Parti 1: L-Efflux tal-Magnesium Miċ-Ċelloli ta' Drosophila Kenyon Huwa Kritiku Għall-Memorja fit-Tul Normali u mtejba bid-Dieta

għal aktar informazzjoni:Ali.ma@wecistanche.com

Pls ikklikkja hawn għall-Parti 2

Yanying Wu1, Yosuke Funato2, Eleonora Meschi1, Kristijan D Jovanoski1, Hiroaki Miki2, Scott Waddell1*

1Centre for Neural Circuits and Behaviour, L-Università ta' Oxford, Tinsley Building, Oxford, ir-Renju Unit; 2Dipartiment tar-Regolamentazzjoni Ċellulari, Istitut tar-Riċerka għall-Mard Mikrobiku, Università ta’ Osaka, Suita, Ġappun

Is-supplimentazzjoni tal-manjeżju tad-dieta (Mg2 plus) tista 'ttejjebmemorjafi firien żgħar u ta’ età.Memorja-It-titjib tal-kapaċità kienet fil-biċċa l-kbira attribwita għal żidiet fid-densità sinaptika tal-hippocampal u espressjoni elevata tas-subunità NR2B tar-riċettur tal-glutamate tat-tip NMDA. Hawnhekk nuru li l-għalf Mg2 flimkien itejjeb ukoll fit-tulmemorjafid-Drosophila. Normali u Mg2 plus - titjir imtejjebmemorjajidher indipendenti mir-riċetturi NMDA fil-ġisem tal-faqqiegħ u minflok jeħtieġ l-espressjoni ta 'trasportatur Mg2 tat-tip CNNM kkonservat flimkien ma' -eflux kodifikat mill-ġene mhux estiż (uex). UEX fih dominju putattiv ta' omoloġija li jgħaqqad nukleotidi ċikliċi u l-mutazzjoni tiegħu tifred rwol vitali għal uex minn funzjoni f'memorja. Barra minn hekk, il-lokalizzazzjoni UEX fiċ-ċelloli Kenyon tal-ġisem tal-faqqiegħ (KCs) hija mibdula fihamemorja-dubbien difettużi li jħaddnu mutazzjonijiet fil-ġeni relatati mal-cAMP. Immaġini funzjonali jissuġġerixxu li l-effluss dipendenti fuq UEX huwa meħtieġ għal manutenzjoni ritmika bil-mod ta 'KC Mg2 plus. Nipproponu li l-Mg2 plus effluss newronali regolat huwa kritiku għan-normal u Mg2 plus mtejbamemorja.

Ikklikkja biexCistanche vitamin shop u Cistanche għall-memorja

Introduzzjoni

Il-manjesju (Mg2 plus ) għandu rwol kritiku fil-metaboliżmu ċellulari u huwa meqjus bħala ko-fattur essenzjali għal aktar minn 350 enzima (Romani u Scarpa, 2000; Vink and Nechifor, 2011). Bħala riżultat, alterazzjonijiet ta 'Mg2 flimkien ma' omeostażi huma assoċjati ma' firxa wiesgħa ta 'kundizzjonijiet kliniċi, inklużi dawk li jaffettwaw is-sistema nervuża, bħall-glawkoma (DeToma et al., 2014), il-marda ta' Parkinson (Hermosura et al., 2005; Hermosura u Garruto, 2007; Lin et al., 2014; Shindo et al., 2016), Il-marda ta’ Alzheimer (Andra´si et al., 2000; Andra´si et al., 2005; Cilliler et al., 2007; Durlach et al., 2007; ., 1997; Glick, 1990; Lemke, 1995; Chui et al., 2011; Vural et al., 2010), ansjetà (Sartori et al., 2012), dipressjoni (Whittle et al., 2011; Murck, 2002; Murck, 2013; Rasmussen et al., 1990; Ghafari et al., 2015), u diżabilità intellettwali (Arjona et al., 2014).

