Parti 1: Farmakoloġija tan-Netwerk Integrata U Mudell Zebrafish Biex Jinvestigaw Komponenti b'effetti doppji Ta' Cistanche Tubulosa Għat-Trattament Kemm tal-Osteoporożi kif ukoll tal-Marda ta' Alzheimer
Mar 30, 2022
Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * u Fei Li 1, 2, *
ASTRATT
Rilevanza etnofarmakoloġika:L-osteoporożi (OP) u l-marda ta 'Alzheimer (AD) huma mard konkorrenti ġerjatriku komuni, u ħafna studji jindikaw il-konnessjoni tal-patoġenesi tagħhom. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) hija mediċina tradizzjonali Ċiniża użata ħafna u ġiet applikata b'mod estensiv biex tikkura OP u AD, rispettivament. Madankollu, l-ingredjenti attivi kemm għall-mard konkorrenti simultanjament kif ukoll għall-mekkaniżmi sottostanti huma limitati.
Għan tal-istudju:Dan ix-xogħol immira li jistabbilixxi metodu ta 'screening tan-netwerk effettiv u affidabbli biex jinstabu komposti b'effetti doppji f'CT li jistgħu jipproteġu AD u OP fl-istess ħin. U se tipprovdi perspettivi ġodda tar-rabta bejn OP u AD dwar mekkaniżmi molekulari.
Materjal u metodi:L-effetti doppji ta 'CT ġew analizzati b'mod sistematiku bl-integrazzjoni ta' databases multipli u analiżi estensiva fuq livell ta 'farmakoloġija tan-netwerk. Inbena netwerk klassifikat ta 'interazzjoni bejn il-mediċina u l-mira biex jiżvela differenzi fl-effetti bejn tipi differenti ta' komposti. Biex tipprova l-effettività ta 'dan in-netwerk, intgħażlu xi komposti biex jivverifikaw fil-mudell OP Pre-induced u l-mudell AD indott minn AlCl3-zebrafish skond il-parametri topoloġiċi.
Kliem ewlieni:Netwerk Farmakoloġija; Osteoporożi;Il-marda ta' Alzheimer; Cistanche tubulosa; Zebrafish.
Cistanche għandu funzjoni kontra l-Alzheimer.
1. Introduzzjoni
It-tendenza tal-età tal-popolazzjoni tirriżulta f'żieda fil-prevalenza tal-osteoporożi (OP) u l-marda ta 'Alzheimer (AD) matul is-snin (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Illum il-ġurnata kemm OP kif ukoll AD ġew rikonoxxuti bħala theddid kbir għas-saħħa pubblika peress li jistgħu javvanzaw mingħajr sintomi u jġibu piżijiet soċjali kbar (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Bħala mard relatat mal-età, ħafna drabi jidher li jseħħ flimkien fil-prattika klinika b'rata għolja ta' diżabilità u fatalità (Dengler-Crish u Elefteriou, 2019). OP hija marda skeletrika sistemika kkaratterizzata minn massa baxxa tal-għadam u mikro-arkitettura indebolita tat-tessut tal-għadam, b'fraġilità mtejba tal-għadam u riskju akbar ta 'ksur (Rizzoli, 2018). AD hija l-aktar deġenerazzjoni komuni tal-moħħ ikkaratterizzata minn telf progressiv tal-memorja u funzjonijiet konjittivi oħra (Bondi et al., 2017). Sa issa, għad m'hemmx għażliet b'saħħithom biżżejjed biex jipprevjenu jew ifejqu ż-żewġ mardiet tal-etjoloġija u l-patoġenesi kumplessi tagħhom. U l-agħar huwa li l-pazjent aktar spiss ikollu effetti sekondarji (Brown, 2017; Huang and Mucke, 2012).
