F'dawn l-aħħar Għexieren ta' Deċennji, ix-Xjentisti Kisbu Progress notevoli fit-titjib tas-saħħa u l-estensjoni tal-ħajja.

Jekk jogħġbok ikkuntattjaoscar.xiao@wecistanche.comgħal aktar informazzjoni

INTRODUZZJONI

Iċ-ċelloli epiteljali tal-lenti (LECs) jiffurmaw monosaff ta 'ċelloli li jgħattu l-kapsula ta' qabel tal-lenti u jestendu sal-pruwa tal-lenti ekwatorjali [1, 2]. Il-kostruzzjoni u l-funzjoni normali tal-LECs huma essenzjali għaż-żamma tat-trasparenza u l-omeostasi metabolika tal-lenti kollha[3]. Żieda fl-evidenza tindika li s-senescence tal-LECs tista' tikkawża modifika, denaturazzjoni, u aggregazzjoni ta' proteini tal-lenti inklużi enżimi u kristallini, u b'hekk fl-aħħar mill-aħħar iwasslu għal opacifikazzjoni tal-lenti jew saħansitra katarretti [3-5]. Il-katarretti relatati mal-età (ARC) jibqgħu l-kawża ewlenija ta 'indeboliment tal-vista u għama, li taffettwa severament il-kwalità tal-ħajja ta' individwi anzjani [6]. Bħalissa, m'hemm l-ebda strateġiji effettivi għall-prevenzjoni tal-progressjoni tal-ARC. Għalhekk, huwa meħtieġ li jiġi żviluppat intervent farmakoloġiku li jista 'jtejjeb it-trasparenza tal-lenti u jdewwem il-progressjoni tal-ARC.

Matul l-aħħar ftit deċennji, ix-xjentisti kisbu progress notevoli fit-titjib tas-saħħa u l-estensjoni tal-ħajja bl-użu ta 'diversi interventi ġenetiċi, tad-dieta u farmakoloġiċi [7]. Metformin (MET) huwa wieħed mill-aġenti anti-aging studjati b'mod estensiv. Studji sostanzjali jissuġġerixxu li MET jista 'jtaffi s-senescence u jestendi ħajja b'saħħitha f'diversi sistemi ta' mudelli ta 'annimali. MET jista' mhux biss itawwal il-ħajja ta' Caenorhabditis elegans iżda wkoll itejjeb is-saħħa u l-vitalità tiegħu [8]. MET jista 'jnaqqas l-akkumulazzjoni relatata mal-età u relatata mal-istress ossidattiv ta' ħsara fid-DNA fiċ-ċelloli staminali tal-musrana tan-nofs tad-Drosophila biex jestendu l-ħajja tagħhom [9]. Studji preċedenti jindikaw ukoll li l-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET ittejjeb is-saħħa u l-ħajja tal-ġrieden [10]. Barra minn hekk, evidenza emerġenti tindika li meta pazjenti bid-dijabete jiġu kkurati b'MET, huma juru benefiċċji ta 'sopravivenza, anke meta mqabbla ma' kontrolli li m'għandhomx id-dijabete [11].

Jekk jogħġbok ikklikkja hawn biex tkun taf aktar

Minbarra l-attività li tippromwovi l-ħajja tal-MET f'diversi organiżmi mudell, MET jimmira mogħdijiet multipli ta 'sinjalazzjoni ċellulari biex ittejjeb il-mard relatat mal-età. MET intwera li jimmodula l-awtofaġija prinċipalment permezz tal-attivazzjoni tal-proteina kinażi attivata minn adenosine monophosphate (AMP) (AMPK) u jipprevjeni n-newrodeġenerazzjoni u n-newroinfjammazzjoni biex ikollhom rwol newroprotettiv fil-marda ta 'Parkinson [12]. Bl-istess mod, MET itejjeb il-bidliet relatati mal-età fiċ-ċellula endoteljali sinusojdali tal-fwied permezz tal-AMPK u l-mogħdijiet tal-ossidu nitriku endoteljali [13].cistanche dożaġġ redditBarra minn hekk, l-attivazzjoni kronika tal-AMPK minn MET tipprevjeni l-kardjomijopatija billi tirregola l-awtofaġija fil-ġrieden OVE26 bid-dijabete [14]. Barra minn hekk, MET itaffi d-deterjorazzjoni kardjovaskulari assoċjata mal-età billi ttejjeb l-awtofaġija u r-restrizzjoni kalorika [15]. Barra minn hekk, it-trattament MET jista 'jinibixxi l-aterosklerożi assoċjata mal-età fil-ġrieden ApoE-7-u fniek indotti minn dieta b'ħafna xaħam, jipprevjeni b'mod sinifikanti l-kalċifikazzjoni tal-plakka aterosklerotika, inaqqas il-livelli ta' proteina C-reattiva ta 'sensittività għolja, u jrażżan l-attivazzjoni tal- mogħdija tal-fattur nukleari kappa B(NF-kB) fil-vini tad-demm [16-18].

