Parti 1 Diskriminazzjoni Kimika U Ġenetika Ta' Cistanches Herba Ibbażata fuq UPLC-QTOF/MS U Barcoding tad-DNA
Mar 03, 2022
Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com
Astratt
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), magħruf bħala ''Ginseng tad-deżert'', għandu effett kurattiv impressjonanti fuq is-saħħa u n-nutrizzjoni, speċjalment fit-tisħiħ tal-kliewi biex issaħħaħ il-yang. Madankollu, iż-żewġ oriġini tal-pjanti ta 'Cistanches Herba, Cistanche deserticola u Cistanche tubulosa, ivarjaw f'termini ta' azzjoni farmakoloġika u komponenti kimiċi. Biex tiddiskrimina l-oriġini tal-pjanti ta 'Cistanches Herba, l-ewwelnett ġiet impjegata f'dan l-istudju sistema ta' metodu kombinat ta 'kimika u ġenetika – UPLC-QTOF/MS teknoloġija u DNA barcoding. Ir-riżultati indikaw li tliet komposti markaturi potenzjali (isomer ta 'campneoside II, cistanoside C, u cistanoside A) inkisbu biex jiddiskriminaw iż-żewġ oriġini permezz ta' analiżi PCA u OPLS-DA. Il-barcode tad-DNA ppermettiet li tiddistingwi żewġ oriġini b'mod preċiż. Siġra NJ wriet li żewġ oriġini miġbura f'żewġ clades. Is-sejbiet tagħna juru li ż-żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba għandhom kompożizzjonijiet kimiċi u varjazzjonijiet ġenetiċi differenti. Din hija l-ewwel evalwazzjoni rrappurtata ta 'żewġ oriġini ta' Cistanches Herba, u s-sejba se tiffaċilita l-kontroll tal-kwalità u l-applikazzjoni klinika tagħha.
Introduzzjoni
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), magħruf bħala ''Ġinseng tad-deżert'', joriġina minn zkuk sukkulenti mnixxfin ta'Cistanche deserticolaYC Ma uCistanche tubulosa(Schrenk) Wig skond il-Farmakopea Ċiniża (edizzjoni 2010), u hija popolari għat-tonifikazzjoni tagħha tal-kliewi-yin, li tibbenefika essenza tal-ħajja u musrana rilassati. Bħalissa,Cistanches Herbahija prinċipalment imqassma f'deżerti niexfa u sħan fil-majjistral taċ-Ċina, partikolarment fil-provinċji ta 'Xinjiang u Inner Mongolia. Madankollu, iż-żewġ oriġini ta 'Cistanches Herbadifferenti f'termini tal-attività farmakoloġika u l-komponenti kimiċi tagħhom. Tu et al. investiga d-decoction ta’ tliet speċi ta’ Cistanche (C. deserticola, C. tubulosa, Salsa Cistanche) u sabet liC. tubulosawera l-inqas effett fil-mudell tal-ġurdien b'defiċjenza Yang [1]. Zhang et al. attività farmakoloġika mqabbla bejnC. deserticola, C. tubulosa,uC. Salsa,u sabet li dawn l-ispeċi kellhom funzjonijiet mediċinali bħalma huma t-tolleranza kontra l-għeja u l-ipoksja, iżda mhux bl-istess mod [2]. Riċerka preċedenti rrappurtat il-komponent kimiku u indikat id-differenza tal-komponent kimiku u l-kontenut għall-oriġini tal-pjanti taCistanches Herba[3]. Fir-rigward tal-applikazzjoni klinika u ċ-ċirkolazzjoni tas-suq, bħala toniku,C. tubulosatradizzjonalment intuża bħala aġent li jippromwovi ċ-ċirkolazzjoni tad-demm u fit-trattament ta 'impotenza, sterilità, lumbago, dgħjufija tal-ġisem fil-Ġappun [4-8]. Konsegwentement, huwa ta’ sinifikat kbir li jiġu diskriminati żewġ oriġini ta’Cistanches Herbagħall-kontroll tal-kwalità u applikazzjoni klinika. Madankollu, m'hemm l-ebda fokus ta 'riċerka fuq id-diskriminazzjoni ta' żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba. Ħafna metodi riċerkati, inklużi