Parti 1: Identifikazzjoni tan-newroni dopaminerġiċi li jistgħu kemm jistabbilixxu memorja assoċjattiva kif ukoll ttemm b'mod akut l-espressjoni tal-imġieba tagħha

Kuntatt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Michael Schleyer,1* Alice Weiglein,1 Juliane Thoener,1 Martin Strauch,2 Volker Hartenstein,3

Melisa Kantar Weigelt,1 Sarah Schuller,1 Timo Saumweber,1 Katharina Eichler,4,5,6 Astrid Rohwedder,4,7 Dorit Merhof,2 Marta Zlatic,5,7 Andreas S. Thum,4,8 u Bertram Gerber1,9 ,10*

1Leibniz Institute for Newrobiology, Dipartiment Ġenetika tat-Tagħlim uMemorja, 39118 Magdeburg, Ġermanja, 2Istitut tal-Immaġini u Viżjoni tal-Kompjuter, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Ġermanja, 3Dipartiment tal-Bijoloġija Molekulari, Ċelluli u tal-Iżvilupp, Università ta’ Kalifornja, Los Angeles, California 90095-1606, 4Università ta’ Konstanz, Istitut għall-Bijoloġija, 78464 Konstanz, il-Ġermanja, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Newrobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Dipartiment taż-Żooloġija, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, ir-Renju Unit, 8University Leipzig, Istitut għall-Bijoloġija, 04103 Leipzig, il-Ġermanja, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, il-Ġermanja, u 10Istitut għall-Bijoloġija, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, il-Ġermanja

Transizzjoni adattiva mill-esplorazzjoni tal-ambjent fit-tfittxija ta’ riżorsi vitali għall-isfruttament ta’ dawn ir-riżorsi ladarba t-tfittxija kienet ta’ suċċess hija importanti għall-annimali kollha. Hawnhekk nistudjaw iċ-ċirkwiti newronali li jippermettu lill-larva Drosophila melanogaster ta 'kull sess biex tinnegozja din it-tranżizzjoni ta' esplorazzjoni-esplojtazzjoni. Nagħmlu dan billi nikkombinaw il-kondizzjonament Pavlovjan ma 'traċċar ta' mġiba b'riżoluzzjoni għolja, manipulazzjoni optoġenetika ta 'newroni identifikati individwalment, u analiżi bbażata fuq id-dejta EM ta' organizzazzjoni sinaptika. Insibu li l-attivazzjoni optogenetika tan-newron dopaminerġiku DAN-i1 tista' t-tnejn tistabbilixximemorjawaqt it-taħriġ u ttemm b'mod akut l-imġieba ta' tfittxija mgħallma f'test ta' recall sussegwenti. L-attivazzjoni tagħha tħalli l-imġieba intrinsika mhux affettwata, madankollu. Speċifikament, l-attivazzjoni DAN-i1 tista 'tistabbilixxi memorji assoċjati ta' valenza opposta wara taħriġ imqabbad u mhux paired b'riħa, u l-attivazzjoni tagħha waqt it-test ta 'l-irtirar tista' ttemm l-imġieba ta 'tfittxija li tirriżulta minn waħda minn dawn il-memorji. Ir-riżultati tagħna jissuġġerixxu wkoll li fis-sinifikat komportamentali tagħha l-attivazzjoni DAN-i1 tixbaħ, iżda ma tixbahx il-premju taz-zokkor. Analiżi Dendrogram tal-konnessjonijiet sinaptiċi kollha bejn DAN-i1 u ż-żewġ miri ewlenin tiegħu, iċ-ċelluli Kenyon, u n-newron tal-ħruġ tal-ġisem tal-faqqiegħ MBON-i1, jissuġġerixxu wkoll li s-sinjali DAN-i1 waqt it-taħriġ u waqt it-test tal-irtirar jistgħu jitwasslu lil iċ-ċelluli Kenyon u lil MBON-i1, rispettivament, fi ħdan strutturi tal-fergħat lokalment limitati li qabel ma kinux rikonoxxuti. Dan jipprovdi motiv ta 'ċirkwit eleganti biex itemm it-tfittxija meta titlesta b'suċċess.

