Effett newroprotettiv tal-Estratt ta' Bu-Shen-Huo-Xue Kontra Apoptożi Għolja Indotta minn Glukożju fiċ-Ċelloli PC12

Għal aktar informazzjoni:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Studju ta 'Riċerka ta' Integrazzjoni tal-Mediċina Tradizzjonali u tal-Punent, l-Ewwel Sptar, Università ta 'Peking, Beijing, iċ-Ċina.

2Laboratorju Ewlenin tal-Istat tad-Drogi Naturali u Bijomimetiċi, Skola tax-Xjenzi Farmaċewtiċi, Università ta’ Peking, Beijing, iċ-Ċina.

Il-punti ewlenin

In-newrotossiċità indotta minn glukożju għoli (HG) hija implikata fil-patoloġija ta'dijabetikuenċefalopatija (DE). Fl-istudju tagħna, l-estratt ta 'Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), formula polyherbal, jesibixxinewroprotettivattività fuq ċelluli PC12 indotti minn HG u l-mekkaniżmi possibbli jistgħu jkunu assoċjati mas-soppressjoni tal-ġenerazzjoni ta 'speċi ta' ossiġnu reattiv (ROS) kif ukoll mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ta' caspase medjat mill-mitokondrija u JNK/p38 MAPK. Dan l-istudju jipprovdi aġent promettenti għat-trattament tad-DE f'applikazzjonijiet kliniċi.

Ikklikkja għall-benefiċċji ta 'estratt ta' cistanche u Cistanche għall-kliewi

Cistanchehija ħwawar toniku magħrufa li jistgħu jrawmu u jipproteġu l-kliewi. Fit-teorija tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża,Cistanchehija l-aħjar ħaxix għalkliewi.Cistanchehija rikka fl-echinacoside, acteoside, u flavonoids.These ingredjenti effettivi filCistanchejistgħu jnaqqsukliewiapoptożi taċ-ċelluli u żiedakliewiproliferazzjoni taċ-ċelluli. Għalhekk,Cistanchehuwa asuppliment naturali tal-kliewi.

Astratt

Għan: Biex tinvestiga l-effett newroprotettiv tal-estratt ta 'Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), formula polyherbal, kontra n-newrotossiċità indotta minn Glukożju Għoli (HG) fiċ-ċelloli PC12. Metodi: Assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli, assaġġ Lactate Dehydrogenase (LDH), sejbien ta 'Speċi Ossiġenu Reattiv (ROS), Hoechst 33258, Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) double tebgħa, u Assaġġ Mitochondrial Membrane Potential (MMP). Barra minn hekk, Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved caspase-3, PARP, cleaved PARP, cytochrome c, u Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) ġew skoperti permezz ta 'western blot. Riżultati: L-estratt ta 'BSHX żied il-vijabbiltà taċ-ċelluli u naqqas it-tnixxija ta' LDH b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni fiċ-ċelloli PC12 indotti minn HG. Barra minn hekk, l-estratt ta 'BSHX naqqas il-livell ta' ROS intraċellulari, żied il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali, irregola l-espressjonijiet ta 'Bax u Bcl-2, u inibixxi r-rilaxx ta' cytochrome c mill-mitokondrija. Barra minn hekk, l-estratt BSHX attenwa l-attivazzjoni ta 'caspase-3 u PARP u inibixxi l-fosforilazzjoni ta' c-Jun N-terminal kinase (JNK) u p38 MAPKs. Konklużjoni: L-estratt ta 'BSHX wera effett newroprotettiv sinifikanti fuq l-apoptosi indotta minn HG fiċ-ċelloli PC12. Dan l-effett jista 'jkun assoċjat mas-soppressjoni tal-ġenerazzjoni ta' ROS kif ukoll mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ta' caspase medjat mill-mitokondrija u JNK/p38 MAPK.

Kliem ewlieni:enċefalopatija dijabetika, mediċina tradizzjonali Ċiniża, estratt Bu-Shen-Huo-Xue,newroprotettiv, glucose għoli

Abbrevjazzjoni: AO: oranġjo akridina; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Enċefalopatija Dijabetika; DM: Dijabete Mellitus; DMSO: Dimethyl Sulfoxide; EB: Ethidium Bromide; ERK: Protein Kinases Regolati Extraċellulari; HG: Glukożju Għoli; JNK: c-Jun N-terminal Kinase; LDH: Lactate Dehydrogenase; MAPKs: Protein Kinases Attivati ​​minn Mitoġenu; MWP: Preskrizzjoni Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium Bromide; PBS: Phosphate Buffer Saline; PBST: Phosphate-Buffered Saline, 0.1 fil-mija Tween 20; ROS: Speċi ta 'Ossiġenu Reattiv; T2DM: Dijabete Mellitus tat-Tip 2; TCM: Mediċini Tradizzjonali Ċiniżi

Sfond

F'dawn l-aħħar snin, l-Enċefalopatija Dijabetika (DE), kumplikazzjoni tad-Dijabete Mellitus (DM) li sseħħ fis-Sistema Nervuża Ċentrali (CNS), irċeviet attenzjoni mifruxa. DE jista 'jkun assoċjat ma' diversi fatturi ta 'riskju bħall-età, it-tul, u l-kontroll gliċemiku tad-dijabete [1, 2]. Il-manifestazzjonijiet kliniċi ta 'DE huma bidliet morfoloġiċi u fiżjoloġiċi fl-imħuħ u disfunzjoni konjittiva li tirriżulta. Ipergliċemija, stress ossidattiv, u infjammazzjoni kronika jistgħu jkunu l-kawżi patoġeniċi importanti ta 'DE [3]. Għalkemm numru dejjem jikber ta 'esperimenti wrew li l-ipergliċemija sostnuta fit-tul tista' taċċellera t-tixjiħ tal-moħħ, il-patoġenesi preċiża ta 'DE mhix esplorata.