Abbażi ta' dawn l-osservazzjonijiet, l-istudju preżenti pprova jesplora jekk il-MET jistax idewwem it-tixjiħ tal-ARC u l-mekkaniżmu molekulari sottostanti. Is-sejbiet tagħna huma kif ġej: (i) trattament kroniku b'doża baxxa MET ittardja s-senescence ta 'LECs fil-ġrieden ta' età naturali, u b'hekk inibixxi l-opaċità tal-lenti; (i) il-mogħdija AMPK kienet inattivata, u l-fluss awtofaġiku kien imfixkel f'LECs senescent; (i) ) trattament kroniku b'doża baxxa MET ittardja s-senescence ta 'LECs fil-ġrieden ta' età naturali billi attiva l-mogħdija AMPK u ssaħħaħ l-awtofaġija. Is-sejbiet tagħna jissostanzjaw ir-rwol putattiv ta' kontra t-tixjiħ tal-MET u jipprovdu biżżejjed evidenza li l-MET jista' juri li huwa għażla terapewtika possibbli għall-ARC.

RIŻULTATI

Senescence ta 'LECs kienet assoċjata ma' ARC fil-ġrieden ta 'età naturali

Mekkaniżmi potenzjali multipli ta 'ARC, inkluż l-effett tat-tixjiħ, ġew investigati b'mod estensiv.benefiċċji ta 'estratt ta' cistanche,Madankollu, l-assoċjazzjoni bejn is-senescence ta 'LECs u ARC in vivo għadha mhux ċara. Aħna ipoteżijna li s-senescence ta 'LECs tista' tirriżulta f'ARC in vivo. Għalhekk, bnejna mudell tal-ġurdien ta 'ARC. Ir-riżultati tagħna wrew li t-trasparenza tal-lenti fil-ġrieden ta 'età naturali (ġrieden anzjani) naqset b'mod sinifikanti meta mqabbla ma' dik fil-grupp ta 'kontroll (ġrieden żgħar) (Fig.1a). Kif muri f'Fig.1b, l-inċidenza tal-katarretti fil-grupp ta 'età naturali kienet ta' 95.23 fil-mija. L-assaġġ tat-tbajja 'H&E indika li l-LECs fil-grupp ta' kontroll kienu forma tonda u rranġati regolarment, u d-densità tal-LECs normali kienet relattivament għolja, filwaqt li l-LECs tal-ġrieden b'età naturali kienu ċatti fil-forma u rranġati b'mod irregolari, u d-densità ta ' LECs senescent naqas sew (Fig.1c). Barra minn hekk, SA - -tbajja Gal wera li l-proporzjon ta 'LECs senescent kien elevat fil-ġrieden ta' età naturali (Fig. 1d). Barra minn hekk, analiznajna l-espressjoni tal-proteini ta 'markaturi assoċjati mas-senescence permezz ta' tbajja IHC u analiżi tal-western blot. It-tbajja 'IHC wriet li l-espressjoni ta' p21 u p53 żdiedet fil-LECs ta 'ġrieden ta' età naturali meta mqabbla ma 'ġrieden żgħar (Fig. 1e, f). Bl-istess mod, skoprejna wkoll li l-espressjoni tal-proteini ta 'p21 u p53 kienet ogħla fil-kapsuli tal-lenti ta' ġrieden b'età naturali milli fil-kapsuli tal-lenti ta 'ġrieden żgħar (Fig. 1g). Dawn ir-riżultati ssuġġerew li s-senescence ta 'LECs kienet assoċjata ma' ARC fil-ġrieden ta 'età naturali.