Kliem ewlieni: dopamine; esplorazzjoni-esplojtazzjoni; korp tal-faqqiegħ; Optoġenetika; rinfurzar; tfittxija

Cistanchejista 'jtejjeb il-memorja

Dikjarazzjoni ta' Sinifikat

Fil-ġlieda għas-sopravivenza, l-annimali jridu jesploraw l-ambjent tagħhom biex ifittxu l-ikel. Ladarba jinstab l-ikel, madankollu, huwa adattiv li tipprijoritizza l-isfruttament tiegħu fuq it-tkomplija ta 'tfittxija li issa tkun inutli daqs it-tfittxija għan-nuċċalijiet li tkun tilbes. Dan il-kompromess bejn l-esplorazzjoni u l-isfruttament huwa importanti għall-annimali u l-bnedmin, kif ukoll għall-apparati ta’ tiftix tekniku. Aħna ninvestigaw liema mill-uniċi 10,000 newroni ta' larva tad-dubbiena tal-frott jista' jxaqleb il-bilanċ f'dan il-kompromess, u nidentifikaw newron tad-dopamina wieħed imsejjaħ DAN-i1 li jista' jagħmel dan. Minħabba x-xebh fil-funzjoni tan-newroni tad-dopamina madwar l-annimali king-

dom, dan jista' jirrifletti prinċipju ġenerali ta' kif it-tfittxija tintemm ladarba tirnexxi.

Introduzzjoni

Annimal li jesplora l-ambjent tiegħu jista’ juża l-esperjenza tal-passat biex jiggwida t-tfittxija tiegħu għall-ikel. Meta jinstab l-ikel, madankollu, huwa adattiv li ttemm it-tfittxija u minflok jiġi sfruttat is-sors tal-ikel. Hawnhekk nistudjaw iċ-ċirkwiti li jippermettu lill-larva Drosophila melanogaster tinnegozja din it-tranżizzjoni ta 'esplorazzjoni-esplojtazzjoni. Is-sempliċità numerika tal-moħħ tal-larva, flimkien ma 'espressjoni transġene speċifika għaċ-ċelluli u għarfien tal-konnettività sinaptika tagħha (Pfeiffer et al., 2010; Li et al., 2014; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020), jippermetti li dan jiġi investigat fil-livell ta 'newroni identifikati individwalment.

Il-larva ta’ D. melanogaster faċilment jassoċjaw irwejjaħ ma’ premju tal-ikel (Scherer et al., 2003; Gerber and Hendel, 2006; Schipanski et al., 2008; Rohwedder et al., 2012; Apostolopoulou et al., 2014; Kudow et al., 2014; , 2017, 2019). B'mod kritiku, imġieba mgħallma bbażata fuq dawn l-assoċjazzjonijiet ta 'riħa-ikel tieqaf jekk waqt test ta' sejħa lura l-premju jkun preżenti (Fig. 1A). L-imġiba mgħallma għalhekk tista' titqies bħala tfittxija, li tiġi tterminata b'mod adattiv mir-riżultat imfittex (jiġifieri, mill-premju) (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a). L-imġieba innata li tinxtamm mhijiex affettwata bl-istess mod (Fig. 1B), li tissuġġerixxi li tali imġieba intrinsika hija organizzata b'mod li jixbah ir-rifless (Schleyer et al., 2011, 2013, 2015a,b). Għalhekk, premjijiet naturali jistgħu jinduċu żewġ effetti: matul it-taħriġ, jipprovdu sinjal ta 'premju li jista' jkun assoċjat ma 'indikazzjonijiet li sussegwentement jiggwidaw it-tfittxija ta' premju; u matul it-test tar-recall, jistgħu jtemmu b'mod akut din it-tfittxija mgħallma, u jipprevjenu lill-annimali milli jitbiegħdu minn riżors ladarba jinstab. Din it-tranżizzjoni għalhekk tirrifletti bidla fl-istrateġija għall-kisba ta 'premju, mhux bidla fil-motivazzjoni (jiġifieri, mhux telf ta' interess fil-premju).

