Effetti newroprotettivi ta' Erba' Glycosides Phenylethanoid Fuq H2O 2-Apoptożi Indotta Fuq Ċelloli PC12 Permezz tal-Pathway Nrf2/ARE

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Maiquan Li 1, Tao Xu 1, Fei Zhou 1, Mengmeng Wang 1, Huaxin Song 1, Xing Xiao u Baiyi Lu 1,*

1. Introduzzjoni

L-istress ossidattiv, li huwa żbilanċ ta 'l-omeostasi antiossidanti, jinduċi perossidazzjoni tal-lipidi, ħsara lill-proteini u d-DNA, tixjiħ taċ-ċelluli, u mewt taċ-ċelluli. Dan il-proċess x'aktarx jikkontribwixxi għal diversi disturbi newrodeġenerattivi, bħall-marda ta 'Alzheimer (AD), il-marda ta' Parkinson (PD), u iskemija/riperfużjoni [1]. Il-perossidu tal-idroġenu (H2O2), li huwa wieħed mill-ispeċijiet ewlenin tal-ossiġnu reattiv (ROS), huwa magħruf li jikkawża perossidazzjoni tal-lipidi u ħsara lid-DNA [2]. Barra minn hekk, H2O2 huwa sors endoġenu ta 'radikali ħielsa mill-hydroxyl li jikkontribwixxi għal-livell ta' sfond ta 'stress ossidattiv ċellulari [3,4]. Għalhekk, strateġiji terapewtiċi għall-prevenzjoni tal-apoptosi indotta mill-istress ossidattiv jista 'jkollhom il-potenzjal fit-trattament tal-mard newrodeġenerattiv.

Fattur nukleari erythroid 2-fattur 2 relatat (Nrf2), huwa fattur ta' traskrizzjoni li huwa assoċjat b'mod qawwi ma' stress ossidattiv. L-attivazzjoni ta’ Nrf2 tinduċi t-traskrizzjoni ta’ bosta ġeni antiossidanti u ta’ ditossifikazzjoni, inkluż heme oxygenase-1 (HO{-1), NAD(P)H quinone oxidoreductase 1, anti-infjammatorji [13], u immunomodulatorji [14 ] bijoattivitajiet. Osmanthusfragrans huwa ingredjent komuni f'diversi ikel Asjatiku u ilu jiġi kkunsmat. Preċedentement urejna li l-estratti tal-fjuri O.fragrans tejbu t-tagħlim u l-memorja spazjali, inibixxu l-ħsara ossidattiva, u wrew attivitajiet newroprotettivi fit-tixjiħ indott mid-d-galactose f'mudell tal-ġurdien ICR [15]. Salidroside, acteoside u isoacteoside huma r-rispons ewlieni tal-PhGs għall-attivitajiet antiossidanti tal-estratti tal-fjuri O.fragrans [16].

Studji dwar l-effett newroprotettiv tal-PhGs kisbu riżultati mixtieqa. Salidroside naqqas b'mod sinifikanti l-apoptosi taċ-ċelluli taċ-ċelluli PC12 li kienu esposti f'MPP plus [17,18]. Acteoside ttaffi wkoll l-apoptosi indotta minn MPP plus u l-istress ossidattiv fiċ-ċelloli PC12 [19] u l-ħsara taċ-ċelluli SH-SY5Y indotta minn A p25-35-[20]. Echinacoside ġie investigat fuq apoptosi indotta minn fattur ta' nekrożi tat-tumur-a (TNFa) f'ċelloli SH-SY5Y [21], tossiċità dopaminerġika kkaġunata minn MPTP fil-ġrieden [22], kulturi primarji ta' ċelluli kortikali tal-firien imweġġgħin bil-glutamate [23], u { {19}}Ħsara kkaġunata mill-OHDA fiċ-ċelloli PC12 [24]. Ir-riżultati indikaw li PhGs urew effett ċitoprotettiv u huma aġenti potenzjali biex jittrattaw mard newrodeġenerattiv. Studji wrew il-proprjetajiet anti-ossidanti tal-PhGs taħt ħafna bijoattivitajiet oħra għal dawn il-komposti [25]. Madankollu, ftit studji investigaw il-mekkaniżmu molekulari tal-PhGs kontra t-tossiċità ossidattiva.

Fl-istudju tagħna, għażilna erba 'PhG tipiċi kif ġej: salidroside (phenylethanoid monosaccharides), acteoside (phenylethanoid disaccharides), isoacteoside (phenylethanoid disaccharides), u echinacoside (phenylethanoid trisaccharides). Aħna impjegajna mudell ta 'mewt newronali bl-użu ta' ċelluli PC12 differenzjati [26] biex ninvestigaw l-effett protettiv u l-mekkaniżmu molekulari ta 'PhGs fuq il-mudell taċ-ċelluli PC12 indotti minn H2O2-. Aħna wrejna li PhGs attivaw il-mogħdija Nrf2/ARE billi jorbot ma 'proteina 1 assoċjata ma' ECH bħal Kelch (Keap1). Dan il-proċess irregola l-enzimi antiossidanti u żied ir-reżistenza taċ-ċelloli PC12 għall-istress ossidattiv.

