Norwogonin itattenwa l-istress ossidattiv u l-apoptożi kkaġunati mill-ipoksja fiċ-Ċelloli PC12

Għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com

Astratt

Sfond: Norwogonin huwa flavone naturali bi tliet gruppi idroksil fenoliċi fi struttura skeletriċi u għandu eċċellentiantiossidantattività. Madankollu, l-effett newroprotettiv ta 'norwogonin għadu mhux ċar. Hawnhekk, investigajna l-kapaċità protettiva ta 'norwogonin kontra ħsara ossidattiva suscitata mill-ipoksja fiċ-ċelloli PC12. Metodi: Il-vijabbiltà taċ-ċelluli u l-apoptożi ġew eżaminati b'assaġġ MTT u t-tbajja' ta' Annexin V-FITC/PI, rispettivament. Il-kontenut ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) kien imkejjel bl-użu ta 'assaġġ DCFH-DA. Lactate dehydrogenase (LDH), malondialdehyde (MDA), uantiossidantlivelli ta' enzimi ġew determinati bl-użu ta' kits kummerċjali. L-espressjoni ta 'ġeni u proteini relatati kienet imkejla b'PCR kwantitattiv f'ħin reali u Western blotting, rispettivament. Riżultati: Sibna li norwogonin itaffu l-ħsara kkawżata mill-ipoksja fiċ-ċelluli PC12 billi żiedet il-vijabbiltà taċ-ċelluli, tnaqqas ir-rilaxx ta 'LDH, u tejbet il-bidliet fil-morfoloġija taċ-ċelluli. Norwogonin aġixxa wkoll bħala anantiossidantbilli tneħħi ROS, tnaqqas il-produzzjoni ta 'MDA, iżżomm l-attivitajiet ta' superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), u glutathione peroxidase (GPx), u tnaqqas il-livelli ta 'espressjoni ta' HIF-1 u VEGF. Barra minn hekk, wogonin ipprevjeni l-apoptożi taċ-ċelluli billi jinibixxi l-livelli ta 'espressjoni ta' caspase-3, cytochrome c, u Bax filwaqt li żied il-livelli ta 'espressjoni ta' Bcl-2 u l-proporzjon ta 'Bcl-2/Bax. Konklużjonijiet: Norwogonin jnaqqas il-ħsara kkaġunata mill-ipoksja fiċ-ċelloli PC12 billi jitfi ROS, u jżomm l-attivitajiet ta 'antiossidantenżimi, u jinibixxu l-mogħdija tal-apoptożi mitokondrijali.

Kliem ewlieni: Norwogonin,Attività antiossidanti, Ipoksja, Stress ossidattiv, Apoptożi

Sfond

L-organiżmi aerobiċi jeħtieġu l-ossiġnu (O2) biex jipproduċu l-enerġija. L-ipoksja hija definita bħala provvista insuffiċjenti ta' O2 biex tinżamm il-funzjoni ċellulari fit-tessut u ħafna drabi sseħħ f'xi sitwazzjonijiet fiżjoloġiċi bħal altitudni għolja [1], u f'ħafna sitwazzjonijiet patoloġiċi bħal puplesija [2]. Il-moħħ huwa partikolarment sensittiv għal korriment ikkawżat mill-ipoksja minħabba l-konsum għoli ta’ ossiġnu tiegħu, rikk f’aċidi grassi mhux saturati, u baxx.antiossidantkapaċità [3]. Evidenza dejjem akbar indikat li l-ipoksja tista 'tikkawża effetti ħżiena fuq il-moħħ [4-6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia, u Huiping Ma

Dipartiment tal-Farmaċija, l-Isptar 940 tal-forza ta 'Appoġġ tal-Loġistika Konġunta tal-PLA, Lanzhou 730050, Gansu, iċ-Ċina

L-istress ossidattiv u l-apoptożi huma kkunsidrati bħala żewġ fatturi li jikkontribwixxu fil-ħsara kkawżata mill-ipoksja [7, 8]. L-espożizzjoni għall-ipoksja ġiet irrappurtata li żżid il-produzzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv intraċellulari (ROS), li tiffaċilita l-istress ossidattiv. ROS eċċessiv, bħal superoxide anion (O2−˙ ), hydrogen peroxide (H2O2), u hydroxyl radical (HO•), iwassal għal bidliet ċellulari strutturali u funzjonali billi jattakkaw lipidi, membrani, proteini u DNA, u sussegwentement jikkawża ħsara fiċ-ċelluli [ 9].