Invertebrati u invertebrati bl-istess mod, newroni dopaminerġiċi (DANs) jipprovdu sinjali ta' rinfurzar għat-tagħlim assoċjattiv (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun and Rothenfluh, 2017). F'D. melanogaster, settijiet distinti ta' DANs iwasslu rinfurzar appetittiv u avversiv, rispettivament (larva: Schroll et al., 2006; Rohwedder et al., 2016; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; dubbien adulti: Schwaerzel et al., 2003; Claridge-Chang et al., 2009; Liu et al., 2012) (xenarju simili jista’ jkun ukoll invertebrati emerġenti: Lammel et al., 2012; Groessl et al., 2018; Menegas et al., 2018; al., 2018). Li jistabbilixxu struttura kompartimentali, dawn DANs jaqsmu l-fibri paralleli taċ-ċelloli Kenyon (KCs), in-newroni intrinsiċi taċ-ċentru tax-xamm ta 'l-ogħla ordni ta' l-insetti, imsejjaħ il-ġisem tal-faqqiegħ. Filwaqt li jirrispettaw din l-istess struttura kompartimentali, newroni tal-ħruġ tal-ġisem tal-faqqiegħ (MBONs) jiġbru in-formazzjoni madwar il-KCs u jibagħtuha lejn ċirkwiti efferenti (ara Fig. 2A–D) (larva: Selcho et al., 2009; Pauls et al., 2010). ; Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018; Eschbach et al., 2020; adulti: Sejourne et al., 2011; Places et al., 2013; Aso et al., 2014a,b; Oswald u Waddell , 2015; Takemura et al., 2017). Notevolment, rikostruzzjoni reċenti tal-mikroskopju elettroniku wriet li DANs għandhom żewġ miri ewlenin: il-KCs u l-MBONs (ara Fig. 2B) (larva: Eichler et al., 2017; adulti: Takemura et al., 2017).

Fil-larva D. melanogaster, l-attivazzjoni tad-DANs mill-cluster pPAM tista 'teżerċita effett ta' sodisfazzjon waqt it-taħriġ (Rohwedder et al., 2016). Mill-erbat ijiem ta 'dan il-cluster, tnejn jistgħu individwalment jagħtu effett ta' sodisfazzjon bħal dan (DAN-h1 u DAN-i1) (Saumweber et al., 2018). Hawnhekk, għażilna li niffukaw

Figura 1. Iz-zokkor jista 'jagħti premju u sinjali ta' terminazzjoni ta 'tfittxija. A Larva ġew imħarrġa b'tali mod li riħa ġiet ippreżentata jew paired jew mhux imqabbla ma 'zokkor. F'test ta' recall sussegwenti, ġew ttestjati għall-preferenza tar-riħa tagħhom jew fin-nuqqas jew fil-preżenza taz-zokkor (skeċċ lejn in-naħa ta' fuq). Ittestjar fin-nuqqas ta 'zokkor żvelat olfactory assoċjattivamemorja, ikkwantifikat bħala PI pożittiv. L-espressjoni tal-imġieba ta 'danmemorjaġie mitmum fil-preżenza taz-zokkor. Għalhekk, iz-zokkor jista 'jikkonferixxi żewġ tipi ta' sinjal: waqt it-taħriġ, jipprovdi sinjal ta 'premju li jista' jiġi assoċjat mar-riħa biex jiggwida lill-annimali aktar tard fit-tfittxija tagħhom ta 'premju; u matul it-test tar-recall, iz-zokkor bħala l-premju mfittex jipprovdi sinjal biex itemm din it-tfittxija mgħallma. Daqsijiet tal-kampjun: N=29, N =28. B, Il-larva ġew ittestjati għal preferenza ta 'riħa intrinsika, jew fin-nuqqas jew fil-preżenza ta' zokkor (skeċċ lejn in-naħa ta 'fuq). Iz-zokkor ma affettwax l-imġieba li tinxtamm innata, li tissuġġerixxi l-organizzazzjoni tiegħu bħal rifless. Daqsijiet tal-kampjun: N=20 kull wieħed. Ittri differenti 'l fuq mill-plottijiet tal-kaxxa jindikaw sinifikat f'pari (Test U Mann–Whitney, p, 0.05, ikkoreġut skont Bonferroni-Holm). *Sinifikat minn żero (test tas-sinjal ta' kampjun wieħed, p, 0.05, ikkoreġut skont Bonferroni-Holm). ns, mhux sinifikanti. It-testijiet statistiċi kollha u r-riżultati tagħhom huma rrappurtati flimkien mad-dejta tas-sors fil-Figura ta' Dejta Estiża 1-1. Għall-valuri tal-preferenza tar-riħa sottostanti l-punteġġi PI ta 'dan l-esperiment, ara Figura 9A.

