Astratt

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, ħxejjex aromatiċi prezzjużi tal-ikel-mediċina omologa mill-familja Orobanchaceae, hija kkultivata b'mod wiesa 'fin-Nofsinhar ta' Xinjiang taċ-Ċina. Il-kostitwenti bijoattivi ewlenin tiegħu tal-phenylethanoid glycoside,echinacosideuacteoside (verbascoside), iwassal diversi attivitajiet farmakoloġiċi inklużi anti-ossidazzjoni, anti-infjammazzjoni u regolazzjoni immuni. Proċeduri ta’ pproċessar tradizzjonali mhux standardizzati ħafna drabi jikkawżaw telf sostanzjali ta’ dawn il-komposti attivi ewlenin, li jillimitaw l-applikazzjoni tal-ikel mediċinali u funzjonali ta’Cistanche tubulosabiċċiet tad-decoction. Din ir-riċerka kellha l-għan li tottimizza l-parametri moderni tal-ipproċessar għall-friskCistanche tubulosaslices biex timmassimizza l-irkupru ta 'acteoside u echinacoside, u tiċċara aktar il-bijoattività anti-ossidattiva-istress u anti-infjammatorja kif ukoll il-mekkaniżmu molekulari sottostanti ta' biċċiet tad-decoction ipproċessati bl-aħjar mod fil-livell ċellulari.

Twettqu esperimenti b'fattur wieħed biex jiġu skrinjati firxiet xierqa għall-ħxuna tal-qatgħat, it-tul tal-fwar u t-temperatura tat-tnixxif tal-forn. Ġiet adottata metodoloġija tal-wiċċ ta’ rispons Box-Behnken bi tliet fatturi u tliet livelli biex jiġu stabbiliti mudelli ta’ interazzjoni b’ħafna fatturi, bl-użu ta’ kontenut ta’ acteoside u echinacoside bħala indikaturi ta’ evalwazzjoni doppja. Sussegwentement, inbena mudell taċ-ċelluli makrofaġi tal-ġurdien RAW264.7 stimulat minn lipopolysaccharide (LPS) biex jissimula perossidazzjoni tal-lipidi u ħsara infjammatorja akuta. Ġew implimentati serje ta’ analiżi bijokimiċi inklużi MTT, skoperta fluworexxenti ROS, ELISA u Western blot biex tiġi vvalutata l-qawwa tal-istress anti-ossidattiv u jiġu esplorati mogħdijiet ta’ trasduzzjoni tas-sinjali.

Skont riżultati sperimentali, l-aħjar parametri tal-ipproċessar ġew determinati bħala ħxuna tal-porzjon ta '0.6 ċm, trattament bil-fwar għal 6 min, u temperatura tat-tnixxif stabbilita għal 57 grad. Taħt din il-kundizzjoni prattika tal-ipproċessar, il-kontenuti mkejla ta 'acteoside u echinacoside laħqu 7.25 % u 31.62 % rispettivament, li juru konsistenza tajba mal-valuri ta' tbassir teoretiku. Assaġġi bbażati fuq iċ-ċelluli wrew li pproċessati bl-aħjar modCistanche tubulosaL-estratti tal-biċċa tad-decoction naqqsu b'mod sinifikanti l-konċentrazzjonijiet ta' ossidu nitriku (NO) u malondialdehyde (MDA) f'makrofaġi RAW264.7 sfidati bl-LPS. Sadanittant, żied b'mod notevoli l-attivitajiet ta 'enżimi antiossidanti intraċellulari ta' superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), lactate dehydrogenase (LDH), flimkien ma 'kontenut miżjud ta' glutathione (GSH). Il-livelli ta' sekrezzjoni ta' medjaturi pro-infjammatorji inklużi TNF-, IL-1 u IL-6 kienu mrażżna wkoll b'mod dipendenti mid-doża. L-iskoperta tal-western-blot ivvalidat danCistanche tubulosaestratti trażżan fosforilazzjoni eċċessiva ta 'proteini ewlenin fi ħdan kaskati ta' sinjalazzjoni p38/AKT/JNK/NF-κB.

Fil-qosor, dan il-protokoll modern ottimizzat ta' pproċessar itejjeb b'mod effettiv ir-rendiment ta' glikożidi feniletanojdi karatteristiċi (acteoside u echinacoside) f'Cistanche tubulosabiċċiet tad-decoction. Materjal veġetali pproċessat jeżerċita effetti anti-ossidattivi-istress u anti-infjammatorji prominenti fil-mudell ta 'korriment makrofaġi indott minn LPS, li l-mekkaniżmu farmakoloġiku tiegħu huwa realizzat parzjalment permezz ta' inibizzjoni ta 'attivazzjoni żejda ta' assi ta 'sinjalazzjoni infjammatorja p38/AKT/JNK/NF-κB. Dan ix-xogħol jipprovdi parametri tekniċi affidabbli għall-manifattura industrijali standardizzata u jipprovdi appoġġ sperimentali għall-iżvilupp ta’ ikel funzjonali anti-ossidant derivat minnCistanche tubulosa.