mikroskopija, ultravjola, u skoperta infra-aħmar, metodu ta 'repetizzjonijiet ta' sekwenza inter-sempliċi ntużaw biex jidentifikaw il-ġeneru ta 'Ċistanċi, iżda mhux biss għal żewġ oriġini speċjalment [9-20]. Hawnhekk, użajna b'mod konġunt tekniki kimiċi u molekulari biex niddistingwu żewġ oriġini ta 'Cistanches Herba, UPLC QTOF/MS (kromatografija likwida ultra-prestazzjoni flimkien ma' spettrometrija tal-massa quadrupole time-of-flight) u barcoding tad-DNA. UPLC-QTOF/MS jipprovdi informazzjoni aktar malajr u b'mod effiċjenti meta mqabbel ma 'tekniki oħra. Is-selettività u s-sensittività għolja ta 'UPLC-QTOF/MS irriżultaw fl-applikazzjoni tagħha kemm għal analiżi kwantitattiva kif ukoll kwalitattiva, kif ukoll fl-analiżi tal-metaboliti u l-identifikazzjoni ta' komposti kumplessi fil-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża [21-22]. Analiżi tal-komponenti prinċipali (PCA) u projezzjoni ortogonali għal analiżi diskriminanti ta 'struttura moħbija (OPLSDA) huma żviluppati wkoll biex jidentifikaw komposti ta' markatur potenzjali. Barcode tad-DNA, teknoloġija ta 'markatur molekulari aktar faċli u universali, juża framment tad-DNA biex jidentifika speċi jew ġeneri. Huwa oġġettiv, aktar preċiż, u aktar faċli biex jitwettaq minn metodi ta 'identifikazzjoni tradizzjonali u teknoloġiji oħra ta' markatur molekulari. Barra minn hekk, id-DNA barcoding ġie applikat b'suċċess biex jiġu identifikati annimali u pjanti, inklużi pjanti mediċinali [23–26]. L-għan ta’ din ir-riċerka huwa li tiġi stabbilita sistema ta’ metodu xjentifiku, UPLC-QTOF/MS magħquda u barcoding tad-DNA, għad-diskriminazzjoni ta’ żewġ oriġini tal-pjanti ta’Cistanches Herba.
Cistanches għeruq sħaħ
Materjali u metodi
Dikjarazzjoni etika Aħna nikkonfermaw li l-istudji fuq il-post ma involvewx speċi fil-periklu jew protetti. Il-koordinati tal-GPS ġew inklużi fl-informazzjoni tal-kampjun, jekk jogħġbok ara t-tabella 1."
Materjali tal-pjanti u reaġenti
Zkuk sukkulenti ta 'Cistanches Herba inġabru mir-reġjuni tad-deżert selvaġġ f'Inner Mongolia, Provinċji Qinghai, Reġjun Awtonomu Uygur Xinjiang, Repubblika Popolari taċ-Ċina (Tabella 1) f'Mejju 2012. Il-kampjuni tar-riċerka nġabru kollha f'reġjuni tad-deżert selvaġġ, mhux f’art privata, fejn ma kienu meħtieġa l-ebda permessi speċifiċi. L-identitajiet botaniċi taz-zkuk ġew ikkonfermati minn Dr Linfang Huang. Kampjuni ta’ vawċers ġew depożitati fl-Istitut tal-Iżvilupp tal-Pjanti Mediċinali. Aċetonitrile ta 'grad ta' kromatografija likwida ta 'prestazzjoni għolja (HPLC) (Merck KGaA, Darmstadt, il-Ġermanja) u aċidu formiku (Tedia, USA) ġew utilizzati għall-analiżi UPLC. L-ilma dejonizzat ġie purifikat bl-użu ta 'sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Il-kimiċi l-oħra kollha kienu ta' grad analitiku.
Preparazzjoni tal-kampjun
Kampjuni ta' Cistanches Herba (1.0 g, 65-malji) ġew trasferiti fi flixkun koniku ta' 50-mL, u ġew miżjuda 50 mL ta' 70 fil-mija metanol. Wara t-tixrib għal 30 min, saret ultrasonikazzjoni (35 kHz) f'temperatura tal-kamra għal 30 min. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'10,000 rev/min għal 10 min, is-supernatant inħażen f'4uC u ffiltrat minn membrana ta' 0.22-mm qabel l-injezzjoni fis-sistema UPLC-QTOF/MS għall-analiżi.