Trattament ta' disturbi newrodeġenerattivi:PhGs minn cistanche

2. Riżultati

2.1. PhGs Imrażżna H2O2-Ċitotossiċità Indotta fiċ-Ċelloli PC12

Effetti ċitotossiċi ta 'H2O2 u PhGs (0.1,1,5, u 10 卩g/mL) fuq ċelluli PC12 ġew ittestjati. Ir-riżultati wrew li l-H2O2 indotta telf ta 'vijabbiltà taċ-ċelluli PC12 b'modi dipendenti fuq il-konċentrazzjoni u dipendenti fuq il-ħin (Figura 1A). L-espożizzjoni taċ-ċelluli PC12 għal 200 H2O2 għal sagħtejn irriżulta f'vijabbiltà taċ-ċelluli ta' 57.4 fil-mija. It-trattament minn qabel ta' ċelluli b'PhGs f'0.1,1, 5, u 10 昭/mL ma kellu l-ebda effett fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli (Figura 1B) u ċ-ċelluli PC12 protetti b'mod notevoli minn H2O2-ikkawża ħsara billi tejjeb il- vijabbiltà taċ-ċelluli bħala 9.549-22.141 fil-mija , 12.092-25.289 fil-mija , 1.470-9.289 fil-mija , u 3.411-11.441 fil-mija , rispettivament ( Figura 1C). Madankollu, salidroside (0.1 ^g/mL), isoacteoside (0.1, 1, 5, u 10 ^g/mL), echinacoside (0.1,1, u 5 ^g/mL) pretrattament ma wera l-ebda differenza sinifikanti fuq iċ-ċellula indotta minn HzOz korriment. It-trattament minn qabel taċ-ċelloli b'PhGs tejjeb ukoll il-karatteristika morfoloġika indotta minn H2O2 (Figura 1D).

Figura 1.PhGs irażżnu ċ-ċitotossiċità indotta minn H2O2-fiċ-ċelloli PC12. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet skoperta b'assaġġ MTT. Effett ċitotossiku ta 'H2O2 (A) u PhGs (B) f'konċentrazzjonijiet differenti fuq ċelluli PC12. (C) PhGs attenwati H2O2-indotta tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli. Iċ-ċelluli PC12 ġew inkubati b'PhGs (0.1, u 10 mg/mL) għal 24 siegħa, u mbagħad ġew inkubati b'200 pM H2O2 għal 2 oħra. h wara li tneħħew il-PhGs. (D) Osservazzjoni morfoloġika. Ċelloli wara t-trattament ġew osservati permezz ta 'mikroskopju b'kuntrast ta' fażi (x100), CK: grupp normali, H2O2: grupp trattat H2O2, HL: grupp ittrattat b'doża baxxa ta 'salidroside, HH: grupp ittrattat b'dożaġġ għoli ta' salidroside, ML: grupp ittrattat b'doża baxxa ta 'acteoside, MH: grupp ittrattat ta 'dożaġġ għoli ta' acteoside, IL: grupp ittrattat ta 'dożaġġ baxx ta' isoacteoside, IH: grupp ittrattat ta 'dożaġġ għoli ta' isoacteoside, SL: grupp ta 'trattament ta' dożaġġ baxx ta 'echinacoside, SH: grupp ittrattat ta' dożaġġ għoli ta 'echinacoside. ** p < 0.01="" kontra="" grupp="" mhux="" trattat;="" #="" p="">< 0.05,="" kontra="" l-grupp="" ittrattat="" h2o2;="" ##="" p=""><0.01, kontra="" l-grupp="" ittrattat="">

2.2. PhGs Imrażżna H2O2-Akkumulazzjoni Intraċellulari Indotta ta' ROS, Perossidazzjoni tal-Lipidi (MDA), u Attivitajiet Żieda ta' Superoxide Dismutase (SOD) fiċ-Ċelloli PC12

L-espożizzjoni taċ-ċelloli PC12 għal 200 pM H2O2 għal 2 sigħat żiedet il-livelli ta 'ROS, il-kontenut ta' MDA, u naqqset l-attività SOD (Figura 2). It-trattament minn qabel ta 'PhGs attenwat il-livell ta' ROS, salidroside, u acteoside, u d-dożaġġ għoli ta 'isoacteoside u echinacoside pretrattament attenwat b'mod sinifikanti l-livell ta' ROS (p <0.01). it-trattament="" minn="" qabel="" ta="" 'salidroside="" ma="" wera="" l-ebda="" effett="" fuq="" il-kontenut="" ta'="" mda,="" iżda="" t-trattament="" minn="" qabel="" ta="" 'acteoside="" attenwa="" b'mod="" sinifikanti="" l-kontenut="" ta'="" mda="" (p=""><0.05). isoacteoside="" u="" echinacoside="" pretrattament="" attenwat="" b'mod="" sinifikanti="" l-kontenut="" mda="" għal="">