Kliem ewlieni: Cistanche tubulosa; teknoloġija tal-ipproċessar tal-biċċa tad-decoction; acteoside; echinacoside; stress anti-ossidattiv; RAW264.7 makrofagu; mogħdija tas-sinjalar p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Introduzzjoni

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight jappartjeni għall-familja Orobanchaceae, u z-zokk bil-qoxra imlaħħam tiegħu huwa l-parti mediċinali uffiċjali. Din il-pjanta mediċinali tad-deżert hija mħawla fil-biċċa l-kbira fin-Nofsinhar aridu ta 'Xinjiang, iċ-Ċina. Fil-prattika tradizzjonali tal-ħxejjex Ċiniża,Cistanche tubulosasservi bħala ħaxix toniku klassiku b'funzjonijiet terapewtiċi dokumentati ta 'tonifikazzjoni tal-kliewi-yang, riforniment tad-demm essenza, u illaxkar tal-moviment tal-musrana. Klinikament huwa applikat biex itaffi l-uġigħ-dgħjufija tal-lumbus u l-irkopptejn, infertilità kkawżata minn defiċjenza tal-kliewi, u stitikezza indotta minn nixfa intestinali维普期刊.

Phenylethanoid glycosides stand għall-markaturi bijoattivi l-aktar kritiċi taCistanche tubulosa. Il-Farmakopea Ċiniża tistipula li l-kontenut totali ta 'echinacoside flimkien ma' acteoside m'għandux ikun inqas minn 1.50 % għal materjali mediċinali kwalifikati. Madankollu, kurrenti mainstream manifattura ta 'Cistanche tubulosaIl-biċċiet tad-decoction għadhom isegwu l-aktar flussi tax-xogħol manwali tal-qedem: tixrib tal-ħaxix nej frisk, niedja sewwa, tqattigħ u tnixxif naturali jew ipproċessar tal-inbid bil-fwar. Dawn l-approċċi konvenzjonali m'għandhomx speċifikazzjonijiet tekniċi kwantitattivi preċiżi. L-instabilità termali tal-phenylethanoid glycosides spiss twassal għal degradazzjoni severa tal-ingredjent attiv matul l-ipproċessar, li tnaqqas il-kwalità tal-prodott finali u tirrestrinġi l-produzzjoni ta 'kwalità għolja fuq skala kbira. Fil-preżent, riċerka limitata biss tgħaqqad simultanjament l-ottimizzazzjoni tat-teknoloġija tal-ipproċessar mal-validazzjoni tal-attività bijoloġika; il-biċċa l-kbira tal-istudji sempliċement jiskopru kontenuti ta' kostitwenti kimiċi mingħajr verifika funzjonali ċellulari, u joħolqu lakuni għat-trasformazzjoni industrijali Google għal....

L-istress ossidattiv jaġixxi bħala trigger patoloġiku ewlieni għal mard metaboliku u infjammatorju kroniku multipli. Akkumulazzjoni eċċessiva ta 'speċi ta' ossiġenu reattiv (ROS) tfixkel l-omeostażi redox, u tkompli tipprovoka attivazzjoni żejda tal-makrofaġi u rilaxx massiv ta 'ċitokini pro-infjammatorji, li jiffurmaw ċiklu vizzjuż bejn l-ossidazzjoni u l-infjammazzjoni. Investigazzjonijiet farmakoloġiċi eżistenti wrew liCistanche‑oriġini phenylethanoid glycosides għandhom proprjetajiet anti-ossidanti u anti-infjammatorji. Esperimenti preċedenti fuq l-annimali wrew danCistanche tubulosaglycosides totali tjiebu l-ħsara epatika f'mudelli ta 'annimali gerriema sepsis billi attivaw is-sinjalar antiossidant Nrf2/HO-1. Komponenti lignan-glycoside iżolati minnCistanche tubulosajista 'jtaffi r-risponsi infjammatorji provokati mill-LPS permezz tal-modulazzjoni tal-mogħdija PI3K/AKT fil-makrofaġi RAW264.7. Madankollu, jekk il-biċċiet tad-decoction manifatturati taħt kundizzjonijiet ta' pproċessar ottimizzati ġodda jżommux bijoattività qawwija kontra l-istress ossidattiv ma ġiex evalwat b'mod sistematiku. Il-mekkaniżmu regolatorju molekulari konkret għadu jeħtieġ esplorazzjoni aktar profonda.

Il-makrofagu RAW264.7 stimulat mill-LPS huwa mudell in-vitro ta' infjammazzjoni-ħsara ossidattiva aċċettata sew, adottat b'mod wiesa 'għall-valutazzjoni tal-effetti anti-ossidanti u anti-infjammatorji ta' prodott naturali. F'dan l-istudju, l-ewwel inwettqu screening b'fattur wieħed segwit minn ottimizzazzjoni tal-wiċċ tar-rispons Box-Behnken biex niksbu parametri tekniċi standardizzati tat-tqattigħ-fwar-tnixxif li jimmiraw rendimenti għoljin ta 'acteoside u echinacoside. Wara li niksbu prodotti ottimizzati tal-biċċa tad-decoction, aħna nippreparaw estratti tal-ħxejjex u nadottaw mudell ta 'korriment ċellulari RAW264.7 indott mill-LPS. Pjattaformi sperimentali multipli inklużi l-kejl tal-markatur tal-istress ossidattiv-bijokimiċi, il-kwantifikazzjoni tal-ELISA taċ-ċitokini u l-analiżi tal-mogħdija Western-blot huma utilizzati biex jiċċaraw l-effikaċja tal-istress anti-ossidattiv u l-mekkaniżmu tat-trasduzzjoni tas-sinjali. Din ir-riċerka tagħti parametri prattiċi tal-proċess għall-produzzjoni fuq skala pilota ta' kwalità għoljaCistanche tubulosaBiċċiet tad-decoction b'attività stabbli kontra l-istress ossidattiv, u jistabbilixxi bażi sperimentali għall-iżvilupp sussegwenti ta 'ikel funzjonali u prodotti ta' supplimenti tad-dieta li ġejjin minn XinjiangCistanche tubulosariżorsi.

