PARTI 1 Effetti Antiossidanti U Antikoagulanti Ta' Phenylpropanoid Glycosides Iżolati Minn Broomrapes (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria, U P. Ramosa)
Mar 06, 2022
Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,
Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*
Università ta' Ło´d´z, Dipartiment tal-Bijokimika Ġenerali, Fakultà tal-Bijoloġija u Protezzjoni Ambjentali, 90-236 Ł´od´z, il-Polonja
b Dipartiment tal-Bijokimika u l-Kwalità tal-Uċuħ, Istitut tax-Xjenza tal-Ħamrija u l-Kultivazzjoni tal-Pjanti, Istitut tar-Riċerka tal-Istat, 24-100 Puławy, il-Polonja
Ċentru għar-Riċerka u l-Konservazzjoni tal-Bijodiversità, Dipartiment tal-Bijoloġija Ambjentali, Istitut tal-Bijoloġija, Università Jan Kochanowski, 25-406 Kielce, Polonja
Astratt
Pjanti holoparasitiċi tal-Orobanchaceae, inklużiCistanche, Orobanche, u Phelipanche spp, huma magħrufa għar-rikkezza tagħhom ta 'phenylpropanoid glycosides (PPGs). Ħafna komposti PPG instabu li għandhom spettru wiesa 'ta' attivitajiet, bħal antimikrobiċi, anti-infjammatorji, antiossidanti u li jtejbu l-memorja. Biex tesplora aħjar il-potenzjal tal-bijoattività tal-broomrapes Ewropej (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) u għaxar kostitwenti tal-fenilpropanoid iżolati singoli, investigajna l-azzjoni antiradikali tagħhom, effett protettiv kontra l-ossidazzjoni fis-sistema in vitro tal-plażma , u influwenza fuq il-parametri tal-koagulazzjoni. L-estratti ttestjati wrew attività ta' scavenging ta' 50–70 fil-mija tal-qawwa ta' Trolox. L-estratt OC, rikk flacteoside, Kellu aktar minn 20 fil-mija potenzjal antiradikali aħjar minn estratt PR li kien l-uniku wieħed li kien fih PPGs nieqsa minn B-ring catechol moety fl-unità acyl. Barra minn hekk, instab li tmien PPG ittestjati biss wrew potenzjal antiossidant fil-plażma umana ttrattata b'H2O2/Fe; madankollu, it-tliet PPG ittestjati kellhom potenzjal antikoagulanti minbarra proprjetajiet anti-ossidanti. Jidher li l-istruttura ta 'PPGs, speċjalment il-preżenza ta' partijiet acyl u catechol, hija prinċipalment relatata mal-proprjetajiet antiossidanti tagħhom. Il-potenzjal antikoagulanti ta 'dawn il-komposti huwa wkoll relatat mal-istruttura kimika tagħhom. PPGs magħżula juru l-potenzjal għat-trattament ta 'mard kardjovaskulari assoċjat ma' stress ossidattiv.
Għal aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattja:Joanna.jia@wecistanche.com
Cistanchetubulosa għandha ħafna effetti
1. Introduzzjoni
L-istress ossidattiv huwa magħruf ħafna għall-impatt negattiv tiegħu fuq is-saħħa ta 'organiżmi ħajjin, inkluż tixjiħ aċċellerat u xi kanċer. L-okkorrenza ta 'stress ossidattiv hija assoċjata ma' bilanċ disturbat bejn il-mekkaniżmi ossidattivi u antiossidattivi (inkluż difiża enżimatika (catalase, glutathione peroxidase) u difiża mhux enżimatika (glutathione) fiċ-ċelloli tal-ġisem [1]. Il-produzzjoni żejda ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS), inklużi radikali ossidanti u speċi ta 'qoxra magħluqa, hija waħda mill-mekkaniżmi ewlenin wara l-formazzjoni ta' stress ossidattiv. Madankollu, l-effett bijoloġiku ikkawżat minn ROS jiddependi ħafna fuq il-konċentrazzjoni, il-ħin ta 'espożizzjoni, u l-post. Taħt kundizzjonijiet normali (konċentrazzjoni baxxa), ir-radikali ta 'l-ossiġnu/nitroġenu jista' jkollhom ir-rwol ta 'messaġġiera sekondarja, iżda fil-livell ogħla, jistgħu jibdew jirreaġixxu ma' strutturi bijoloġiċi, bħall-membrani taċ-ċelluli [2]. Fost l-ispeċi kollha ROS, radical hydroxyl (HO.) qed jikkawża waħda mill-akbar ħsara lill-bijo-makromolekuli: proteini, lipidi, u DNA. L-istress ossidattiv huwa magħruf li għandu rwol importanti f'firxa ta 'mard, inklużi dawk kardjovaskulari. Disturbi tas-sistema tad-demm ġew korrelatati u/jew preċeduti minn bidliet f'diversi parametri ta 'emostasis u bijomarkaturi tal-plażma [1,3].