Forsi b'mod sorprendenti, iż-żieda fil-moħħ Mg2 plus permezz tad-dieta tista 'ttejjeb il-plastiċità newronali umemorjaprestazzjoni ta 'annimali gerriema żgħar u ta' età, imkejla f'varjetà ta 'kompiti ta' mġiba (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Barra minn hekk, Mg2 elevat flimkien ma 'defiċits konjittivi mnaqqsa f'mudell tal-ġurdien tal-marda ta' Alzheimer (Li et al., 2013) u tejbu l-estinzjoni ta 'memorji tal-biża' (Abumaria et al., 2011). Dawn l-effetti apparentement ta’ benefiċċju wasslu għall-proposta li Mg2 plus tad-dieta jista’ jkollu valur terapewtiku għal pazjenti b’varjetà ta’memorja-problemi relatati (Billard, 2011).

Minkejja numru kbir ta 'siti potenzjali ta' Mg2 flimkien ma 'azzjoni fil-moħħ, il-memorja-it-titjib tal-proprjetà fl-annimali gerriema ġie attribwit fil-biċċa l-kbira għal żidiet fid-densità sinaptika tal-hippocampal u l-attività tar-riċetturi tal-glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDARs). Extraċellulari Mg2 plus jimblokka l-pori tal-kanal ta 'l-NMDAR u b'hekk jinibixxi l-passaġġ ta' joni oħra (Mayer et al., 1984; diġest Il-proverbjali qal "int dak li tiekol" perfettament jiġbor fil-qosor il-kunċett li d-dieta tagħna tista 'tinfluwenza kemm tagħna mentali kif ukoll saħħa fiżika Aħna nafu li ikel li huwa tajjeb għall-qalb, bħall-ġewż, ħut żejtni, u berries, huma wkoll tajbin għall-moħħ Nafu wkoll li l-vitamini u l-minerali huma essenzjali għas-saħħa ġenerali tajba Imma hemm xi evidenza li ż-żieda fil-konsum tiegħek ta 'vitamini jew minerali speċifiċi tista' tgħin biex tingħata spinta lill-moħħok?

Filwaqt li jista 'ħoss kważi wisq tajjeb biex ikun veru, hemm xi evidenza li dan huwa l-każ għal mill-inqas minerali wieħed, il-manjeżju. Studji fil-annimali gerriema wrew li ż-żieda ta 'supplimenti tal-manjeżju mal-ikel ittejjeb kemm l-annimali jwettqu l-kompiti tal-memorja. Kemm annimali żgħar kif ukoll anzjani jibbenefikaw minn manjesju addizzjonali. Anke annimali gerriema anzjani b'kundizzjoni simili għall-marda ta 'Alzheimer juru inqasmemorjatelf meta jingħata supplimenti tal-manjeżju. Imma xi ngħidu dwar speċi oħra?

Wu et al. issa juru li s-supplimenti tal-manjeżju wkoll jagħtu spinta lill-prestazzjoni tal-memorja fid-dubbien tal-frott. Grupp wieħed ta 'dubbien kien mitmugħ b'qamħirrum standard għal diversi jiem, filwaqt li l-grupp l-ieħor irċieva qamħirrum supplimentat bil-manjeżju. Iż-żewġ gruppi mbagħad ġew imħarrġa biex jassoċjaw riħa ma 'premju tal-ikel. Dubbien li kienu rċevew il-manjeżju żejjed urew aħjarmemorjagħar-riħa meta tiġi ttestjata 24 siegħa wara t-taħriġ.

Wu et al. juru li l-manjeżju jitjiebmemorjafid-dubbien permezz ta' mekkaniżmu differenti minn dak irrappurtat qabel għall-annimali gerriema. F'annimali gerriema, il-manjeżju żied il-livelli ta' proteina riċettur għal kimika tal-moħħ imsejħa glutamat. Fil-dubbien tal-frott, b'kuntrast, il-memorjaspinta tiddependi fuq proteina li tittrasporta l-manjeżju 'l barra min-newroni. Dubbien mutanti li ma kellhomx dan it-trasportatur wrew nuqqasijiet fil-memorja. B'differenza minn dubbien normali, dawk mingħajr it-trasportatur ma wrew l-ebda titjib fil-memorja wara li kielu ikel arrikkit bil-manjeżju. Ir-riżultati jissuġġerixxu li t-trasportatur jista 'jgħin biex jaġġusta l-livelli tal-manjeżju ġewwa ċ-ċelloli tal-moħħ bi tweġiba għall-attività newrali.