Figura 2. Iċ-ċirkwiti tal-matriċi DAN-KC-MBON. Il-kijażma tal-lobu medjali. L-informazzjoni dwar ir-riħa tiġi pproċessata biex tinduċi approċċ intrinsiku, kif ukoll lejn ir-reġjun tal-kaliċi tal-KCs tal-ġisem tal-faqqiegħ (vjola; murija bis-sħiħ huwa eżempju wieħed KC fuq in-naħa tal-lemin). L-informazzjoni dwar il-premju tat-togħma hija bl-istess mod ipproċessata biex tiggwida l-imġieba intrinsika, kif ukoll permezz ta 'newroni modulatorji aminerġiċi l-aktar (wiri huwa DAN-i1, lewn/iswed) lejn kompartimenti individwali tal-lobi tal-ġisem tal-faqqiegħ (fuq in-naħa tax-xellug, il-kompartimenti huma indikati). Kull wieħed mill-erba 'kompartimenti tal-lobu medjali (hk) jirċievi input minn DAN wieħed li jinnerva wkoll l-istess kompartiment fl-emisferu kontralaterali. L-MBONs tal-lobu medjali jiġbdu minn kompartimenti singoli, tipikament taż-żewġ emisferi (wiri huwa MBON-i1, maġenta/isfar), u jwasslu l-output tagħhom, f'konfigurazzjonijiet li jvarjaw bejn il-kompartimenti, madwar id-diviżjoni emisferika. B'mod kollettiv, l-MBONs huma responsabbli għalihommemorjaimġieba ta 'tfittxija bbażata fuq. Id-dejta hija bbażata fuq Eichler et al. (2017) u Saumweber et al. (2018). B, Il-matriċi DAN-KC-MBON fil-kompartiment i. DAN-i1 u l-biċċa l-kbira tal-KCs jistabbilixxu sinapsi kimiċi reċiproċi, u kemm DAN-i1 kif ukoll KCs jipprovdu output lil MBON-i1. Għas-sempliċità, sinapsi biss bin-newroni tax-xellug DAN-i1 u MBON-i1 huma murija fid-dettall. L-istess konnettività tinsab fil-biċċa l-kbira, jekk mhux kollha, tal-kompartimenti l-oħra (Eichler et al., 2017; Saumweber et al., 2018). C, DAN-i1 (lewn) jirċievi input minn barra l-ġisem tal-faqqiegħ (griż skur) ipsilaterali mal-ġisem taċ-ċellula tiegħu (reġjun immarkat 1) u mbagħad jinnerva l-kompartiment i fiż-żewġ emisferi (ittikkettati 2 u 3). MBON-i1 (maġenta) jaqsam il-linja tan-nofs darbtejn; jirċievi input fil-kompartiment i taż-żewġ emisferi u jipprovdi output f'reġjuni maġenb il-korp tal-faqqiegħ taż-żewġ emisferi. D, L-istess bħal f'Ċ, iżda f'dehra kemmxejn inklinata, li turi rikostruzzjonijiet tal-iskeletru tan-newroni tax-xellug DAN-i1 u MBON-i1 u eżempju wieħed KC (iswed). Id-dejta hija bbażata fuq Eichler et al. (2017). E, Dendrogram tan-newron DAN-i1 tax-xellug. It-tikek ikkuluriti jirrappreżentaw sinapsi tal-ħruġ minn DAN-i1. Trijangoli jirrappreżentaw sinapsi input għal DAN-i1. Il-kuluri jirrappreżentaw in-newron sieħeb tas-sinapsi rispettiva. Is-sinapsi l-oħra kollha fil-ġisem tal-faqqiegħ huma mmarkati "Oħrajn." Mhux murija huma sinapsi li DAN-i1 jifforma b'newroni barra l-ġisem tal-faqqiegħ, b'mod partikolari fir-reġjun 1 (Eschbach et al., 2020). Linji stippled jindikaw reġjuni fejn in-newron jaqsam il-linja tan-nofs tal-moħħ. F, L-istess bħal f'E, iżda għan-newron MBON-i1 tax-xellug. Mhux murija huma sinapsi li MBON-i1 jifforma b'newroni barra l-ġisem tal-faqqiegħ. Għal verżjonijiet b'riżoluzzjoni għolja tan-newroni DAN-i1 u MBON-i1 taż-żewġ emisferi, kif ukoll il-KCs maturi kollha, ara Figuri ta' Data Estiża 2-1, 2-2, u 2-3, rispettivament .