UPLC-QTOF/MS
Għall-analiżi UPLC, intużaw is-sistemi/parametri li ġejjin: Sistema Waters Acquity (Waters) mgħammra b'pompa binarja ta' konsenja tas-solvent, auto-sampler u PDA detector konness ma' stazzjon tad-dejta Waters Empower 2; ultrasonikazzjoni (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Zhejiang, iċ-Ċina); u mudell ta' bilanċ analitiku elettroniku AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Zurich, l-Isvizzera). Kolonna Waters Acquity UPLC BEH C18 (1.7 mm, 2.16100 mm, Waters) u kolonna ta' protezzjoni Waters C18 (l-istess materjal, ilmijiet) ġew użati u miżmuma fi 30uC. Il-fażi mobbli kienet 0.1 fil-mija soluzzjoni milwiema ta 'aċidu formiku (A) u aċetonitrile (B) bi programm gradjent kif ġej: 0-3 min, 10-22 fil-mija B; 3–4 min, 22–23 fil-mija B; 4–6 min, 23–35 fil-mija B; 6–8 min, 35–37 fil-mija B; 8–11 min, 37–42 fil-mija B; 11– 12 min, 42–48 fil-mija B; 12-15 min, 48 fil-mija –50 fil-mija B b'rata ta 'fluss ta' 0.3 mL/min. Il-volum tal-injezzjoni kien 5 mL.
L-analiżi UPLC/MS saret fuq sistema QTOF Synapt G2 HDMS (Waters, Manchester, UK) mgħammra b'sors ta 'jonizzazzjoni elettrospray (ESI) operat fil-modalità ta' jone negattiv. N2 intuża bħala l-gass tad-desolvation. It-temperatura tad-desolvazzjoni ġiet issettjata għal 45{{10}}uC b'rata ta 'fluss ta' 800 L/h, u t-temperatura tas-sors ġiet issettjata għal 120uC. Il-vultaġġi kapillari u tal-koni ġew issettjati għal 2500 u 40 V, rispettivament. Id-dejta nġabret bejn 50–1200 Da b'ħin ta' skanjar ta' 0.1-s u dewmien ta' interskanjar ta' 0.01-s fuq ħin ta' analiżi ta' 15-min. L-argon intuża bħala l-gass tal-ħabta fi pressjoni ta '7.06661023 Pa. Id-dejta kollha tal-MS inġabret bl-użu tas-sistema LockSpray biex tiżgura l-eżattezza u r-riproduċibilità tal-massa. Il-jone [MH]- ta 'leucine-enkephalin f'm/z 554.2615 intuża bħala l-massa tal-lock fil-mod ESI negattiv.
Analiżi tad-dejta
Id-dejta UPLC-QTOF/MS għal kampjuni ta 'Cistanches Herba ġiet analizzata biex tidentifika varjabbli diskriminanti potenzjali. Is-sejba tal-ogħla livelli, l-allinjament u l-iffiltrar tad-dejta mhux ipproċessata ES twettqu bl-użu tal-maniġer tal-applikazzjonijiet Marker Lynx, verżjoni 4.1 (Waters, Man chester, UK). Il-parametri użati kienu kif ġej: ħin ta' żamma (tR) ta' 0–15 min, massa ta' 50–1200 Da, tolleranza ta' ħin ta' żamma ta' 0.02 min, u tolleranza tal-massa ta' 0.02 Da. Intużaw tliet kampjuni replikati miġbura minn kull post ġeografiku (n=3). Total ta '6, 339 varjabbli intużaw biex jinħoloq il-mudell.