Il-bnedmin jipproduċu erba 'varjanti ta' dan it-trasportatur tal-manjeżju, kull wieħed kodifikat minn ġene differenti. Wieħed minn dawn it-trasportaturi diġà ġie implikat fl-iżvilupp tal-moħħ. Is-sejbiet ta' Wu et al. jissuġġerixxu li t-trasportaturi jistgħu jaġixxu wkoll fil-moħħ tal-adulti biex jinfluwenzaw il-konjizzjoni. Huma meħtieġa aktar studji biex jiġi ttestjat jekk l-immirar tat-trasportatur tal-manjeżju jistax fl-aħħar ikun wegħda għat-trattamentmemorjaindebolimenti.

Bekkers u Stevens, 1993; Jahr u Stevens, 1990; Nowak et al., 1984). Importanti, depolarizzazzjoni newronali minn qabel, immexxija minn riċetturi oħra ta 'trasmettitur, hija meħtieġa biex tirrilaxxa l-blokka Mg2 plus fuq l-NMDAR u tippermetti l-influss ta' Ca2 plus glutamate. L-NMDAR, għalhekk, għandu rwol importanti fil-plastiċità newronali bħala detector potenzjali ta 'koinċidenza Hebbian. Elevazzjoni akuta tal-konċentrazzjoni extraċellulari Mg2 plus ([Mg2 plus ]e) fi ħdan il-medda fiżjoloġika (0.8–1.2 mM) tista' antagonizza l-induzzjoni ta' qawwa fit-tul dipendenti fuq NMDAR (Dunwiddie u Lynch, 1979; Malenka et al., 1992; Malenka; u Nicoll, 1993; Slutsky et al., 2004). B'kuntrast, iż-żieda ta '[Mg2 plus ]e għal diversi sigħat f'kulturi newronali twassal għal titjib tal-kurrenti medjati NMDAR u faċilitazzjoni tal-espressjoni ta' LTP (Slutsky et al., 2004). L-effetti ta 'titjib ta' [Mg2 plus ]e ġew osservati wkoll in vivo fil-moħħ ta 'firien mitmugħa b'Mg2 plus -L-threonate (Slutsky et al., 2010). Iċ-ċirkwiti newronali ta 'l-ippocampal jgħaddu minn plastikità omeostatika (Turrigiano, 2008) biex jakkomodaw iż-żieda [Mg2 plus ]e billi jirregolaw l-espressjoni ta' NMDARs li fihom is-subunità NR2B (Slutsky et al., 2004; Slutsky et al., 2010). Id-densità ogħla tas-sinapsi tal-hippocampal b'NMDARs li fihom NR2B hija maħsuba li tikkumpensa għaż-żieda kronika f'[Mg2 plus ]e billi ttejjeb il-kurrenti NMDAR waqt l-isparar tal-fqigħ. B'appoġġ għal dan il-mudell, ġrieden li huma ġenetikament inġinerija biex jesprimu żżejjed NR2B juru LTP mtejba u komportamentali tal-hippocampal.memorja(Tang et al., 1999).

Riħamemorjaf'Drosophila jinvolvi mekkaniżmu eterosinaptiku mmexxi bit-tisħiħ tan-newroni dopaminerġiċi, li jirriżulta f'dipressjoni presinattika ta' konnessjonijiet kolinerġiċi bejn ċelluli Kenyon (MB) tal-ġisem tal-faqqiegħ attivat bir-riħa (KCs) u newroni tal-ħruġ tal-ġisem tal-faqqiegħ downstream (MBONs) (Schwaerzel et al., 2003). ; Aso et al., 2010; Aso et al., 2012; Claridge-Chang et al., 2009; Burke et al., 2012; Liu et al., 2012; Plac¸ais et al., 2013; Owald et al. ., 2015; Hige et al., 2015; Barnstedt et al., 2016; Parisse et al., 2016; Aso et al., 2014; Oswald and Waddell, 2015). Barra minn hekk, l-informazzjoni tax-xamm titwassal lil KCs permezz ta 'trasmissjoni kolinerġika minn newroni ta' projezzjoni tax-xamm (Yasuyama et al., 2002; Leiss et al., 2009). Għalkemm huwa konċepibbli li l-glutamate jitwassal lin-netwerk MB permezz ta' rotta li għadha trid tiġi identifikata, bħalissa m'hemm l-ebda post ovvju għall-plastiċità dipendenti fuq NMDAR fl-arkitettura magħrufa tas-saffi ta' input jew output kolinerġiċi (Barnstedt et al., 2016). ). Il-fly, għalhekk, tipprovdi mudell potenzjali biex tinvestiga mekkaniżmi oħra li permezz tagħhom Mg2 plus tad-dieta jista 'jtejjebmemorja.