2. Materjali u Metodi

2.1 Materja Prima, Reaġenti u Strumenti

FriskCistanche tubulosazkuk imlaħħam inħasdu fil-ħarifa minn Hotan, ir-Reġjun Awtonomu Uyghur ta 'Xinjiang, iċ-Ċina. RAW264.7 ġurdien monocyte-macrophage lewkimja linja taċ-ċelluli nxtrat minn Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, iċ-Ċina). L-aċetonitrile u l-metanol ta' grad kromatografiku ġew fornuti minn Merck (il-Ġermanja). Sustanzi standard ta' referenza echinacoside u acteoside (purità akbar minn jew ugwali għal 98 %) inkisbu mill-Istitut tar-Riċerka tat-Teknoloġija tal-Metroloġija ta' Beijing North Weiye. Dimethyl sulfoxide (DMSO) inxtara minn Sigma-VETEC (USA). DMEM ta 'glukożju għoli, kit ta' analiżi tal-proteini totali BCA kienu prodotti ta 'Thermo Fisher Scientific (USA). Serum bovin tal-fetu (FBS) inxtara minn BI (Iżrael). Is-soluzzjoni ta’ antikorpi doppji tal-peniċillina-streptomycin ġiet minn HyClone (USA). Kits ta 'assaġġ kummerċjali għal NO, MDA, SOD, CAT, GSH ġew akkwistati minn Beyotime Biotechnology (Shanghai, iċ-Ċina). Kit ta' detezzjoni tal-LDH u lipopolisakkarid (LPS,E. coli055: B5) inkisbu minn Solarbio (Beijing, iċ-Ċina).

L-istrumenti ewlenin tal-laboratorju kienu jinkludu sistema ta’ kromatografija likwida ta’ prestazzjoni għolja (HPLC) Shimadzu, evaporatur rotatorju LabTech, polverizzatur tal-ħxejjex Ċiniżi b’veloċità għolja tat-tip swing, forn termostatiku għat-tnixxif tal-blast, tagħmir ta’ steam pot, BioTek SYNERGY-H1 multi-mode microplate reader, qarrej ta’ microplate refriġerat elettroniku CF12404 ċentrifuga, kabinett tal-bijosigurtà BSC-1300IIA2 u mikroskopju ottiku invertit BDS200-PH.

2.2 Esperimenti ta' Ipproċessar b'Fattur Uniku

FriskCistanche tubulosazkuk imlaħħam inqatgħu fi flieli ta 'ħxuna differenti (0.2 ċm, 0.4 ċm, 0.6 ċm, 0.8 ċm, 1.0 ċm, 1.2 ċm). Flieli ġew steamed għal tul ta 'żmien varjat (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Wara l-materjali ġew imnixxfa taħt gradjenti ta 'temperatura differenti (ambjent 25 grad, 40 grad, 50 grad, 60 grad, 70 grad, 80 grad). Kampjuni tal-biċċa tad-decoction imnixxfa għal kollox ġew polverizzati u mgħarbel permezz ta' għarbiel ta' 40 malja għall-kwantifikazzjoni sussegwenti tal-komponenti HPLC.

2.3 Determinazzjoni tal-Kontenut ta' Acteoside u Echinacoside

Preparazzjoni tas-soluzzjoni tal-kampjun: Iżen b'mod preċiż 1.0 g trab tal-biċċa tad-decoction pulverizzat fi flixkun koniku bit-tapp. Żid 100 mL 50 % soluzzjoni ta' metanol preċiż. Wettaq 30-min tixrib segwit minn 40-min estrazzjoni ultrasonika. Wara li tkessaħ, imla t-telf fil-piż tas-solvent b'50 % metanol, ħawwad b'mod uniformi u ħalli l-issetiljar statiku. Is-supernatant ġie ffiltrat permezz ta 'membrana mikroporuża ta' 0.22 μm għal injezzjoni HPLC.

Preparazzjoni ta’ soluzzjoni standard ta’ referenza: Iżen b’mod preċiż il-kwantità xierqa ta’ sustanzi ta’ referenza acteoside u echinacoside, dewweb b’50 % metanol ġewwa fliexken volumetriċi, ipprepara soluzzjonijiet standard gradjent serjali, iffiltra b’membrana tal-filtru ta’ 0.22 μm.