Figura 2.PhGs imblukkaw l-akkumulazzjoni ta 'ROS u MDA u żiedu l-attivitajiet ta' SOD fiċ-ċelloli PC12. Iċ-ċelloli PC12 ġew inkubati b'PhGs (0.1, u 10 4g/mL) għal 24 siegħa, u mbagħad ġew inkubati b'200 |^M H2O2 għal ieħor 2 sigħat wara li tneħħew il-PhGs. (A) PhGs imblukkat l-akkumulazzjoni ta 'ROS u MDA. (B) PhGs imblukkat akkumulazzjoni MDA. (C) PhGs żiedu l-attivitajiet ta 'SOD. CK: grupp normali, Mudell: grupp trattat H2O2, Salidroside: grupp ittrattat salidroside, Acteoside: grupp ittrattat acteoside, Isoacteoside: grupp ittrattat isoacteoside, Echinacoside: grupp ittrattat echinacoside. ** p < 0.01="" kontra="" grupp="" mhux="" trattat;="" #="" p="">< 0.05,="" kontra="" grupp="" trattat="" h2o2,="" ##="" p="">< 0.01,="" kontra="" grupp="" trattat="">

2.3.PhGs H2O inversat2-Apoptożi Indotta fiċ-Ċelloli PC12

Trattament H2O2 (200 |1M) għal 2 sigħat żied b'mod sinifikanti l-apoptosi fiċ-ċelloli PC12, b'rata apoptotika totali sa 16.02 fil-mija (Figura 3). Madankollu, trattament minn qabel b'PhGs (0.1 u 10 卩g / mL) għal 24 siegħa naqqas ir-rata ta 'apoptożi b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (p <0.01). salidroside,="" acteoside,="" isoacteoside,="" u="" echinacoside="" naqqsu="" b'mod="" notevoli="" l-perċentwal="" ta="" 'apoptożi="" taċ-ċelluli="" b'4.750-6.627="" fil-mija,="" 4.413-5.800="" fil-mija,="" 6.593-10.047="" fil-mija,="" u="" 1.530-7.510="" fil-mija="" ,="">

Figura 3. PhGs ireġġgħu lura l-apoptosi indotta minn H2O2-fiċ-ċelloli PC12. Iċ-ċelloli PC12 ġew inkubati b'PhGs (0.1, u 10 卩g/mL) għal 24 siegħa, u mbagħad ġew inkubati b'2{00 pM H2O2 għal sagħtejn oħra wara l- PhGs tneħħew. Imbagħad, l-apoptożi ġiet imkejla permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu ta' sonda fluworexxenti PI/FITC. CK: grupp normali, Mudell: grupp trattat H2O2, Salidroside: grupp ittrattat salidroside, Acteoside: grupp ittrattat acteoside, Isoacteoside: grupp ittrattat isoacteoside, Echinacoside: grupp ittrattat echinacoside. ** p < 0.01="" kontra="" grupp="" mhux="" trattat;="" ##="" p=""><0.01, kontra="" l-grupp="" ittrattat="">

2.4. PhGs Reversed H2O2-Id-downregulazzjoni Indotta tal-Espressjoni tal-Proteina ta' HO-1, NQO1, GCLC, u GCLM

HO{{0}}, NQO1, u glutamate-cysteine ​​ligase (GCL) huma enzimi antiossidanti ċellulari importanti, u HO-1, NQO1, u subunitajiet katalitiċi jew modifikati ta' GCL (GCLC jew GCLM) huma Ġeni downstream regolati Nrf2-[27]. L-espressjoni tal-proteina ta' HO-1, NQO1, GCLC, u GCLM kienet osservata wara t-trattament. Instabet differenza ovvja bejn l-espressjoni tal-proteina ta 'HO-1 u NQO1 bi jew mingħajr H2O2 (Figura 6A-C) (p <0.01). phgs="" (0.1="" u="" 10="" p^g/ml)="" reġġgħu="" lura="" l-h2o2-downregulation="" indott="" tal-espressjoni="" tal-proteini="" ta="" 'ho-1="" (ħlief="" salidroside="" f'{{32}="" }.1="" pg/ml),="" nqo1="" (ħlief="" acteoside="" fi="" 0.1="" pg/ml)="" (p=""><{{40}}.01). l-h2o2="" irregola="" wkoll="" l-espressjoni="" tal-proteina="" gclc="" u="" gclm="" (p=""><0.05) (figura="" 6a,d,e).="" phgs="" (0.1="" u="" 10="" pg/ml)="" reġġa'="" lura="" h2o2-ikkaġunat="" ir-regolazzjoni="" 'l="" isfel="" tal-espressjoni="" tal-proteina="" ta'="" gclc="" (ħlief="" echinacoside="" f'0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01)="" u="" gclm="" (ħlief="" salidroside="" f'0.1="" pg/ml)="" (p="">< 0.01).="" imbagħad,="" l-inibituri="" kimiċi="" għal="" ho-1="" intużaw="" biex="" jevalwaw="" aktar="" ir-rwoli="" tal-enzimi="" antiossidanti="" fir-regolamentazzjoni="" tal-protezzjoni="" tal-phgs="" kontra="" ċ-ċitotossiċità="" indotta="" minn="" h2o2-.="" phgs="" (0.1="" u="" 10="" pg/ml)="" evitaw="" iċ-ċitotossiċità="" indotta="" minn="" h2o2-,="" iżda="" tali="" effett="" protettiv="" ġie="" mreġġa="" 'lura="" mill-inibitur="" ho="" -1="" znpp="" (p="">< 0.01)="" f'20="" pm="" (figura="" 6f,="" p="">< 0.01)="">