L-effetti ta' rinfurzar tad-dopamina jiddependu fuq ir-riċettur tad-dopamina tat-tip Dop1R D1-(Kim et al., 2007; Qin et al., 2012; Handler et al., 2019), li huwa akkoppjat b'mod pożittiv mal-produzzjoni tal-cAMP (Tomchik). u Davis, 2009; Boto et al., 2014). Barra minn hekk, studji bikrija f'Drosophila identifikaw il-cAMP phosphodiesterase kodifikati minn dunce u rutabaga u tat-tip I Ca2 plus-stimulated adenylate cyclase, rispettivament, li huma essenzjali għax-xamm.memorja(Dudai et al., 1976; Byers et al., 1981; Dudai u Zvi, 1984; Chen et al., 1986; Livingstone et al., 1984; Levin et al., 1992). Studji fiċ-ċelloli tal-mammiferi wrew li l-ormoni jew l-aġenti li jżidu l-livell ta 'cAMP ċellulari ħafna drabi jqanqlu estrużjoni sinifikanti ta' Na plus -dipendenti ta 'Mg2 plus fl-ispazju extraċellulari (Romani u Scarpa, 1990b; Romani u Scarpa, 1990a; Romani u Scarpa, 2000; Vink u Nechifor, 2011; Vormann u Gu¨nther, 1987). Madankollu, mhuwiex ċar jekk Mg2 plus l-estrużjoni għandhiex rwol fl-ipproċessar fil-memorja.

Hawnhekk aħna nuru li Drosophila fit-tulmemorja(LTM) jista 'jissaħħaħ b'Mg2 tad-dieta flimkien ma' supplimenti. Insibu li l-ġene mhux estiż (uex) (Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010), li jikkodifika ortologu tal-fly funzjonali tal-proteini tal-mammiferi Cyclin M2 Mg2 plus -efflux transporter (CNNM), huwa kritiku għall-memorja-titjib tal-proprjetà ta 'Mg2 plus. Il-funzjoni UEX f'MB KCs hija meħtieġa għal LTM u r-restawr funzjonali ta 'uex jiżvela li l-MB huwa s-sit ewlieni tat-titjib tal-memorja Mg2 plus dipendenti. Il-metaboliżmu tal-cAMP li jbiddel b'mod kroniku billi jintroduċi mutazzjonijiet fil-ġeni dnc jew rut jibdel il-lokalizzazzjoni ċellulari ta 'UEX. Barra minn hekk, il-mutazzjoni tad-dominju tal-omoloġija tal-irbit tan-nukleotidi ċikliku kkonservat (CNBH) f'UEX tneħħi rwol essenzjali għal uex mill-funzjoni tiegħu fil-memorja. Mg2 plus efflux immexxi minn UEX huwa meħtieġ għal manutenzjoni ritmika bil-mod tal-livelli KC Mg2 plus li jissuġġerixxu rwol potenzjali għall-ipproċessar ta 'Mg2 plus fluss fil-memorja.