Setup kromatografiku: kolonna analitika COSMOSIL C₁₈; sistema ta' fażi mobbli: fażi mobbli A: 0.1 % soluzzjoni milwiema ta' aċidu fosforiku; fażi mobbli B: aċetonitrile. Wavelength ta 'skoperta ġie stabbilit bħala 330 nm; temperatura tal-kolonna 35 grad; rata tal-fluss 1 mL/min. Ġie applikat metodu ta' standard estern għall-kalkolu kwantitattiv tal-kontenut ta' acteoside u echinacoside. Punteġġ ta' valutazzjoni komprensiva=(kontenut ta' echinacoside × 50 %) + (kontenut ta' aktoside × 50 %). Punteġġi komprensivi servew bħala indikatur ta' valutazzjoni kompost għall-prestazzjoni tal-kundizzjoni tal-ipproċessar.

2.4 Disinn Sperimentali ta' Rispons-Wiċċ Box‑Behnken

Ibbażat fuq riżultati sperimentali ta’ fattur wieħed, is-softwer Design‑Expert 13.0 intuża biex jimplimenta arranġament sperimentali ta’ tliet livelli ta’ tliet fatturi ta’ Box‑Behnken. Il-ħxuna tal-qatgħat (X₁, cm), il-ħin tat-trattament tal-fwar (X₂, min), it-temperatura tat-tnixxif (X₃, grad ) intgħażlu bħala varjabbli indipendenti. Il-kontenut ta' Acteoside (Y₁, %) u l-kontenut ta' echinacoside (Y₂, %) kienu valuri ta' rispons. Twettqu sbatax-il grupp ta 'esperimenti. Intgħażel livell żero għal kull fattur skont l-aħjar parametru miksub f'testijiet b'fattur wieħed. Wara li spiċċaw il-provi tal-wiċċ tar-rispons, tlestew l-analiżi tal-varjanza tal-mudell, il-plottjar tal-wiċċ tar-rispons 3D u t-tbassir tal-kundizzjoni. Twettqu esperimenti ta' verifika prattiċi wara li ġew aġġustati l-parametri teoretiċi previsti għal valuri ta' produzzjoni attwali operabbli.

2.5 Kultura taċ-Ċelloli u Preparazzjoni tal-Kampjun

Il-materja prima tal-biċċa tad-decoction ġiet immanifatturata taħt kundizzjonijiet ta' pproċessar ottimizzati. Trab tal-ħxejjex ġie estratt skont il-protokoll tal-preparazzjoni tal-kampjuni msemmi hawn fuq, ikkonċentrat b'evaporazzjoni rotatorja u mnixxef bil-vakwu biex jinkiseb trab tal-estratt solidu. Is-soluzzjoni tal-ħażniet ġiet ippreparata billi tħoll trab tal-estratt f'DMSO, dilwit aktar b'medja DMEM kompluta (li fih 10 % FBS u 1 % penicillin-streptomycin) għal esperimenti ċellulari; il-konċentrazzjoni finali tax-xogħol tad-DMSO kienet ikkontrollata taħt 0.1 % (v/v). Il-makrofagi RAW264.7 ġew ikkultivati ​​f'medja kompluta DMEM taħt 37 grad, ambjent ta 'inkubatur umidifikat ta' 5% CO₂.

2.6 MTT Assaġġ taċ-Ċitotossiċità

Iċ-ċelluli RAW264.7 ġew miżrugħa fuq mikropjanċi ta '96-well f'densità taċ-ċelluli ta' 8 × 10⁴ ċelluli/mL. Gruppi sperimentali kienu jinkludu grupp ta' kontroll tas-solvent (0.1 % DMSO medium), grupp tal-mudell LPS (konċentrazzjoni finali ta' LPS 1 ug/mL), u multipliCistanche tubulosagruppi ta 'konċentrazzjoni ta' estratt (3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Wara sagħtejn qabel l-inkubazzjoni b'kampjun tal-ħxejjex, LPS (konċentrazzjoni finali 1 ug/mL) ġie supplimentat għal kull grupp ħlief grupp ta 'kontroll tas-solvent. L-inkubazzjoni kompliet għal 24 siegħa. Imbagħad reaġent MTT (5 mg/mL) ġie miżjud u inkubat għal 4 sigħat. Armi s-supernatant, żid 150 μL DMSO kull bir, ħawwad f'37 grad għal 15-il minuta. Il-valur ta' l-assorbenza f'wavelength ta' 490 nm inqara fuq microplate reader, u ġiet ikkalkulata r-rata ta' sopravivenza taċ-ċelluli. Ġiet determinata medda ta' konċentrazzjoni ta' xogħol bla periklu għal testijiet funzjonali ta' segwitu.