Min-naħa l-oħra, ħafna sustanzi naturali, bħall-polifenoli u l-aċidi grassi polyunsaturated, ġew identifikati bħala antiossidanti qawwija kapaċi jipprevjenu l-formazzjoni u/jew inaqqsu l-ispeċi reattivi tal-ossiġnu. Komposti bi proprjetajiet bħal dawn jinstabu f'ħafna prodotti tal-ikel u preparazzjonijiet farmaċewtiċi ta 'oriġini mill-pjanti. Dieta arrikkita b'ħxejjex u frott frisk, u terapiji antiossidanti bbażati fuq antiossidanti naturali, huma għalhekk rakkomandati ħafna peress li jistgħu jnaqqsu l-livell ta 'stress ossidattiv u jipprevjenu diversi proċessi patofiżjoloġiċi [4,5]. Il-polifenoli tal-pjanti huma grupp divers ta 'metaboliti sekondarji, li fosthom l-aċidi fenoliċi jokkupaw post importanti, peress li huma distribwiti b'mod wiesa' u juru varjetà ta 'effetti bijoloġiċi, bħal antimikrobiċi, antiossidanti u anti-infjammatorji. Phenylpropanoid glycosides (PPGs) huma ester de-qraba tal-aċidu idrossiċinnamiku u huma l-klassi prinċipali/unika ta’ metaboliti sekondarji preżenti fil-pjanti oloparassitiċi Orobanchaceae, inklużiCistanche, Orobanche, u Phelipanche spp. Diversi speċi ta 'din il-familja huma pesti serji ta' għelejjel li l-bdiewa jridu jeħilsu minnhom fl-għelieqi (eżempju ta 'Phelipanche ramosa), ftit huma użati fil-farmakoloġija, filwaqt li ħafna huma ta' ftit importanza għall-bnedmin. HerbaCistanchetintuża b'mod estensiv fil-mediċina tradizzjonali Ażjatika fit-trattament ta 'defiċjenza tal-kliewi u bħala aġent li jsaħħaħ l-immunità u l-memorja, kontra t-tixjiħ u kontra l-għeja [6]. Analiżi fitokimiċi ta 'diversi gruppi ta' riċerka wrew li phenylpropanoid glycosides, bħal acetonide, echinacoside, u podium side, huma wieħed mill-ingredjenti attivi ewlenin ta 'Herba Cistanche [7]. Studju reċenti ta 'diversi speċi ta' ġummar misjuba fil-Polonja minn Jedrejek et al. [8] wera li dan il-materjal tal-pjanti għandu kompożizzjoni kwalitattiva simili (dominazzjoni tal-PPGs), barra minn hekk, huwa ugwali jew saħansitra jaqbeż il-Cistanchespp. f'termini tal-kontenut ta' sustanzi attivi [8].