Cistanche jista 'anti-aging

L-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET tejbet it-trasparenza tal-lenti u ttaffi s-senescence ta 'LECs Qabel ma ttestjajna l-effett ta' metformin fuq ARC, iddeterminajna jekk l-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET hijiex sigura għall-ġrieden. Wara trattament MET għal 10 xhur, 28 ġrieden (18 fil-grupp ta 'età naturali u 10 fil-grupp MET) mietu minn kawżi naturali. Sibna li ġrieden ħajjin fiż-żewġ gruppi kienu b'saħħithom, u ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fil-piżijiet tal-ġisem u l-piżijiet tal-organi bejn iż-żewġ gruppi (Tabella 1). Għalhekk, dawn ir-riżultati indikaw li d-dożaġġ ta 'metformin użat fl-istudju kien sigur għall-annimali u jista' jintuża għal esperimenti sussegwenti.

Sussegwentement, MET b'doża baxxa kronika ġiet amministrata biex jiġi vvalutat jekk MET jistax jinibixxi l-opaċità tal-lenti u jtaffi s-senescence relatata mal-età ta 'LECs fil-ġrieden ta' età naturali. Kif mistenni, it-trasparenza tal-lenti fil-grupp MET tjiebet ħafna meta mqabbla mat-trasparenza tal-lenti fil-grupp ta 'età naturali (Fig.2a). Barra minn hekk, osservazzjonijiet morfoloġiċi kkonfermaw li l-lenti tal-grupp MET wriet tnaqqis fl-opaċità. L-inċidenza tal-katarretti fil-grupp ta 'età naturali kienet ta' 95.23 fil-mija, filwaqt li dik fil-grupp MET kienet ta '19.00 fil-mija (Fig.2b).L-assaġġ tat-tbajja' H&E wera li d-densità ta' LECs fil-grupp MET kienet notevolment ogħla minn dak fil-ġrieden b'età naturali (Fig. 2c). Barra minn hekk, il-LECs tal-grupp MET kienu relattivament tondi fil-forma meta mqabbla ma 'dawk tal-grupp ta' età naturali (Fig.2c). SA- -Tbajja ta 'Gal wera li l-proporzjon ta' LECs senescent naqas b'mod sinifikanti fil-grupp MET meta mqabbel ma 'dak fil-grupp ta' età naturali (Fig.2d). L-analiżi IHC wriet li l-espressjoni ta 'p21 u p53 naqset aktar fil-LECs tal-grupp MET milli fil-grupp ta' età naturali (Fig.2e, f). Bl-istess mod, l-analiżi tal-western blot wriet li l-espressjoni tal-proteina ta 'p21 u p53 naqset b'mod notevoli fil-kapsuli tal-lenti tal-grupp MET meta mqabbla ma' dawk tal-grupp ta 'età naturali (Fig.2g). Dawn ir-riżultati wrew li l-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET tista 'ttejjeb it-trasparenza tal-lenti u ttaffi s-senescence ta' LECs.

Amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET attenwat is-senescence ta 'LECs fi ġrieden ta' età naturali permezz ta 'attivazzjoni ta' AMPK Ammont kbir ta 'dejta jappoġġja l-konklużjoni li l-attivazzjoni ta' AMPK hija biżżejjed biex testendi l-ħajja f'organiżmi mudell, u żżid l-appell tagħha bħala mira ta 'lonġevità [19,20] . Meta wieħed iqis din it-teorija, aħna vvalutajna l-espressjoni tal-mogħdija AMPK fil-LECs tal-ġrieden. Il-livell relattiv tal-mRNA tal-FAS tnaqqas fil-grupp ta 'età naturali u żdied fil-grupp MET (Fig. 3a). Kif muri f'Fig.3b, c, l-espressjoni ta 'AMPKa fosforilata (Thr172) u ACC fosforilata (Ser79) tnaqqset fil-LECs ta' ġrieden b'età naturali meta mqabbla ma 'dawk ta' ġrieden żgħar. Madankollu, l-espressjoni ta 'AMPKa fosforilata (Thr172) u ACC fosforilata (Ser79) kienet elevata fil-LECs tal-grupp MET meta mqabbla ma' dawk tal-grupp ta 'età naturali. Barra minn hekk, l-analiżi tal-western blot wriet li l-espressjoni tal-proteina ta 'AMPKa fosforilata (Thr172) u ACC fosforilata (Ser79) kienet irregolata b'mod sinifikanti fil-kapsuli tal-lenti ta' l-età naturali, u l-livelli ta 'espressjoni ta' proteina ta 'AMPKa fosforilata (Thr172) u ACC fosforilata ( Ser79) żdiedu fil-kapsuli tal-lenti tal-Grupp MET (Fig.3d). Din id-dejta wriet li l-mogħdija AMPK kienet inattivata fil-LECs ta 'ġrieden ta' età naturali. Barra minn hekk, l-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET attenwat is-senescenza ta 'LECs fi ġrieden ta' età naturali permezz ta 'attivazzjoni ta' AMPK.

Amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET irrestawrat il-fluss awtofaġiku biex itaffi s-senescence ta 'LECs fi ġrieden ta' età naturali Studji preċedenti indikaw li l-awtofaġija jista 'jkollha rwol importanti fil-ġlieda kontra l-effetti avversi tat-tixjiħ [21,22]. Biex tanalizza aktar il-bidliet molekulari u ċellulari fil-lenti wara t-trattament MET, iddeterminajna l-espressjoni ta 'LC3 u p62 minħabba li huma aċċettati b'mod wiesa' bħala bijomarkaturi tal-livelli ta 'awtofaġija. Kif muri fil-Fig. 4a, il-livell relattiv ta 'espressjoni ta' mRNA p62 żdied b'mod sinifikanti fil-grupp ta 'età naturali meta mqabbel ma' dak tal-grupp ta 'kontroll; madankollu, il-livell relattiv ta 'espressjoni ta' mRNA ta 'p62 kien sostanzjalment irregolat 'l isfel fil-grupp MET meta mqabbel ma' dak fil-grupp ta 'età naturali.cistanche genghis khanBarra minn hekk, it-tbajja 'IHC wriet li l-livelli ta' proteina assoċjata mal-mikrotubuli 1 katina ħafifa 3(LC3-II/l) u p62 żdiedu fil-LECs ta 'ġrieden ta' età naturali. Barra minn hekk, ir-riżultati tagħna wrew li l-livelli ta 'LC3-II/l u p62 naqsu b'mod notevoli fil-LECs tal-Grupp MET (Fig. 4b, c). Il-livelli ta 'proteina ta' LC3-ll u p62 żdiedu b'mod notevoli fil-kapsuli tal-lenti tal-grupp ta 'età naturali (Fig.4d). B'kollox, spekulajna li l-fluss awtofaġiku kien imfixkel fil-LECs ta 'ġrieden ta' età naturali u jista 'jiġi rrestawrat permezz ta' amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET biex ittaffi s-senescence ta 'LECs fi ġrieden ta' età naturali.

DISKUSSJONI

Il-katarretti mhux ittrattati huma kawża ewlenija ta 'għama madwar id-dinja li huma kkaratterizzati minn opacifikazzjoni tal-lenti kristallina [23]. Studji epidemjoloġiċi wrew li l-età hija l-fattur ta 'riskju dominanti għall-katarretti, magħrufa bħala ARC, u l-uniku trattament huwa t-tneħħija kirurġika [24]. Studji preċedenti wrew li s-senescence tal-LECs hija l-kawża ewlenija tal-ARC [25]. Sal-lum, ma kien hemm l-ebda aġenti terapewtiċi effettivi biex jinibixxu l-sħab tal-lenti u jtaffu s-senescence ta 'LECs mingħajr effetti sekondarji mhux mixtieqa. Il-fokus tal-istudju preżenti kien li jevalwa l-bażi bijoloġika molekulari għas-senescence tal-LECs u l-mekkaniżmu tal-protezzjoni tal-LECs normali kontra s-senescence. Ir-riżultati tagħna wrew li l-inattivazzjoni tal-AMPK u l-indeboliment tal-awtofaġija kienu assoċjati mas-senescence ta 'LECs u ARC. Barra minn hekk, sibna li MET jista 'jipproteġi l-LECs kontra s-senescence u jinibixxi t-sħab tal-lenti billi jattiva AMPK u jsaħħaħ l-awtofaġija.