Riżultati

L-għalf Mg2 flimkien itejjeb l-LTM ta' dubbien tat-tip selvaġġ

Studji preċedenti rrappurtaw li l-għalf tal-firien b'ikel li fih konċentrazzjoni għolja ta 'Mg2 plus -tejbu l-kapaċità ta' tagħlim u memorja tagħhom (Slutsky et al., 2010; Landfield and Morgan, 1984; Abumaria et al., 2011; Mickley et al., 2013; Abumaria et al., 2013). Aħna, għalhekk, ittestjajna jekk jeżistux effetti simili fid-dubbien billi għalfhom b'ikel li jkun fih konċentrazzjoni għolja ta 'Mg2 plus qabel it-taħriġ. B'mod sorprendenti, dubbien tat-tip selvaġġ mitmugħa għal 4 ijiem qabel it-taħriġ b'ikel supplimentat b'klorur tal-manjeżju addizzjonali (MgCl2) urew prestazzjoni tal-memorja ta '24 siegħa mtejba b'mod sinifikanti. It-titjib tal-memorja jiddependi fuq il-konċentrazzjoni u kien massimu meta l-ikel kien supplimentat b'80 mM MgCl2 (Figura 1A). Il-prestazzjoni tal-memorja immedjata ma kinitx ovvjament imsaħħa (Figura 1B). L-effett ta 'titjib ta' MgCl2 kien osservat ukoll f'dubbien mitmugħa b'sulfat tal-manjeżju (MgSO4) iżda mhux klorur tal-kalċju (CaCl2) (Figura 1C). Barra minn hekk, it-tmigħ tad-dubbien għal 4 ijiem b'ikel li fih bejn 5 u 80 mM strontium chloride (SrCl2) irriżulta f'livelli għoljin ta 'mortalità u dubbien li baqgħu ħajjin għalf ta' 5 mM SrCl2 ma wrewx prestazzjoni mtejba tal-memorja immedjata jew 24 siegħa (dejta mhux murija) . L-effetti li jtejbu l-memorja jistgħu għalhekk jiġu attribwiti speċifikament għas-supplimentazzjoni tad-dieta ta 'Mg2 plus divalenti.

Il-memorja mtejba Mg2 plus hija indipendenti mill-NMDAR fil-korpi tal-faqqiegħ

Peress li l-memorja msaħħa tal-manjeżju-L-threonate fil-firien kienet korrelatata ma 'upregulation ta' NMDARs li fihom is-subunità ta 'l-ippocampal NR2B (Slutsky et al., 2010), aħna ttestjajna għal bidliet fl-espressjoni tar-riċettur tal-glutamate f'dubbien mitmugħa b'MgCl2. L-analiżi RT-qPCR ma wrewx differenza sinifikanti fl-abbundanza ta’ mRNAs għar-riċetturi putattivi NMDA (Nmdar1, Nmdar2), AMPA (GluRIA), jew kainate-type (GluRIIA) f’irjus meħuda minn dubbien mitmugħa għal 4 ijiem b’80 mM MgCl2 kontra dawk mitmugħa b'1 mM MgCl2 (Figura 1D).

Imbagħad ittestjajna direttament jekk il-memorja mtejba Mg2 flimkien ma kinitx teħtieġ il-funzjoni NMDAR, billi naqqas l-espressjoni tal-ġeni Nmdar1 jew Nmdar2 bl-użu ta' interferenza RNA transġenika mmexxija mill-UAS.

Figura 1. Mg2 tad-dieta flimkien ma 'supplimenti ttejjeb il-memorja fit-tul ta' Drosophila. (A) Id-dubbien tat-tip selvaġġ ġew imħarrġa u ttestjati għal memorja appetittiva ta '24 siegħa wara ġranet 1-5 ta' għalf ad libitum fuq ikel supplimentat b'Mg2 plus. Il-memorja tjiebet b'mod sinifikanti f'dubbien mitmugħa għal 4 ijiem b'80 mM MgCl2, meta mqabbla ma 'dawk mitmugħa b'1 mM. 80 mM MgCl2 ipproduċa prestazzjoni marġinalment ogħla minn 50 mM jew 100 mM u għalhekk kien ikkunsidrat ottimali (l-asterisks jindikaw p<0.05, t-test="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" groups="" for="" each="" time="" point,="" n="6–8)." (b)="" 4="" days="" of="" 80="" mm="" mgcl2="" food="" did="" not="" enhance="" immediate="" memory.="" (c)="" appetitive="" 24="" hr="" memory="" was="" enhanced="" by="" feeding="" wild-type="" flies="" for="" 4="" days="" with="" mgcl2="" and="" mgso4,="" but="" not="" cacl2.="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05, anova,="" n="6)" between="" mg2+="" fed="" and="" plain="" groups.="" (d)="" rt-qpcr="" showed="" no="" significant="" differences="" in="" glutamate="" receptor="" mrna="" expression="" between="" 1="" mm="" and="" 80="" mm="" fed="" flies="" (t-test,="" n="5)." (e)="" c739-gal4;="" uas-magfret-1="" flies="" were="" fed="" for="" 4="" days="" on="" food="" supplemented="" with="" mg2+.="" brains="" were="" dissected="" and="" fixed="" and="" a="" fluorescence="" emission="" ratio="" measurement="" (citrine/cerulean)="" was="" taken="" as="" an="" indicator="" of="" [mg2+]i.="" the="" magfret="" signal="" was="" significantly="" greater="" in="" the="" ab="" lobes="" of="" flies="" fed="" with="" 80="" mm="" mgcl2="" than="" those="" fed="" with="" 1="" mm="" mgcl2=""><0.05, t-test,="" n="52–60)." unless="" otherwise="" noted,="" all="" data="" are="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" the="" mean="" (sem).="" asterisks="" denote="" significant="" differences=""><0.05), individual="" data="" points="" displayed="" as="" open="">

