Parti 1|L-Estratt ta' Herba Cistanche Isaħħaħ il-Ġenerazzjoni Mitokondrijali ta' ATP fil-Qlub tal-Firien U Ċelloli H9c2

Kuntatt: emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung u Kam Ming Ko

Dipartiment tal-Bijokimika, Hong Kong University of Science & Technology, Clear Water Bay, Hong Kong SAR, iċ-Ċina

Kliem ewlieni: ATP,Cistanche deserticola, ċelluli H9c2, qalb, mitokondrija

Astratt

Biex tinvestiga l-bażi farmakoloġika tal-"Yang- tonqos" azzjoni ta 'Herbal Cistanche [il-pjanta sħiħa mnixxfa ta'Cistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae)], fil-mediċina Ċiniża, l-effetti tal-estratt tal-metanol ta 'Herba Cistanche fuq il-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali ġew eżaminati bl-użu ta' mudell tal-qalb tal-firien ex vivo u assaġġ taċ-ċelluli H9c2 in situ. It-trattament bl-estratt ta 'Herba Cistanche żied il-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali mijokardijaku b'mod dipendenti mid-doża fil-firien, kif evalwat permezz ta' kejl in vitro. L-istimulazzjoni tal-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP kienet assoċjata ma 'titjib parallel fit-trasport tal-elettroni mitokondrijali appoġġjat minn pyruvate iżda mhux succinate. Il-kura b'Herba Cistanche żiedet ukoll l-attivitajiet tal-kumpless mitokondrijali mijokardijaku I u l-kumpless III, bil-firxa ta 'stimulazzjoni fuq l-attività tal-kumpless I tkun akbar. It-trattament b'Herba Cistanche ipproduċa żieda dipendenti fuq id-doża u l-ħin fil-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali fiċ-ċelloli H9c2. Ir-riżultati jindikaw li t-trattament ta 'Herba Cistanche jista'iżżid il-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijalifil-qlub tal-firien ex vivo u ċelluli H9c2 in situ, possibilment permezzit-tisħiħ tal-fosforilazzjoni ossidattiva.

Cistanche jista 'jtejjeb il-funzjoni tal-qalb, ibaxxi l-pressjoni tad-demm, u jbaxxi l-lipidi tad-demm

Introduzzjoni

"Invigoration Yang", li tinkorpora t-titjib ġeneralizzat tal-funzjoni tal-ġisem fil-mediċina Ċiniża, tinvolvi l-użu tal-enerġija fit-tmexxija ta 'diversi proċessi bijokimiċi.

F'dan ir-rigward, l-ATP, li hija l-munita universali ta 'l-enerġija biex talimenta l-funzjoni ċellulari, hija prinċipalment iġġenerata permezz ta' fosforilazzjoni ossidattiva fil-mitokondrija. Aħna postulaw li "Yang tissaħħaħ" ħwawarjippossjedu l-abbiltà li jżidu l-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mitokondrijali(Ko et al., 2004). Dan huwa sostnut mis-sejba reċenti tagħna li l-ħxejjex aromatiċi Ċiniżi ta 'tonifikazzjoni "Yang-invigorating" iżda mhux "Yin-nutriment" jistgħu jtejbu l-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP mijokardijaku fil-qlub tal-ġrieden ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, il-pjanta parassitika sħiħa mnixxfa (minbarra l-fjura) ta’ Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), hija kklassifikata bħala'Yang-invigorating' ħwawar tonifying fil-mediċina tradizzjonali Ċiniża (Chen, 1998), u jidher bħala l-ingredjent l-aktar popolari f'numru ta 'formulazzjonijiet ta' privattivi Ċiniżi użati għall-yang-invigoration'. Fiċ-Ċina u l-Ġappun, Herba Cistanche tintuża ħafna għat-trattament ta 'għadd ta' sintomi ta 'defiċjenza Yang. Studji farmakoloġiċi indikaw li Herba Cistanche jista'scavenge radikali ħielsa(Xiong et al., 1996),jipproduċi sedattiv(Lu, 1998),kontra t-tixjiħ(Lee et al., 1990),effetti antinoċiċettivi u anti-infjammatorji(Lin et al., 2002), uittejjeb il-funzjoni immuni(Wu et al., 2005). L-ingredjent attiv ewlieni ta 'Herba Cistanche huwaphenylethanoid glycosides(Ouyang et al., 2003), li nstabu li kellhomantibatteriċi, kontra l-istress, u antiossidantproprjetajiet (Xiong et al., 1998), kif ukoll effetti anti-apoptotic fuq newroni kkultivati ​​(Tian & Pu, 2005). Fl-istudju attwali, sabiex tiġi investigata l-bażi farmakoloġika ta 'l-azzjoni Yang-invigorating ta' Herba Cistanche, ġew eżaminati l-effetti tat-trattament ta 'Herba Cistanche fuq il-kapaċità ta' ġenerazzjoni ta 'ATP fil-mitokondrija iżolati minn qlub tal-firien ex vivo u kardjomijoċiti H9c2 kkultivati ​​in situ. Biex tesplora l-mekkaniżmu bijokimiku sottostanti l-azzjoni li ttejjeb il-ġenerazzjoni tal-ATP, l-effetti tat-trattament ta 'Herba Cistanche fuq it-trasport tal-elettroni mitokondrijali u attivitajiet kumplessi I-IV ġew eżaminati wkoll fil-qlub tal-firien.