2.5. Keap1 Espressjoni u Analiżi ta 'Docking Molekulari

Taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, Keap1 jaġixxi bħala proteina repressur ta 'Nrf2 billi jorbot mad-dominju Neh2 ta' Nrf2 u jimmira lil Nrf2 għal E3 ubiquitin ligase ibbażat fuq Cul3- għal ubiquitination u degradazzjoni sussegwenti mill-proteasome 26S [28]. Il-kapaċità ta 'rbit għal Keap1 ta' PhGs ġiet evalwata permezz ta 'analiżi ta' docking molekulari biex tinvestiga l-mekkaniżmu taħt l-effett antiossidant tagħhom.

Effett antiossidant: CistanchePhGs

3. Diskussjoni

Aħna investigajna n-newroprotezzjoni tal-PhGs fuq iċ-ċitotossiċità indotta minn H2O2 fiċ-ċelloli PC12. Ir-riżultati juru li t-trattament minn qabel ta 'PhGs trażżan b'mod sinifikanti ċ-ċitotossiċità indotta minn HzOz, attenwat il-livell ta' ROS intraċellulari, tejbu l-livell ta 'enzimi antiossidanti intraċellulari, u fl-aħħar mill-aħħar reġġa' lura ċ-ċitotossiċità indotta minn H2O 2- fiċ-ċelluli PC12. Barra minn hekk, PhGs żiedu l-attivazzjoni tat-traskrizzjoni ta 'Nrf2, reġġa' lura t-tnaqqis indott minn HzOz tal-espressjoni tal-proteini ta 'HO-1, NQO1, GCLC, u GCLM. Barra minn hekk, PhGs wrew interazzjoni potenzjali mas-sit ta 'rbit ta' Nrf2 fil-proteina Keap1.

Fil-ħsara taċ-ċelluli PC12 indotta mill-H2O2-, il-perossidazzjoni tal-lipidi, li tirreferi għal degradazzjoni ossidattiva tal-lipidi, żiedet il-permeabilità tal-membrani, u wassal għal ħsara fiċ-ċelluli [29]. Il-formazzjoni tal-MDA tintuża ħafna bħala l-indiċi tal-perossidazzjoni tal-lipidi [30]. L-H2O2 tejbet il-produzzjoni ta 'ROS u enzimi ta' difiża antiossidanti eżawriti, bħal SOD, catalase, u GPx. Dan il-proċess iwassal għal stress ossidattiv [31], li għandu rwol ewlieni fil-kawżalità u l-progressjoni tal-maġġoranza tad-disturbi newrodeġenerattivi. B'mod konsistenti ma 'studji preċedenti, osservajna livell miżjud ta' ROS, enzimi antiossidanti intraċellulari mnaqqsa, u apoptosi mtejba taċ-ċelluli PC12 wara trattament H2O2. It-trattament minn qabel ta 'PhGs attenwa b'mod sinifikanti ż-żieda indotta minn HzOz f'ROS intraċellulari, tejbu l-enzimi antiossidanti intraċellulari, u fl-aħħar mill-aħħar reġġa' lura ċ-ċitotossiċità indotta minn HzOz fiċ-ċelloli PC12.

Kuang et al. [32] irrapporta li echinacoside wera effett newroprotettiv sinifikanti fuq iċ-ċitotossiċità indotta minn H2O2- fiċ-ċelloli PC12 permezz tal-mogħdija apoptotika mitokondrijali. F'dan l-istudju, sibna li echinacoside, salidroside, acteoside, u isoacteoside wrew effetti newroprotettivi billi tejbu l-attività anti-ossidanti taċ-ċelloli PC12 minħabba li żiedu l-attivazzjoni tat-traskrizzjoni ta 'Nrf2 u rregolaw 'l fuq l-espressjoni tal-proteina downstream ta' HO -1, NQO1, GCLC, u GCLM. Bosta studji wrew biċ-ċar li l-attivazzjoni tal-ġeni fil-mira Nrf2, b'mod partikolari HO-1, fl-astroċiti u n-newroni jipproteġu bil-qawwa kontra l-infjammazzjoni, il-ħsara ossidattiva, u l-mewt taċ-ċelluli. Is-sistema HO-1 ġiet irrappurtata li hija attiva ħafna fis-sistema nervuża ċentrali, u l-modulazzjoni tagħha jidher li għandha rwol kruċjali fil-patoġenesi ta 'disturbi newrodeġenerattivi [33]. Studji reċenti ċċaraw ukoll ir-rwol ta 'Nrf2 fil-progressjoni u r-riskju ta' PD [9] u Keap1 bħala mira effiċjenti għar-riattivazzjoni ta 'Nrf2 f'AD [34]. Ir-riżultati jappoġġjaw evidenza ġdida għal Nrf2 bħala mira terapewtika f'mard newrodeġenerattiv.