Is-senescence hija proċess bijoloġiku fundamentali akkumpanjat minn tnaqqis ġenerali fil-funzjoni tat-tessut. Hekk kif il-ħajja tiżdied, disfunzjonijiet relatati mal-età bħal ARC isiru saħħa serja

kwistjonijiet [26]. Ġie rrappurtat li s-senescence tal-LECs huma involuti fl-okkorrenza u l-iżvilupp tal-ARC [5]. Ir-riżultati tagħna wrew li l-LECs tal-ġrieden ta 'età naturali kienu ċatti fil-forma u rranġati b'mod irregolari, u d-densità ta' LECs naqset b'mod notevoli (Fig. 1c, d). Barra minn hekk, l-espressjoni ta 'ġeni assoċjati mat-tixjiħ (p21 u p53) kienet upregulated fil-LECs tal-ġrieden ta' età naturali (Fig. 1e, f, g). Ir-riżultati tagħna implikaw li s-senescence tal-LECs kienet assoċjata mal-okkorrenza u l-iżvilupp tal-ARC. Għalhekk, għarfien preċiż tal-mekkaniżmi molekulari sottostanti s-senescence ta 'LECs jista' jkun meħtieġ biex jipprovdi raġuni għal strateġiji ġodda ta 'trattament.

MET huwa l-aktar medikazzjoni ipogliċemika orali preskritta għad-dijabete tat-tip 2 madwar id-dinja. Evidenza emerġenti tindika li MET għandu effetti ta 'benefiċċju fuq is-saħħa lil hinn minn dawk assoċjati mat-titjib fil-gliċemija [27]. Ġie kkonfermat li l-mekkaniżmi ta 'MET huma importanti biex jimmiraw mogħdijiet fundamentali fit-tixjiħ bijoloġiku, bħall-attivazzjoni tal-AMPK, iż-żieda tal-awtofaġija, l-inibizzjoni tal-infjammazzjoni, u l-eżerċizzju ta' effetti anti-ossidattivi [28]. Fil-bnedmin, MET ilu jintuża fil-prattika klinika għal aktar minn 60 sena; għandha profil ta' sikurezza għoli u tinsab f'pożizzjoni unika biex tintervjeni f'bosta mogħdijiet kruċjali responsabbli għat-tixjiħ u l-mard relatat mal-età. Madankollu, l-effetti ta' MET fuq ARC u l-mekkaniżmu regolatorju ta' dawk l-effetti qatt ma ġew irrappurtati. Konsegwentement, fl-istudju tagħna, l-amministrazzjoni kronika ta 'doża baxxa ta' MET fil-ġrieden ta 'età naturali tejbet it-trasparenza tal-lenti (Fig. 2a) u attenwaw is-senescence ta' LECs in vivo (Fig. 2).

Huwa rikonoxxut ħafna li l-MET jattiva l-passaġġ AMPK li huwa l-mekkaniżmu potenzjali tal-MET biex jeżerċita effett kontra t-tixjiħ [29]. AMPK, sensor tal-enerġija ċellulari, għandu rwol kruċjali fir-regolamentazzjoni tal-bilanċ tal-enerġija ċellulari [30]. Diversi studji wrew li l-AMPK iservi bħala integratur u medjatur ta 'bosta mogħdijiet u proċessi li jassoċjaw enerġetika mal-lonġevità. Fl-istudju tagħna, sibna li l-inattivazzjoni ta 'AMPK kienet karatteristika ta' LECs senescent fil-ġrieden ta 'età naturali (Fig.3). Sussegwentement, MET intwera li jistimula l-passaġġ AMPK biex jipprevjeni s-senescence ta 'LECs (Fig.3). Bħala attivatur AMPK stabbilit, ir-rwol ta 'MET fil-prevenzjoni tat-tixjiħ huwa ġeneralment attribwit għall-effetti tiegħu fuq il-modulazzjoni ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni downstream, bħal restawr ta' awtofaġija, attivazzjoni ta 'Sirt1 u Foxo1 u soppressjoni ta' mTOR [31,32]. L-istudju tagħna pprovda linja ġdida ta 'evidenza li saħqet dwar l-importanza tal-funzjoni AMPK attivata minn MET fil-prevenzjoni tal-okkorrenza ta' ARC.