2.7 Kejl ROS intraċellulari

Il-makrofagi RAW264.7 ġew imlaqqma fuq pjanċi ta 'sitt bir-densità ta' 4 × 10⁵ ċelluli għal kull bir. Wara l-aderenza taċ-ċelluli, sar trattament ta 'raggruppament: grupp ta' kontroll tas-solvent, grupp tal-mudell LPS, u gruppi ta 'trattament ta' estratt CT (12.5, 25, 50, 100 ug/mL). Wara trattament minn qabel ta' sagħtejn bil-kampjun, ġie miżjud LPS 1 ug/mL ħlief grupp ta' kontroll tas-solvent, inkuba 24 siegħa. Il-livell ta' ROS intraċellulari ġie skopert bl-użu tal-metodu ta' tagħbija ta' sonda fluworexxenti skont l-istruzzjonijiet tal-kit. L-intensità fluworexxenti ġiet imkejla b'qarrej tal-mikroplate fluworexxenti (eċċitazzjoni 488 nm, emissjoni 525 nm).

2.8 Sejbien ta 'NO, MDA, SOD, CAT, LDH u GSH

Wara t-trattament taċ-ċelluli korrispondenti, inġabar is-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli għal kejl NO bl-adozzjoni tar-reazzjoni ta' Griess. Iċ-ċelloli mwaħħla ġew maħsula b'PBS imkessaħ minn qabel, lisati fuq is-silġ, is-supernatant tal-lisat taċ-ċelluli nħasad wara ċ-ċentrifugazzjoni (10 000 r/min, 4 gradi, 5 min). Il-kit BCA iddetermina l-konċentrazzjoni totali ta' proteina ta' kull kampjun. Il-kontenut tal-MDA, il-GSH u l-indikaturi tal-attività enżimatika SOD, CAT, LDH ġew ttestjati strettament wara manwali operattivi tal-kit.

2.9 Determinazzjoni ta' ELISA ta' Ċitokini Pro-Infjammatorji

Iċ-ċelloli RAW264.7 irċevew trattament minn qabel tal-kampjun u stimulazzjoni LPS għal 16-il siegħa totali. Is-supernatant tal-kultura taċ-ċelluli inġabar u ċċentrifugat. Konċentrazzjonijiet ta 'TNF-, IL-1, IL-6 fis-supernatant ġew ikkwantifikati minn kits ELISA kummerċjali.

2.10 Analiżi Western-Blot

Wara 45 min ta 'LPS u ko-inkubazzjoni tal-kampjun, iċ-ċelloli RAW264.7 ġew lysed bl-użu ta' buffer ta 'liżi RIPA supplimentat b'cocktail ta' inibitur ta 'protease-phosphatase. Lisat taċ-ċelluli ġie ċentrifugat fi 10 000 r/min taħt 4 gradi għal 5 min. Kit BCA kkwantifikat konċentrazzjoni totali ta' proteini. Proteini tal-kampjun (50 ug kull korsija) ġew żnaturati f'banju tal-metall ta '100 grad għal 5 min. L-elettroforeżi tal-ġel SDS-PAGE sseparat il-proteini fil-mira, li mbagħad ġew trasferiti fuq membrani PVDF. Il-membrani ġew imblukkati għal siegħa b'5 % soluzzjoni TBST ta' ħalib xkumat. Antikorpi primarji mmirati lejn p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 u GAPDH ġew inkubati matul il-lejl f'4 gradi. Wara l-ħasil tat-TBST, l-antikorpi sekondarji korrispondenti ġew inkubati f'temperatura tal-kamra għal siegħa. Wara ħasil ripetut, reaġent kimiluminixxenti ultra-sensittiv ECL ġie applikat għall-immaġni tal-faxxa tal-proteini. Analiżi kwantitattiva fuq skala griża tal-banda ġiet implimentata għall-valutazzjoni tal-livell relattiv tal-espressjoni tal-proteini tal-fosforilazzjoni.

2.11 Analiżi Statistika

Is-softwer GraphPad Prism 8.0.2 ġie utilizzat għall-komputazzjoni statistika u l-plottjar tal-grafiċi. Ir-riżultati tad-dejta kwantitattiva sperimentali ġew espressi bħala medja ± devjazzjoni standard (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). ANOVA f'direzzjoni waħda segwita minn testijiet ta' tqabbil multiplu post-hoc ġiet applikata għal tqabbil bejn il-gruppi. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Riżultati Sperimentali

3.1 Riżultati ta' Esperimenti ta' Fattur Uniku

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0.4 cm) imxekkel ir-rilaxx tas-sustanza interna, li jnaqqas il-kontenut finali tal-komponent li jista' jinduna. Taħt il-ħin fiss tal-fwar (10 min) u t-temperatura tat-tnixxif (60 grad), ħxuna ta 'slice ta' 0.4 ċm kisbet l-ogħla punteġġ ta 'evalwazzjoni komprensiva.

Ir-riżultati tat-tul tat-trattament tal-fwar: meta l-ħxuna tal-porzjon ġiet iffissata għal 0.4 ċm u t-temperatura tat-tnixxif tinżamm f'60 grad, ħin insuffiċjenti tal-fwar ma setax jeqred biżżejjed l-istruttura taċ-ċelluli tal-pjanti sabiex il-komposti attivi kienu diffiċli biex jinħall. Ladarba l-ħin tal-fwar qabeż is-6 minuti, il-fwar żejjed għamel ħsara lit-tessut tal-ħxejjex u kkaġuna degradazzjoni tal-echinacoside u l-acteoside. Għalhekk 6 min ġew identifikati b'mod preliminari bħala tul ta' żmien preferibbli għall-ipproċessar tal-fwar.