L-ingredjenti effettivi ta 'Cistanche jistgħu jneħħu diversi radikali ħielsa mill-ossiġnu attivi

Materjali u metodi

Kimiċi, kultura taċ-ċelluli, u materjali erbali

ATP, ADP, u 3-[4,5-dimethylthiozol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) inxtraw minn Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, l-Istati Uniti). Soluzzjoni Luciferase (ATPlite) inkisbet minn PerkinElmer (Boston, MA, USA). Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM) u serum bovin fetali (FBS) inxtraw minn GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Il-linja taċ-ċelluli H9c2 inxtrat minn ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche ġie fornut minn negozjant tal-ħxejjex lokali (Lee Hoong Kee). Il-ħwawar ġiet awtentikata mill-fornitur, u kampjun ta 'vawċer (HKUSTY00301) ġie depożitat fid-Dipartiment tal-Bijokimika, l-Università tax-Xjenza u t-Teknoloġija ta' Ħong Kong (HKUST).

Estrazzjoni tal-ħxejjex

Herba Cistanche (100g) inqatgħet f'biċċiet żgħar u mbagħad ġiet estratta billi tissaħħan taħt rifluss fi 300 mL metanol f'65◦C għal sagħtejn. Il-proċedura ġiet ripetuta darbtejn. L-estratt miġbur kien imnixxef billi s-solvent jiġi evaporat taħt pressjoni mnaqqsa, u l-estratt tal-metanol ta 'Herba Cistanche inkiseb b'rendiment ta' 39 fil-mija (w/w). Analiżi kimika indikat li l-estratt tal-metanol ta 'Herba Cistanche kien fih saponini totali, flavonoids totali, lignans totali, u polysaccharides f'konċentrazzjonijiet ta' 1.62 fil-mija (w/w), 0.08 fil-mija, 0.15 fil-mija u 75.6 fil-mija, rispettivament.

Kura tal-annimali

Firien irġiel adulti Sprague-Dawley (8–10 ġimgħat; 250–300g) inżammu taħt ċiklu ta’ skur/dawl ta’ 12-siegħa f’kamra kkontrollata bl-arja/umdità f’madwar 22◦C u ppermettew ikel u ilma ad libitum fil-Faċilitajiet tal-Kura tal-Annimali f'HKUST. Protokolli sperimentali ġew approvati mill-Kumitat tal-Prattika tar-Riċerka f'HKUST.

Trattament tad-droga

L-annimali kienu maqsuma b'mod każwali fi gruppi, b'ħames sa sitt annimali f'kull wieħed. Fil-gruppi ta 'trattament, il-firien ġew amministrati intragastrikament bl-estratt tal-metanol ta' Herba Cistanche (maħlul/sospiż fl-ilma) f'dożi dejjem jiżdiedu ({{0}}.031–0.5 g/kg) għal 3 ijiem. L-annimali tal-kontroll irċevew ilma biss. Erbgħa u għoxrin siegħa wara l-aħħar dożaġġ, il-qalb inkisbet minn annimali anestetizzati b'fenobarbital u ġiet soġġetta għal analiżi bijokimika.