Kif imsemmi hawn fuq, AMPK jikkomunika ma 'bosta mogħdijiet u proteini biex jeżerċita effett kontra s-senescence, inkluż it-tkabbir tal-awtofaġija. L-awtofaġija, li qed toħroġ bħala proċess ewlieni għall-assigurazzjoni tal-lonġevità, ġibdet interess mifrux bħala mira terapewtika potenzjali għal mard relatat mal-età. L-awtofaġija hija proċess bijoloġiku kumpless fluwidu b'ħafna stadji. Il-proċess sħiħ ta 'awtofaġija jissejjaħ fluss awtofaġiku, li huwa użat ħafna biex jirrifletti l-livell ta' awtofaġija. Bħala indikatur tal-awtofaġija, LC3-Il huwa marbut sewwa mal-membrana awtofagosomali li hija degradata minn enzimi lisosomali.estensjoni tal-ħajja ta' cistancheBl-istess mod, p62, sottostrat speċifiku għall-awtofaġija, huwa ġeneralment degradat f'autophagolysosome, u l-espressjoni tiegħu tirrifletti indirettament il-livell ta 'awtofaġija. Fl-istudju preżenti, is-sejbiet tagħna implikaw li l-livell ta 'awtofaġija naqas b'mod distint fl-LECs senescent (Fig. 4), filwaqt li MET reġġa' lura l-indeboliment relatat mal-età ta 'autophagy (Fig. 4). Il-mekkaniżmu molekulari kontra t-tixjiħ ta 'MET huwa attribwit għall-funzjoni primarja ta' AMPK fiċ-ċelloli minħabba li ġeneralment itejjeb l-awtofaġija permezz ta 'attivazzjoni ta' AMPK [33]. Barra minn hekk, MET huwa muri li jkabbar l-awtofaġija direttament, u b'hekk jikkontribwixxi għall-prevenzjoni tas-senescence [34]. Madankollu, huma meħtieġa studji aktar dettaljati biex jiċċaraw il-mekkaniżmi sottostanti, li jipprova li l-MET iżid l-awtofaġija permezz ta 'passaġġ AMPK indipendenti jew dipendenti.

Intwera li l-prevalenza ta 'ARC ma ġietx assoċjata mas-sess f'popolazzjonijiet ta' oriġini Asjatika [35, 36]. Għalhekk, aħna ma kkunsidrawx is-sess bħala fattur li jista 'jaffettwa ARC. L-istudju tagħna għandu jiġi interpretat meta jitqiesu l-limitazzjonijiet imsemmija hawn fuq.

KONKLUŻJONI

Fil-qosor, aħna ppruvajna li l-inattivazzjoni tal-mogħdija AMPK u l-indeboliment tal-awtofaġija relatat mal-età jistgħu jikkontribwixxu għas-senescence tal-LECs u l-okkorrenza tal-ARC. Barra minn hekk, id-dejta mill-esperimenti tagħna wriet li MET effettivament ittardja s-senescence ta 'LECs u l-formazzjoni ta' ARC permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija AMPK u t-tkabbir tal-awtofaġija. Is-sejbiet tagħna huma linja bażika għal aktar investigazzjoni tal-mekkaniżmi molekulari li huma utli fir-rwol tal-MET matul il-proċess ta 'tixjiħ tal-ARC u se jkunu informattivi għal studji aktar intensivi dwar l-iżvilupp ta' strateġiji ġodda kontra l-okkorrenza u l-iżvilupp tal-ARC.

MATERJALI U METODI Reaġenti

MET inxtara minn Bristol-Myers Squibb Company(China).Antikorpi kontra p21 (ab188224), p53 (ab131442), AMPKa fosforilata (p-AMPK) (Thr172) (ab133448), AMPKa1 (ab32047), -actin (ab822) u SQSTM1/p62 (3340-1) inkisbu minn Abcam(MA, USA).Antikorpi kontra LC3 (12741)u phospho-acetyl CoA carboxylase (p-ACC)(Ser79)(3661)inxtraw minn Cell Signaling Technology ( MA, l-Istati Uniti).

Annimali u trattament

Ġrieden maskili C57BL6J li kellhom 3 u 8 xhur inxtraw minn Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.(Beijing, China). Il-ġrieden kienu miżmuma f'kundizzjonijiet ikkontrollati b'temperatura (temperatura, 20-25 grad u umdità relattiva, 55±15 fil-mija) b'ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12-il siegħa, b'aċċess ħieles għall-ikel u l-ilma. Il-proċeduri u l-protokolli kollha li saru fuq l-annimali ġew approvati mill-kumitat tal-etika tal-Università Medika ta’ Harbin.