Ikklikkja għal Cistanches għall-antiossidant

Fl-istess ħin, ROS prodott żejjed jiffaċilita wkoll il-ftuħ ta 'pori ta' transizzjoni tal-permeabilità mitokondrijali (mPTP) [10] u t-trasferiment ta 'proteini pro-apoptosi għall-membrana mitokondrijali ta' barra, li jinduċi depolarizzazzjoni ta 'membrani mitokondrijali u rilaxxi ta' cytochrome c [11]. Dawn il-bidliet fl-aħħar mill-aħħar jikkawżaw apoptożi dipendenti fuq il-mitokondrija [12]. Għalhekk, huwa maħsub liantiossidantibil-kapaċità li jinibixxu jew jeliminaw ROS eċċessivi jistgħu jeżerċitaw l-effett protettiv tagħhom permezz ta 'stress ossidattiv attenwanti u apoptożi indotta minn ipoksja. Ħafna studji wrew danantiossidantsupplimenti bħall-vitamina C [13], isoflavone [8], u nitrossidu radikali [14], jistgħu jillimitaw il-ħsara kkaġunata mill-ipoksja in vitro u in vivo. Flavonoids huma klassi kbira u diversa ta 'metaboliti sekondarji tal-pjanti kullimkien. Huma dejjem meqjusa bħala naturali eċċellentiantiossidantbil-kapaċità li tneħħi r-radikali ħielsa u tinibixxi l-perossidazzjoni tal-lipidi.

Bħalissa, aktar u aktar attenzjoni ngħatat lil din il-klassi ta 'komposti minħabba l-effetti ta' benefiċċju tagħhom fuq is-saħħa tal-bniedem. Intwera li l-flavonojdi għandhom firxa wiesgħa ta 'azzjonijiet farmakoloġiċi, bħal attività anti-infjammatorja, antinoċiċettiva u newroprotettiva, eċċ., li kollha jistgħu jiġu attribwiti għall-attivitajiet antiossidanti tagħhom [15]. Bosta studji indikaw li l-flavonoids juru effetti protettivi eċċellenti fuq falliment ikkawżat mill-ipoksja. Pereżempju, ir-rutina għandha effett newroprotettiv qawwi kontra l-mewt taċ-ċelluli tal-ganglioni tar-retina indotta mill-ipoksja [16]. Studju reċenti juri wkoll li r-rutin jista 'jtaffi l-ħsara tal-ipoksja kkaġunata mill-klorur tal-kobalt billi jinibixxi l-istress ossidattiv u l-apoptożi fiċ-ċelloli H9c2 [17]. Barra minn hekk, Liu et al jissuġġerixxu li nobiletin (3′,4′,5,6, 7,8-hexamethoxy flavone) jnaqqas il-ħsara mijokardijaka I/R permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija Akt/GSK-3 fiċ-ċellula H9c2 [18]. Barra minn hekk, acacetin jista 'jipproteġi kardjomijoċiti tal-firien u kardjomijoblasti H9C2 kontra ħsara kkawżata minn ipoksja / riossiġenazzjoni permezz ta' attivazzjoni medjata mill-AMPK tal-mogħdija ta 'sinjalazzjoni Nrf2 [19].

Norwogonin (5,7,8-trihydroxy flavone, Fig. 1) huwa flavone farmakoloġikament attiv separat mill-għerq ta 'Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" fiċ-Ċiniż), ħaxix tradizzjonali Ċiniż użat biex jikkura l-influwenza u l-kanċer [20, 21]. Madankollu, ġew irrappurtati studji limitati dwar l-attivitajiet bijoloġiċi ta 'norwogonin minħabba l-livelli baxxi tiegħu fil-pjanti naturali. Sabiex tiġi indirizzata din il-problema, huma rrappurtati diversi metodi ta 'sintesi ta' norwogonin [22, 23].

L-istudju preċedenti tagħna stabbilixxa wkoll metodu sempliċi biex jinkiseb norwogonin minn chrysin f'erba 'passi [24]. Dawn ir-riċerki influwenzaw b'mod pożittiv l-evalwazzjoni ulterjuri tal-attivitajiet bijoloġiċi ta 'norwogonin. Studji wrew li norwogonin għandu attivitajiet antiossidanti [25], kontra l-kanċer [26, 27], antivirali [28], u antimikrobiċi [29] kif ukoll jinibixxi l-produzzjoni stimulata taċ-ċjanur ta 'ROS [30]. Madankollu, jekk norwogonin għandux kapaċitajiet protettivi kontra korriment ikkawżat mill-ipoksja għadu mhux magħruf. L-għan tal-istudju preżenti kien li jinvestiga l-effetti protettivi ta 'norwogonin kontra stress ossidattiv indott mill-ipoksja u apoptosi fiċ-ċelloli PC12.