Fuq il-bażi teoretika tad-differenzjazzjoni tas-sindromu (Sucher, 2013), il-mediċini tradizzjonali Ċiniżi (TCMs) b'komponenti multipli li jimmiraw aktar minn mekkaniżmu patofiżjoloġiku wieħed għandhom superjorità unika fit-trattament ta 'xi mard kumpless familjari. Bħala ħwawar toniku tal-kliewi, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) tintuża ħafna kontra t-telf tal-memorja u d-debbiltà atrofika tal-għadam minn tobba Ċiniżi tradizzjonali (Fu et al., 2018). Minbarra l-effikaċja tradizzjonali tagħha, riċerka konsiderevoli wriet li kellha diversi attivitajiet farmakoloġiċi, bħat-titjib tad-defiċits konjittivi u tal-imġieba (Wu et al., 2014), anti-infjammatorji (Fu et al., 2018), li jippromwovu l-formazzjoni tal-għadam, u jrażżnu l-għadam. assorbiment mill-ġdid (Li et al., 2013; Li et al., 2012), kif ukoll attività antiossidanti (Zhang et al.,2016). Iżda l-kompliċità tal-ingredjenti attivi tagħha u l-proċess metaboliku qajmet diffikultajiet kemm fl-esplorazzjoni tal-miri fit-tessuti umani kif ukoll fl-esponiment tal-mekkaniżmu ta 'azzjoni.
Fuq kollox, hija meħtieġa diskussjoni affidabbli tal-miri terapewtiċi ta 'OP/AD. Speċjalment ibbażati fuq il-ħsieb ta '"istess trattament għal mard differenti" fit-TCMs, u l-metodoloġiji ta' "terapewtika b'ħafna komponenti, netwerk bijoloġiku" farmakoloġija fin-netwerk, it-tentattivi ta 'tfittxija għal miri komuni sinifikanti bejn iż-żewġ mardiet jista' jkollhom effett partikolarment prattiku. tfisser li tipprovdi gwida għall-prevenzjoni u l-kontroll tal-OP u l-AD. Il-fish zebra għandhom xebh qawwi fil-fiżjoloġija skeletriċi tagħhom mal-mammiferi u ġeni omologi ħafna għall-bnedmin. Huwa mudell ta 'annimali disponibbli u attraenti in vivo għar-riċerka OP u AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Għalhekk, din ir-riċerka farmakoloġika tan-netwerk kienet immirata biex teżamina kostitwenti attivi b'effetti doppji ta 'CT, tesplora l-miri potenzjali komuni ta' OP u AD, kif ukoll tikxef il-possibbiltà li tuża CT biex tikkura żewġ mardiet fl-istess ħin. F'dan l-istudju, l-informazzjoni tal-miri ta 'ingredjenti attivi CT, ġenomi, u informazzjoni proteomika ta' OP u AD inġabret rispettivament minn databases differenti biex jiġi stabbilit netwerk interattiv, u nbniet analiżi ta 'arrikkiment biex tiskopri mekkaniżmi sinerġistiċi ta' CT għat-trattament ta 'OP u AD. . Barra minn hekk, induċejna mudelli taż-żebra OP u AD rispettivament, u qbadna l-komposti ewlenin fin-netwerk biex nivverifikaw l-effikaċja u l-miri tagħhom għal żewġ mardiet.
Cistanche isaħħaħ it-tkabbir ta 'sclerotin.
2. Materjali u metodi
2.1 Reaġenti
Standards kimiċi ta 'genistein (GE), quercetin (QU), aċidu abietic (AA), -sitosterol (BSS) (purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) inxtraw minn Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, iċ-Ċina). Il-pjanċi tal-kultura nkisbu minn Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, iċ-Ċina). Prednisolone (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O inxtara minn Aladdin Reagent Inc. Zebrafish alkaline phosphatase (ALP), acid phosphatase reżistenti għat-tartrat (TRAP), acetylcholinesterase (AChE), u kolin acetyltransferase (ChAT) immunosorbent assay (ELISA) marbuta mal-enżimi ġew forniti minn Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, iċ-Ċina). Trizol inkiseb minn Nanjing KeyGen Biotech. Co, Ltd (Nanjing, iċ-Ċina). Transtar Top Green qPCR SuperMix inxtara minn TransGen Biotech. Co, Ltd (Beijing, iċ-Ċina).
estratt ta' cistanche
2.2 Annimali
Zebrafish adulti (razza AB, 4 xhur) inżammu fi 28 grad taħt ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 14/10 h f'akkwarju fornut bl-iskambju ta 'ilma ħelu. Inżammu darbtejn kuljum b'dieta tal-gambli tas-salmura li għadha kemm tfaqqsa (Chen et al., 2018). Ġew magħżula embrijuni fertilizzati normalment u kkultivati għal 3 ijiem wara l-fertilizzazzjoni (dpf) f'inkubatur ta 'tkabbir ħafif. L-esperimenti kollha fuq l-annimali kienu skont il-linji gwida tal-istituzzjoni u l-gvern għall-esperimenti fuq l-annimali.