Il-verżjoni online ta' dan l-artikolu tinkludi s-suppliment(i) tal-figura li ġejja għall-figura 1:

Suppliment tal-figura 1. Knockdown ta 'N-methyl-D-aspartate glutamate receptor (NMDAR) fil-korpi tal-faqqiegħ ma jfixkilx il-memorja mtejba Mg2 plus.

(RNAi) kostruzzjonijiet (Dietzl et al., 2007; Perkins et al., 2015). Miż-żewġ linji indipendenti UAS-Nmdar1R-NAi u erba' UAS-Nmdar2RNAi li ttestjajna, linja waħda biss Nmdar1RNAi (BDSC 25941), meta misjuqa fin-newroni kollha minn Synaptobrevin (nSyb)-GAL4 newronali, uriet naqset b'mod sinifikanti prestazzjoni tal-memorja ta' 24 siegħa, kif meta mqabbel ma 'dak ta' dubbien ta 'kontroll eterozigoti (Figura 1-figura suppliment 1A). B'kuntrast, espressjoni aktar selettiva ta 'dan l-UAS-Nmdar1RNAi f'KCs ab rilevanti għall-LTM bl-użu ta' c739-GAL4 ma fixkelx b'mod sinifikanti l-prestazzjoni tal-memorja ta '24 siegħa (Figura 1—figura suppliment 1B). Barra minn hekk, dubbien li jesprimu Nmdar1RNAi fin-newroni ab żammew memorja msaħħa Mg2 plus robusta (Figura 1—figura suppliment 1C). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-memorja mtejba Mg2 plus ma tbiddilx l-espressjoni tar-riċetturi tal-glutamate, jew teħtieġ funzjoni NMDAR f'ab KCs.

Il-konċentrazzjoni ta 'Mg2 plus fin-newroni ab hija elevata f'dubbien mitmugħa għolja Mg2 plus Aħna użajna MagFRET, l-ewwel sensur fluworexxenti Mg2 plus ikkodifikat ġenetikament (Lindenburg et al., 2013), biex tittestja jekk Mg2 flimkien ma' l-għalf bidlitx il-konċentrazzjoni intraċellulari Mg2 plus ([Mg2). flimkien ma ]i). Bnejna dubbien li fihom transġene UAS-MagFRET-1 u kkombinajna ma' c739-GAL4 biex nesprimi MagFRET- 1 f'KCs ab. Aħna qabblu s-sinjali FRET f'imħuħ fissi minn c739; UAS-MagFRET-1 dubbien mitmugħa jew 1 mM jew 80 mM MgCl2 ikel għal 4 ijiem. Is-sinjal MagFRET kien ogħla b'mod sinifikanti kemm fil-kollaterali a u b ta 'ab KCs ta' dubbien mitmugħa b'80 mM, milli f'dawk mitmugħa b'1 mM (Figura 1E). Dan ir-riżultat jindika li t-tmigħ Mg jgħolli n-newronali [Mg2 plus ]i. Minħabba l-affinità ta 'MagFRET-1 (Kd=148 mM) u ż-żieda ta' ~ 50 fil-mija fis-sinjal FRET fuq l-irbit ta 'Mg2 flimkien (Lindenburg et al., 2013), aħna nistmaw li t-titjib ta' ~ 8 fil-mija ta ' is-sinjal MagFRET imkejjel f'dubbien mitmugħa 80 mM MgCl2 jikkorrispondi bejn wieħed u ieħor għal żieda ta '50 mM ta' ab KC [Mg2 plus ]i bħala medja.