Metodi

Materjali u reaġenti

Norwogonin (purità akbar minn jew ugwali għal 98 fil-mija) ġie sintetizzat skont il-metodu rrappurtat qabel tagħna [24]. Rutin (purità akbar minn jew ugwali għal 96 fil-mija) inxtara minn Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, China). Norwogonin u rutin ġew maħlula f'dimethyl sulfoxide sterili (DMSO), maħżuna f'-20 grad, u dilwit fil-medju tal-kultura taċ-ċelluli immedjatament qabel l-użu. Dulbecco's modifikat Eagle's medium (DMEM), serum bovin tal-fetu (FBS), streptomycin, u peniċillina nxtraw minn Solarbio co., Ltd. (Beijing, iċ-Ċina).

Il-kits ta 'malondialdehyde (MDA), lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), u glutathione peroxidase (GPx) inkisbu minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, iċ-Ċina). 2′,7′-dichloride-hydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) u (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium (MTT) inkiseb minn Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Antikorpi primarji għall-fattur induċibbli mill-ipoksja-1 (HIF-1 ), fattur tat-tkabbir endoteljali vaskulari (VEGF), limfoma taċ-ċelluli B-2 (Bcl{-2), Bcl{{17 }} proteina X assoċjata (Bax), Caspase-3, Cytochrome C, u -actin inxtraw kollha minn Abcam (Cambridge, UK). Antikorpi sekondarji nkisbu minn ZsBio Company (Beijing, iċ-Ċina).

Inkiseb kit ta 'analiżi tal-apoptożi mill-Istitut tal-Bijoteknoloġija Beyotime (Jiangsu, iċ-Ċina). Il-kimiċi u s-solventi kollha kienu ta 'grad analitiku u nkisbu minn fornitur kummerċjali fiċ-Ċina. Kultura taċ-ċelluli Iċ-ċelloli PC12 inxtraw minn Cell Bank tal-Akkademja Ċiniża tax-Xjenzi (TCR 9, Shanghai, iċ-Ċina) u miżmuma f'DMEM b'10 fil-mija (v/v) FBS, 100 U/mL peniċillina, u 100 U/mL streptomycins f'37 grad f'inkubatur umidifikat li fih 5 fil-mija CO2. Biex tiġi evalwata ċ-ċitotossiċità tan-norwogonin, iċ-ċelluli PC12 (passaġġ 4 ~ 6) ġew inkubati minn qabel b'konċentrazzjonijiet differenti (10− 8 , 10− 7, 10− 6, 10− 5, 10− 4 mol/L) ta' nor wogonin għal 1 siegħa u mbagħad ikkultivata għal 24 siegħa. Espożizzjoni ta 'ipoksja Biex tinduċi mudell ta' ħsara ta 'ipoksja taċ-ċelluli, ċelluli PC12 kienu soġġetti għal ambjent ta' ipoksja (1 fil-mija O2, 5 fil-mija CO2, u 94 fil-mija N2) f'37 grad għal 24 siegħa f'kamra umidifikata. Ċelloli ta 'kontroll normoxic ġew ikkultivati ​​f'37 grad f'inkubatur ta' 5 fil-mija CO2 għal 24 siegħa.