L-apoptożi hija mewt taċ-ċelluli programmata kkontrollata minn ġeni biex tinżamm l-istabbiltà tal-mikroambjent. Il-proteini involuti fl-apoptożi jinkludu l-familja Bcl-2, caspases, p53, eċċ. Il-familja Bcl-2 hija maqsuma f'żewġ kategoriji, waħda li tippromwovi l-mewt taċ-ċelluli, bħal Bax, u l-oħra tirreżisti l-apoptożi, bħal Bcl-2. Jistgħu jirregolaw l-apoptożi permezz tal-mogħdija tas-sinjalar tal-caspase, li hija reazzjoni ta 'amplifikazzjoni kaskata ta' sottostrat ta 'idroliżi finita irriversibbli ta' caspase [4-6]. Barra minn hekk, studji wrew li l-apoptożi indotta minn Glukożju Għoli (HG) hija assoċjata ma 'disfunzjoni mitokondrijali, ħsara fid-DNA, u produzzjoni eċċessiva ta' Speċijiet ta 'Ossiġenu Reattiv (ROS) [7]. Studju ta 'ġrieden dijabetiċi wera li Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-attivat Protein Kinase (AMPK), riċettur ta' enerġija u stress intraċellulari, jista 'jinibixxi l-apoptosi medjata minn ROS. Barra minn hekk, evidenza dejjem akbar wriet li l-inibizzjoni ta 'Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) tista' tkun ta 'benefiċċju għall-inibizzjoni tal-apoptosi newronali. Rapport ieħor wera li c-Jun N-terminal Kinase (JNK), Extracellular Regulated Protein Kinases (ERK), mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni p38 MAPK jistgħu potenzjalment jirregolaw l-apoptosi newronali [8,9].

Ibbażat fuq it-teorija tal-mediċina tradizzjonali Ċiniża,kliewidefiċjenza essenza u stasis tad-demm huma kkunsidrati bħala patoġenesi bażika ta 'DE. Għalhekk, l-istrateġija ta 'nutrizzjonikliewiu d-demm li jattiva huwa komunement użat f'applikazzjonijiet kliniċi għal DE. Studji preċedenti jistgħu jikkonfermaw li l-preskrizzjoni modifikata ta' Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), riċetta li għandha l-għan li talimentakliewi, jista 'jtejjeb l-indeboliment konjittiv u jipproteġi n-newroni billi jnaqqas it-tossiċità A [10, 11]. Preskrizzjoni Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), li fiha l-arlinga tiżdied ibbażata fuq MWP, hija fformulata speċifikament biexjrawmukliewiu jattiva d-demm. Riċentement studji wrew li l-preskrizzjoni BSHX tista 'ttejjeb is-sindromu tad-deterjorament tal-memorja tal-pazjenti DM, li tissuġġerixxi proprjetajiet newroprotettivi qawwija [12]. Madankollu, il-mekkaniżmu farmakoloġiku dettaljat għal BSHX għadu mhux ċar. F'dan l-istudju, aħna nimmiraw li nosservaw l-effett protettiv tal-estratt BSHX fuq ċelluli PC12 indotti minn HG u nesploraw mekkaniżmi molekulari potenzjali.

Metodi

Materjali u reaġenti

Il-ħxejjex aromatiċi kollha nxtraw minn Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Beijing, iċ-Ċina) u awtentikati minn Dr PF Tu, farmakognosist, skont il-Farmakopea Ċiniża (Il-Kummissjoni tal-Farmakopea tar-RPĊ, 2010). 3- [4, 5-Dimethylthiazol-2-yl] 2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) kien minn Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Kitt tal-assaġġ tal-lactate dehydrogenase (LDH) inxtara minn Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, iċ-Ċina). Acridine Orange (AO)/Ethidium Bromide (EB) kit ta 'tebgħa doppja u Hoechst 33258 inkisbu minn Solar Co., Ltd. (Beijing, iċ-Ċina). Kitt tal-analiżi tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali b'JC-1, 2, 7-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) inxtara minn Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, iċ-Ċina). Antikorpi primarji għal caspase-3, caspase cleaved-3, PARP, PARP cleaved, ċitokrom C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK, u -tubulin inkisbu minn Cell signaling Technology (Boston, MA, USA).

Preparazzjoni ta 'estratt BSHX

BSHX jikkonsisti f'seba' komponenti mediċinali (Tabella 1). Għall-preparazzjoni tal-estratt BSHX, Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) u Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) tħalltu fil-proporzjon ta '8:8:4:1:2:1:8 u mgħaddsa f'volum totali ta' 10 darbiet (v/w) ilma distillat għal 30min , imbagħad mgħolli għal 1 siegħa u reġa' mgħolli għal 1h f'volum totali ta '5 darbiet (v/w) ilma distillat. Is-supernatanti ġew magħquda u mnixxfa b'lijofilizzazzjoni. L-estratt finali mnixxef kien 25 fil-mija (w/w) tal-piż tal-ħxejjex aromatiċi nejjin u kampjun tal-vawċer ġie depożitat fiċ-Ċentru ta 'Riċerka Moderna għall-Mediċina Tradizzjonali Ċiniża, iċ-Ċentru tax-Xjenza tas-Saħħa tal-Università ta' Peking, Beijing, iċ-Ċina.

Kultura taċ-ċelluli

Linji taċ-ċelluli tal-feokromoċitoma tal-firien (ċelluli PC12) inkisbu minn Peking Union Medical College Cell Bank (Beijing, iċ-Ċina) u mkabbra f'Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Beijing, China) supplimentat b'10 fil-mija serum tal-fetu bovin (Biowest, Franza) ) u 1 fil-mija Peniċillina-Streptomycin (100×, Macgene, Beijing, iċ-Ċina) f'inkubatur umidifikat li fih 95 fil-mija arja u 5 fil-mija CO2 f'37 grad .

