-kurduni tal-fwied kienu rranġati b'mod ordnat, bil-qalba tonda u ċara. In-nuklei jinsabu fiċ-ċentru taċ-ċellula, b'ċitoplasma abbundanti. Iż-żona portal biss għandha ammont żgħir ta 'tessut fibruż (Fig. 2a). Fil-grupp mudell, l-istruttura lobulari kienet bil-ħsara serjament. Iċ-ċelluli tal-fwied urew deġenerazzjoni ħafifa ta 'l-ilma, l-aktar deġenerazzjoni ballooning u/jew deġenerazzjoni tax-xaħam. Ġew osservati wkoll il-formazzjoni ta 'infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji, iperplażja estensiva tat-tessut fibruż, il-formazzjoni ta' numru kbir ta 'septum fibruż, lobuli maqsuma, u proliferazzjoni sinifikanti taċ-ċelluli tal-fwied. Dawn l-osservazzjonijiet ikkonfermaw is-suċċess ta 'l-istabbiliment tal-mudell ta' l-annimal ta 'ħsara immuni tal-firien ta' fibrożi epatika (Fig. 2b). Meta mqabbel mal-grupp mudell, kien hemm tnaqqis fl-infiltrazzjoni taċ-ċelluli infjammatorji fis-CPhGs differenti. Kienu osservati wkoll inqas nekrożi u deġenerazzjoni tax-xaħam taċ-ċelloli tal-fwied kif ukoll it-taffija tal-fibrożi. CPhGs itaffu b'mod sinifikanti l-patoloġija tal-fibrożi tal-fwied indotta minn BSA fil-firien, itaffu n-nefħa taċ-ċelluli tal-fwied, u effettivament ipprevjenu nekrożi tal-epatoċiti u infiltrazzjoni ta 'ċelluli infjammatorji, li jissuġġerixxu li CPhGs jeżerċitaw effett protettiv fuq fibrożi epatika tal-firien indotta minn BSA. (Fig. 2c–f). Tbajja tat-trikromju ta 'Masson Fil-grupp normali, it-tessut tal-fwied kien normali. Iż-żona portal epatika wriet numru żgħir ta 'fibri tal-kollaġen blu, u t-tessut tal-fwied kien normalment strutturat (Fig. 3a). Meta mqabbel mat-tessut tal-fwied tal-grupp normali, it-tessut fibruż ipprolifera mill-fuljett ċentrali u estiż fil-parenkima tal-fwied. Fibri tal-kollaġen estiżi u marbuta u

envelops-lobu kollu u mdawra l-vina ċentrali. Dawn l-effetti, flimkien ma 'fibrożi tal-epatoċiti, ħsara strutturali lobulari, fibrożi periportali u formazzjoni ta' psewdolobuli (Fig. 3b) ipprovdew evidenza li l-mudell ġie stabbilit. Meta mqabbel mal-grupp mudell, il-fibri tal-kollaġen fil-grupp ta 'kontroll pożittiv tad-droga ġew estiżi b'mod ħafif 'l barra miż-żona tal-portal periferali (Fig. 3c). Meta mqabbla mal-grupp mudell, il-fibri tal-kollaġen fil-gruppi ta 'doża ta' CPhGs differenti tnaqqsu b'mod sinifikanti, il-proliferazzjoni tal-fibri ġiet inibita, u l-proliferazzjoni ta 'tessut fibruż fil-parenkima tal-fwied tnaqqset b'mod sinifikanti. Dawn ir-riżultati ssuġġerew li CPhGs jipproteġu l-firien minn fibrożi epatika indotta minn BSA (Fig. 3d-f).

Tbajja immunoistokimika

Importanti, l-espressjoni tal-collagen tat-tip I u tal-kollaġen tat-tip III għandhom rwoli essenzjali fl-iżvilupp tal-fibrożi epatika, u l-ġenerazzjoni u d-depożizzjoni tagħhom fit-tessut tal-fwied jistgħu jservu bħala determinant importanti tal-effikaċja tal-fibrożi kontra l-fwied. Ir-riżultati huma miġbura fil-qosor fit-Tabella 5

Collagen tat-tip I

Il-grupp normali esprima l-kollaġen tat-tip I prinċipalment fil-vini u ż-żona tal-portal. Il-grupp mudell esprima ħafna collagen tip I fibrożi vaskulari f'żoni portali. Fl-ispazju ta 'Disse, it-tbajja tal-kollaġen tat-tip I kienet osservata strixxi jew bħala distribuzzjoni irqiq. Septa fibruż miksi mill-kollaġen biex jifforma pseudolobule. F'dawn l-esperimenti, ġew iffurmati inqas septa fibruż għal BJRJ (600 mg/kg) u gruppi ta' doża differenti ta' CPhGs (125, 250, u 500 mg/kg) [PCol I=0.002, PCol I {{ 6}}.001, PCol I=0.023, u P Col I=0.044, rispettivament]. Ir-riżultati semikwantitattivi wrew li l-espressjoni tat-tip ta 'collagen I tagħhom kienet sinifikament aktar baxxa meta mqabbla mal-grupp mudell (Fig. 4).