Analiżi ta 'docking molekulari wriet li PhGs jistgħu jorbtu ma' Keap1, bil-kapaċitajiet ta 'rbit li ġejjin: echinacoside > isoacteoside > acteoside > salidroside. B'konsistenza ma 'dawn ir-riżultati, it-trattament minn qabel ta' PhGs wassal għat-traslokazzjoni nukleari Nrf2, bl-espressjoni Nrf2 li ġejja fin-nukleu: echinacoside > isoacteoside * acteoside > salidroside. Assumina li n-numru ta 'glycosides affettwa l-mod ta' rbit possibbli ta 'PhGs u Keap1, u l-mod ta' rbit aktar ikkawża r-rilaxx ta 'Nrf2 minn Keap1. Dan il-proċess irriżulta fl-attivazzjoni ta' Nrf2 u l-ġeni downstream u fl-aħħar mill-aħħar jipproteġi ċ-ċelloli PC12 minn stress ossidattiv indott minn H2 O2 -.

Effetti newroprotettivi ta' cistanchePhGs

4. Materjali u Metodi

4.1. Komposti u Reaġenti Kimiċi

Salidroside (CAS Nru {{0}}), acteoside (CAS Nru 61276-17-3), isoacteoside (CAS Nru 61303-13-7), u echinacoside (CAS Nru {{3} }) inxtraw minn YYuanye Biotechnology Company (Shanghai, iċ-Ċina). Il-PhGs ġie maħlul fil-PBS biex jipproduċi soluzzjoni stokk ta '10 mg/mL, li kienet maħżuna fi -20 grad. H2O2 inxtara minn Aladdin® (Shanghai, iċ-Ċina). RPMI-1640 medju u serum bovin fetali nxtraw minn Hyclone (Logan, UT, USA), u 0.5 fil-mija trypsin EDTA, peniċillina, u streptomycin inxtraw minn Keyi (Hangzhou, iċ-Ċina). MDA, kits dijanjostiċi SOD, MTT, u DCFH-DA nxtraw minn Beyotime Institute of Biotechnology (Nanjing, Jiangsu, iċ-Ċina). Annexin V-FITC/PI double tbajja Kit inxtara minn Solarbio Life Sciences (Beijing, iċ-Ċina). Antikorpi għal Nrf2, Histone H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, u p-actin, anti-mouse-horseradish peroxide (HRP) IgG, u anti-fenek-HRP-IgG inxtraw mingħand Abcam (Londra, ir-Renju Unit). Inibituri ta' HO-1 u ZnPP inxtraw minn Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RNAiso Plus, PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser, u SYBR® Premix Ex Taq™ II inxtraw minn Takara (Shiga, il-Ġappun). Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent inxtara minn Thermo Fisher Scientific (Waltham, UK). Is-sekwenzi siRNA Nrf2 kienu kif ġej: quddiem, CCGAAUUACAGUGUCUUAA; u bil-maqlub, UUAAGACACCUGUAUUCGG. Sadanittant, is-sekwenzi tas-siRNA tal-kontroll kienu kif ġej: quddiem, UUCUCCGAACGUGUCACGU; u reverse, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Kultura taċ-Ċelloli

Linja ta 'feokromoċitoma adrenali tal-ġurdien (ċelluli PC12) inkisbet mill-Istitut tal-Bijokimika u l-Bijoloġija taċ-Ċelloli, SIBS, (CAS, Shanghai, iċ-Ċina). Iċ-ċelloli nżammu f'RPMI-1640 (Hyclone) li kien fih 10 fil-mija serum bovin tal-fetu (Hyclone), 100 U/mL peniċillina, u 0.1 mg/mL streptomycin f'37 grad b'5 fil-mija CO2. Il-mezz kien mibdul kull jum ieħor.

4.3. Assay tal-Vijabilità taċ-Ċelluli

Iċ-ċelluli PC12 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi bir-bir f'2 x 104 ċelluli/bir. Wara t-twaħħil, iċ-ċelloli ġew inkubati minn qabel bi jew mingħajr inibitur għal 20 min, inkubati bi jew mingħajr PhGs għal 24 siegħa, u mbagħad inkubati b'H2O2 għal 2 sigħat oħra wara li l-PhGs tneħħew. Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'5 mg/mL MTT għal 4 sigħat f'37 grad, u l-midja tneħħiet bir-reqqa. Il-kristalli ta 'formazan li kienu ffurmati minn ċelloli superstiti ġew maħlula f'150 rL ta' DMSO biex jiġġeneraw kulur blu [35], u l-assorbanza tkejjel f'570 nm fuq qarrej tal-pjanċa. Il-kontrolli użaw l-istess konċentrazzjoni ta 'medja b'DMSO waħdu. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet normalizzata bħala l-perċentwal ta' kontroll.

Il-konċentrazzjonijiet ta 'PhGs (0.1,1,5, u 10 Rg/mL) intgħażlu skont l-analiżi taċ-ċitotossiċità ta' PhGs u l-effett ċitoprotettiv irrappurtat tal-echinacoside [32]. Skont ir-rapport, ma kien hemm l-ebda effett ta 'ċitotossiċità murija taħt 10 Rg/mL, u echinacoside ġie rrappurtat li juri effett ċitoprotettiv fil-mudell taċ-ċelluli mweġġa' HzOz.