Biex jiġi evalwat l-effett protettiv tan-norwogonin kontra l-ħsara kkawżata mill-ipoksja, iċ-ċelluli PC12 ġew inkubati minn qabel b'konċentrazzjonijiet differenti (10− 8, 10− 7, 10− 6, 10− 5 mol/ L) ta 'norwogonin għal siegħa qabel it-trattament ta' l-ipoksja. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet imkejla b'assaġġ MTT kif deskritt qabel [31]. Fil-qosor, ċelluli PC12 (1 × 105 ċelluli / mL) ġew miżrugħa fi pjanċi ta 'kultura ta' 96 bir. Imbagħad konċentrazzjonijiet differenti ta 'norwogonin ġew miżjuda mal-bjar. Volum ugwali ta 'DMSO ġie miżjud għall-kontroll bjar. Il - konċentrazzjoni finali ta ' DMSO fil - mezz ta ' kultura taċ - ċelluli hija 0.1 fil - mija . Wara l-inkubazzjoni f'kundizzjonijiet normossiċi jew ipoksiċi, 10 μL ta 'MTT (5.0 mg/mL) ġew miżjuda ma' kull bir, segwit minn inkubazzjoni f'37 grad għal 4 sigħat. Imbagħad, is-supernatant b'MTT tneħħa u l-prodott formazan ġie maħlul f'100 μL DMSO. L-assorbanza tkejlet fuq qarrej tal-mikroplate SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) f'570 nm. Ir-riżultati ġew espressi bħala l-persentaġġ relattiv tal-grupp ta 'kontroll. Ematossilin u eosin (HE) ċelluli PC12 tbajja miżrugħa fuq coverslips tal-ħġieġ ġew inkubati għal 24 siegħa qabel ma ġew ittrattati b'norwogonin bl-istess mod kif deskritt hawn fuq.

Il-medju tneħħa u l-coverslips tal-ħġieġ ġew maħsula b'PBS kiesaħ, segwit minn iffissar bil-metanol għal 10 min f'temperatura tal-kamra, u mbagħad maħsula b'PBS kiesaħ tliet darbiet għal 5 min. Fl-aħħarnett, iċ-ċelloli kienu mtebbgħin skont il-protokoll tat-tbajja 'HE [32]. L-analiżi taċ-ċellula twettqu bl-użu ta 'mikroskopju OLYMPUS IX73 (100×) sabiex jiġu vverifikati l-bidliet morfoloġiċi taċ-ċelluli. Immaġini diġitali nkisbu bl-użu tal-kamera diġitali DXM 1200 C (Nikon) assoċjata mal-mikroskopju. Kontenut ta 'ROS Il-livell ta' ROS intraċellulari fiċ-ċelloli PC12 ġie determinat bl-użu ta 'assaġġ DCFH-DA [33]. Fil-qosor, iċ-ċelluli PC12 (1 × 105 ċelluli/mL) ġew miżrugħa fi 6-pjanċi tal-bir. Wara t-trattament tal-ipoksja, iċ-ċelluli PC12 ġew maħsula b'PBS u mbagħad ġew inkubati fil-mezz tal-kultura li kien fih 10 μM DCFH-DA għal 30 min fid-dlam f'37 grad. Iċ-ċelloli ġew osservati b'mikroskopju ta 'fluworexxenza invertita Olympus (Tokyo, Ġappun) u ġew analizzati b'ċitometru tal-fluss Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) b'wavelength ta' eċċitazzjoni ta '488 nm u wavelength ta' emissjoni ta '525 nm. Il-livell ROS kien espress bħala persentaġġ relattiv ta 'kontroll. Tnixxija ta 'LDH, kontenut ta' MDA, u attività ta 'enzimi antiossidanti ċelluli PC12 (1 × 105 ċelluli / mL) ġew miżrugħa f'dixx ta' 90 mm. Wara trattament ta 'ipoksja kif deskritt hawn fuq, inġabret 50 μL supernatant tal-kultura minn kull dixx, u l-attività LDH fil-medju ġiet skoperta bl-użu ta' kits ta 'assaġġ kummerċjali (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, iċ-Ċina) u ġiet espressa bħala U/mL. Iċ-ċelloli PC12 ġew maħsuda u omoġenizzati wara ħasil darbtejn b'PBS kiesaħ. Il-konċentrazzjoni tal-proteina totali kienet imkejla mill-kit tal-assaġġ tal-proteina BCA. Il-kontenut ta 'MDA u l-attività ta' l-enzimi antiossidanti ġew determinati bl-użu ta 'kits ta' analiżi kummerċjali (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, iċ-Ċina).