2.3 Proċess Farmakoloġiku tan-Netwerk
2.3.1 Kalkolu tal-Ispazju Kimiku u Skrinjar tal-Komposti Kandidati
Id-dejta kollha tal-ingredjenti kimiċi tas-CT inġabret mill-Pjattaforma tad-Database u l-Analiżi tal-Farmakoloġija tas-Sistemi tal-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża. TCMSP hija pjattaforma farmakoloġika ta' sistemi ta' mediċini erbali Ċiniżi li tiġbor ir-relazzjonijiet bejn id-drogi, il-miri, u l-mard (Ru et al., 2014). Sadanittant, erba' parametri essenzjali relatati mal-farmakoloġija fit-TCMSP ġew akkwistati għall-analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA), inkluż il-piż molekulari (MW), il-koeffiċjent tal-qsim bejn l-ottanol u l-ilma (AlogP), l-għadd tad-donaturi tal-idroġenu (Hdon) u l-għadd tal-aċċettaturi tal-idroġenu ( Hacc). Id-distribuzzjoni kimika ta 'CT inbniet bil-parametri ta' hawn fuq bl-użu tas-softwer SIMCA (Verżjoni 14.1, Umetrics). U mediċini ta 'molekula żgħira approvati għal AD/OP minn DrugBank ġew ipproċessati fl-istess kors. Ingredjenti minn CT ġew iffiltrati skond id-droga-likeness (DL). DL huwa kunċett kwalitattiv użat fid-disinn tad-droga għal stima ta' kemm kompost prospettiv huwa "bħal mediċina". Din il-proprjetà vitali tintuża bħala kriterju tal-għażla għall-komposti "li jixbħu d-droga" fil-ħxejjex tradizzjonali Ċiniżi u tgħin biex jiġu ottimizzati l-farmakokinetiċi u l-proprjetajiet farmaċewtiċi (Tao et al., 2013). Ibbażat fuq suġġerimenti fil-letteratura u TCMSP, għażilna DL Greater minn jew ugwali għal 0.18 bħala kundizzjonijiet tal-filtru. L-ingredjenti li jikkonformaw mal-kundizzjoni ġew esportati għal analiżi sussegwenti. L-istrutturi 2-dimensjonali (2D) u 3D tagħhom kienu miżbugħin mis-softwer ChemDraw Professional 16.0. U l-istrutturi 3D ġew ottimizzati bil-funzjoni li timminimizza l-enerġija f'Chem3D 16.0.
2.3.2 Ġbir ta' Miri Assoċjati OP u AD
L-assoċjazzjonijiet tal-ġeni kollha għal OP u AD inġabru b'mod indipendenti minn DisGeNET u GeneCards. Id-database DisGeNET hija waħda mill-akbar pjattaformi ta 'skoperta disponibbli pubblikament ta' ġeni u varjanti assoċjati ma 'mard tal-bniedem (Pinero et al., 2017). GeneCards hija database integrata ta' ġeni umani li tinkludi informazzjoni ġenomika, traskrittomika, proteomika, ġenetika, klinika u funzjonali (Safran et al., 2010).
2.3.3 Ġbir ta' Miri Komposti u Tbassir ta' Docking Inverse
Id-database GeneCards u d-database Swiss TargetPrediction ġew magħquda biex ibassru miri rilevanti ta 'ingredjenti attivi fis-CT. GeneCards jindika l-miri attivi magħrufa ta 'komposti, filwaqt li d-database ta' l-Isvizzera TargetPrediction tista' tistma l-aktar miri makromolekulari probabbli ta' molekuli żgħar (Daina et al., 2019). Qabel it-tbassir, l-istrutturi tal-molekuli kandidati ġew ikkonvertiti mill-format mol2 għall-format SMILES billi tuża Open Babel (Verżjoni 2.4.1).