fuq DAN-i1 minħabba li qabel ġie analizzat f'aktar dettall (Saumweber et al., 2018) u minħabba li jagħti effett ta 'premjazzjoni aktar robust minn DAN-h1 (Saumweber et al., 2018; data mhux ippubblikata). L-ewwel nipprovdu rendikont dettaljat tal-arranġament spazjali tas-sinapsi kollha bejn DAN-i1 u ż-żewġ imsieħba ewlenin tal-output tiegħu, MBON-i1 u l-KCs. Imbagħad, nistaqsu jekk l-attivazzjoni optoġenetika ta 'DAN-i1 tistax timmedja mhux biss sinjal ta' premju waqt it-taħriġ iżda wkoll sinjal biex ittemm b'mod akut it-tagħlimiet li jfittxu l-premju waqt it-test tal-irtirar.

bodybuilding cistanche

Materjali u metodi

Mudell sperimentali u dettalji tas-suġġett. Larva tat-tielet stadju tal-għalf taż-żewġ sessi (D. melanogaster), ta 'età ta' 5d wara t-tqegħid tal-bajd, intużaw tul. Id-dubbien inżammu fuq medju standard, fil-kultura tal-massa f'25 grad, 60 fil-mija -70 fil-mija umdità relattiva, u ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12/12 h. Ħadna kuċċarina ta 'medja ta' l-ikel minn kunjett ta 'l-ikel, għażilna b'mod każwali n-numru mixtieq ta' larva, laħlaħhom fil-qosor fl-ilma tal-vit, u bdejna l-esperiment.

Aħna użajna larvi transġeniċi biex nesprimu l-kanal tal-joni ChR2-XXL li jaħdem mid-dawl fid-DANs. Għal dan il-għan, ir-razza effetur UAS-ChR2-XXL (Dawydow et al., 2014) (ġentilment ipprovduta minn R. Kittel, Università ta' Leipzig), inqabżet għal waħda minn żewġ razez tas-sewwieq: jew 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer et al., 2008; Liu et al., 2012; Rohwedder et al., 2016) (Bloomington Stock Centre nru. 41347) jew ir-razza tas-sewwieq split-Gal4 SS00864 (Eichler et al., 2017; Saumweber; et al., 2018) biex tikseb frieħ doppju eterozigoti. Sewwieq jikkontrolla r-razez tas-sewwieq ġew qasmu għal kopja lokali ta 'w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Bħala effector jikkontrolla razza li ġġorr is-siti tal-inżul użati għall-Gal4 (attP2) jew il-qasma-Gal4 (attP40/attP2), iżda mingħajr dominju Gal4 imdaħħal ("vojt") (Pfeiffer et al., 2010), inqabżet għal UAS- ChR2-XXL. Aħna kkonfermajna l-mudell tal-espressjoni ta '58E02 u SS00864 billi qasmuhom għal pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer et al., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Minħabba li ChR2-XXL huwa sensittiv biżżejjed biex jiġi attivat bid-dawl tal-ġurnata (mhux murija), id-dubbien tqajmu f'kunjetti mdallma kontinwament minn tgeżwir tal-kartun iswed. Għall-esperiment ippreżentat fil-Figura 8E, UAS-ChR2 (Schroll et al., 2006) inqabeż għal 58E02-Gal4.