Trattament tal-kampjun

Fit-test preliminari, iċ-ċelloli PC12 ġew ittrattati b'estratt BSHX (20, 50, 100 mg/L) waħdu għal 48 siegħa biex tiġi evalwata ċ-ċitotossiċità. Għall-analiżi tal-effett newroprotettiv tal-estratt BSHX kontra n-newrotossiċità indotta minn glukożju għoli (HG), iċ-ċelluli PC12 ġew kotrattati b'estratt BSHX (20, 50, 100 mg/L) u HG (75 mM) għal 48 siegħa, segwiti b'assaġġ MTT għall-vijabbiltà taċ-ċelluli. L-assaġġi l-oħra kollha saru taħt l-istess kundizzjoni bil-firxa ta 'konċentrazzjoni ta' estratt BSHX minn 20 sa 100 mg / L.

Assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli

Iċ-ċelluli PC12 ġew miżrugħa fi 96-pjanċi bir-bir b'densità ta' 3.5 × 103 ċelluli għal kull bir. Wara l-inkubazzjoni bl-estratt BSHX (bi jew mingħajr HG) għal 48 siegħa, is-supernatant tneħħa u ġiet miżjuda soluzzjoni MTT (0.5 mg/mL). Wara l-inkubazzjoni f'37 grad għal 4 sigħat, soluzzjoni MTT tneħħiet u ċ-ċelloli ġew maħlula f'dimethyl sulfoxide (DMSO) għal tħawwad 5 min. Id-densità ottika (OD) ġiet imkejla f'570 nm bl-użu ta' microplate reader. Vijabilità taċ-ċelluli ( fil-mija )=[OD (trattament) – OD (vojta)]/ [OD (kontroll mhux trattat) – OD (vojta)] × 100 fil-mija .

Assaġġ LDH

Iċ-ċelloli PC12 ġew ikkultivati ​​u stimulati għal trattament ta 'estratt ta' HG u BSHX kif deskritt qabel. Imbagħad, l-LDH rilaxxata miċ-ċelloli ġiet skoperta bl-użu ta 'kit LDH kummerċjali skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. L-assorbiment tkejjel f'450 nm. LDH (U/L)=[OD (trattament) – OD (vojt)] / [OD (standard) – OD (vojt)] × 0.2 (mmol/L) × 1000.

Tbajja Hoechst 33258 u tbajja AO/EB

Għat-tbajja 'Hoechst 33258, iċ-ċelloli ġew iffissati b'4 fil-mija paraformaldehyde għal 30 min. Imbagħad iċ-ċelloli ġew maħsula bil-Phosphate Buffer Saline (PBS) 3 darbiet u inkubati b'soluzzjoni ta 'ħidma Hoechst 33258 (1 ug/mL) fid-dlam għal 30 min f'temperatura tal-kamra. L-immaġini nqabdu bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti (IX73, Olympus, Ġappun) taħt wavelength ta' eċċitazzjoni 352 nm / wavelength ta 'emissjoni 461 nm. Għat-tbajja 'AO/EB, neħħi l-medju minn 96-pjanċi bir-bir u żid taħlita AO/EB (100 ug/mL AO u 100 ug/mL EB imħallat) għal 5 min fid-dlam f'temperatura tal-kamra. Imbagħad iċ-ċelloli ġew maħsula bil-PBS 3 darbiet. Iċ-ċelloli ġew viżwalizzati bl-użu ta 'mikroskopju fluworexxenti taħt wavelength ta' eċitazzjoni 490 nm / wavelength ta 'emissjoni 530 nm għal tbajja AO u wavelength ta' eċċitazzjoni 520 nm / wavelength ta 'emissjoni 590 nm għal tbajja EB.

Sejbien ta' ROS intraċellulari

Għall-iskoperta ta 'ROS intraċellulari, iċ-ċelloli PC12 ġew miżrugħa fi 6-pjanċi ta' sew f'densità ta '5 × 105 u soġġetti għal trattament ta' estratt HG u BSHX għal 24 siegħa. Wara l-inkubazzjoni 24 siegħa, iċ-ċelluli PC12 ġew maħsula b'medju tal-ajkla modifikat Dulbecco mingħajr serum għal 3 darbiet u miżjuda f'10μΜ 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), li huwa ossidizzat għal 2', 7'-dichlorofluorescein fluworexxenti. (DCF) minn idroperossidi, f'37 grad għal 30 min fid-dlam. Imbagħad, iċ-ċelloli ġew maħsula b'PBS kiesaħ 3 darbiet u ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS. Il-livell intraċellulari ta 'ROS ġie skopert billi tkejjel l-intensità medja tal-fluworexxenza permezz ta' ċitometrija tal-fluss (BD FACSCaliburTM, USA). Il-wavelengths ta 'eċċitazzjoni/emissjoni kienu f'488 / 525 nm. Minimu ta' 10,000 avvenimenti ġew magħduda għal kull kampjun. Il-valuri ġew espressi bħala l-assorbenza medja normalizzata għall-perċentwali tal-valur tal-kontroll.

Assaġġ tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali

Id-depolarizzazzjoni mitokondrijali ġiet ivvalutata bl-użu ta' kit ta' analiżi kummerċjali JC{0}}. Wara li ġew ittrattati bl-estratt HG u BSHX, iċ-ċelloli ġew inkubati b'soluzzjoni ta 'ħidma JC-1 (1 ×) f'temperatura ta' 37 grad għal 15-il minuta fid-dlam. Imbagħad, neħħi s-supernatant u aħsel iċ-ċelloli 2 darbiet b'soluzzjoni buffer JC-1 (1 ×). Iċ-ċelloli ġew viżwalizzati bl-użu ta' mikroskopju fluworexxenti taħt wavelength ta' eċitazzjoni 460 nm/wavelength ta' emissjoni 530 nm għal monomeru JC-1 (skoperti f'ċelloli b'mitokondrija depolarizzata), u wavelength ta' eċċitazzjoni 520 nm/ wavelength ta' emissjoni 590 nm għal JC{13 }} polimeru (preżenti fil-mitokondrija polarizzata). Iċ-ċelloli bi fluworexxenza ħadra (monomerika) tqiesu li kellhom mitokondrija depolarizzata; iċ-ċelloli bi fluworexxenza ħamra (polimerika) tqiesu li għandhom mitokondrija normali.