Għal esperimenti ta 'gradjent ta' temperatura tat-tnixxif tal-forn: ħxuna tal-qatgħat ta '0.4 ċm u ħin ta' fwar 6 min ġew iffissati. Il-kontenut tal-komponenti żdied maż-żieda fit-temperatura tat-tnixxif f'ċertu medda. Ladarba t-temperatura tat-tnixxif qabżet is-60 grad, id-dekompożizzjoni termali f'temperatura għolja kkawżat tnaqqis notevoli tal-kontenut tas-sustanza fil-mira. Għalhekk intgħażel 60 grad bħala kundizzjoni inizjali ottimali tat-temperatura tat-tnixxif għall-ottimizzazzjoni sussegwenti tal-wiċċ tar-rispons.

3.2 Ottimizzazzjoni u Verifika tar-Rispons tal-Wiċċ Box‑Behnken

Sbatax-il grupp ta' ġiri sperimentali Box-Behnken ġew lesti skont il-matriċi tad-disinn. Ir-riżultati tal-analiżi tal-varjanza indikaw li mudelli ta' rigressjoni kemm għall-kontenut ta' acteoside kif ukoll għal echinacoside kisbu sinifikat statistiku (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >ħxuna tal-porzjon.

Permezz tal-kalkolu matematiku tal-mudell, il-parametri teoretiċi tal-ipproċessar ottimali kienu: ħxuna tal-porzjon 0.600 ċm, ħin tat-trattament tal-fwar 5.685 min, temperatura tat-tnixxif 57.009 grad. Meta wieħed iqis il-fattibbiltà attwali tal-operat industrijali, il-parametri ġew aġġustati għal ħxuna tal-qatgħat 0.6 ċm, ħin tal-fwar 6 min, temperatura tat-tnixxif 57 grad. Twettqu tliet esperimenti ta' validazzjoni paralleli. Taħt din il-kondizzjoni prattika, il-kontenut mkejjel ta 'acteoside kien 7.25 %, il-kontenut ta' echinacoside laħaq 31.62 %. Id-devjazzjoni bejn il-valuri mkejla u t-tbassir teoretiku baqgħet taħt il-5 %, u dan juri li dan il-mudell tal-wiċċ tar-rispons kien affidabbli u applikabbli biex jiggwida l-produzzjoni tad-decoction fid-dinja reali.

3.3 Skrinjar taċ-ċitotossiċità ta' Ottimizzat-PproċessatCistanche tubulosaEstratt f'Ċelloli RAW264.7

Ir-riżultati taċ-ċitotossiċità MTT wrew li l-konċentrazzjoni tal-estratt li tvarja 0-100 ug/mL ma eżerċitat l-ebda effett tossiku ovvju fuq il-makrofagi RAW264.7, u saħansitra wriet tendenza ħafifa li tippromwovi l-proliferazzjoni taċ-ċelluli. Meta l-konċentrazzjoni tat-trattament telgħet għal 200 ug/mL u 400 ug/mL, ir-rata ta 'sopravivenza taċ-ċelluli naqset b'mod sinifikanti meta mqabbla mal-grupp ta' kontroll tas-solvent, u turi ċitotossiċità dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Għalhekk, gradjenti ta 'konċentrazzjoni ta' 12.5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL ġew magħżula bħala konċentrazzjonijiet ta 'ħidma sikuri għal analiżi ċellulari sussegwenti relatati mal-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni.

3.4 Cistanche tubulosaEstratt ta' Livell ta' ROS Intraċellulari Mnaqqas f'Makrofaġi Stimulati minn LPS

Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll tas-solvent, l-intensità fluworexxenti ROS intraċellulari tal-grupp tal-mudell LPS żdiedet b'mod estremament sinifikanti (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaestratt, l-akkumulazzjoni intraċellulari ta' ROS naqset b'mod dipendenti fuq id-doża. Kull grupp ta' trattament tad-droga wera tnaqqis statistikament sinifikanti ta' ROS versus grupp tal-mudell LPS (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Effetti fuq il-Kontenut NO u MDA

NO iservi bħala medjatur infjammatorju klassiku rilaxxat minn makrofaġi attivati. L-MDA huwa bijomarkatur standard tad-deheb li jirrifletti l-ħsara ossidattiva tal-perossidazzjoni tal-lipidi. Meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll tas-solvent, l-istimulazzjoni tal-LPS żiedet b'mod sinifikanti l-kontenut ta' NO u MDA fiċ-ċelloli RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosatrattament ta 'estratt jista' jbaxxi l-konċentrazzjoni NO b'mod sinifikanti. Għall-indikatur MDA: grupp ta' 12.5 ug/mL ma pproduċiex titjib statistikament sinifikanti; Gruppi ta’ konċentrazzjoni ta’ 25-100 ug/mL naqqsu b’mod osservabbli l-livell ta’ MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Impatti fuq Indikaturi Bijokimiċi Relatati mal-Antiossidanti SOD, CAT, LDH, GSH

Wara l-isfida tal-LPS, l-attività enżimatika intraċellulari ta' SOD, CAT, LDH kif ukoll il-kontenut ta' GSH naqas drastikament meta mqabbel mal-grupp ta' kontroll tas-solvent (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaL-estratti tal-biċċa tad-decoction jistgħu jirrestawraw il-kapaċità ta 'difiża anti-ossidant endoġenu ċellulari kontra insulti ossidattivi indotti minn LPS.