4.4. Assaġġ tal-Apoptożi

L-apoptożi ġiet skoperta b'Kit ta 'tebgħa doppja ta' Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa fi 6-pjanċi bir-bir f'2 x 105 ċelluli/bir. Wara t-twaħħil, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'PhGs (0.1 u 10 Rg/mL) għal 24 siegħa u inkubati b'H2O2 għal 2 sigħat oħra wara li tneħħew il-PhGs. Wara l-inkubazzjoni, iċ-ċelluli ġew maħsula f'PBS kiesaħ, ċentrifugati darbtejn f'1500 rpm għal 10 min, u sospiżi mill-ġdid f'500 rL ta 'buffer li torbot. Annexin V (5 rL) ittikkettat bil-FITC u jodur tal-propidju.

Abbrevjazzjonijiet

GCLC glutamate-cysteine ​​ligase-subunità katalitika

Subunità modifikatur GCLM glutamate-cysteine ​​ligase-catalytic

H2O2 idroġenu perossidu

HO-1 heme oxygenase 1

Keap1 Kelch ECH assoċjazzjoni proteina 1

NQO1 NAD(P)H quinone oxidoreductase 1

Fattur nukleari Nrf2 erythroid 2-fattur 2 relatat

PhGs salidroside, acteoside, isoacteoside, u echinacoside

Speċi ta 'ossiġnu reattiv ROS

ZnPP protoporphyrin taż-żingu

Estratt ta 'Cistanche deserticola: PHG ta' cistanche

Referenzi

1. Ħad, AY; Chen, YM Stress ossidattiv u disturbi newrodeġenerattivi. J. Biomed. Sci. 1998, 5, 401-414. [CrossRef] [PubMed]

2. Maheshwari, A.; Mikro, MM; Aggarwal, A.; Sharma, RK; Nandan, D. Mogħdijiet involuti fl-apoptosi taċ-ċelluli ġerminali testikolari indotta minn H2O2 in vitro. FEBS J. 2009,276, 870-881. [CrossRef] [PubMed]

3. Halliwell, B. Speċi ta 'ossiġnu reattiv u s-sistema nervuża ċentrali. J. Neurochem. 1992, 59,1609-1623. [CrossRef] [PubMed]

4. Richardson, JS; Subbarao, KV; Ang, LC Dwar ir-rwol possibbli tal-perossidazzjoni radikali ħielsa indotta mill-ħadid fid-deġenerazzjoni newrali fil-marda ta 'Alzheimer. Ann. NY Acad. Sci. 1992, 648, 326-327. [CrossRef] [PubMed]

5. Zhang, DD Studji mekkanistiċi tal-passaġġ tas-sinjalar Nrf2-Keap1. Droga Metab. Rev 2006, 38, 769-789. [CrossRef] [PubMed]

6. Itoh, K.; Tong, KI; Yamamoto, M. Mekkaniżmu molekulari li jattiva l-passaġġ Nrf2-Keap1 fir-regolamentazzjoni tar-rispons adattiv għall-elettrofili. Free Radic. Biol. Med. 2004, 36,1208-1213. [CrossRef] [PubMed]

7. Kong, AN; Owuor, E.; Yu, R.; Hebbar, V.; Chen, C.; Hu, R.; Mandlekar, S. Induzzjoni ta 'enzimi ksenobijotiċi mill-mogħdija ta' map kinase u l-element ta 'rispons antiossidant jew elettrofilu (ARE / EpRE). Droga Metab. Rev 2001, 33, 255-271. [CrossRef] [PubMed]

8. Buendia, I.; Michalska, P.; Navarro, E.; Gameiro, I.; Egea, J.; Leon, R. Nrf2-ARE mogħdija: Mira emerġenti kontra stress ossidattiv u newroinfjammazzjoni f'mard newrodeġenerattiv. Pharmacol. Ther. 2016, 157, 84-104. [CrossRef] [PubMed]

9. Skibinski, G.; Hwang, V; Ando, ​​DM; Daub, A.; Lee, AK; Ravisankar, A.; Modan, S.; Finucane, MM; Shabby, BA; Finkbeiner, S. Nrf2 itaffi n-newrodeġenerazzjoni indotta minn LRRK2- u a-synuclein billi timmodula l-proteostasi. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 114, 1165-1170. [CrossRef] [PubMed]

10. Jimenez, C.; Riguera, R. Phenylethanoid glycosides fil-pjanti: Struttura u attività bijoloġika. Nat. Prod. Rep 1994, 11, 591-606. [CrossRef] [PubMed]

11. Georgiev, M.; Alipieva, K.; Orhan, I.; Abrashev, R.; Denev, P.; Angelova, M. Attivitajiet inibitorji antiossidanti u cholinesterases ta 'Verbascum xanthophoeniceum Griseb. u phenylethanoid glycosides tiegħu. Chem tal-Ikel. 2011, 128, 100-105. [CrossRef] [PubMed]

12. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Effetti newroprotettivi ta 'Cistanches HerbaTerapija fuq Pazjenti b'Mard Moderat ta' Alzheimer/i. Evid.-Komplement Ibbażat. Alternattiv. Med. 2015, 2015,103985. [CrossRef] [PubMed]

13. Liu, YL; Hu, WJ; Mo, L.; Shi, MF; Zhu, YY; Pan, S.; Li, XR; Xu, QM; Yang, SL Attivitajiet antimikrobiċi, anti-infjammatorji u tossikoloġija ta 'phenylethanoid glycosides minn Monochasma savatieri Franch. ex Maxim. J. Ethnopharmacol. 2013,149, 431-437. [CrossRef] [PubMed]

14. Dong, Q.; Yao, J.; Fang, JN; Ding, K. Karatterizzazzjoni strutturali u attività immunoloġika ta' żewġ polisakkaridi estratti bl-ilma kiesaħ minnCistanche deserticola YC Ma. Karboidrat. Riż. 2007, 342,1343-1349. [CrossRef] [PubMed]

15. Xiong, L.; Mao, S.; Lu, B.; Yang, J.; Zhou, F.; Hu, Y.; Jiang, Y.; Shen, C.; Zhao, Y. Osmanthusfragrans Estratt tal-Fjura u Acteoside Ipproteġi Kontra d-D-Galactose-Induced Aging f'Mudell tal-Ġurdien ICR. J. Med. Ikel 2016, 19, 54-61. [CrossRef] [PubMed]

16. Jiang, Y.; Mao, S.; Huang, W.; Lu, B.; Cai, Z.; Zhou, F.; Li, M.; Lou, T.; Zhao, Y. Profili ta 'Glycoside Phenylethanoid u Attivitajiet Antiossidanti ta' Osmanthusfragrans Lour. Fjuri minn UPLC/PDA/MS u Mudell ta' Diġestjoni Simulata. J. Agri. Chem tal-Ikel. 2016, 64, 2459-2466. [CrossRef] [PubMed]

17. Li, X.; Iva, X.; Li, X.; Sun, X.; Liang, Q.; Tao, L.; Kang, X.; Chen, J. Salidroside jipproteġi kontra l-apoptosi indotta MPP plus fiċ-ċelloli PC12 billi jinibixxi l-mogħdija NO. Brain Res. 2011,1382, 9-18. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhang, L.; Ding, W.; Sun, H.; Zhou, Q.; Huang, J.; Li, X.; Xie, Y.; Chen, J. Salidroside jipproteġi ċ-ċelluli PC12 minn apoptosi indotta MPP plus permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K/Akt. Chem tal-Ikel. Tossikol. 2012, 50, 2591-2597. [CrossRef] [PubMed]

19. Sheng, GQ; Zhang, JR; Pu, XP; Ma, J.; Li, CL Effett protettiv ta' verbascoside fuq in-newrotossiċità indotta mill-jone ta' 1-metil-4- fenilpiridinju fiċ-ċelloli PC12. Eur. J. Pharmacol. 2002, 451,119-124. [CrossRef]

20. Wang, H.; Xu, Y.; Yan, J.; Zhao, X.; Sun, X.; Zhang, Y.; Guo, J.; Zhu, C. Acteoside jipproteġi ċ-ċelluli tan-newroblastoma umana SH-SY5Y kontra l-ħsara taċ-ċelluli indotta minn beta-amyloid. Brain Res. 2009, 1283, 139-147. [CrossRef] [PubMed]

21. Min, D.; Jin, YZ; Yong, J.; Zheng, BL; Yao, HW Echinacoside isalva ċ-ċelloli newronali SHSY5Y minn apoptosi indotta minn TNFa. Chin. Pharmacol. Bull. 2005, 505,11-18.

22. Zhao, Q.; Gao, JP; Li, WW; Cai, DF Effetti newrotrofiki u newrorescue ta 'Echinacoside fil-mudell tal-ġurdien MPTP subakut tal-marda ta' Parkinson. Brain Res. 2010,1346, 224-236. [CrossRef] [PubMed]

23. Koo, KA; Sung, SH; Park, JH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC Attivitajiet newroprotettivi in ​​vitro ta 'phenylethanoid glycosides minn Callicarpa dichotoma. Planta Med. 2005, 71, 778-780. [CrossRef] [PubMed]

24. Liu, YG; Li, X.; Xiong, C.; Yu, B.; Pu, X.; Ye, XS Derivattivi sintetiċi ta 'phenylethanoid glycoside bħala aġenti newroprotettivi potenzjali. Eur. J. Med. Chem. 2015, 95, 313-323. [CrossRef] [PubMed]

25. Fu, G.; Pang, H.; Wong, YH Glikożidi feniletanojdi li jseħħu b'mod naturali: Ċomb potenzjali għal terapewtiċi ġodda. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 2592-2613. [CrossRef] [PubMed]

26. Greene, LA; Tischler, AS Stabbiliment ta' linja klonali noradrenerġika ta' ċelluli tal-feokromoċitoma adrenali tal-firien li jirrispondu għall-fattur tat-tkabbir tan-nervituri. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976, 73, 2424-2428. [CrossRef] [PubMed]