Setup sperimentali. Għal esperimenti ta 'mġieba, larvi ġew imħarrġa f'platti Petri ta' dijametru intern ta '9 ċm u ttestjati f'platti Petri ta' dijametru intern ta '9 jew 15cm (it-tnejn minn Sarstedt) kif imsemmi fil-leġġendi tal-figura, fil-każijiet kollha mimlija b'1 fil-mija agarose (grad ta' elettroforeżi). ; Roth). Bħar-riħa, użajna n-amyl acetate dilwit 1:20 f'żejt tal-paraffin (AM; CAS: 628-63-7; Merck), u f'xi każijiet addizzjonalment mhux dilwit 1-octanol (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).

L-esperimenti saru ġewwa kaxxa tal-madwar ta' 43 43 73cm mgħammra b'mejda tad-dawl apposta li fiha 24 12 firxa LED (470nm; Solarox) u pjanċa ta' diffużjoni ta' 6-mm ħxuna ta' Plexiglas matt fuq nett biex tiżgura dawl blu uniformi għall-attivazzjoni ChR2-XXL (120mW/cm2). Dixxijiet Petri tpoġġew direttament fuq il-pjanċa tad-diffużjoni. Id-dixxijiet Petri kienu mdawra b'ċirku ta 'diffużjoni tal-polyethylene; wara ċ-ċirku tad-diffużjoni, ġew immuntati 30 LED infra-aħmar (850nm; Solarox) biex jipprovdu illuminazzjoni li kienet inviżibbli għal-larva iżda ppermettew ir-reġistrazzjoni u t-traċċar tal-imġieba tagħhom għal analiżi offline. Għal dan il-għan, kamera (Basler acA204090umNIR; Basler) mgħammra b'filtru infrared-pass tpoġġiet fuq id-dixx Petri. Għal dettalji addizzjonali dwar is-setup sperimentali, ara Saumweber et al. (2018).

bodybuilding cistanche

Tagħlim assoċjattiv ta' riħa-zokkor. L-esperimenti ta' tagħlim segwew protokolli stabbiliti (Michels et al., 2017). Il-kontenituri tar-riħa ġew ippreparati billi żiedu 10ml ta 'sustanza ta' riħa għal kontenituri tat-Teflon magħmulin apposta (dijametru ta 'ġewwa ta' 5 mm b'għatu mtaqqab b'7 toqob ta 'dijametru ta' 0.5 mm kull wieħed). Dixxijiet Petri kienu mgħottija b'għotjien modifikati mtaqqba fiċ-ċentru bi 15-il toqba ta 'dijametru ta' 1 mm kull wieħed biex itejbu l-arjazzjoni.

Għat-taħriġ ta' riħa-zokkor, 20 larva tqiegħdu f'nofs dixx Petri mimli b'agarose li kien fih 2mol/L D-fructose (CAS: 57-48-7; Roth) bħala premju (1) u mgħammra b'żewġ riħa. kontenituri fuq naħat opposti, it-tnejn mimlija bl-AM (AM1). Wara 2.5min, il-larva ġew spostati fuq dixx Petri frisk b'agarose sempliċi u bla togħma, mgħammra b'żewġ kontenituri vojta (EM), fejn qattgħu wkoll 2.5min. Twettqu tliet ċikli ta’ taħriġ “imqabbla” bħal dawn, f’kull każ bl-użu ta’ dixxijiet Petri friski. F'nofs il-każijiet, it-taħriġ beda bi dixxijiet Petri li fihom il-premju kif indikat (AM1/EM), filwaqt li fin-nofs l-ieħor tal-każijiet is-sekwenza ġiet maqluba (EM/AM1). Għal kull koorti ta 'larva mħarrġa AM1/EM (jew EM/AM1), it-tieni koorti ġiet imħarrġa reċiprokament, jiġifieri, permezz ta' preżentazzjonijiet "mhux imqabbla" ta 'riħa u premju (AM/EM1, jew EM1/AM, rispettivament).

