PARTI 1 Cistanche Deserticola Polysaccharide Jinibixxi Telf ta 'Għadam indotta minn OVX fil- Ġrieden U Osteoklastoġenesi kkaġunati minn RANKL
Mar 02, 2022
Introduzzjoni
Osteoporożi - marda kkaratterizzata minn tnaqqis fil- massa ta ' l- għadam, mikrostruttura anormali tat- tessuti ta ' l- għadam, żieda fil- fraġilità ta ' l- għadam, u ksur (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, &2006) - bħalissa taffettwa aktar minn 200 miljun ruħ madwar id- dinja u tippreżenta piż mediku u soċjoekonomiku sostanzjali fuq is- soċjetà moderna (Strom et al., 2011). Il- kura klinika ta ' l- osteoporożi tiffoka l- aktar fuq is- sostituzzjoni ta ' l- ormoni, bisphosphonate, jew terapija b' denosumab. Dawn il-metodi huma effettivi iżda joħolqu effetti sekondarji fit-tul bħar-riskju potenzjali ta 'kanċer tas-sider u ksur tal-wirk atipiku (Iswed, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, > Hof- Bauer, 2011). Għalhekk, hemm ħtieġa urġenti li jiġu esplorati drogi li mhux biss jistgħu jinibixxuosteoporożiiżda għandhom ukoll inqas effetti sekondarji mhux mixtieqa.
Cistanche deserticola(CD), ikel toniku u mediċinali użat b'mod wiesa' fiċ-Ċina, magħruf bħala "ginseng tad-deżert", huwa z-zokk sukkulenti mnixxef b'weraq tal-iskala ta'C. deserticolaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) u għandu diversi u effettivFarmakoloġiċiAttivitajiet, bħar-regolamentazzjoni immuni, l-anti-ossidazzjoni, u l-osteoporożiproperties (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Studji preċedenti dwar is- sustanzi attivi ta ' CD dwar it- trattament ta ' l- osteoporożi ffokaw l- aktar fuqfenitanojdeglikosidi(Li, Jiang, > Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). Madankollu, is-CD fiha wkoll komponenti effettivi oħra bħal iridoids, lignans,polisakkaridi(Wang, Zhang, > Xie, 2012). L-applikazzjoni klinika tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża (TCM) hija prinċipalment dekompożizzjoni tal-ilma.Polisakkaridihuma komponenti li jinħallu fl- ilma u x' aktarx ikunu l- komponenti farmakodinamiċi ewlenin ta ' TCM. Il-polisakkaridi estratti mit-TCM kienu rrappurtati b'mod selvaġġ li kellhom anti-osteoporożieffett u ftit effetti sekondarji mhux mixtieqa, li ġeneralment intużaw fi kliniċi (eż., polisakkaridi estratti minn Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, &Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Wang, &Yan, 2018), u Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Għalhekk, aħna ipotetizzaw liCistanche deserticolapolysaccharide(CDP) estratt minn CD jista ' jkun mediċina potenzjalment sigura għat- trattament ta ' l- osteoporożi.
Tipikament, ir-riassorbiment tal-għadam u l-formazzjoni tal-għadam iżommu bilanċ dinamiku waqt ir-remodeling tal-għadam f'koordinazzjoni ma 'diversi tipi ta' ċelloli, inklużi osteoklalasti, osteoblasts, ċelloli tal-kisi tal-għadam, u osteoċiti (Kular, Tickner, Ċmienu, &Xu, 2012). Pawża f'dan il-bilanċ tista' tirriżulta f'varjetà ta' mard metaboliku tal-għadam, bħalosteoporożi(Zhu et al., 2018) u osteosclerosis (Ihde et al., 2011). Osteoklasts, bħala ċelloli differenzjati fit-tmiem derivati min-nisel mononukleari/ makrofaġi, huma l-uniċi ċelloli b'funzjoni ta 'assorbiment mill-ġdid ta' l- għadam (Teitelbaum, 2000). Hemm żewġ ċitokini ewlenin li jipparteċipaw fid-divrenzjar u l-maturazzjoni tal-osteoklast (Koga et al., 2004): fattur li jistimula l-kolonji tal-makrofaġi (M-CSF) u l-attivatur tar-riċettur tal-ligand (NF-κB) tal-fattur nukleari (NF-κB) (RANKL). M- CSF jimmedita d- divrenzjar taċ- ċelluli staminali ematopojetiċi fi proġenituri osteoklast u jippromwovi d- divrenzjar ta ' osteoklasts billi jirriregola l- espressjoni tar- riċettur RANK (Takayanagi, 2007). It- twaħħil ta ' RANKL u