Analiżi Western blot

Iċ-ċelloli PC12 inġabru u ġew lisati f'buffer RIPA kiesaħ b'inibitur tal-protease cocktail 1 ×. Is-supernatant inġabar permezz ta' ċentrifugazzjoni b'veloċità għolja fi 12,000 rpm għal 10 min f'4 gradi. Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew determinati mill-assaġġ Bradford. Ċitosol u frazzjonijiet arrikkit-mitokondrija ġew iżolati bil-Mitochondria Isolation Kit (Pierce, Rockford, USA) għall-analiżi cytochrome c. Għal proteini oħra, lisati taċ-ċelluli totali ġew separati minn SDS-PAGE (10 fil-mija -15 fil-mija ) u trasferiti għal membrani Polyvinylidene Fluoride (PVDF). Il-membrani tal-fluworidu tal-poliviniliden imbagħad ġew imblukkati b'5 fil-mija ħalib bla xaħam u inkubati bl-antikorpi primarji indikati f'4 gradi għal matul il-lejl. Il-membrani ġew maħsula b'PBST (saline buffered fosfat, 0.1 fil-mija Tween 20) tliet darbiet u inkubati b'antikorpi sekondarji f'temperatura tal-kamra għal 2 sigħat. Imbagħad, il-membrani ġew maħsula bil-PBST tliet darbiet oħra u viżwalizzati bl-użu ta 'sottostrat kimiluminixxenti mtejjeb, u skennjati bis-Sistema ta' Immaġini Diġitali Kodak (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

Analiżi statistika

Il-valuri kollha huma espressi bħala medja ± devjazzjoni standard (SD). Is-sinifikat tad-differenzi bejn il-valuri medji ġiet iddeterminata b'analiżi one-way tal-varjanza (ANOVA) bl-użu tal-Pakkett Statistiku għax-Xjenzi Soċjali (SPSS 16.0 softwer). P <0.05 meta="" mqabbel="" mal-grupp="" ta'="" kontroll="" kien="" ikkunsidrat="" statistikament="">

Riżultati

L-estratt ta 'BSHX jipproteġi ċ-ċelloli PC12 kontra l-ħsara taċ-ċelluli kkaġunata minn HG

Biex tinvestiga jekk l-estratt BSHX jistax jipproteġi ċ-ċelluli PC12 minn insult HG, aħna ttrattati ċ-ċelluli PC12 b'firxa ta 'konċentrazzjonijiet ta' estratt BSHX (20, 50, u 100 mg / L) għal 48 siegħa taħt kundizzjonijiet HG (75 mM). Il-valutazzjoni tal-vijabbiltà taċ-ċelluli bl-użu tal-assaġġ MTT wera li l-insult HG ikkawża tnaqqis sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelluli PC12 (il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet ta 'madwar 56.9 ± 6.7 fil-mija) u li t-trattament tal-estratt BSHX ipprevjeni b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli żdiedet għal 87.8 ± 9.2 fil-mija meta ċ-ċelloli ġew kotrattati b'estratt BSHX (100 mg/L) (Figura.1A). Lactate Dehydrogenase (LDH) huwa rilaxxat minn ċelluli bil-ħsara u għalhekk jista 'jintuża wkoll bħala indikatur tat-tossiċità taċ-ċelluli. B'mod konsistenti mar-riżultati tal-assaġġ MTT, sibna li l-insult HG żied b'mod sinifikanti r-rilaxx tal-LDH minn ċelluli PC12 u li t-trattament tal-estratt BSHX ipprevjeni r-rilaxx tal-LDH b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Figura. 1B), Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-estratt BSHX iżid il-vijabbiltà taċ-ċelluli f'ċelluli PC12 indotti minn HG.

L-estratt tal-BSHX jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli PC12 permezz tal-mogħdija dipendenti fuq il-caspase-9/3-

Biex tiddetermina l-effett tal-estratt BSHX fuq l-apoptosi taċ-ċelluli, użajna żebgħa tad-DNA Hoechst 33258 bħala assaġġ sensittiv għall-apoptożi. In-nuklei ta 'ċelloli normali mtebbgħin minn Hoechst 33258 wrew fluworexxenza blu uniformi, filwaqt li ċelloli apoptotiċi li pyknosis sħaba tal-kromatina nukleari wrew partiċelli fluworexxenti iper-kromatiċi u densi. Il-perċentwal ta 'apoptożi ġie kkalkulat skond in-numru ta' ċelluli apoptotiċi vs in-numru totali ta 'ċelluli. Id-dejta tagħna wriet li l-insult ta 'HG (75 mM) żied b'mod drammatiku l-proporzjon ta' ċelloli apoptotiċi (51.7 ± 4.3 fil-mija) u t-trattament tal-estratt BSHX protett b'mod sinifikanti kontra l-apoptożi indotta minn HG fiċ-ċelloli PC12 (Figura.2A). Dawn ir-riżultati kienu appoġġjati aktar minn analiżi ta 'tbajja' doppja AO/EB. AO jidħol kemm fiċ-ċelloli normali kif ukoll fl-apoptotiċi u jarmi fluworexxenza ħadra filwaqt li EB jidħol biss fiċ-ċelloli apoptotiċi u jarmi fluworexxenza ħamra [13]. L-assaġġ AO/EB wera li l-persentaġġ ta 'ċelluli apoptotiċi żdied b'mod sinifikanti wara l-insult ta' HG (75 mM) (47.8.7 ± 2.6 fil-mija) u naqas mat-trattament tal-estratt BSHX fiċ-ċelloli PC12 (Figura.2B), li jissuġġerixxi li l-estratt BSHX jista 'effettivament jinibixxi l-apoptożi taċ-ċelluli PC12 indotta minn HG.