Wara t-taħriġ, il-larva ġew trasferiti fin-nofs ta 'dixx Petri tat-test u ttestjati għall-preferenza tar-riħa tagħhom. Importanti, it-test tal-irtirar sar jew fuq dixx Petri sempliċi biex jiġi vvalutatmemorjaimġieba ta’ tfittxija bbażata fuq jew fuq dixx Petri li jkun fih premju biex jiġi ddeterminat jekk il-preżenza ta’ premju temmetx il-memorjatfittxija bbażata fuq. Fi kwalunkwe każ, naħa waħda tad-dixx Petri tat-test kienet mgħammra b'kontenitur AM u n-naħa l-oħra b'kontenitur EM. In-numru ta' larvi fuq kull naħa ġie determinat mill-immaġni tal-kamera fi 3min wara li jkun beda t-test. Minn dawn in-numri, ġiet ikkalkulata preferenza ta' riħa kif ġej:

Għalhekk, il-valuri PI jistgħu jvarjaw minn 1 għal 1, b'valuri pożittivi li jindikaw li l-larva ppreferew ir-riħa aktar wara t-taħriġ imqabbad milli mhux imqabbad. Valuri PI pożittivi għalhekk jindikaw assoċjattiv appetittivmemorjali huwa l-aħjar interpretat bħalamemorjaimġieba ta 'tfittxija bbażata fuq. Valuri negattivi tal-PI, b'kuntrast, jindikaw assoċjattiv avversivmemorja.

Tagħlim assoċjattiv permezz ta' attivazzjoni DAN optoġenetika. Għal esperimenti optoġenetiċi, it-taħriġ u t-test saru b'mod analogu. Madankollu, id-dixxijiet Petri kollha kienu mimlija b'agarose sempliċi (jiġifieri, ma ntużaw l-ebda degustazzjoni ta 'sodisfazzjon). Minflok, għal taħriġ imqabbad, AM ġiet imqabbda ma 'stimulazzjoni tad-dawl blu kontinwu biex jattiva jew 58E02-DAN jew 864- DAN għal 2.5min, segwit minn 2.5min ta' dlam mingħajr riħa (AM1/EM). Għal taħriġ mhux imqabbad, il-preżentazzjoni tar-riħa u l-istimulazzjoni tad-dawl seħħew separatament (AM/EM1). Għall-esperiment ippreżentat fil-Figura 8E, ir-riħa u d-dawl ġew ippreżentati għal 5min kull wieħed; dak l-esperiment segwa l-proċeduri deskritti minn Rohwedder et al. (2016).

Wara tliet ċikli ta 'taħriġ bħal dawn, it-test ta' recall sar, u l-preferenza tar-riħa u l-PI ġew ikkalkulati kif deskritt. B'mod kritiku, it-test tal-irtirar sar jew mingħajr attivazzjoni tad-dawl blu biex jiddetermina jekk id-DANs jimmedjawx sinjal ta 'premju waqt it-taħriġ jew b'attivazzjoni tad-dawl blu biex jiddeterminaw jekk, barra minn hekk, id-DAN jistgħux jimmedjaw sinjal biex itemmu t-tfittxija.

Varjazzjonijiet ta 'dan il-protokoll huma indikati fil-leġġendi tal-figura.