Cistanche deserticola għandha ħafna effetti, ikklikkja hawn biex tkun taf aktar
L-istudju preżenti kien immirat biex jevalwa l-potenzjal antiradikali u antiossidanti, kif ukoll l-influwenza fuq il-parametri tal-emostasi tat-tliet estratti tal-broomrape (Orobanche Caryophyllaceae - OC, Pheli- panache Arenaria - PA, u P. ramosa - PR) rikki f'diversi fenil -
prostanoids, kif ukoll il-kostitwenti PPG uniċi tagħhom. Il-kapaċità antiradikali tkejjel bl-użu ta' 2,2′-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid/Trolox Equivalent (ABTS/TE) u 2,2-diphenyl-1-picrylhybrazil (DPPH) ) testijiet. L-istress ossidattiv fis-sistema tat-test tal-plażma ġie indott bl-użu ta 'hydroxyl radical (H2O2/Fe), imbagħad perossidazzjoni tal-lipidi (assaġġ ta' speċi reattivi ta 'aċidu thiobarbituric (TBARS)), u l-livell ta' proteina karbonil u gruppi thiol ġew imkejla. Fost il-parametri determinati ta 'emostasis kien hemm: ħin ta' tromboplastin parzjali attivat (APTT), ħin ta 'protrombina (PT), u ħin ta' trombin (TT).
2. Materjali u metodi
2.1. Kimiċi
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH), 2,2′-azinobis-3-eth-ylbenzthiazoline-6-aċidu sulfoniku (ABTS), persulfat tal-potassju, {{9} }}hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-aċidu karboksiliku (Trolox), dimethylsulfoxide (DMSO), thiobarbituric acid (TBA), aċidu formiku (grad LC-MS), u H2O2 inxtraw minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO., USA). Metanol (grad ta 'gradjent HPLC) u aċetonitrile (grad LC-MS) ġew akkwistati minn Merck (Darmstadt, il-Ġermanja). għaxar fenil-
komposti propanoiċi ttestjati f'dan ix-xogħol, inklużi 2'-O-acetylatteoside (97 fil-mija), 2'-O-acetylpoliumoside (98 fil-mija), 3-O-methylpoliumoside (96 fil-mija), acetonide (99 fil-mija), arena ġewwa (97 fil-mija), crenatoside (98 fil-mija), teniposide (99 fil-mija), poliumoside (99 fil-mija), tubuloside A (96 fil-mija), u wiedemannioside D (96 fil-mija) qabel kienu iżolati minna minn materjal tal-pjanti mogħti hawn taħt [ 8]. Il-purità tal-komposti ġiet ivvalutata bl-użu ta 'analiżi UHPLC-PDA-MS. Ilma ultrapur kien ippreparat internament bl-użu ta 'sistema ta' purifikazzjoni tal-ilma Milli-Q (Millipore Co.). Reaġenti oħra kienu ta 'grad analitiku u ġew ipprovduti minn fornituri kummerċjali domestiċi.
2.2. Materjal tal-pjanti
Pjanti tal-fjuri ta 'tliet speċi broomrape, inklużi Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel, u P. Ramos (L.) Pomel ġew identifikati mill-prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski University, Kielce, Polonja) u miġbura minn sors naturali fil-Polonja.
Kampjuni ta' vawċers (O. Caryophyllaceae – Chomento´wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), art bil-ħaxix xerotermika, parasitize Galium boreale, Mejju 2014; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.3652◦N, 22.5801◦E, ħaxixa) mhux maħdum, parasitize Artemisia campestris, Ġunju 2014;
P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), qasam, parasitize Solanum Lycopersicum, Settembru 2014) huma depożitati fl-Erbarju tal-Università Jan Kochanowski fi Kielce (KTC). Il-materjal tal-pjanti kien lajofilizzat u mitħun fin qabel l-estrazzjoni.