Preparazzjoni ta' frazzjonijiet mitokondrijali u kejl tal-kapaċità ta' ġenerazzjoni ta' ATP (ATP-GC) ex vivo

Kampjuni tat-tessut ventrikulari tax-xellug tal-qalb tneħħew u laħlaħ b'buffer isotoniku kiesaħ bis-silġ (0.32 M sukrożju, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 7.4). Il-frazzjonijiet mitokondrijali tal-qalb ġew ippreparati permezz ta 'ċentrifugazzjoni differenzjali f'buffer iżotoniku f'4◦C. Ġie ppreparat omoġenat kardijaku ta '10 fil-mija (w/v) billi ġie omoġenizzat it-tessut ventrikulari ikkapuljat b'omoġenizzatur tal-ħġieġ tat-Teflon f'4000 rpm għal 20-30 puplesiji kompluti. L-omoġenat ġie ċentrifugat f'600 × g għal 10 min biex jitneħħew nuklei u debris taċ-ċelluli. Is-supernatant imbagħad ġie ċentrifugat fi 8000 × g għal 30 min biex jissedimenta l-mitokondrija (Evan, 1992). Il-gerbub ġew sospiżi mill-ġdid f'1 mL tal-buffer iżotoniku u rikostitwiti l-frazzjonijiet mitokondrijali. L-ATP-GC mitokondrijali ta 'annimali mhux ittrattati tkejjel bil-metodu ta' Leung et al. (2005)

Cistanche polysaccharides jistgħu jdewmu d-deġenerazzjoni fiżjoloġika tal-organi u d-deġenerazzjoni tal-morfoloġija taċ-ċelluli

Kejl tat-trasport tal-elettroni mitokondrijali

Il-kejl tat-trasport tal-elettroni f'mitokondrija iżolata, li huwa bbażat fuq it-tnaqqis tal-MTT, kif imwettaq kif deskritt minn Cohen et al. (1997). Il-mitokondrija ġew ippreparati f'konċentrazzjoni ta' proteina ta' 1 mg/mL b'buffer ta' inkubazzjoni (250 mM sukrożju, 50 mM HEPES, 10 mM KH2PO4, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4) . Alikwot (40 µL) tal-mitokondrija tħallat ma' 100 µL kull wieħed ta' 15 mM pyruvate jew 0.5 mM succinate u 0.42 mg/mL MTT. It-taħlita ta 'reazzjoni ġiet inkubata f'37◦C għal 10 min bi tħawwad ġentili. Wara l-inkubazzjoni, it-taħlita ta 'reazzjoni ġiet mitmuma biż-żieda ta' 100 µL lysis buffer (10 fil-mija, w/v, sodium dodecyl sulfate, u 45 fil-mija dimethylformamide, aġġustat għal pH 4.7 b'aċidu aċetiku glaċjali). Wara wieqfa għal 5 min, il-qari tal-assorbiment tat-taħlita ta 'reazzjoni ttieħed b'qarrej tal-pjanċa tal-mikrotiter (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) u rrapportat bħala d-differenza bejn 570 nm u 630 nm. Id-dejta ġiet espressa bħala perċentwal tal-valur medju tal-grupp ta' kontroll (jiġifieri, Herba Cistanche-mhux trattat).