Collagen tat-tip III

Il-collagen tat-tip III kien espress b'mod dgħajjef fil-grupp normali, u ż-żoni periferali madwar il-vini portali u epatiċi wrew ammont żgħir ta 'isfar fin minflok fibri kontinwi (Fig. 5a). Fil-grupp tal-mudell, il-fibri tal-kollaġen urew kurduni wesgħin u ħoxnin, li jindikaw espressjoni qawwija, prinċipalment li jinsabu fiż-żoni portali u tat-tessut fibruż (Fig. 5b). Fibri tal-collagen ta 'BJRJ (600 mg/kg) u gruppi ta' doża differenti ta 'CPhGs (125, 250, u 500 mg/kg) kienu filamentożi u mqassma madwar il-vina ċentrali u ż-żoni portali. Meta mqabbel mal-grupp mudell, il-fibri tal-kollaġen tnaqqsu b'mod sinifikanti, it-tbajja' kienet pallida u rqiqa, u t-tbajja' immunoistokimika kienet dgħajjef pożittiva (Fig. 5c-f). Dawn ir-riżultati semi-kwantitattivi juru li ċ-ċelloli espressi b'mod pożittiv fil-gruppi ta' doża pożittivi u differenti [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PCol III=0.010, u P Col III=0.037, rispettivament] kienu differenti minn dawk fil-grupp tal-mudell.

TGF- 1

Ftit kien hemm espressjoni ta' TGIF{{0}} fiċ-ċelloli normali tal-fwied tal-firien. L-espressjoni kienet limitata għal numru żgħir ta 'ċelluli interstizjali (Fig. 6a). Fil-grupp mudell, l-espressjoni ta 'TGF- 1 kienet imqassma b'mod wiesa' fiż-żona tal-portal, spazji fibrużi, ċelloli stellati epatiċi, ċelloli infjammatorji, il-ħajt sinusojdali u ċitoplasma. Żona tal-portal partikolari wriet espressjoni pożittiva b'mod qawwi bi tbajja' kannella-isfar (Fig. 6b). Kien hemm ammont żgħir ta 'espressjoni fiż-żona tal-portal u septa fibruż ta' BJRJ (600 mg / kg) u gruppi ta 'doża differenti ta' CPhGs (125, 250, u 500 mg / kg). Il-firxa ta 'tbajja' pożittiva f'dawn il-gruppi tnaqqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma 'dak tal-grupp mudell. Tbajja fiċ-ċelloli interstizjali fis-septa fibruż u ċ-ċitoplasma ta 'ċelloli infjammatorji naqset (Fig. 6c-f). Riżultati semi-kwantitattivi wrew li BJRJ u gruppi ta' doża differenti ta' CPhGs [P TGF- 1=0.001, P TGF{- 1 < 0.001,="" p="" tgf{-="" 1="0.009," ptgf{-="" 1="0" .004,="" rispettivament]="" kienu="" sinifikanti="" meta="" mqabbla="" mal-grupp="" mudell.="" kif="" issemma="" qabel="" fl-artiklu,="" tgf-="" 1="" huwa="" ċitokin="" importanti="" fil-patofiżjoloġija="">

fibrożi, li tistimula l-produzzjoni ta 'matriċi extraċellulari [19]. Aħna wrejna li l-livell ta' TGF- 1 żdied fil-grupp mudell b'mod konsistenti mas-severità tal-fibrożi tal-fwied. Il-livelli ta' espressjoni ta' TGF- 1 fil-fwied kienu konsistenti mal-livelli ta' TGF- 1 fis-serum. Dan jindika li CPhGs jistgħu jnaqqsu b'mod sinifikanti l-fibrożi tal-fwied minħabba l-espressjoni ta 'TGF- 1 billi jipparteċipaw fis-sintesi u d-degradazzjoni tal-ECM. L-espressjoni ta 'collagen tip I, collagen tip III, u TGF- 1 jistgħu jiskopru l-proċess patoloġiku ta' fibrożi epatika. Il-livelli ta 'espressjoni tagħhom fil-gruppi ta' trattament naqsu b'mod sinifikanti u wrew li CPhGs jistgħu jtejbu l-attività tal-collagenase, u jżommu l-ekwilibriju dinamiku tas-sintesi u d-degradazzjoni tal-ECM tal-fwied, u b'hekk idewmu u jipprevjenu l-formazzjoni tal-fibrożi tal-fwied.