2.3. Preparazzjoni ta' estratti tal-broomrapes
Materjal tal-pjanti trab (O. Caryophyllaceae (OC) - 2 g, P. Arenaria (PA) - 3 g u P. ramosa (PR) - 3 g) ġie estratt bi 80 fil-mija MeOH f'40 ◦C u 1500 psi (pressjoni tas-solvent ) bl-użu ta' ASE 200 aċċellerat
estrattur tas-solvent (Dionex, Sunnyvale, CA, USA). L-estratti ġew evaporati u mnixxfa bil-friża (Gamma 2-16 LSC freeze dryer, Christ, il-Ġermanja). L-effiċjenza ta 'estrazzjoni għal OC, PA, u PR kienet 55 fil-mija, 37 fil-mija, u 43 fil-mija bil-piż tal-materjal tal-pjanti, rispettivament. Minħabba l-kontenut għoli ta 'karboidrati (dejta mhux murija), l-estratti mhux ipproċessati ġew ippurifikati aktar permezz ta' estrazzjoni ta 'fażi solida (SPE) fuq mikrokolonna Oasis HLB (500 mg; Waters, Milford, MA, USA). Iz-zokkor tneħħa b'1 fil-mija MeOH, imbagħad komposti ta 'interess ġew elużi b'80 fil-mija MeOH. Wara li tneħħi s-solvent, l-estratti OC, PA, u PR ġew lajofilizzati (Gamma 2-16 LSC freeze dryer), u r-rendimenti tal-purifikazzjoni SPE kienu 53 fil-mija (OC), 67 fil-mija (PA) u 51 fil-mija (PR) .
2.4. Karatteristiċi fitokimiċi tal-estratti tal-broomrapes
Analiżi kwalitattivi u kwantitattivi ta 'estratti broomrape saru bl-użu ta' sistema ACQUITY UPLC (Waters) imqabbda ma 'fotodiode array detector (PDA) u spettrometru tal-massa tandem quadrupole (TQD-MS/MS). Estratti OC, PA, u PR imnixxfa bil-friża ġew maħlula f'50 fil-mija metanol f'konċentrazzjoni ta' 0.50 mg/mL u mbagħad
kromatografiku fuq kolonna BEH C18 (100 × 2.1 mm, 1.7 µm, Ilmijiet). Il-kundizzjonijiet kromatografiċi kienu kif ġej: temperatura tal-forn – 25 ◦C,
gradjent lineari 10→25 fil-mija tal-fażi mobbli B (0.1 fil-mija aċidu formiku fl-aċetonitrile) fil-fażi mobbli A (0.1 fil-mija aċidu formiku f'H2O) fuq 12 min, rata tal-fluss - 0.4 mL / min, volum ta 'injezzjoni - 2 μL, firxa UV - 190-490 nm (riżoluzzjoni ta' 3.6 nm). L-analiżi MS twettqet f'modalità ta 'jone negattiv b'jonizzazzjoni elettrospray (ESI), bl-użu tas-settings li ġejjin: firxa ta' skennjar 100-1200 m/z; vultaġġ kapillari 2.8 kV; vultaġġ kon 35 V;
temperatura tas-sors 150 ◦C; temperatura ta 'desolvation 450 ◦C; desolvation
fluss tal-gass 900 L/h, u fluss tal-gass tal-kon 100 L/h. L-akkwist u l-ipproċessar tad-dejta saru bl-użu tas-softwer Waters MassLynx 4.1.
Il-qċaċet tal-phenylpropanoid glycoside (PPG) ġew identifikati bit-tqabbil tad-dejta LC-MS miksuba ma 'dawk ta' komposti iżolati qabel [8]. Il-kwantifikazzjoni tal-PPGs fl-estratti tal-broomrape kienet ibbażata fuq il-metodu UPLC-UV b'detezzjoni f'330 nm, u kalibrazzjoni standard esterna bl-użuacteoside(Sigma-Aldrich, 99 fil-mija, HPLC) as
standard tal-grupp. Kurva ta’ kalibrazzjoni lineari ġiet ippreparata f’sitt konċentrazzjonijiet fil-medda ta’ 1–200 ug/mL u wriet linearità tajba (R2
0.999). Ir-riżultati kwantitattivi jirrappreżentaw il-valur medju SD ta' tliet injezzjonijiet u ġew espressi bħala milligrammiacteosideekwivalenti (eq) għal kull gramma ta' estratt (mgacteosideeq/g).