Imbagħad, investigajna l-effett tal-estratt tal-BSHX fuq il-mogħdija tal-caspase-3/PARP, mogħdija importanti għall-apoptożi relatata mal-mitokondrija [14]. Western blot wera li l-insult ta' HG (75 mM) żied b'mod sinifikanti l-espressjonijiet ta' forom attivi ta' caspase-3 u PARP u naqqas l-espressjonijiet ta' caspase totali-3 u PARP fiċ-ċelluli PC12, u dan l-effett inqaleb sew permezz ta 'trattament ta' estratt BSHX (Figura.2C), li jissuġġerixxi li l-estratt ta 'BSHX ipproteġi b'mod effettiv iċ-ċelluli PC12 kontra l-apoptosi permezz tar-regolazzjoni tal-mogħdija ta' caspase-3/PARP dipendenti mill-mitokondrijali.

L-estratt ta 'BSHX jinibixxi l-produzzjoni ta' ROS intraċellulari fiċ-ċelloli PC12 indotti minn HG

Peress li HG jista 'jtejjeb il-formazzjoni ta' ROS intraċellulari [15], aħna ttestjajna l-livell ta 'ROS intraċellulari biex niddeterminaw jekk l-estratt ta' BSHX jistax jinibixxi l-ġenerazzjoni ta 'ROS. Kien hemm żieda ta' 3.23-darbiet fl-intensità medja tal-fluworexxenza osservata fiċ-ċelloli PC12 li kienu esposti għal 75 mM HG għal 48 siegħa meta mqabbla mal-kontroll. B'kuntrast, il-ko-trattament bl-estratt BSHX naqqas b'mod sinifikanti l-intensità medja tal-fluworexxenza għal madwar 0.76-, 0.{{10}}, u 0.{ {12}}darbiet tal-grupp mudell, rispettivament, li jindika li l-estratt ta 'BSHX jista' jinibixxi l-produzzjoni ta 'ROS indotta minn HG (Figures.3A, B).

L-estratt ta' BSHX iżomm l-omeostażi mitokondrijali fiċ-ċelloli PC12 indotti minn HG billi jirregola l-espressjoni ta' Bax u Bcl-2

Il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali huwa parametru importanti tal-funzjoni mitokondrijali użata bħala indikatur tas-saħħa taċ-ċelluli. JC-1 huwa żebgħa lipofilika u katjonika li tista' b'mod selettiv tidħol fil-mitokondrija u tibdel il-kulur b'mod riversibbli minn aħdar għal aħmar hekk kif jiżdied il-potenzjal tal-membrana. F'ċelloli b'saħħithom b'potenzjal għoli ta' membrana mitokondrijali, JC-1 jifforma spontanjament kumplessi magħrufa bħala J-aggregates bi fluworexxenza ħamra intensa. Min-naħa l-oħra, f'ċelloli apoptotiċi b'potenzjal baxx ta 'membrana mitokondrijali, JC-1 jibqa' fil-forma monomerika, li turi biss fluworexxenza ħadra [16, 17]. Il-proporzjon ta 'fluworexxenza ħadra għal fluworexxenza ħamra jista' għalhekk jirrifletti depolarizzazzjoni mitokondrijali. Fl-istudju tagħna, in-numru ta 'ċelluli b'mitokondrija depolarizzata (fluworexxenza ħadra) żdied b'mod sinifikanti wara HG (75 mM) għal 48 siegħa, u din iż-żieda ġiet imreġġa' lura permezz ta 'trattament ta' estratt BSHX b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Figura.4A).

Sussegwentement skoprejna d-distribuzzjonijiet mitokondrijali u ċitoplasmiċi taċ-ċitokromu ċ, attur ewlieni fil-mogħdija tal-apoptożi tal-attivazzjoni dipendenti fuq il-caspase. Sibna li l-insult ta 'HG (75 mM) għal 48 siegħa wassal għal traslokazzjoni drammatika ta' ċitokromu ċ minn mitokondrija għaċ-ċitoplasma, u din ir-rilokazzjoni ġiet evitata b'mod sinifikanti permezz ta 'trattament ta' estratt BSHX (Figura.4B), li jindika li l-estratt ta 'BSHX jista' jinibixxi r-rilaxx ta ' ċitokromu ċ mill-mitokondrija.

Barra minn hekk, il-proteini tal-familja Bcl-2 huma regolaturi importanti ta' diversi mogħdijiet apoptotiċi. Bcl-2 jista 'jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli kkawżata minn varjetà ta' fatturi ċitotossiċi u huwa l-inibitur tar-rilaxx taċ-ċitokromu ċ mill-mitokondrija għaċ-ċitoplasma. Madankollu, Bax, bħala membru tal-familja Bcl-2, huwa fattur pro-apoptosi. Meta tiġi indotta l-apoptożi, Bax jemigra miċ-ċitoplasma għall-mitokondrija u jeqred l-integrità mitokondrijali [5, 18]. Fl-istudju tagħna, il-livell tal-proteina ta 'Bcl-2 kien regolat 'l isfel u Bax kien regolat 'il fuq minn insult HG (75 mM) għal 48 siegħa, dan l-effett kien imreġġa' lura b'mod dipendenti mill-konċentrazzjoni mill-estratt BSHX (Figura.4C). Dawn ir-riżultati kollha hawn fuq issuġġerew li l-estratt BSHX ipproteġi ċ-ċelloli PC12 kontra d-depolarizzazzjoni mitokondrijali indotta minn HG billi jirregola l-espressjoni ta 'Bax u Bcl-2.