Il-kontenut ta' MDA ġie ppreżentat bħala nmol/mg proteina. L-attivitajiet ta 'SOD, CAT, u GPx ġew ippreżentati bħala proteina U/mg. Apoptożi taċ-ċelluli (tbajja 'Annexin-V/PI) Wara t-trattament ta' l-ipoksja, iċ-ċelluli PC12 ġew maħsuda, maħsula darbtejn b'PBS kiesaħ, u mbagħad sospiżi b'buffer li torbot. Iċ-ċelloli ġew ittrattati bis-soluzzjoni Annexin V-FITC u PI skont il-protokoll tal-manifattur (Beyotime, Shanghai, iċ-Ċina). Il-ġbir tad-dejta saru bl-użu taċ-ċitometru tal-fluss Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Analiżi PCR kwantitattiva f'ħin reali L-RNA totali taċ-ċelluli PC12 ġie estratt bl-użu tar-reaġent Trizol (Takara, Dalian, iċ-Ċina) u kkonvertit għal cDNA bl-użu tal-Kit tar-reaġent PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, iċ-Ċina). Is-cDNA li jikkodifika HIF-1, VEGF, Bcl-2, Bax, caspase-3, cytochrome C, u glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) ġene ġie amplifikat minn reali kwantitattivi PCR tal-ħin bl-użu ta' Sistema ta' sejbien f'ħin reali 7300 (Applied Biosystems, CA, USA). Il-primers użati ġew murija fit-Tabella 1. Il-kundizzjonijiet taċ-ċikli tal-PCR kienu 95 grad għal 30 s, segwiti minn 40 ċiklu ta '95 grad għal 5 s u 60 grad għal 31 s. Il-livelli ta' mRNA ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu 2-ΔΔCt u normalizzati għal GAPDH, li huwa l-ġene ta' referenza. Iċ-ċelloli PC12 Western blot ġew maħsuda u omoġenizzati f'aġenti RIPA. Il-konċentrazzjoni tal-proteini totali ġiet ikkwantifikata bl-użu tal-kit tal-assaġġ tal-proteini BCA. 30 ug ta 'kampjuni ġew solvuti fuq 12 fil-mija elettroforesi SDS-PAGE u mbagħad trasferiti għal membrani polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA).

Il-membrani ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib niexef bla xaħam f'TBST buffer għal siegħa f'temperatura tal-kamra u inkubati b'antikorpi primarji: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, UK), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, UK), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, UK), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, UK), anti caspase-3 (1:300, ab44976, Abcam, UK), kontra cytochrome C (1:1000, ab13575, Abcam, UK) u anti- -actin (1:2000, ab8227) , Abcam, UK) f'4 gradi matul il-lejl. Imbagħad, il-membrani ġew maħsula u inkubati b'antikorpi sekondarji (1:2000, ZsBio, Beijing, China;) għal siegħa f'temperatura tal-kamra. Il-meded immunoreattivi ġew viżwalizzati bl-użu ta 'reaġenti ta' kimiluminixxenza msaħħa (ECL). L-intensitajiet relattivi tal-meded ġew normalizzati għall-kontroll intern -actin u analizzati bl-użu ta 'Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Analiżi statistika

Ir-riżultati ġew espressi bħala medja ± SD derivata minn mill-inqas tliet esperimenti indipendenti. Id-differenza bejn il-gruppi ġiet analizzata bl-użu ta' analiżi tal-varjanza f'direzzjoni waħda (ANOVA) segwita mit-test post hoc Student–Newman–Keuls. Valur P ta' < 0.05="" kien="" meqjus="" bħala="" statistikament="">

Riżultati

Ċelluli PC12 protettivi Norwogonin kontra korriment ikkawżat mill-ipoksja

L-ewwel, biex tipprekludi l-attività proliferattiva ta 'norwogonin, iċ-ċitotossiċità tagħha fuq ċelluli PC12 normali ġiet iddeterminata bl-użu ta' analiżi MTT. Kif jidher fil-Fig. 2a, il-proliferazzjoni ċellulari ma nbidlitx b'mod sinifikanti wara t-trattament b'norwogonin f'konċentrazzjonijiet ta' 1 × 10- 8 -1 × 10- 5 mol/L (P > 0.05 ). Madankollu, il-vijabbiltà taċ-ċelluli naqset b'mod sinifikanti meta l-konċentrazzjoni ta 'norwogonin żdiedet għal 1 × 10- 4 mol / L (P <0.05). ir-riżultati="" indikaw="" li="" norwogonin="" ma="" werax="" tossiċità="" jew="" attività="" proliferattiva="" fuq="" ċelluli="" pc12="" fil-konċentrazzjonijiet="" ta="" '1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="">