27. Liang, QN; Sheng, YC; Jiang, P.; Ji, LL; Xia, YY; Min, Y.; Wang, ZT Id-differenza tas-sistema antiossidant tal-glutathione fil-fwied tal-ġrieden li għadhom kif ġew miftuma u żgħar u l-involviment tagħha fl-epatotossiċità indotta mill-isoline. Arch. Tossikol. 2011, 85, 1267-1279. [CrossRef] [PubMed]

28. Kobayashi, A.; Kang, M.; Okawa, H.; Ohtsuji, M.; Zenke, Y; Chiba, T.; Igarashi, K.; Yamamoto, M. Ossidative Stress Sensor Keap1 Jiffunzjona bħala Adapter għal Cul3-Ibbażat E3 Ligase Biex Jirregola d-Degradazzjoni Proteasomal ta 'Nrf2. Mol. Ċellula. Biol. 2004,24, 7130-7139. [CrossRef] [PubMed]

29. Kornelju, C.; Crupi, R.; Calabrese, V; Graziano, A.; Milone, P.; Pennisi, G.; Radak, Z.; Calabrese, EJ; Cuzzocrea, S. Korriment trawmatiku fil-moħħ: Stress ossidattiv u newroprotezzjoni. Antiossidu. Sinjal Redox. 2013, 19, 836-853. [CrossRef] [PubMed]

30. Hou, Z.; Luo, W.; Sun, X.; Hao, S.; Zhang, Y.; Xu, F.; Wang, Z.; Liu, B. Salina b'ħafna idroġenu tipproteġi kontra ħsara ossidattiva u defiċits konjittivi wara korriment trawmatiku ħafif fil-moħħ. Brain Res. Bull. 2012, 88, 560-565. [CrossRef] [PubMed]

31. Ansari, MA; Roberts, KN; Scheff, SW Kors ta 'żmien ta' stress ossidattiv ikkaġunat mill-kontużjoni u proteini sinaptiċi fil-kortiċi f'mudell tal-far ta 'TBI. J. Neurotrauma 2008, 25, 513-526. [CrossRef] [PubMed]

32. Kuang, R.; Sun, Y.; Yuan, W.; Lei, L.; Zheng, X. Effetti protettivi ta 'echinacoside, wieħed mill-phenylethanoid glycosides, fuq H2O2-ċitotossiċità indotta fiċ-ċelloli PC12. Planta Med. 2009, 75, 1499-1504. [CrossRef] [PubMed]

33. Scapagnini, G.; Vasto, S.; Abraham, NG; Caruso, C.; Zella, D.; Fabio, G. Modulazzjoni tal-mogħdija Nrf2/ARE mill-polifenoli tal-ikel: Strateġija newroprotettiva nutrittiva għal disturbi konjittivi u newrodeġenerattivi. Mol. Neurobiol. 2011, 44, 192-201. [CrossRef] [PubMed]

34. Kerr, F.; Sofolaadesakin, O.; Ivanov, DK; Gatliff, J.; Gomez, PB; Bertrand, HC; Martinez, P.; Callard, R.; Snoeren, I.; Cochem, HM Direct Keap1-Tfixkil Nrf2 bħala mira terapewtika potenzjali għall-marda ta' Alzheimer/s. PLoS Genet. 2017, 13, e1006593. [CrossRef] [PubMed]

35. Hansen, MB; Nielsen, SE; Berg, K. Eżami mill-ġdid u żvilupp ulterjuri ta 'metodu ta' żebgħa preċiż u rapidu għall-kejl tat-tkabbir taċ-ċelluli/qtil taċ-ċelluli. J. Immunol. Metodi 1989, 119, 203-210. [CrossRef]

36. Press, C. Screening Virtwali fl-iskoperta tad-droga; Crc Press: Boca Raton, FL, USA, 2005.

37. Muegge, I.; Martin, YC; Hajduk, PJ; Fesik, SW Evalwazzjoni tal-punteġġ PMF fid-docking ligands dgħajfa għall-proteina li torbot FK506. J. Med. Chem. 1999, 42, 2498—2503. [CrossRef] [PubMed]

38. Kuntz, ID; Blaney, JM; Oatley, SJ; Langridge, R.; Ferrin, TE Approċċ ġeometriku għall-interazzjonijiet makromolekula-ligand. J. Mol. Biol. 1982,161, 269-288. [CrossRef]

39. MD, E.; Murray, CW; Auton, TR; Paolini, GV; Mee, RP Funzjonijiet ta 'punteġġ empiriku: I. L-iżvilupp ta' funzjoni ta 'punteġġ empiriku mgħaġġel biex tiġi stmata l-affinità ta' rbit ta 'ligandi f'kumplessi ta' riċetturi. J. Comput.-Mgħjun Mol. Des. 1997,11,425-445.

© 2018 mill-awturi. Detentur tal-liċenzja MDPI, Basel, l-Isvizzera. Dan l-artikolu huwa artiklu b'aċċess miftuħ imqassam taħt it-termini u l-kundizzjonijiet tal-liċenzja Creative Commons Attribution (CC BY) (http:ZZcreativecommons.org/licenses/byZ4.0Z).