Imġieba li tinxtamm innata. Kontenituri tar-riħa u dixxijiet Petri ġew ippreparati kif deskritt hawn fuq. Ġew miġbura koorti ta';20 larva mill-kunjett, maħsula fil-qosor fl-ilma tal-vit, u mqiegħda fuq dixx Petri b'kontenitur AM fuq naħa waħda u kontenitur vojt fuq in-naħa l-oħra. Wara 3min, il-preferenza ta' riħa intrinsika ġiet iddeterminata skont l-Ekwazzjoni 1. Dan it-test ta' preferenza sar jew fin-nuqqas jew fil-preżenza taz-zokkor, jew fin-nuqqas jew fil-preżenza ta' attivazzjoni tad-dawl blu, biex jiġi ddeterminat jekk dawn il-kundizzjonijiet tat-test ibiddlux. imġieba li tinxtamm innata.

Analiżi tal-modulazzjonijiet tal-imġieba wara t-taħriġ bl-attivazzjoni ta' 864-DAN. L-imġiba tal-larva ġiet traċċata bil-vidjo u analizzata kif deskritt fid-dettall minn Paisios et al. (2017). Fil-qosor, ġew analizzati żewġ aspetti tal-kimotassi tal-larva. L-ewwel, il-modulazzjoni tar-ras castrate (HC kull sekonda) (HC/s) ġiet ikkalkulata kif ġej:

F'din il-miżura, l-angolu tal-intestatura (HA) jiddeskrivi l-orjentazzjoni tar-ras tal-annimal relattiva għar-riħa, b'angoli tal-intestatura assoluti (abs (HA)) ta' 0 grad jew 180 grad , pereżempju, li jindikaw li r-riħa huwa fuq quddiem jew fuq wara tal-larva, rispettivament. Din il-miżura għalhekk tagħti punteġġi pożittivi għall-attrazzjoni (jiġifieri, meta l-HC jidderieġi l-larva lejn aktar milli 'l bogħod mill-mira tar-riħa), filwaqt li tagħti punteġġi negattivi għall-istmerrija.

Immunoistokimika. L-imħuħ tal-larva ġew imqassma f'soluzzjoni salina ħielsa minn Ca{{{0}}u ffissati f'soluzzjoni ta' Bouin dilwita 1:2 b'soluzzjoni salina ħielsa minn Ca{21-għal 7min. Tliet passi tal-ħasil (kull 10min) f'PBST (0.3 fil-mija Triton-X 100 f'PBS) ġew segwiti minn inkubazzjoni bl-antikorpi primarji matul il-lejl f'4 gradi. Wara tliet ħasliet (kull 10min) f'PBS, it-tessut ġie inkubat bl-antikorpi sekondarji għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Wara tliet passi finali tal-ħasil fil-PBS (kull 10min), il-kampjuni ġew immuntati f'Vectashield (Vector Laboratories). Il-preparazzjonijiet ġew eżaminati taħt mikroskopju konfokali DM 6000 CS (Leica Microsystems).

bodybuilding cistanche

Bħala antikorpi, aħna jew użajna antikorp tal-ġurdien monoklonali anti-FASII (DSHB, dilwit 1:50 f'soluzzjoni ta 'imblukkar li fiha 4 fil-mija serum normali tal-mogħoż) u antikorp tal-fenek anti-GFP (A11122, Invitrogen, dilwit 1:1{ {28}}00 f'soluzzjoni li timblokka li fiha 4 fil-mija serum normali tal-mogħoż) bħala antikorpi primarji u antikorp Cy3 kontra l-ġrieden (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) u Alexa-488 kontra l-fenek antikorp (A11034, Invitrogen), it-tnejn dilwiti 1:200 f'PBS, bħala antikorpi sekondarji; jew użajna antikorp tal-ġurdien monoklonali anti-ChR2 (ProGen Biotechnik) dilwit 1:100 f'0.3 fil-mija PBST bħala antikorp primarju, antikorp Cy3 anti-ġurdien (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), dilwit 1:300 f'0.3 fil-mija PBST , bħala l-antikorp sekondarju, u Alexa-488 anti-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), dilwit 1:300 f'0.3 fil-mija PBST, għall-kontrostaining.