2.3.4 Analiżi tal-Interazzjoni proteina-proteina
Id-database STRING ġiet applikata biex tiskopri l-interazzjonijiet fost grupp ta 'miri kondiviżi CT-OP-AD. Wara tfittxija taħt il-mudell ta '"Homo sapiens", in-netwerk ta' interazzjoni proteina-proteina (PPI) ġie viżwalizzat minn softwer Cytoscape (Verżjoni 3.7.2). STRING hija database ta 'PPI magħrufa u mbassra, derivati minn tbassir ta' kuntest ġenomu, esperimenti ta 'laboratorju ta' rendiment għoli, koespressjoni (konservata), tħaffir awtomatizzat ta 'testi, u għarfien preċedenti f'databases (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche huwa tajjeb għall-marda ta 'Alzheimer.
2.3.5 Analiżi ta' Arrikkiment tal-Pathway GO u KEGG
L-analiżi tal-arrikkiment tal-Ontoloġija tal-Ġene (GO) saret fuq is-softwer Funrich. FunRich (Verżjoni 3.1.3) huwa softwer funzjonali użat prinċipalment għall-analiżi tal-arrikkiment tal-ġeni u l-proteini (Pathan et al., 2015). Id-database tal-ConsensusPathDB-bniedem ġiet impjegata biex twettaq l-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija. Il-lista tal-ġeni miksuba ġiet sottomessa għad-database bl-issettjar "p-value cutoff" bħala 0.01. Wara li kisbu r-riżultati, dawn il-mogħdijiet biss relatati ma 'OP u/jew AD ġew magħżula u maqsuma fi gruppi skont il-kategoriji tal-funzjoni KEGG. CPDB huwa netwerk ta 'interazzjoni bla xkiel li fih interazzjonijiet binarji u kumplessi proteini-proteini, ġenetiċi, metaboliċi, ta' sinjalar, regolatorji tal-ġeni, u interazzjonijiet fil-mira tad-droga, kif ukoll mogħdijiet bijokimiċi f'Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Proċeduri Sperimentali għall-Mudell OP Zebrafish
2.4.1 Raggruppament tal-Mudell
Il-larva tal-ħut taż-żebra ġew maqsuma f'diversi gruppi: grupp ta 'kontroll, grupp mudell, grupp mudell flimkien ma' Ed, gruppi mudell flimkien ma 'komposti, li kull wieħed minnhom kien fih 30 larva. Il-grupp ta 'kontroll inżamm fil-medju b'0.2 fil-mija DMSO. Il-grupp mudell ġie ttrattat bi Pre (25 µM) minn 3 dpf sa 8 dpf. Il-grupp tal-mudell flimkien ma' Ed ġie kotrattat bi Pre u Ed (30 µg/mL).
2.4.2 Tbajja 'l-Aħmar ta' Alizarin
Wara 5 ijiem ta 'kultura b'komposti differenti, il-larva ġew anestetizzati, iffissati, u ibbliċjati min-naħa tagħhom. Aħmar alizarin intuża biex itebba l-għadam tar-ras taż-zebrafish. 1 fil-mija KOH u glycerol (proporzjonijiet ta '3:1, 1:1 u 1:3) ġew applikati rispettivament biex jitneħħew l-eċċess. Fl-aħħarnett, stereomikroskopju (Olympus SZX16) ġie impjegat biex jinqabad l-immaġini tat-tbajja taż-żebrafish taħt il-pożizzjoni suxxettibbli. Iż-żona tat-tbajja' u d-densità ottika integrata (IOD) ġew ikkalkulati minn Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Determinazzjoni tal-Attività ALP u TRAP
Larva tal-ħut taż-żebra bi 3 dpf ġew subkultivati fi 6-pjanċi bir-bir u inkubati bi Pre fil-preżenza jew in-nuqqas ta' komposti għal 5 ijiem. Imbagħad inġabru għall-kejl tal-attività tal-ALP. L-attività ALP ġiet iddeterminata bl-użu tal-kit ALP ELISA zebrafish ibbażat fuq il-protokoll tal-manifattur. Il-metodu biex tiġi evalwata l-attività TRAP kien l-istess bħal ALP.