RANK fuq is- superfiċje taċ- ċellula ta ' osteoclast jirriżulta f' dan li ġej: (1) reklutaġġ ta ' molekuli ta ' adapter tas- sinjalar bħal fattur 6 assoċjat mar- riċettur ta ' TNF (TRAF6); (2) l-attivazzjoni ta' diversi miri downstream, inklużi l-kinases tal-proteina attivati bl-NF- κB u l-proteini attivati mitoġenu (MAPKs); u (3) regolamentazzjoni tal-livelli ta' espressjoni ta' fattur nukleari ta' ċelloli-T attivati, ċitoplasmika 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). L-attivazzjoni ta' dawn il-mogħdijiet ta' sinjalazzjoni tirregola direttament l-espressjoni ta' ġeni osteoklast, inkluż l-aċidu phosphatase 5 (Acp5) [l-kodifikazzjoni tal-aċidu reżistenti għat-tartrat (TRAcP)], il-metalloproteinase tal-matriċi 9 (MMP9), u l-cathepsin K (CTSK) (Boyle, Simonet, &Lacey, 2003). Għalhekk, l- inibizzjoni ta ' mogħdijiet ta ' sinjalar relatati ma ' osteoclast ikkaġunati minn RANKL hija metodu terapewtiku potenzjali għall- osteoporożi.
F'dan l-istudju, aħna ppeddejna biex niddeterminaw l-effetti tat-trattament ta' CDP fuq l-indotta ovariektomija (OVX)osteoporożimudell tal-ġrieden in vivo u fuq attività ta' osteoclast ikkaġunata minn RANKL in vitro, b'enfasi fuq l-espressjoni ta' ġeni speċifiċi għall-osteoklast u l-attivazzjoni ta' NFATc1 u l-mogħdijiet ta' sinjalar NF-κB u MAPKs. Is-sejbiet tagħna jistgħu jipprovdu għarfien ġdid dwar il-potenzjal tas-CDP bħala mediċina sigura u effettiva għat-trattament tal-osteoporożi.
Għal aktar informazzjoni, jekk jogħġbok ikkuntattja lil:Joanna.jia@wecistanche.com
2. Materjali u metodi
2.1. Is-sustanzi kimiċi u l-ġbir tal-kampjuni
CD (no. 180801) inxtara minn Anhui Jishun Traditional Ċiniż Medicine Co., Ltd. (Anhui, iċ-Ċina) u identifikat mill-Professur Haibo Huang mill-Iskola tax-Xjenzi Farmaċewtiċi, l-Università ta 'Guangzhou tal-Mediċina Ċiniża, Guangzhou, iċ-Ċina. Il- pilloli estradiol valerate inxtraw mingħand Bayer (Leverkusen, North- Westphalia, il- Ġermanja). Mezz essenzjali minimu modifikat bl-alfa
(α-MEM) u serum tal-bovini tal-fetu (FBS) inkisbu minn Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Il-peniċillina/streptomycin u l-kit tat-tbajja' TRAcP inkisbu minn Solarbio (Beijing, iċ-Ċina). Il- ġurdien rikombinanti M- CSF u l- ġurdien rikombinanti RANKL kienu pro- ikkurati b' Sistemi ta ' R&D (Minneapolis, MN, l- Istati Uniti). Il-pjanċi miksija bl-idrossiapatite nxtraw minn Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). L-antikorpi primarji għal NFATc1 u CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK, u P-JNK (Teknoloġija tas-Sinjalar taċ-Ċelloli, Dan-vers, MA, USA); u β-actin (CWBIO, Beijing, iċ-Ċina) inkiseb ukoll. Ir-reaġenti l-oħra użati f'dan l-istudju kienu ta 'grad analitiku, u l-ilma ġie ppurifikat mis-sistema ta' purifikazzjoni tal-ilma Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
2.2. Estrazzjoni tas-CDP
Is-CD kien mitħun għal trab fin u mħallat ma 'thrice etere tal-petroleum biex jegħlebha. Ir-residwu solidu nġabar permezz ta' filtrazzjoni u mbagħad imnixxef f'temperatura ambjentali. Il-polisakkaridiġew estratti mill- kampjuni ttrattati minn qabel b' ilma għal 2 siegħa, ikkonċentrati, preċipitati biż- żieda ta ' ethanol anidru ma ' konċentrazzjoni finali ta ' 80% (v/ v), u maħżuna f' 4 ◦C għal 24 siegħa. Il-preċipitati nġabru permezz ta' ċentrifugazzjoni fi 3000 rpm għal 20 minuta, maħlul f'ilma distillat, u ppurifikat (tneħħija ta' proteini ħielsa) bl-użu tal-metodu Sevag (Zhao et al., 2019). L-irkupratpolisakkaridikienu ċelizzati, imnixxfa, u maħżuna sakemm jintuża aktar. Barra minn hekk, ir-riżultati tal-kompożizzjoni kimika wrew li l-kontenut totali taz-zokkor, l-aċidu uroniku, is-sulfat, u l-proteina tas-CDP kienu 67.63 0.98%, 21.05 0.49%, 1.90 0.24%, u 8.81 0.36%.