2.5. Attività antiradikali in vitro
2.5.1. ABTS assaġġ radikali scavenging
It-test antiradikali ABTS sar bl-użu tal-metodu deskritt minn Kontek et al. [9], b'modifiki ħfief kif ġej: 20 fil-mija MeOH intuża biex jipprepara reaġenti (7 mM ABTS u 4.9 mM potassju per-
sulfat); is-soluzzjonijiet ta' estratti OC, PA, u PR, f'erba' livelli ta' konċentrazzjoni fil-medda ta' 100—400 ug/mL, u soluzzjonijiet Trolox, f'sitt livelli ta' konċentrazzjoni fil-medda ta' 10 250 ug/mL, ġew ippreparati b' 50 fil-mija MeOH. Il-proporzjon tal-kampjun għas-soluzzjoni tax-xogħol ABTS kien 1:25 (v/v). L-assorbiment f'734 nm tkejjel wara 30 min inkubazzjoni
fid-dlam bl-użu ta’ spettrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio,
Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA).
L-inibizzjoni tal-assorbiment (perċentwali) ġiet ikkalkulata kif ġej: [(Absecon-
trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.
Ġew ikkalkulati l-Ekwivalenti Trolox (TE) tal-estratti tal-broomrapes
bl-użu tal-formula TE=msample/mstandard, fejn m hija l-inklinazzjoni tad-dritta
kurvi tal-linja (inibizzjoni tal-assorbiment vs konċentrazzjoni). Il-valur TE ta'
il-kampjun jiddeskrivi l-attività normalizzata tiegħu kontra Trolox (TEstandard =
1.0). Il-valuri IC50 għall-estratti OC, PA, u PR u Trolox kienu
milħuqa b'mod sperimentali, imbagħad ġew ikkalkulati mil-linja dritta tagħhom
kurvi (inibizzjoni assorbanza vs konċentrazzjoni) u huma espressi fi
ug/mL.
L-assaġġ sar fi tliet kopji, u r-riżultati huma ppreżentati
bħala mezz ± devjazzjonijiet standard (SD).
2.5.2. Assaġġ ta 'scavenging radikali DPPH
It-test antiradikali DPPH sar bl-użu tal-metodu deskritt minn Jedrejek et al. [8] u Brand-Williams et al. [10], b'modifiki żgħar kif ġej: is-soluzzjonijiet ta 'estratti OC, PA, u PR, f'erba' livelli ta 'konċentrazzjoni fil-medda ta' 50▽ 250 ug/mL, u soluzzjonijiet Trolox, f'sitt livelli ta 'konċentrazzjoni fil-medda ta' 10▽ 250 ug/mL, ġew ippreparati b'50 fil-mija MeOH. Il-proporzjon tal-kampjun għal DPPH kien 1:19 (v/v). L-assorbiment f'517 nm tkejjel wara 30 min inkubazzjoni fid-dlam bl-użu ta 'spettrofotometru UV-vis (Evolution 260 Bio). L-inibizzjoni tal-assorbiment (perċentwali) ġiet ikkalkulata kif ġej: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Il-valuri Trolox Ekwivalenti (TE) u IC50 tal-kampjuni tat-test ġew ikkalkulati bl-istess mod bħal fit-test ABTS (Taqsima 2.5.1). L-assaġġ sar fi tliet kopji, u r-riżultati huma ppreżentati bħala mezzi ± SD.
2.6. Soluzzjonijiet tal-ħażniet ta' komposti tal-pjanti ttestjati u estratti għal esperimenti bil-plażma umana
Soluzzjonijiet tal-ħażniet tal-komposti ttestjati u l-estratti tal-pjanti ġew ippreparati f'50 fil-mija DMSO. Il-konċentrazzjoni finali ta 'DMSO fil-kampjuni ttestjati kienet inqas minn 0.05 fil-mija u l-effetti tagħha ġew determinati fl-esperimenti kollha.