Barcode tad-DNA: estrazzjoni tad-DNA, amplifikazzjoni u sekwenzar tal-PCR
Kampjuni meħuda minn zkuk imnixxfin imlaħħam ta 'C. deserticola u C. tubulosa (30 mg) ġew jingħorok għal 2 minuti bi frekwenza ta' 30 r/ s. Id-DNA ġie estratt skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur (Tiangen). Speċifikament, il-protokoll ġie modifikat b'tali mod li l-kloroform ġie sostitwit b'taħlita ta 'kloroform: alkoħol isoamyl (24: 1 fl-istess volum), u soluzzjoni buffer GP2 b'isopropanol (l-istess volum). It-trab jingħorok tpoġġa f'tubi eppendorf ta '1.5 ml, żied 700 mL 65uC GP1 imsaħħan minn qabel u 1 mL b-mercaptoethanol biex jitħallat bl-użu ta' vortiċi għal 10-20 s, u inkubat għal 60 minuta f'65uC; Żieda ta '700 mL taħlita ta' kloroform: alkoħol isoamyl (24:1), ċentrifuga għal 5 minuti f'12000 rpm (,134006g); Pipetta s-supernatant għal tubu ġdid, żid 700 mL isopropanol, ħallat għal 15-20 minuta; Ibdel it-taħlita kollha fil-kolonna spin CB3 u ċċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u żżid 500 mL GD (żieda ta' etanol anidru kwantitattiv qabel l-użu), ċentrifuga f'12000 rpm għal 40 s; twarrab il-filtrat u żżid 700 mL PW (iżżid etanol anidru kwantitattiv qabel l-użu) biex taħsel il-membrana, ċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u żżid 500 mL PW, ċentrifuga għal 40 s f'12000 rpm; Armi l-filtrat u ċċentrifuga għal 2 minuti f'12000 rpm biex tneħħi l-buffer tal-ħasil residwu PW; It-trasferiment tal-kolonna spin CB3 f'tubu eppendorf nadif ta' 1.5 ml, u t-tnixxif f'temperatura tal-kamra għal 3–5 minuti; Iċċentrifuga għal 2 minuti f'12000 rpm biex tikseb id-DNA totali. Primers għar-reazzjoni tal-katina tal-polimerażi (PCR) kienu bbażati fuq sekwenzi rrappurtati qabel [4,5]. Taħlitiet ta' reazzjoni tal-PCR kien fihom 2-mL DNA template, 8.5- mL ddH2O, 12.{5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., China), 1/{{57 }}mL primers 'il quddiem/reverse (F/R) (2.5 mM), f'volum finali ta' 25 mL. L-amplifikazzjoni tal-PCR saret kif deskritt minn Kress et al. [4]. Il-primer tar-reazzjoni tal-PCR kienu fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) u rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). Il-prodotti tal-PCR ġew separati u skoperti permezz ta 'elettroforesi tal-ġel agarose 1 fil-mija. Il-prodotti tal-PCR ġew ippurifikati skont il-protokoll tal-manifattur u suġġetti direttament għal sekwenzar.
Il-kompost effettiv ewlieni ta 'cistanche: Acteoside
Riżultati
Assenjazzjoni tal-quċċata tentattiva minn UPLC-QTOF/MS Kromatogrammi rappreżentattivi ta 'C. deserticola u C. tubulosa minn żoni ta' produzzjoni differenti huma murija fil-Figura 1. Il-kromatogramma tal-marki tas-swaba 'indika xebh fost il-kampjuni ta' Cistanches Herba. Ġew skoperti total ta '23 quċċata tal-massa kwalifikata u 16-il quċċata ġew identifikati billi tqabbel il-ħinijiet ta' żamma u l-ispettri tal-massa ma 'dawk irrappurtati qabel (Tabella 2) [29-35]. Il-qċaċet 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22, u 23 ġew identifikati b’mod tentattiv bħala cistanoside F, mussaenoside acide, cistanbuloside C1/C2, campneoside II , isomer ta' campneoside II, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, syringalide A-39-aL-rhamnopyranoside, cistanoside C, 29-acetylacteosid, osmanthuside B, cistanoside D, tubuloside B, u cistancinenside A, rispettivament . Kostitwenti kimiċi ġew determinati li huma primarjament phenylethanoid glycosides (PhGs), filwaqt li kompost wieħed, mussaenoside acide, kien iridoid polysaccharide. PhGs huma l-komposti attivi ewlenin f'termini ta 'trattament ta' defiċjenza tal-kliewi, u effetti antiossidanti u newroprotettivi [36]
PCA ta' C. deserticola u C. tubulosa
PCA kien impjegat biex jiddistingwi kampjuni ta 'speċi ta' pjanti differenti. Il-PCA huwa metodu ta' analiżi tad-dejta multivarjata mhux sorveljat li għandu l-għan li jħaffef ix-xebh u/jew id-differenzi fi ħdan id-dejta multivarjata tal-kompożizzjoni tal-metaboliti sekondarji [37]. Il-mudell PCA b'żewġ komponenti ammonta b'mod kumulattiv għal 46.04 fil-mija tal-varjazzjoni (PC1, 36.43 fil-mija; PC2, 9.61 fil-mija). Il-Figura 2 turi li 24 kampjun ġew miġbura f'żewġ gruppi fil-punteġġi PCA mpinġija skont l-oriġini tal-ispeċi, li jindika li l-kompożizzjoni kimika ta 'C. deserticola u C. tubulosa kienet differenti b'mod sinifikanti.
Il-kompost effettiv ewlieni ta 'cistanche: Echinacoside