Kultura taċ-ċelluli

Iċ-ċelloli H9c2, linja taċ-ċelluli permanenti derivata minn mijoblasti kardijaċi (Hescheler et al., 1991), ġew ikkultivati ​​bħala monosaffi f'DMEM supplimentat b'10 fil-mija (v/v) FBS. Il-medju kien fih glukożju (4.5 g/L) u glutamina (4.5 mM), supplimentati b'NaHCO3 (17 mM), peniċillina (100 IU/mL), u streptomycin (100µg/mL). Iċ-ċelloli kollha tkabbru taħt atmosfera ta '5 fil-mija (v/v) CO2 fl-arja f'37◦C. Il-medju kien mibdul b'medju frisk kull jumejn jew 3 ijiem. Ħażniet ta' ċelluli tkabbar f'kunjett ta' kultura ta' 75 cm2 u nqasam qabel il-konfluwenza bi proporzjon ta' subkultivazzjoni ta' 1:10. Għall-assaġġ ATP-GC, iċ-ċelluli H9c2 ġew miżrugħa b'densità ta' 2.5 × 104 ċelluli/bir ġo pjanċa ta' 24-bir. Wara t-twaħħil taċ-ċelluli, l-estratt ta 'Herba Cistanche (imdewweb f'salina buffered bil-fosfat; PBS) ġie applikat fil-medju, u ċ-ċelloli ġew inkubati għal perjodi dejjem jiżdiedu (2-16 h) ta' żmien. Iċ-ċelloli ta' kontroll (mhux ittrattati) ingħataw il-PBS biss.

Kejl ta' ATP-GC in situ

Wara l-perjodi ta' inkubazzjoni indikati bl-estratt ta' HerbaCistanche f'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu (5{{10}}–30{0µg/mL), sar l-assaġġ ATP-GC. Il-medju kien aspirat u ċ-ċelloli ġew ittrattati b'digitonin (50µg/mL) f'buffer ta' inkubazzjoni (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0.1 mM MgCl2, 0.5 fil-mija BSA, pH 7.4) għal 373 min. ◦C. Wara l-aspirazzjoni tad-digitonin, glutamate (5 mM), malate (5 mM) u ADP (60µM) ġew miżjuda maċ-ċelloli għall-ġenerazzjoni ta 'ATP mitokondrijali, li kien immonitorjat f'intervalli ta' ħin li jvarjaw minn 0 sa 15 min. Ir-reazzjoni ġiet mitmuma biż-żieda ta '60 µL ta' aċidu perkloriku (30 fil-mija, w/v), u t-taħlitiet ta 'reazzjoni mbagħad ġew ċentrifugati f'600 × ggħal 10 min f'4◦C. Alikwot (120 µL) tas-supernatant kien imħallat ma '90 µL ta' 1.4 M KHCO3 għan-newtralizzazzjoni. It-taħlitiet reġgħu ġew ċentrifugati f'600 × g f'4◦C, u s-supernatanti ġew imkejla għall-kontenut ATP kif deskritt qabel. L-ATP-GC taċ-ċelloli mhux ittrattati ġie stmat billi kkalkola l-erja taħt il-kurva tal-graff(AUC1) li tpinġi l-ATP iġġenerat (nmol/mg proteina) kontra l-ħin (0-15 min) u espress f'unitajiet arbitrarji. Għaċ-ċelloli ttrattati b'HerbaCistanche, il-valuri AUC1 ta' ħinijiet ta' inkubazzjoni li qed jiżdiedu (3, 5, 7, 10, u 15-il minuta) ġew normalizzati għal valur medju rispettiv ta' kontroll minn kampjuni mhux ittrattati u espressi bħala kontroll perċentwali. Imbagħad, iż-żona taħt il-kurva (AUC2) tal-grafika li tpinġi l-perċentwali tal-kontroll tal-valuri kontra l-ħin ta 'inkubazzjoni (3-15 min) ġiet ikkalkulata u espressa f'unitajiet arbitrarji. Id-dejta tal-gruppi ttrattati b'Herba Cistanche ġiet espressa bħala perċentwal tal-kontroll mill-ekwazzjoni:

[AUC2(HerbaCistanche − trattat)/AUC2(mhux trattat)]×100 fil-mija

Kejl ta' attivitajiet kumplessi I–IV u citrate synthase

L-attivitajiet tal-kumpless I-III tal-katina tat-trasport tal-elettroni mitokondrijali (ETC) tkejlu b'metodi spettrofotometriċi bl-użu ta' substrati speċifiċi għal kumplessi (NADH għal complexI, succinate għall-kumpless II, u decylubiquinol għal complexIII) kif deskritt (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005;Mark et al., 2001). L-attività Kumpless IV tkejjel bl-użu ta' kit ta' analiżi ta' cytochrome c oxidase minn Sigma. L-attività mitokondrijali taċ-ċitrat synthase ġiet imkejla bil-metodof Srere (1969).