Il-kompożizzjoni monosakkarid u l-analiżi infra-aħmar ta 'Fourier trasformati tas-CDP intwerew fi Fig. 1 u 2 Supplimentari.
2.3. Mudell tal-ġurdien tal-osteoporożi kkaġunat mill-OVX
L-esperimenti kollha fuq l-annimali ġew approvati mill-Kumitat tal-Etika tal-Annimali tal-Università tal-Mediċina Ċiniża ta 'Guangzhou (approvat SYXK 2019-0202). Tletin ġrieden nisa C57BL / 6 nisa ta '6 ġimgħat ġew fornuti miċ-Ċentru tal-Annimali Esperiment tal-Università ta' Guangzhou tal-Mediċina Ċiniża. Wara l- akklimatizzazzjoni għal ġimgħa, grupp wieħed ta 'ġrieden ingħata operazzjoni sham (grupp Sham), filwaqt li l-bqija tal-ġrieden kienu soġġetti għal operazzjoni ovariectomy (grupp OVX). Wara l-kirurġija, il-ġrieden tħallew jirkupraw għal ġimgħa. Imbagħad, il-ġrieden immudellati b'suċċess kienu maqsuma b'mod każwali f'5 gruppi, b'6 ġrieden għal kull grupp:
(1) Grupp Sham: ittrattat b'ilma distillat, (2) grupp ta' doża baxxa OVX: ittrattat b'ilma distillat, (3) grupp ta' doża għolja OVX E2 (E2): ittrattat b'pilloli ta' 0.13 mg/kg estradiol valerate, (4) grupp ta' doża baxxa OVX CDP (CDP-L): ittrattat bi 300 mg/kg ta' CDP, (5) OVX CDP grupp ta' doża għolja (CDP-H): ikkurat b'600 mg/kg ta' CDP. Ilma distillat, E2, jew CDP ingħata b'gavage darba kuljum. Il-ġrieden kollha ġew sagrifikati wara l-perjodu ta 'trattament ta' 12-il ġimgħa (Fig. 1A). L-utru nġabru u jintiżnu, u t-tibji tax-xellug inġabru għal eżamijiet sussegwenti. Kampjuni sħaħ tad-demm inġabru u ġew ċentrifugati f'5000 rpm għal
15 min f'4 ◦C. Is-supernatants tas-serum kienu aspirati u maħżuna f'temperatura
—80 ◦C sa analiżi ulterjuri.
2.4. Analiżi tat-tomografija mikro-komputata (mikro-CT) u istomorfometrija tal-għadam
It-tibji tax-xellug kienu ffissati b'4% paraformaldeid għal 48 siegħa u sussegwentement tqiegħdu f'tubi ċentrifugi li fihom salina normali. Il-kampjuni fissi ġew skannjati bi strument Mikro-CT Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, il-Belġju) bl-użu tas-settings li ġejjin: vultaġġ, 80 kV; kurrent tas-sors, 100 μA; Al, filtru ta' 0.5 mm; Pixel
daqs, 9.76 μm; u pass ta 'rotazzjoni, 0.6◦. Diversi parametri tal-
għadam trabekulari, inkluża d- densità minerali ta ' l- għadam (BMD), frazzjoni tal- volum ta ' l- għadam (BV/ TV), il- wiċċ ta ' l- għadam għal kull volum totali (BS/ TV), numru trabekulari (Tb. N), u spazjar trabekulari (Tb. Sp) tkejlu bl- użu ta ' software ta ' CT- Analyser® (Bruker micro- CT, Skyscan). Stampi tridimensjonali ġew iġġenerati bl-użu ta 'softwer CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).