2.7. Iżolament tal-plażma tal-bniedem
Demm uman, jew plażma, inkiseb minn sitt donaturi regolari (irġiel u nisa li ma jpejpux) għal bank tad-demm (Lodz, il-Polonja) u ċentru mediku (Lodz, il-Polonja). Id-demm inġabar bħala soluzzjoni CPD (ċitrat/fosfat/destrożju; 9:1; v/v demm/CPD) jew soluzzjoni CPDA (ċitrat/fosfat/destrożju/adenina; 8.5:1; v/v; demm/CPDA). Id-donaturi ma kienu ħadu l-ebda medikazzjoni jew sustanzi vizzju (inkluż tabakk, alkoħol, u supplimenti antiossidanti) għal mill-inqas ġimgħatejn qabel donazzjoni. L-analiżi tagħna tal-kampjuni tad-demm saret taħt il-linji gwida tad-Dikjarazzjoni ta 'Ħelsinki għar-Riċerka tal-Bniedem u approvata mill-Kumitat dwar l-Etika tar-Riċerka fl-Esperimentazzjoni tal-Bniedem fl-Università ta' Lodz. Il-plażma ġiet ippreparata biċ-ċentrifugazzjoni ta 'demm uman frisk f'4500x g għal 25 min f'temperatura tal-kamra. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet ikkalkulata billi tkejjel l-assorbenza tal-kampjuni ttestjati f'280 nm, skond il-proċedura ta 'Whitaker u Granum [11].
2.8. Markers ta 'stress ossidattiv fil-plażma umana
2.8.1. Kejl tal-perossidazzjoni tal-lipidi
Il-perossidazzjoni tal-lipidi fil-plażma ġiet ikkwantifikata billi tkejjel il-konċentrazzjoni tas-sustanzi reattivi tal-aċidu thiobarbituric (TBARS). Il-konċentrazzjoni ta' TBARS ġiet ikkalkulata bl-użu tal-koeffiċjent ta' estinzjoni molari (ε=156,000 M 1 cm 1 ). Il-metodu huwa deskritt aktar bir-reqqa inkella kienu [12,13]. 2.8.2. Kejl tal-gruppi tal-karbonil Il-livell tal-gruppi tal-karbonil ġie kkalkulat bl-użu tal-koeffiċjent tal-estinzjoni molari (ε=22,000 M 1 cm 1 ) u ġie espress bħala nmol gruppi karbonil/mg ta’ proteina tal-plażma, skont Bartosz [ 13] u Levine et al. [14]. 2.8.3. Determinazzjoni tal-grupp thiol Il-kontenut tal-grupp thiol fil-proteini tal-plażma tkejjel b'mod spettrofotometriku bl-użu ta 'SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, il-Ġermanja) b'assorbiment f'412 nm b'5,5' -dithiol-bis-(2- nitrobenzoic acid). Il-metodu huwa deskritt f'aktar dettall x'imkien ieħor [15-17].
2.9. Parametri ta 'emostasis
2.9.1. Il-kejl tal-ħin tal-protrombina (PT)
PT ġie determinat koagulometriku bl-użu ta' Koagulazzjoni Ottika
L-ittri jindikaw ir-riżultati tat-test ta' Tukey (p < 0.05), valuri bl-istess
ittra f'ringiela mhix differenti b'mod sinifikanti.
2.9.2. Il-kejl tal-ħin tat-trombina (TT)
It-TT ġie ddeterminat b'mod koagulometriku bl-użu ta 'Optic Coagulation Analyzer (mudell K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polonja), skond il-metodu deskritt minn Malinowska et al. [18].
2.9.3. Il-kejl tal-ħin ta' tromboplastina parzjali attivat (APTT)
L-APTT ġie ddeterminat b'mod koagulometriku bl-użu ta 'K-3002 Optic Coagulation Analyzer (Kselmed, Grudziadz, Polonja) skond Mali issa ska et al. [18].
2.10. Analiżi tad-dejta It-test Q-Dixon sar biex tiġi eliminata d-dejta inċerta.
Id-dejta ġiet ittestjata għal distribuzzjoni normali bit-test Shapiro-Wilk u l-ugwaljanza ta 'varjanza mat-test ta' Levene. Differenzi statistikament sinifikanti ġew identifikati bl-użu ta 'ANOVA, segwit mit-test ta' paraguni multipli ta 'Tukey jew it-test Kruskal-Wallis. Il-paraguni tqiesu sinifikanti f'p < 0.05.="" il-valuri="" huma="" ppreżentati="" bħala="" mezzi="" ±="">