Assaġġ tal-proteini

Konċentrazzjonijiet ta 'proteini ta' frazzjonijiet mitokondrijali u celllysates ġew determinati bl-użu ta 'assaykit tal-proteini BioRad bl-użu ta' albumina tas-serum bovin bħala standard ({{0}}.038–0.600mg/mL).

Analiżi statistika

Id-dejta kollha ġiet espressa bħala medja ± żball standard tat-tema (SEM). Ġew analizzati b'analiżi one-way ofvariance (ANOVA). Tqabbil multipli post hoc saru ma 'LSD. valuri P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Riżultati

Effetti tat-trattament b'Herba Cistanche fuq ATP-GC mijokardijalmitokondrijali fil-firien

Kif muri fil-Figura 1, it-trattament b'estratt ta' Herba Cistanche f'dożi sa 0.5 g/kg żied l-ATP-GC mitokondrijali mijokardijaku b'mod dipendenti fuq id-doża fil-firien, bil-grad ta' stimulazzjoni jkun 89 fil-mija f'doża. ta' 0.5 g/kg.

Effetti tat-trattament ta 'Herba Cistanche fuq it-trasport ta' l-elettroni mitokondrijali fil-qlub tal-firien

L-estent tat-trasport tal-elettroni f'mitokondrija iżolati kien imkejjel billi jiġi mmonitorjat it-tnaqqis tal-MTT. Is-sottostrat użat għall-assaġġ kien jew piruvat jew succinate.

Figura 1.L-effett tat-trattament ta' Herba Cistanche fuq il-kapaċità ta' ġenerazzjoni ta' ATP mitokondrijali fil-qlub tal-firien ex vivo

Kull bar tirrappreżenta t-tema ± SEM, b'n {{0}}. L-annimali ġew ittrattati oralment b'HerbaCistanche fid-dożi indikati ta' kuljum għal 3 ijiem. Il-kapaċità tal-ġenerazzjoni tal-ATP ġiet imkejla kif deskritt f'"Materjali u Metodi." Id-dejta kienet espressa f'perċentwali ta' kontroll fir-rigward tal-valuri (AUC2) tal-grupp ta' kontroll rispettiv mhux ittrattat. ∗Differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll rispettiv mhux ittrattat; differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ittrattat b'Herba Cistanche b'0.5 g/kg.

Figura 2. Effetti tat-trattament ta 'Herba Cistanche fuq it-trasport tal-elettroni mitokondrijali fil-qlub tal-firien

Kull bar tirrappreżenta l-medja ± SEM, b'n {{0}}. (a) It-trasport ta 'elettroni mitokondrijali appoġġjat minn piruvate (b) appoġġjat minn succinate kien imkejjel permezz ta' tnaqqis MTT, kif deskritt fi "Materjali u Metodi." Id-dejta kienet espressa fil-perċentwal ta' valuri ta' kontroll mhux ittrattati [sostnjati bil-piruvat: OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0.0001 (SEM), n {{ 10}}; appoġġjat minn succinate: maskili, 0.255 ± 0.015, n=5]. ∗Differenti b'mod sinifikanti mill-grupp ta' kontroll mhux ittrattat rispettiv; differenti b'mod sinifikanti minn grupp ta' 0.5 g/kg.

Kif muri fil-Figura 2a, it-trattament ta 'Herba Cistanche b'mod dipendenti fuq id-doża żied il-firxa ta' l-elettrontransport mitokondrijali appoġġjat minn pyruvate fil-qlub tal-firien, bl-aħjar stimulazzjoni osservata f'dożi ta '0.5 g/kg. Madankollu, ma nstabu l-ebda tibdil sinifikanti fil-firxa tat-trasport mitokondrijali tal-elettron appoġġjat minn succinate fi qlub tal-firien ittrattati b'Herba Cistanche (Fig. 2b).

Għall-Parti 2,jekk jogħġbok ikklikkja hawn.