2.5 Proċeduri Sperimentali għall-Mudell AD Zebrafish
2.5.1 Raggruppament tal-Mudell
Il-larva tal-ħut taż-żebra kienu maqsuma f'diversi gruppi: grupp ta 'kontroll, grupp mudell, grupp mudell flimkien ma' DPZ, gruppi mudell flimkien ma 'komposti, li kull wieħed minnhom kien fih 30 larva. Il-grupp ta 'kontroll inżamm fil-medju b'0.2 fil-mija DMSO. Il-grupp mudell ġie ttrattat b'AlCl3 (150 µM, pH 5.8) minn 3 dpf sa 6 dpf. Il-grupp mudell flimkien ma 'DPZ ġew ko-trattati b'AlCl3 u DPZ (8 µM).
2.5.2 Analiżi tal-Imġieba
Wara 3 ijiem ta 'kunsinni tad-droga, il-moviment tal-larva ġie rreġistrat mill-analizzatur tal-imġieba ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). L-esperimenti kollha tlestew f'60 min f'28˚C, li fihom 3 ċikli ta 'fażi dawl/dlam (10 min kull wieħed għal dawl u dlam). Skont il-metodi fir-rapport preċedenti, il-veloċità medja (AS), il-bidla fil-veloċità (∆S), ir-rata ta' rkupru tad-diskinesja (DRR, ekwazzjoni a), u l-effiċjenza tar-rispons (RE, ekwazzjoni b) huma magħżula bħala l-effiċjenza tad-droga kontra l-AD indiċi ta' evalwazzjoni f'dan il-mudell (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/sec)=D / T, DRR ( fil-mija )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
fejn D hija d-distanza tal-moviment taż-zebrafish matul 60 min, T huwa l-ħin sperimentali.
RE ( fil-mija )=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
fejn ∆S hija l-bidla fil-veloċità taż-zebrafish f'ċikli tad-dawl/dlam.
2.5.3 Kejl tal-Attività tal-AChE u t-Chat
Larva tal-ħut taż-żebra fi 3 dpf ġew subkultivati fi 6-pjanċi bir-bir u inkubati b'AlCl3 fil-preżenza jew in-nuqqas ta' komposti għal 3 ijiem. Imbagħad inġabru għall-attività AChE. L-attività AChE ġiet skoperta bl-użu tal-kit AChE ELISA zebrafish ibbażat fuq il-protokoll tal-manifattur. Il-metodu biex tiġi evalwata l-attività ChAT kien l-istess bħal AChE.
2.6 Analiżi kwantitattiva tal-PCR f'ħin reali
Il-larva tal-fish zebra ġew maqsuma fi gruppi OP u AD. Gruppi OP kienu jikkonsistu mill-grupp ta 'kontroll, grupp Pre, u gruppi ta' komposti Pre plus, ikkultivati minn 3 dpf sa 8 dpf. Gruppi AD inkludew il-grupp ta 'kontroll, grupp AlCl3, u gruppi ta' komposti AlCl3 flimkien, ikkultivati minn 3 dpf għal 5 dpf. Kull grupp kien fih 30 larva. L-RNA totali ġie rispettivament estratt minn dawn il-kampjuni ta 'larva ta' zebrafish minn Trizol. Kampjuni ta 'RNA ġew traskritti b'lura għal cDNA skond l-istruzzjoni tal-manifattur tal-kit cDNA. Il-livell ta 'espressjoni ta' mRNA ġie skopert minn PCR kwantitattiv fluworexxenti f'ħin reali (Roche LightCycler96). Ir-riżultati ġew normalizzati għal espressjoni -actin u kkwantifikati bil-metodu komparattiv (2−∆∆Ct). Primers bil-quddiem u b'lura użati ġew sintetizzati minn Sangon Biotech (Shanghai, iċ-Ċina) u elenkati fit-Tabella Supplimentari S1.
cistanche u Tongkat ali trabjgħin biex itejjeb l-immunità.
Għal aktar informazzjoni, jekk jogħġbok ikklikkja hawn.
2.7 Analiżi Statistika
GraphPad Prism verżjoni 8.00 intużat għal analiżi ta' statistika deskrittiva. Id-dejta ġiet espressa bħala medja ± SD u analizzata bil-metodu ANOVA biex tiġi ttestjata l-varjabbiltà bejn kull prova meta kkunsidrat P Inqas minn jew ugwali għal 0.05 bħala sinifikanti.