Imbagħad eżaminajna l-effett protettiv tan-norwogonin kontra l-ħsara taċ-ċelluli PC12 indotta mill-ipoksja. Kif muri fil-Fig. 2b, meta mqabbel mal-grupp ta 'kontroll, il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-grupp ta' ipoksja naqset għal 58.71 fil-mija (P <0.01). meta="" mqabbel="" mat-trattament="" tal-ipoksja,="" ittrattat="" minn="" qabel="" b'1="" ×="" 10−="" 8="" ,="" 1="" ×="" 10−="" 7="" ,="" u="" 1="" ×="" 1{0−="" 6="" mol/l="" norwogonin="" protett="" mid-doża="" pc12="" ċelluli="" kontra="" l-ħsara="" kkawżata="" mill-ipoksja,="" jirkupraw="" il-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" minn="" 58.71="" għal="" 62.79="" fil-mija="" (p=""><0.05), 66.68="" fil-mija="" (p=""><0.01) u="" 69.88="" fil-mija="" (p=""><0.01), rispettivament.="" it-trattament="" minn="" qabel="" b'rutin="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l="" wera="" wkoll="" effett="" protettiv,="" li="" żied="" b'mod="" sinifikanti="" l-vijabbiltà="" taċ-ċelluli="" għal="" 63.78="" fil-mija="" meta="" mqabbel="" mat-trattament="" ta="" 'ipoksja.="" il-vijabbiltà="" pretrattata="" b'1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" norwogonin="" naqset="" għal="" 63.43="" fil-mija,="" li="" għadha="" ogħla="" b'mod="" sinifikanti="" minn="" dik="" fil-grupp="" ta="" 'ipoksja="" (p=""><0.05). dawn="" ir-riżultati="" wrew="" li="" norwogonin="" wera="" ċitoprotezzjoni="" sinifikanti="" fil-konċentrazzjonijiet="" ta="" '1="" ×="" 10−="" 8="" -1="" ×="" 10−="" 5="" mol/l="" u="" l-aktar="" konċentrazzjoni="" effettiva="" hija="" 1="" ×="" 10−="" 6="" mol/l.="" imbagħad="" din="" id-doża="" ntużat="" bħala="" l-aħjar="" doża="" fl-esperimenti="" li="">

Il-kapaċità protettiva ta 'norwogonin ġiet verifikata wkoll b'alterazzjonijiet morfoloġiċi. Kif muri fil-Fig. 2c, ċelluli PC12 mingħajr trattament ta 'ipoksja kibru tajjeb b'forom regolari (fusiform), daqsijiet uniformi. Wara l-espożizzjoni tal-ipoksja, iċ-ċelluli PC12 urew tnaqqis, forma fit-tond, desquamation, u densità taċ-ċelluli mnaqqsa. Iċ-ċelloli pretrattati b'norwogonin jew rutin qabel l-espożizzjoni tal-ipoksja kibru aħjar, in-numru ta 'ċelluli ta' desquamation naqas, u l-forma taċ-ċelluli rkuprat b'mod normali. Barra minn hekk, il-kapaċità protettiva ta 'norwogonin ġiet ikkonfermata mit-tnixxija LDH, li hija assoċjata mat-telf tal-integrità tal-membrana taċ-ċellula. Kif muri fil-Fig. 2d, l-attività LDH fil-medju tal-kultura żdiedet notevolment wara espożizzjoni għall-ipoksja (P <>

Trattament minn qabel b'norwogonin jew rutin naqqas b'mod drammatiku t-tnixxija tal-LDH, u ssuġġerixxi li norwogonin u rutin restawraw l-integrità tal-membrana taċ-ċellula. Norwogonin jinibixxi l-istress ossidant indott mill-ipoksja fiċ-ċelloli PC12 ROS u MDA huma żewġ indikaturi importanti ta 'stress ossidant ċellulari indott mill-ipoksja. Kif muri fil-Fig. 3a u b, kontenut miżjud b'mod sinifikanti ta 'ROS u MDA kien osservat fiċ-ċelloli PC12 wara espożizzjoni ta' ipoksja. It-trattament minn qabel ta 'Norwogonin jew rutin inibixxi b'mod sinifikanti l-produzzjoni ta' ROS u MDA.

Enżimi antiossidanti, bħal SOD, CAT, u GPx, huma meqjusa bħala s-sistema ta 'difiża ewlenija kontra l-istress ossidattiv fiċ-ċelloli. Kif muri f'Fig. 3c-e, l-espożizzjoni ta 'ipoksja inibixxiet b'mod sinifikanti l-attivitajiet ta' SOD, CAT, u GPx fiċ-ċelloli PC12. It-trattament b'norwogonin jew rutin biddel dawn il-bidliet u restawra l-attivitajiet ta 'enzimi antiossidanti. Dawn ir-riżultati kollha indikaw li norwogonin ipproteġi ċ-ċelloli PC12 kontra stress ossidattiv indott mill-ipoksja.