Effett tal-estratt tal-BSHX fuq l-apoptosi taċ-ċelluli permezz tal-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni JNK/p38 MAPK

Xi studji wrew li żieda fil-produzzjoni ta 'ROS ġiet assoċjata ma' l-attivazzjoni ta 'mogħdijiet MAPK, biex tiskatta l-apoptożi taċ-ċelluli9 [19, 20]. Allura aħna investigajna l-effett tal-estratt tal-BSHX fuq il-mogħdija tas-sinjalar tal-Protein Kinase Attivat minn Mitoġenu (MAPK) biex niddeterminaw jekk l-estratt tal-BSHX jistax jattenwa l-apoptosi indotta minn HG. Kif muri fil-Figura 5, HG (75 mM) insult għal 48 siegħa żied il-fosforilazzjonijiet ta 'c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) u p38 fiċ-ċelloli PC12, li kienu inibiti b'mod sinifikanti mill-estratt BSHX f'konċentrazzjoni- b’mod dipendenti. Madankollu, ma ġiex osservat riżultat simili b'MaPK tal-Protein Kinase Regolat Extraċellulari (ERK). Ir-riżultati jissuġġerixxu li l-estratt BSHX jista 'jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli indotta minn HG permezz ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni JNK/p38 MAPK.

Diskussjoni

L-enċefalopatija dijabetika (DE) hija kumplikazzjoni komuni tad-dijabete mellitus tat-tip 2 (T2DM). Jista 'jikkawża indeboliment konjittiv tal-moħħ u huwa fattur ta' riskju importanti ta 'mortalità u diżabilità f'pazjenti bid-dijabete mellitus tat-tip 2 madwar id-dinja [3]. Għalhekk, huwa kritiku li jiġi studjat il-mekkaniżmu ta 'DE kif ukoll l-istrateġiji ta' prevenzjoni u trattament tiegħu.

Fiċ-Ċina, il-mediċini tradizzjonali Ċiniżi (TCMs) intużaw għat-trattament tad-DM għal ħafna snin u wrew effett kurattiv. Xi studji kliniċi jissuġġerixxu li TCMs ibbażati fuq kliewi nutrizzjoni u strateġiji ta 'attivazzjoni tad-demm jistgħu jirregolaw 'l isfel il-glukożju fid-demm, jippromwovu ċ-ċirkolazzjoni, u jtejbu disfunzjoni konjittiva tal-moħħ. Preskrizzjoni BSHX hija rappreżentant ta 'dawn TCMs. L-istudju kliniku preliminari tagħna wera li l-preskrizzjoni BSHX tista 'ttejjeb b'mod effettiv il-glukożju fid-demm, l-omoċisteina (HCY), u l-proteina C-reattiva ta' sensittività għolja (hs-CPR) fis-serum, u ttejjeb il-funzjoni konjittiva ta 'pazjenti dijabetiċi b'indeboliment konjittiv ħafif (MCI) [12]. Madankollu, s'issa hemm nuqqas ta' evidenza li tipprova l-effiċjenza u l-mekkaniżmu farmakoloġiku.

F'dan l-istudju, sibna l-estratt ta 'BSHX jista' jnaqqas it-tnaqqis tal-vijabbiltà taċ-ċelluli indott minn HG, kif imkejjel mill-MTT, assaġġ LDH. Biex tesplora aktar l-effett protettiv tal-estratt BSHX fuq il-vijabbiltà taċ-ċelluli, studjajna l-apoptożi minn Hoechst 33258 u analiżi tat-tbajja 'AO/EB. Ir-riżultati wrew li l-estratt ta 'BSHX jista' jnaqqas b'mod sinifikanti l-apoptosi indotta minn HG. Bħala l-markatur tal-apoptożi, caspase-3 u PARP żdiedu b'mod sinifikanti wara t-trattament b'HG iżda l-attivazzjoni ta 'dawn il-fatturi pro-apoptotiċi ġiet inibita mill-estratt ta' BSHX b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni. Ir-riżultati ta 'hawn fuq indikaw li l-estratt ta' BSHX kellu effett protettiv fuq il-ħsara taċ-ċelluli PC12 indotta minn HG.

ROS huwa ffurmat matul il-proċess ta 'fosforilazzjoni ossidattiva taċ-ċelloli, u ż-żieda tagħha fil-produzzjoni jew il-ħsara tas-sistemi antiossidanti tista' twassal għal stress ossidattiv fiċ-ċelloli [21]. Studji wrew li glukożju għoli jista 'jwassal għall-akkumulazzjoni ta' ROS intraċellulari u eventwalment mogħdija ta 'sinjalazzjoni apoptotika attiva. U l-mekkaniżmu komuni tal-kumplikazzjonijiet dijabetiċi huwa l-istress ossidattiv [22, 23]. Ir-riżultati tagħna wrew li glukożju għoli jista 'jwassal għal żieda ta' ROS fiċ-ċelloli PC12, li kien konsistenti ma 'studji preċedenti [24]. Huwa spekulat li t-tossiċità ta 'glukożju għoli għaċ-ċelloli tista' tinkiseb permezz ta 'apoptożi indotta minn ROS. Il-mitokondrija huma s-siti ewlenin tal-produzzjoni intraċellulari ta 'ROS u l-organu fil-mira maġġuri għall-attakk ROS ukoll [25]. Taħt kundizzjonijiet patoloġiċi, iż-żieda mgħaġġla ta 'ROS tista' tirriżulta f'disfunzjoni mitokondrijali, kollass potenzjali tal-membrana mitokondrijali u eventwalment twassal għal apoptożi taċ-ċelluli [26]. Allura skoprejna l-integrità tal-mitokondrija. Ir-riżultati tagħna wrew li l-glukożju għoli naqqas b'mod sinifikanti l-potenzjal tal-membrana mitokondrijali, żied il-proporzjon ta 'Bax/Bcl-2 li kkontrolla l-bidla tal-pori ta' transizzjoni tal-permeabilità mitokondrijali (MPTP), u ppromwova t-tnixxija taċ-ċitokromu ċ, filwaqt li l-estratt ta 'BSHX jista' ireġġa' lura dawn il-bidliet. Dawn jissuġġerixxu li n-newroprotettiv tal-estratt ta 'BSHX kontra ċelluli PC12 indotti minn HG jista' jirriżulta miż-żamma tal-integrità tal-mitokondrija.