It-trasportatur Mg2 plus tat-tip CNNM kodifikat mhux estiż għandu rwol fil-memorja

Aħna identifikajna mhux estiż (uex; Maeda, 1984; Coulthard et al., 2010) bħala LTM li jinxtamm appetittiv li jbiddel il-ġeni, imsaħħaħ bi premju sukrożju. Dubbien bl-inserzjoni uexMI01943 MiMIC (Venken et al., 2011) wrew difett qawwi fil-memorja ta '24 siegħa, iżda l-prestazzjoni tagħhom immedjatament wara t-taħriġ ma kinitx distinta minn dik ta' kontrolli tat-tip selvaġġ. Analiżi aktar dettaljata tad-dubbien uexMI01943 żvelat tħassir kostanti tal-memorja li l-ewwel sar differenti b'mod sinifikanti għal dak ta 'dubbien tat-tip selvaġġ 12-il siegħa wara t-taħriġ (Figura 2A). L-ebda difett tal-memorja ma kien evidenti f'dubbien eterozigoti uexMI01943/ plus, u dan juri li dan l-allel sesswali putattiv huwa reċessiv.

uex qanqal l-attenzjoni tagħna minħabba li huwa l-ortologu tal-fly wieħed tal-erba’ ġeni CNNM umani li jikkodifikaw it-trasportaturi Mg2 flimkien ma’ trasportaturi (Ishii et al., 2016), u fih ukoll dominju CNBH putattiv li huwa strutturalment relatat ma’ dawk f’nucleotide-gated ċikliku. kanali (Zagotta et al., 2003; Flynn et al., 2007; Kesters et al., 2015). L-allinjament tas-sekwenza UEX ta '834 aċidu amminiku ma' CNNM1-4 jiżvela konservazzjoni ta 'sekwenza partikolarment għolja b'CNNM2 u CNNM4 fid-dominji DUF21, par CBS u CNBH (Figura 2—figura suppliment 1A–C). Aħna, għalhekk, ipotizzajna li UEX kellu l-potenzjal li jgħaqqad l-effetti li jtejbu l-memorja ta 'Mg2 plus tad-dieta ma' plastiċità newronali dipendenti fuq cAMP.

Although uexMI01943 is assigned to the uex gene, the MiMIC element is annotated to lie 17 kb downstream of the uex coding region (Venken et al., 2011; Figure 2B). RYa (Yoon et al., 2016) is the next nearest gene to uexMI01943 but is >230 kb aktar 'il bogħod. L-ewwel ikkonfermajna l-post MiMIC permezz ta 'PCR inversa (Attrill et al., 2016). Importanti, l-ebda inserzjoni MiMIC addizzjonali ma nstabet f'dawn id-dubbien. Wara ttestjajna jekk uexMI01943 kienx responsabbli għad-difett tal-memorja billi neħħi b'mod preċiż l-element MiMIC permezz ta 'qtugħ medjat minn transposase ta' Minos (Arca` et al., 1997; Figura 2— figura suppliment 2A u B). It-tneħħija tal-MiMIC fid-dubbien uexMI01943.ex1 u uexMI01943.ex2 irrestawrat il-prestazzjoni normali tal-memorja ta' 24 siegħa, li turi li l-inserzjoni tal-MiMIC hija meħtieġa għall-uexMI01943memorjadifett (Figura 2C).

Kemm qRT-PCR ta 'mRNA kif ukoll analiżi tal-western blot ta' estratti ta 'proteini minn fly heads naqsu milli jiżvelaw differenza sinifikanti fl-espressjoni uex/UEX fid-dubbien uexMI01943. Aħna, għalhekk, użajna CRISPR biex nintroduċu kodon ta 'waqfien fil-ħames exon ta' kodifikazzjoni tal-locus uex (Figura 2B u Figura 2—Figura suppliment 2C). Dubbien omozigoti għall-mutazzjoni uexD li tirriżulta ma kinux vijabbli bħala adulti, u mietu fl-istadju tal-larva. B'kuntrast, dubbien eterozigoti uexMI01943/uexD kienu vijabbli, iżda l-appetitività tagħhom ta' 24 siegħamemorjakienet indebolita b'mod sinifikanti (Figura 2D). Din id-dejta turi li uex huwa ġene essenzjali u li uexMI01943 huwa allele ipomorfiku vijabbli ta' uex.