Il-ġrieden kienu maqsuma fit-tliet gruppi li ġejjin: (i) grupp ta 'kontroll li kellu ġrieden żgħar (3 xhur, piż tal-ġisem =29.72± 1.66 g, n =40) irċieva dieta standard tal-ġurdien purifikata u ilma ad libitum; Meta l-ġrieden kellhom 10 xahar, 120 ġrieden ġew maqsuma b'mod każwali f'żewġ gruppi: grupp ta' età naturali u grupp MET. (i) grupp ta' età naturali (ġrieden anzjani, 20 xahar, piż tal-ġisem=32.98±1.93g, n{=60) irċieva dieta standard tal-ġurdien purifikata u ilma ad libitum;(ii)grupp MET ( 20 xahar, piż tal-ġisem=31.21±2.81 g,n{=60) inżamm fuq dieta standard tal-ġurdien purifikata u ilma sakemm il-ġrieden laħqu l-10 xhur; wara dan, inbdew it-trattamenti. Ġrieden fil-grupp MET ġew mitmugħa dieta supplimentata b'0.1 fil-mija MET (Bristol Myers Squibb, iċ-Ċina) u ilma liberament għal 10 xhur.

iżolament ta 'lentijiet u kapsuli tal-lenti

Il-ġrieden ġew ewtanizzati permezz ta 'dislokazzjoni ċervikali. L-għajn kollha ġiet imneħħija immedjatament mill-annimali sperimentali kollha u mqiegħda f'salina sterili. In-nerv ottiku tpoġġa 'l fuq u ffissat bi pinzetta. Imbagħad saret inċiżjoni fuq in-nerv ottiku li jidħol fl-għajn, u l-isklera nġibdet lura biex tesponi l-lenti.cistanche nzSussegwentement, użajna pinzetti biex ineħħu bil-mod il-frammenti tal-ġisem ċiljari mwaħħla mal-pjan ekwatorjali tal-lenti. Ir-ritratti tal-lenti friski ttieħdu immedjatament, u l-lenti ġiet iffissata malajr b'4 fil-mija paraformaldehyde f'temperatura tal-kamra. Il-kapsuli kollha tal-lenti ġew imqaxxra malajr mil-lenti li kien fadal, iffriżati snap fin-nitroġenu likwidu, u maħżuna f'80 grad C għal esperimenti sussegwenti.

Ematossilina u eosina (H&E)

Il-lenti friska ġiet imwaħħla immedjatament b'4 fil-mija paraformaldehyde f'temperatura tal-kamra u inkorporata fil-paraffin. Għal eżami istoloġiku, it-tessuti nqatgħu fi flieli 4-μm. Wara d-deparaffinizzazzjoni u r-riidratazzjoni, is-sezzjonijiet tal-paraffin ippreparati ġew imtebba 'b'soluzzjoni ta' ematoxylin (H) għal 8min, segwiti minn 5 dips f'1 fil-mija ta 'etanol aċidu (1 fil-mija HCI f'70 fil-mija ta' etanol)

u tlaħliħ b'ilma distillat. Sussegwentement, it-taqsimiet kienu mtebbgħin b'soluzzjoni ta 'eosin (E) għal 3 min, segwiti minn deidrazzjoni b'alkoħol gradat u tindif bil-xylene. Bidliet morfoloġiċi ġew osservati taħt mikroskopju (Nikon, Eclipse, Ġappun).

Assaġġ -galactosidase assoċjat mas-senescence (SA- -Gal) L-attività -galactosidase (SA- -Gal) assoċjata mas-senescence ġiet imkejla bl-użu ta' kit tat-tbajja' SA{- -Gal (Sigma, CS{ {12}}030). Skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, is-sezzjonijiet tat-tessuti, wara sensiela ta' trattamenti, ġew maħsula b'saline buffered phosphate (PBS) għal 5 minuti (tliet darbiet) u mbagħad inkubati f'soluzzjoni tat-tbajja' SA- -gal (pH 6.0) f' 37 grad mingħajr CO2 għal 24 siegħa. L-immaġini nqabdu taħt mikroskopju tad-dawl (Nikon, Eclipse, il-Ġappun). Il-perċentwal ta' ċelloli pożittivi SA- -gal ġie stmat bħala n-numru medju ta' ċelloli pożittivi/in-numru medju ta' ċelloli totali.