3.7 Effett Inibitorju fuq Ċitokine Pro-Infjammatorju TNF-, IL-1, IL-6 Rilaxx

Ir-riżultati ta' l-iskoperta ta' ELISA wrew li l-istimulazzjoni ta' LPS ippromwoviet bil-qawwa s-sekrezzjoni ta' TNF-, IL-1, IL-6 minn makrofaġi RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosakonċentrazzjoni tat-trattament tal-estratt, il-kwantità tar-rilaxx ta 'dawn it-tliet ċitokini pro-infjammatorji ewlenin ġiet imrażżna progressivament, u ppreżentat korrelazzjoni ċara bejn id-doża u r-rispons. Hija kkonfermat li l-estratt tal-ħxejjex eżerċita funzjoni anti-infjammatorja qawwija billi trażżan is-sekrezzjoni ta 'ċitokini pro-infjammatorji minn makrofaġi attivati.

3.8 Regolament dwar p38/AKT/JNK/NF-κB Fosforilazzjoni tal-Passaġġ tas-Sinjali

Dejta sperimentali tal-western-blot wriet li l-proporzjonijiet ta’ p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK u p-NF-κB/NF-κB kienu elevati b’mod sinifikanti fil-grupp tal-mudell LPS versus il-grupp tal-kontroll tas-solvent (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosal-intervent tal-estratt naqas notevolment il-proporzjon p-p38/p38 u p-JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaL-estratt tal-biċċa tad-decoction ħeles mill-ħsara ossidattiva-infjammatorja permezz tat-trażżin tal-attivazzjoni tal-iper-fosforilazzjoni tan-netwerk tas-sinjalar p38/AKT/JNK/NF-κB.

4. Diskussjoni

Rekwiżiti tal-ipproċessar tradizzjonali rreġistrati fil-Farmakopea Ċiniża għalCistanche tubulosaprinċipalment jinkludu t-tneħħija tal-impurità, ħasil, niedja, tqattigħ u tnixxif, mingħajr ma jiġu speċifikati parametri numeriċi preċiżi għall-ħxuna tal-qatgħat, it-tul tal-fwar u t-temperatura tat-tnixxif. L-ipproċessar manwali mhux standard iġib varjazzjonijiet kbar fil-kwalità tal-prodotti kummerċjali tal-biċċiet tad-decoction. Phenylethanoid glycosides (echinacoside u acteoside) huma komposti bijoattivi termolabbli. Ħin ta 'tisħin jew temperatura mhux xierqa se jikkawżaw dekompożizzjoni kimika u jnaqqas il-valur mediċinali. L-esperimenti tagħna b'fattur wieħed wrew li kemm fwar insuffiċjenti kif ukoll eċċessiv kif ukoll temperatura ta 'tnixxif għolja żżejjed jikkawżaw telf ta' komponenti ta 'glycoside fil-mira. Aktar ottimizzazzjoni b'ħafna fatturi Box-Behnken kisbet parametri prattiċi tal-manifattura: ħxuna tal-qatgħat 0.6 ċm, fwar 6 min, tnixxif 57 grad. Taħt din il-kundizzjoni, il-kontenut ta' acteoside u echinacoside laħaq 7.25 % u 31.62 %, li jaqbeż ħafna l-limitu minimu ta' kwalità tal-farmakopea. Dan il-protokoll ottimizzat jipprovdi referenzi tekniċi kwantitattivi fattibbli għall-ipproċessar industrijali standardizzat ta 'oriġini XinjiangCistanche tubulosa.

L-istress ossidattiv u l-infjammazzjoni huma proċessi patoloġiċi interkonnessi sewwa. Eċċess ta 'ROS jinduċi perossidazzjoni tal-lipidi u jiġġenera MDA, li jattiva aktar il-makrofagi immuni-innati. Makrofagi attivati ​​inixxu NO abbundanti u ċitokini pro-infjammatorji multipli, li bil-maqlub jamplifikaw il-produzzjoni ta 'ROS intraċellulari, u jiffurmaw ċiklu vizzjuż ossidattiv-infjammatorju li jamplifika lilhom infushom. Sustanzi anti-ossidanti naturali derivati ​​mill-pjanti jistgħu jkissru din il-linja patoloġika billi jgħollu s-sistema endoġenika ta 'enżimi anti-ossidanti u jrażżnu t-trasduzzjoni tas-sinjal infjammatorju. F'dan l-istudju in-vitro, ipproċessat bl-aħjar modCistanche tubulosaL-estratti tal-biċċa tad-decoction naqqsu l-livelli ta' ROS, NO u MDA, filwaqt li tejbu l-attivitajiet ta' SOD, CAT, LDH u l-kontenut ta' GSH fil-makrofaġi RAW264.7 stimulati bl-LPS. Fl-istess ħin, inibixxi t-tnixxija ta' TNF-, IL-1, IL-6 pro-infjammatorji-ċitokini, u wera kapaċità integrata ta' stress anti-ossidattiv u anti-infjammatorji.