Il-mogħdija tas-sinjalar MAPK għandha wkoll rwol importanti fl-apoptosi taċ-ċelluli. JNK, ERK, u p38 MAPK huma l-aktar membri studjati tal-familja MAPK. Il-mod ewlieni ta 'azzjoni tagħhom huwa li fosforilaw is-siti speċifiċi tagħhom, u b'hekk jirregolaw l-apoptosi taċ-ċelluli [8, 27, 28]. Barra minn hekk, studji wrew li produzzjoni eċċessiva ta 'ROS tista' twassal għall-fosforilazzjoni ta 'p38MAPK [29-31], u ROS jista' jinduċi jew jimmedja l-attivazzjoni tal-mogħdijiet MAPK [32]. Diversi stimuli ċellulari li jinduċu l-produzzjoni ta 'ROS ukoll b'mod parallel jistgħu jattivaw mogħdijiet MAPK f'tipi ta' ċelluli multipli [32, 33]. Il-mekkaniżmi potenzjali għall-attivazzjoni tal-MAPK minn ROS jistgħu jinkludu l-inattivazzjoni u d-degradazzjoni tal-fosfatasi MAPK li jżommu l-mogħdija fi stat inattiv [19]. Min-naħa l-oħra, biex tikkonferma aktar jekk il-mogħdijiet MAPK ġewx attivati ​​mill-ġenerazzjoni ROS, iċ-ċelloli ġew ittrattati minn qabel b'antiossidanti (eż. NAC, kennies ROS) biex jipprevjenu l-akkumulazzjoni ta 'ROS. U r-riżultati wrew li l-attivazzjoni tal-MAPK kienet kważi inibita wara l-istimulazzjoni taċ-ċelluli bi stimuli ċellulari [32, 33], li jindika l-involviment tal-inattivazzjoni tal-ROS tal-mogħdijiet MAPK. Barra minn hekk, studji wrew li meta ċ-ċelloli ġew ittrattati bl-inibitur speċifiku JNK SP600125, l-apoptożi indotta minn Cardiotoxin III tista 'tiġi mblukkata [34]. L-istudju preċedenti tagħna sab li l-preskrizzjoni modifikata ta 'Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) tista' tinibixxi l-attivazzjoni ta 'ERK/p38 MAPK f'mikroglia BV2 attivat A [10]. Madankollu, f'dan l-istudju, sibna li l-estratt ta 'BSHX jista' jinibixxi l-fosforilazzjoni ta 'JNK u p38 MAPK u ma ksibniex l-istess riżultat ma' p-ERK. Aħna nispekulaw li l-arlingi għandhom rwol differenti fl-estratt tal-BSHX. Ir-riżultati jissuġġerixxu li mekkaniżmu protettiv ieħor ta 'estratt ta' BSHX kontra l-apoptożi fiċ-ċelloli PC12 indotti minn HG jista 'jkun permezz tar-regolamentazzjoni ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni JNK/p38 MAPK.

Konklużjoni

L-estratt ta 'BSHX, formula polyherbal, juri effetti newroprotettivi fuq iċ-ċelloli PC12 kontra l-insult HG. L-estratt ta 'BSHX inibixxi b'mod effettiv l-apoptosi taċ-ċelluli PC12 indotta minn HG permezz tat-tnaqqis tal-ġenerazzjoni ta' ROS intraċellulari, iż-żamma tal-integrità tal-membrana mitokondrijali, u l-imblukkar tal-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ta' caspase -3 u JNK/p38 MAPK (Figura.6). B'mod kollettiv, is-sejbiet tagħna jissuġġerixxu li l-estratt ta 'BSHX huwa aġent promettenti għat-trattament ta' DE f'applikazzjonijiet kliniċi.

Kontribuzzjonijiet tal-awtur

Ikkonċeput u ddisinjat l-esperimenti: Zeng KW, Wang XM. Twettaq l-esperiment: Zhao SY. Analizza d-dejta: Zhao SY, Zeng KW, u Wang XM. Reaġenti/materjali/għodod ta 'analiżi kkontribwew: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW, u Wang XM. Kiteb il-pater: Zhao SY.