Wara analiżi mikro- CT, it- tibias tax- xellug ġew dekolalifikati f' soluzzjoni ta ' 14% EDTA u inkorporati fil- paraffin għas- sezzjoni. Il-kampjuni ġew imqattgħin f'sezzjonijiet ta' 5 μm bl-użu ta' mikrotome qabel l-esperimenti ta' tbajja' ta' hematoxylin u eosin (H&E) u TRAcP. Is-sezzjonijiet imtebba ġew eżaminati u dokumentati bl-użu ta 'mikrokamp ta' Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, il-Ġappun).
Cistanchejista 'jtejjeb id-densità tal-għadam u jtaffi l-osteoporożi
2.5. Analiżi tas-serum
Il-konċentrazzjonijiet tal-kalċju (Ca) u tal-fosforu (P) ġew iddeterminati skont l-istruzzjonijiet tal-kit iddisinjati mill-Istitut tal-Bijoengineering Nanjing Jiancheng (Nanjing, iċ-Ċina). Il- livelli TRAcP- 5b u RANKL fis- serum ġew analizzati bl- użu ta ' kit TRAcP- 5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, iċ- Ċina) u l- kit RANKL ELISA (Cloud- CloneCorp., Wuhan, iċ- Ċina), rispettivament.
2.6. Analiżi in vitro tal-osteoklastoġenesi
Il-BMMs ġew iżolati mit-tibja u l-wirk ta 'ġrieden C57BL / 6 nisa ta' 6 ġimgħat. Iċ- ċelloli iżolati kienu kkoltivati f' mezz α- MEM li fih 25 ng/ mL M- CSF, 10% FBS, u 1% penicillin / streptomycin. Malli laħqu l-konfluwenza, il-BMMs (1 104 ċelloli/bir) inżergħu fi pjanċi ta' 96 bir u ttrattati b'CDP fil-preżenza ta' 50 ng/mL RANKL. Il-medju u s-CDP ġew sostitwiti kull jumejn. Wara 7 ijiem, iċ- ċelloli ġew iffissati b' 4% paraformaldehyde u mtebbgħin għall- preżenza ta ' TRAcP. In-numru ta ' osteoklalasti, definiti bħala ċelloli pożittivi għat- TRAcP bi tlieta nuklei jew aktar, kien magħdud u dokumentat bl- użu ta ' mikroskopju tad- dawl.
2.7. Analiżi tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli
Il-BMMs (1 × 104 ċelloli/bir) inżergħu fi pjanċa ta' 96 bir u inkubati mil-lum għal għada. Wara dan, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' CDP (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20, u 40 μg/mL) għal 48 siegħa. Il-konfluwenza taċ-ċellula ġiet skoperta u analizzata bl-użu ta 'IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), sistema dinamika ta' immaġini ta 'ċelloli ħajjin fit-tul u f'ħin reali.
2.8. Analiżi tar-riassorbiment hydroxyapatite
Il-BMMs (1 104 ċelloli/bir) inżergħu fi pjanċa miksija b'hydroxyapatite, ittrattata b'CDP fil-konċentrazzjonijiet indikati (0, 5, u 10 μg/mL), u kkoltivati f'α-MEM komplet li fih 25 ng/mL M-CSF u 50 ng/mL RANKL. Wara 7 ijiem, iċ-ċelloli nħaslu b'soluzzjoni ta 'bliċ ta' 10% biex jitneħħew il-komponenti taċ-ċellula. L-istampi taż-żoni ta 'assorbiment idrossiapatite nqabdu bl-użu ta' IncuCyte ZOOM® u analizzati bl-użu ta 'softwer ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, &Ram, 2003).