Il-molekuli tal-familja tal-protein-kinase attivati ​​mill-mitoġenu p38, JNK flimkien ma 'AKT u NF-κB jikkomponu hub ċentrali tat-trasduzzjoni tas-sinjali li jimmedjaw risponsi infjammatorji-ossidattivi tal-makrofagi. Mal-istimulazzjoni tal-LPS, is-sinjal upstream iqajjem l-attivazzjoni tal-fosforilazzjoni ta 'p38, JNK u AKT, li b'mod sekwenzjali jippromwovi l-fosforilazzjoni tas-subunità NF-κB p65 u t-traslokazzjoni nukleari. NF-κB attivat jaġixxi bħala fattur ta 'traskrizzjoni u jibda traskrizzjoni ta' lottijiet kbar ta 'ċitokini pro-infjammatorji u ġeni relatati mal-istress ossidattiv. Ir-riżultati Western-blot tagħna wrew danCistanche tubulosaestratt jista' jrażżan il-fosforilazzjoni ta' p38, JNK, AKT u NF-κB p65. Għalhekk, aħna niddeduċu li l-attività bijoloġika anti-ossidattiva u anti-infjammatorja tagħha tinkiseb, tal-inqas parzjalment, permezz tal-imblukkar tal-attivazzjoni żejda tal-assi tas-sinjalar p38/AKT/JNK/NF-κB.

Hemm diversi limitazzjonijiet fir-riċerka attwali. Il-verifiki funzjonali kollha huma limitati għal-livell ta' kultura taċ-ċelluli in-vitro. Huma meħtieġa aktar esperimenti in vivo fuq mudell ta' annimali biex jivverifikaw il-prestazzjoni farmakodinamika in vivo ta' biċċiet tad-decoction ottimizzati. Barra minn hekk, dan l-istudju adotta estratt imħallat totali minn biċċiet tad-decoction, għalhekk ma nistgħux niddistingwu kontribuzzjoni individwali ta 'echinacoside, acteoside u metaboliti sekondarji minuri oħra. Ir-riċerka ta' segwitu tista' tiżola l-komposti tal-monomeri biex tqabbel il-qawwa rispettiva tal-istress kontra l-ossidazzjoni, u twettaq investigazzjoni tal-effett tal-kompatibilità. Minkejja dan, ix-xogħol preżenti tagħna għadu jagħti parametri prattiċi tat-teknoloġija tal-ipproċessar u evidenza mekkanistika preliminari għall-iżviluppCistanche tubulosaprodotti tal-kura tas-saħħa relatati.

5. Konklużjoni

Bħala konklużjoni, il-fluss tax-xogħol tal-ipproċessar modernizzat ottimizzat mill-metodoloġija tal-wiċċ ta 'rispons Box-Behnken (ħxuna tal-porzjon 0.6 ċm, fwar 6 min, temperatura tat-tnixxif 57 grad) jista' jżid b'mod sinifikanti l-kontenut ta 'acteoside u echinacoside ta'Cistanche tubulosabiċċiet tad-decoction. Estratti ppreparati minn dawn il-flieli tal-ħxejjex ipproċessati bl-aħjar mod jeżerċitaw effetti anti-ossidattivi-istress u anti-infjammatorji prominenti kontra ħsara makrofaġi RAW264.7 indotta mill-LPS. Il-mekkaniżmu sottostanti huwa korrelatat mar-restawr tas-sistema ta 'difiża antiossidant intraċellulari u l-inibizzjoni ta' attivazzjoni eċċessiva tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni infjammatorja p38/AKT/JNK/NF-κB. Dan l-istudju jipprovdi bażi sperimentali soda għall-produzzjoni industrijali standardizzata u l-isfruttament tal-ikel funzjonaliCistanche tubulosariżorsi.

Referenzi

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Estrazzjoni ta 'echinacoside minnCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight u investigazzjoni ta 'l-effett protettiv tiegħu fuq il-ħsara fil-fwied fil-firien sepsis. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. L-effetti anti-infjammatorji ta 'lignan glycosides minnCistanche tubulosazkuk fuq ċelluli makrofagi RAW264.7 indotti minn LPS/IFN permezz tal-mogħdija PI3K/AKT. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Stress ossidattiv u disturbi metaboliċi: Patoġenesi u strateġiji terapewtiċi. Xjenzi tal-Ħajja, 2016,148:183‑193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Anti-infjammatorji ta 'dise-necionyl cis-khellactone f'ċelluli RAW264.7 stimulati mill-LPS u l-attività inibitorja tiegħu fuq epoxide hydrolase solubbli. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin itaffi r-risponsi infjammatorji indotti minn lipopolysaccharide fil-makrofaġi billi jrażżnu l-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni MAPK u NF-κB. Ġurnal ta 'Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. Il-mogħdija tas-sinjalar PI3K/AKT f'infjammazzjoni, mewt taċ-ċelluli u formazzjoni ta 'ċikatriċi gliali wara korriment trawmatiku fis-sinsla tad-dahar. Proliferazzjoni taċ-Ċelloli, 2022,55(9):e13275.