Ittestjajna wkoll l-avversivmemorjaprestazzjoni tad-dubbien mutanti uexMI01943. Omozigoti uexMI01943 dubbien esebit immedjatmemorjali ma kienx distint minn dak ta 'kontrolli eterozigoti u tat-tip selvaġġ (Figura 2E). Madankollu, il-memorja tagħhom ta’ 24 siegħa, iffurmata wara jew ħames provi ta’ taħriġ spazjat avversiv (Tully et al., 1994; Jacob and Waddell, 2020), jew prova waħda ta’ taħriġ iffaċilitat is-sawm (Hirano et al., 2013), kienet imfixkla b’mod sinifikanti. (Figura 2E). Dawn l-esperimenti jissuġġerixxu li uexMI01943 dubbien huma aktar ġeneralment kompromessi fil-kapaċità tagħhom li jiffurmaw LTM. Sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor, l-analiżi sussegwenti kollha tamemorjaf'dan l-istudju uża kondizzjonament appetittiv ippremjat biż-zokkor.

Figura 2. uexMI01943 dubbien mutanti għandhom difettużi fit-tulmemorja(LTM). (A) Iż-żamma tal-memorja appetittiva ġiet ittestjata f'diversi ħinijiet wara t-taħriġ. Dubbien omozigoti għal uexMI01943 wera difett sinifikanti fil-memorja minn 12-il siegħa wara t-taħriġ, meta mqabbel mal-prestazzjoni ta’ dubbien eterozigoti uexMI01943/ plus u ta’ kontroll tat-tip selvaġġ (p<0.05, anova,="" n="6–10)." (b)="" the="" uex="" locus="" lies="" on="" chromosome="" 2r="" between="" 3,900,285="" and="" 3,949,425="" (light="" blue="" bar).="" the="" four="" alternate="" uex="" transcripts,="" uex-re,="" uex-rg,="" uex-rh,="" and="" uex-rf,="" all="" encode="" the="" same="" protein.="" the="" uexmi01943="" mimic="" (blue="" triangle)="" resides="" ~17="" kb="" downstream="" of="" the="" uex="" coding="" region.="" the="" crispr/cas9="" edited="" uexd="" allele="" replaces="" a="" 3047="" bp="" fragment,="" including="" exon="" 7="" of="" uex="" with="" a="" stop="" signal="" (termination="" codon="" in="" all="" three="" reading="" frames)="" and="" a="" gfp="" cassette,="" truncating="" the="" uex="" reading="" frame="" (dark="" blue="" bar).="" (c)="" precise="" excision="" of="" the="" uexmi01943="" mimic="" restores="" normal="" 24="" hr="" memory="" to="" uexmi01943.ex1="" and="" uexmi01943.ex2="" flies=""><0.05, anova,="" n="8–11)." (d)="" uexd="" fails="" to="" complement="" the="" 24="" hr="">memorjadifett ta' uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="6–8)." (e)="" flies="" homozygous="" for="" uexmi01943="" showed="" a="" significant="" defect="" in="" aversive="" ltm,="" as="" figure="" 2="" continued="" on="">

Figura 2 kompliet

meta mqabbel mal-prestazzjoni ta’ dubbien eterozigoti uexMI01943/ plus u ta’ kontroll tat-tip selvaġġ (p<0.05, anova,="" n="8–12)." an="" ltm="" defect="" was="" also="" observed="" following="" five="" cycles="" of="" aversive="" spaced="" training="" and="" a="" 16="" hr="" fasting="" facilitated="" one-cycle="" training="" protocol.="" immediate="" aversive="">memorjama kienx affettwat f'dubbien mutanti omozigoti uexMI01943.

Il-verżjoni onlajn ta’ dan l-artikolu tinkludi d-dejta tas-sors li ġejja u s-suppliment(i) taċ-ċifra għall-figura 2:

Sors tad-dejta 1. Tabella ta 'zokkor u kontrolli ta' akutezza sensorja tax-xamm għall-esperimenti kollha ta 'mġieba f'dan il-manuskritt.

Suppliment tal-Figura 1. Konservazzjoni ta 'UEX bl-ortologi tagħha.

Suppliment tal-figura 2. Skemi ta' kostruzzjoni għall-qtugħ ta' uex Mino u l-ħolqien tal-allela uexD.