Reazzjoni kwantitattiva tal-katina tal-polimerażi f'ħin reali (gRT-PCR) RNA totali mill-kapsuli tal-lenti tal-ġrieden ġie estratt bl-użu tar-reaġent TRlzol. It-traskrizzjoni inversa saret bil-ExScript RT Reagent Kit (Invitrogen). Analiżi kwantitattiva tar-reazzjoni tal-katina tat-traskrizzjoni inversa tal-polimerażi (qRT-PCR) saret bl-użu ta’ SYBR Green Supermix

kit (Takara, Tokyo, Ġappun), b'-actin bħala kontroll endoġenu. It-traskrizzjonijiet ġew investigati għal diversi ġeni fil-mira, inklużi FAS (quddiem, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3'u reverse,5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (quddiem,5'-GGCGCCACTACCGCGATGAGGA{{{{ 10}} u reverse,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') u -actin (quddiem, 5 '-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'u reverse,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3'. livelli ta' kull espressjoni tal-ġeni kienu

metodu. normalizzat għal -actin u kkalkulat bl-użu tat-tbajja '2-△△ct r Immunoistokimika (IHC) Total ta' 5 sezzjonijiet rappreżentattivi minn kull waħda mill-10 lentijiet magħżula għal kull grupp intużaw għall-analiżi immunoistokimika (IHC) biex tivvaluta l-espressjoni ta 'p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3, u p62. Wara li l-kampjuni ppreparati ġew inkubati f'60 grad għal 2 sigħat, ġew mgħoddija minn xylene u serje ta 'alkoħol iggradat għad-deparaffinizzazzjoni. Sussegwentement, il-kampjuni ġew mgħollija f'0.1 M ta 'aċidu ċitriku (pH 6.1) għal 30 min u mkessħa għat-temperatura tal-kamra. Wara l-ħasil tliet darbiet bil-PBS, il-kampjuni kienu mxarrba b'0.3 fil-mija HO, biex jinibixxu l-attività tal-perossidasi endoġena. Sussegwentement, antikorpi primarji ġew miżjuda u mkessħa f'4 gradi C, matul il-lejl. L-antikorpi sekondarji korrispondenti ġew inkubati għal siegħa f'37 grad C. Wara l-ħasil bil-PBS, il-kampjuni ġew inkubati f'diaminobenzidine (DAB) sakemm żviluppat l-intensità tat-tebgħa mixtieqa. Stampi taċ-ċelloli immunostained inqabdu bl-użu tal-mikroskopju Nikon Eclipse (Nikon, Eclipse, Ġappun).

Analiżi Western blot

Proteina totali minn kapsuli tal-lenti tal-ġrieden ġiet estratta bl-użu ta’ buffer ta’ analiżi ta’ radju-immunopreċipitazzjoni (RIPA) b’cocktail ta’ inibitur tal-protease (Pierce, USA), u intuża kit ta’ aċidu bicinchoninic (BCA) (Thermo Fisher Scientific, USA) biex tikkwantifika l-konċentrazzjoni tal-proteina. . Il-proteina totali (40 ug) ġiet analizzata bl-użu ta 'elettroforeżi tal-ġel tas-sodju dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) u ttrasferita b'mod elettroforetiku fuq membrani tal-filtru tal-polyvinylidene difluoride (PVDF) (Millipore, il-Ġermanja). Il-membrani ġew inkubati matul il-lejl b'antikorp primarju f'4 gradi C. L-għada, il-membrani ġew inkubati b'antikorpi sekondarji korrispondenti għal siegħa f'37 grad C. Il-meded immunoreattivi ġew viżwalizzati bl-użu tal-metodu tas-sottostrat kimiluminixxenti b'Super Signal West Pico kit (Pierce Biotechnology, l-Istati Uniti). Twettqu tliet esperimenti indipendenti.

Analiżi statistika

Id-dejta kienet espressa bħala l-medja ± devjazzjoni standard (SD). Analiżi statistiċi saru bl-użu tas-softwer GraphPad Prism 7.0 u Microsoft Excel. Il-proteina ġiet ikkwantifikata bl-użu tas-softwer Image J. It-test t ta' Student u l-analiżi tal-varjanza (ANOVA) intużaw biex tiġi kkalkulata s-sinifikat statistiku tad-dejta sperimentali. Differenzi b'valur P<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DISPONIBBILTÀ TA' DEJTA

Is-settijiet tad-dejta użati u analizzati matul l-istudju attwali huma inklużi f'dan l-artikolu ppubblikat.

Dan l-artikolu huwa estratt minn www.nature.com/cddiscovery