Referenzi

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, et al. Il-moħħ dijabetiku u l-konjizzjoni. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Ħsara fil-moħħ bid-dijabete mellitus: evidenza, mekkaniżmi u implikazzjonijiet tat-trattament. Espert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. It-Teorija tal-"Memorja Metabolika" u t-Trattament Bikri tal-Ipergliċemija fil-Prevenzjoni ta' Kumplikazzjonijiet Dijabetiċi. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Il-potenzjal tal-membrana mitokondrijali (Δψm) fl-apoptożi; aġġornament. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Konnessjoni tad-dinamika mitokondrijali u avvenimenti ta 'ħajja jew mewt permezz ta' proteini tal-familja Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R, et al. Mitokondrija u mewt taċ-ċelluli. Aspetti mekkanistiċi u kwistjonijiet metodoloġiċi. Frar J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S, et al. 1,25-(OH)2D3 jinibixxi l-apoptożi għolja indotta mill-glukożju u l-produzzjoni ta 'ROS fiċ-ċelloli mesoteljali peritoneali umani permezz tal-mogħdija MAPK/P38. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, et al. It-trattament minn qabel tal-fattur tat-tkabbir tan-nervituri jnaqqas l-attivazzjoni tal-kinase 1 amino-terminal c-Jun u l-attivazzjoni ta 'p38 u p38 attivati ​​mill-istress u jagħti newroprotezzjoni fil-mudell tal-feochromocytoma PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J, et al. Involviment ta 'caspase-3 u proteina kinase attivata mill-mitoġenu p38 fl-apoptosi indotta mill-klorur tal-kobalt fiċ-ċelloli PC12. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF, et al. Effetti Antinewroinfjammatorji ta 'Preskrizzjoni Modifikata ta' Wu-Zi-Yan-Zong f'Mikroglia BV2 Stimulata bl-Amyloid permezz tal-Mogħdijiet ta 'Sinjali MAPK NF-κB u ERK/p38. Compl Alt Ibbażat fuq Evid 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H, et al. Preskrizzjoni Wu-Zi-Yan-Zong modifikata, formula tradizzjonali tal-polyherbali Ċiniża, trażżan proċessi newroinfjammatorji indotti minn lipopolysaccharide fl-astroċiti tal-firien permezz ta 'mogħdijiet ta' sinjalazzjoni NF-κB u JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, et al. Effett tal-Preskrizzjoni Bushen Huoxue fuq it-Trattament ta 'Indeboliment Ħafif tal-Konjizzjoni tad-Dijabete tat-Tip 2. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P, et al. Analiżi ta 'apoptożi indotta minn cycloheximide fil-lewkoċiti umani: Mikroskopija tal-fluworexxenza bl-użu ta' annexin V/propidium iodide kontra acridine orange/ethidium bromide. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, et al. Caspases Ikkonnettja s-Sinjali taċ-Ċelloli-Mewt ma' Omeostażi Organiżmi. Immunità 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Nitric oxide: fattur ewlieni wara d-disfunzjonalità taċ-ċelloli proġenitriċi endoteljali fid-dijabete mellitus tat-tip -2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, et al. JC-1: Wavelengths ta' eċċitazzjoni alternattivi jiffaċilitaw iċ-ċitometrija tal-potenzjal tal-membrana mitokondrijali. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J, et al. Sondi potenzjali tal-membrana mitokondrijali u l-gradjent tal-protoni: gwida għall-użu prattika. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Kif il-proteini BCL-2 jinduċu permeabilizzazzjoni tal-membrana ta' barra mitokondrijali? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH, et al. Kinażi tal-proteini attivati ​​mill-mitoġenu u speċi ta 'ossiġnu reattivi: kif jista' ROS jattiva l-mogħdijiet MAPK? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, et al. Esteri eteroċikliċi aromatiċi ta 'podophyllotoxin jeżerċitaw attività kontra l-MDR fiċ-ċelluli tal-lewkimja umana K562/ADR permezz tal-mogħdija tas-sinjalar ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Timmira ta' Glycogen Synthase Kinase-3 għal Benefiċċju Terapewtiku kontra Stress Ossidattiv fil-Marda ta' Alzheimer: Involviment tal-Mogħdija Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Ir-Rwol ta 'l-Istress Ossidattiv fin-Neuropatija Dijabetika: Ġenerazzjoni ta' Speċi Radikali Ħieles fir-Reazzjoni ta 'Glycation u Polimorfiżmi tal-Ġene li Jikkodifikaw Enżimi Antiossidanti għal Suxxettibilità Ġenetika għal Newropatija Dijabetika fil-Popolazzjoni ta' Pazjenti Dijabetiċi tat-Tip I. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA, et al. Mewt ċellulari, speċi ta 'ossiġnu reattiv (ROS) u kumplikazzjonijiet dijabetiċi. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD, et al. Ginkgolide B jinibixxi l-apoptożi f'ċelluli endoteljali tal-vina umbilikali tal-bniedem stimulati b'glukożju għoli. Bullettin Farmakoloġiku Ċiniż 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Rwol Deleterju tas-Superoxide Dismutase fl-Ispazju Intermembrana Mitokondrijali. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Sulari KB. Kinażi tal-proteini attivati ​​mill-mitoġenu: mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni ġodda li jaħdmu f'reazzjonijiet ċellulari għall-istress ambjentali. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, et al. MiR-125b jaġixxi bħala onkoġenu fiċ-ċelloli tal-glioblastoma u jinibixxi l-apoptosi taċ-ċelluli permezz ta' mogħdijiet indipendenti minn p53 u p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, et al. Prodotti aħħarin avvanzati ta 'glycation jinduċu apoptosi taċ-ċelluli epiteljali tal-kornea tal-bniedem permezz tal-ġenerazzjoni ta' speċi ta 'ossiġnu reattivi u attivazzjoni ta' mogħdijiet JNK u p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH, et al. Ghrelin jinibixxi l-apoptożi fiċ-ċelluli newronali ipotalamiċi waqt il-privazzjoni tal-ossiġnu-glukożju. Endokrinoloġija 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A jibdel il-proteini regolatorji taċ-ċiklu taċ-ċelluli u jinduċi apoptożi permezz ta 'attivazzjoni ta' p38MAPK dipendenti mill-ispeċi ta 'ossiġnu reattiv fil-linja taċ-ċelluli tal-kanċer tas-sider tal-bniedem MCF -7. Bijoloġija tat-Tumur 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L, et al. Korriment Ossidattiv indott minn ROS involut fil-Patoġenesi tal-Keratite Fungali permezz tal-Attivazzjoni p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Attivazzjoni indotta mill-ispeċi tal-ossiġnu reattiva tal-mogħdijiet tas-sinjalar tal-kinażi MAP. Sinjal Antioxid Redox 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Is-sinjalar Redox u l-mogħdijiet tal-kinase MAP. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Cardiotoxin III jinduċi apoptosi dipendenti fuq kinase c-jun N-terminal fiċ-ċelloli tal-lewkimja tal-bniedem HL-60. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.