2.9. Analiżi tal-iżolament tal-RNA u tal-PCR kwantitattiv fir-reverse transcription f'ħin reali (RT-qPCR)
Il-BMMs (1 105 ċelloli/bir) inżergħu fi pjanċa ta' 6 bjar u stimulati b'RANKL u M-CSF fil-preżenza ta' CDP f'konċentrazzjonijiet differenti (0, 5, u 10 μg/mL) għal 5 ijiem. L- RNA totali kienet iżolata miċ- ċelloli jew mit- tessut ta ' l- għadam tal- ġrieden bl- użu tar- reaġent TRIzol (Sigma- Aldrich). Id-DNA komplementari ġie sintetizzat minn 2 μg RNA totali bl-użu ta 'kit ta' transcriptase invers (TransGen Biotech, Beijing, iċ-Ċina). Ir- reazzjonijiet RT- qPCR tħejjew bl- użu ta ' PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) u nstabu mis- sistema ABI 7500 (Applikata
Bijosistemi, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Il-parametri taċ-ċikliżmu għall-PCR ġew stabbiliti kif ġej: 95 ◦C għal 5 min, segwiti minn 40 ċiklu ta' 95 ◦C għal 15 s, u 60 ◦C għal 30 s. Il-primers speċifiċi użati huma murija fit-Tabella 1, u l-kwantità ta 'kull ġene fil-mira ġiet normalizzata għal GAPDH (kontroll intern).
2.10. Analiżi tal-blot tal-Punent
Il-BMMs (5 105 ċelloli/bir) inżergħu fi pjanċa ta' 6 bjar. Għal esperimenti qosra ta 'kors ta' żmien, iċ-ċelloli ġew inkubati minn qabel bil-konċentrazzjonijiet differenti ta 'CDP (0, 5, u 10 μg / mL) għal siegħa, u mbagħad ittrattati b'50 ng / mL RANKL għal 30 min. Għal żmien twil, iċ-ċelloli ġew stimulati b'50 ng/mL RANKL fil-jiem 3, 5, u 7 fil-preżenza ta' CDP (0, 5, u 10 μg/mL). Il- proteini totali ġew estratti bl- użu tar- buffer tal- lisi RIPA (CWBIO). Il- proteini ġew separati b' 10% SDS- PAGE u trasferiti għal membrani PVDF. Il-membrani ġew imblukkati b'5% ħalib skim f'temperatura ambjentali għal 2 siegħa, inkubati bil-primarja
antikorpi matul il-lejl f'4 ◦C, u mbagħad bis-sekondarja korrispondenti
antikorpi għal 1. Il-membrani ġew żviluppati bl-użu ta 'reaġenti ECL (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), u l-immaġini ttieħdu bl-użu ta' Tanon 5200 Sistema ta 'Immaġini ta' Chemiluminescence (Tanon Science and Technology, Shanghai, iċ-Ċina).
Cistanchejista 'jtejjeb id-densità tal-għadam
2.11. Sejbien tat-traslokazzjoni NFATc1 bl-użu ta' test tal-immunofluworexxenza
Il-BMMs inżergħu fuq għata ta' 12-il bir, stimulati b'RANKL u M-CSF, u ġew ittrattati b'10 μg/mL CDP għal 5 ijiem. Iċ-ċelloli ġew irranġati b'4% paraformaldeid għal 15-il minuta, thrice maħsula bil-PBS, u permeabilizzati b'0.1% Triton X-100 għal 10 min. Iċ- ċelloli kienu mħallta ma ' 10% serum tal- mogħoż (CWBIO) u inkubati għal 2 siegħa. Sussegwentement, iċ-ċelloli ġew inkubati bl-antikorp primarju matul il-lejl f'4 ◦C u mbagħad b'antikorp sekondarju kontra l-ġrieden Alexa Fluor 488 (Abcam, Cambridge, MA, USA) fid-dlam għal siegħa. Il-coverslips inħaslu bil-PBS, immuntat f'Prolong Gold Antifade Reagent b'4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dole (DAPI) (Solar), u
spezzjonat bl-użu ta 'Zeiss LSM 800 bil-mikroskopju konfocal Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, il-Ġermanja).
2.12. Analiżi statistika
Id-dejta sperimentali kollha ġiet analizzata bl-użu ta 'softwer statistiku SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Id-dejta għall-istudji fuq l-annimali u ċ-ċelloli hija espressa bħala mezz ± SEM u tfisser ± SD, rispettivament. Ir-riżultati qed jużaw analiżi f'direzzjoni waħda tal-varjanza jew it-test-t tal-Istudenti. Valuri ta' p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">
Cistanchejista' jnaqqasapoptożiu ssaħħaħ l-għadamDensità
