Osteopontin tal-Ħalib Għall-Imsaren, Immunità U Żvilupp tal-Moħħ fil-Ħnieżer Preterm
Jun 14, 2022
Biex titgħallem aktar informazzjoni jekk jogħġbok ikkuntattjadavid.wan@wecistanche.com
Astratt
Livelli defiċjenti ta' osteopontin tal-ħalib (OPN) fil-formula tat-trabi jistgħu parzjalment jagħtu każ differenzi fl-iżvilupp bejn trabi mitmugħa bil-formula jew ħalib matern. Nivvotaw daqs li dieta tal-ħalib supplimentata b'ħalib tal-boviniOPNitejjeb l-imsaren, l-immunità u l-iżvilupp tal-moħħ u ttestja dan f'mudell ta 'ħnieżer qabel iż-żmien. Ħnieżer qabel iż-żmien mogħtija minn sezzjoni ċesarja (90 fil-mija tqala) ġew mitmugħa ħalib bovin nej (CON, n=19) jew l-istess dieta supplimentata b’doża fiżjoloġikament rilevanti ta’ OPN (46 mg/(kg:d), n{ {3}}). L-endpoints relatati mar-riżultati kliniċi, l-immunità sistemika u l-iżvilupp newrokognittiv ġew evalwati matul l-istudju, u t-tessuti tal-musrana nġabru Jum 19. Il-mudell tat-tkabbir, l-iżvilupp bikri tal-mutur, u l-biċċa l-kbira tal-parametri immuni sistemiċi kienu simili bejn OPN uKONħnieżer. Il-ħnieżer OPN kellhom proporzjonijiet ogħla ta 'villus-to-crypt minn ħnieżer CON u għadd ogħla ta' monoċiti u limfoċiti f'Jum 8. Funzjonijiet diġestivi u assorbenti tal-musrana u prestazzjoni konjittiva (test T-maze) kienu simili bejn ħnieżer OPN u CON. Bħala konklużjoni, supplimenti tad-dieta maOPN'l fuq mil-livelli bażali tal-ħalib bovin indott titjib minuri fl-istruttura tal-imsaren u l-immunità sistemika mingħajr ebda effett fuq il-prestazzjoni konjittiva. Il-livelli minimi ta' OPN fil-formula tat-trabi biex jiġi żgurat l-aħjar adattament fil-perjodu tat-twelid immedjat għad iridu jiġu determinati.
Kliem ewlieni: osteopontin; proteina tal-ħalib bijoattiva; trabi tat-twelid qabel iż-żmien; saħħa intestinali; immunità sistemika; żvilupp tal-moħħ; konjizzjoni
Ikklikkja hawn biex titgħallem aktar dwar Cistanche
1. Introduzzjoni
L-ottimizzazzjoni tal-livelli ta' proteina bijoattiva fil-formuli tat-trabi tista' tgħin biex tnaqqas id-differenzi stabbiliti sew fl-iżvilupp u r-reżistenza għall-mard bejn trabi mitmugħa bil-formula u l-ħalib tal-omm[1-3]. Osteopontin (OPN) hija proteina aċiduża b'glikosilazzjoni u fosforilazzjoni għolja li hija kkunsidrata importanti biex tistimula l-iżvilupp fil-perjodu tat-twelid immedjat u hija preżenti b'mod abbundanti fil-ħalib uman bikri[4-6]. Il-konċentrazzjonijiet tal-ħalib OPN ivarjaw b'mod notevoli bejn l-ispeċi, u fil-ħalib uman anke l-varjazzjoni inter-individwali bejn l-ommijiet hija għolja. Tnaqqis matul il-perjodu tat-treddigħ jidher għalkemm osservazzjoni konsistenti [5,7]. Fi studju multiċentriku, il-livell OPN medjan kien 160 mg/L madwar 13-il ġimgħa wara t-twelid [7]. L-ogħla livell ta’ 25 fil-mija ta’ OPN fil-ħalib uman kien ta’ 230-495 mg/L, li huwa ħafna ogħla mil-livelli medji rrappurtati għall-ħalib tal-ifrat (~18 mg/L) jew formuli tat-trabi (~9 mg/L)[ 4]. Bħalissa, il-ħalib tal-bovini OPN huwa kummerċjalment aċċessibbli u għalhekk jista' jiġi miżjud mal-formula tat-trabi biex jilħaq livelli simili għal-livelli misjuba fil-ħalib uman.
Minħabba s-sit li jgħaqqad l-integrini ta’ arginine-glycine-aspartate (RDG) f’OPN, l-effetti bijoloġiċi jistgħu jkunu mistennija li jkunu simili madwar l-ispeċi [8]. Il-framment li fih is-sekwenza RDG huwa reżistenti ħafna għat-tkissir minħabba glycosylations qrib il-motiv li jgħaqqad l-integrin [9], u b'hekk jappoġġja l-potenzjal bijoattiv tal-ħalib indiġenu OPN fl-imsaren. In vitro, il-ħalib OPN huwa kapaċi jistimula l-proliferazzjoni taċ-ċelluli intestinali u jeżerċita attivitajiet antibatteriċi bħala parti minn kumpless ma 'lactoferrin (LF), proteina importanti oħra tal-ħalib bijoattiva [10,11]. L-effetti ta' benefiċċju tal-ħalib OPN fl-imsaren intwerew ukoll in vivo. L-iżvilupp intestinali fix-xadini rhesus tat-twelid ġie mtejjeb mill-OPN tal-ħalib tal-ifrat u t-traskriptoma jejunal ta 'annimali mitmugħa bil-formula supplimentati bl-OPN kien simili għal dak f'kontropartijiet ireddgħu [12]. Ħalib tad-dietaEffetti OPN, kemm lokalment fl-imsaren kif ukoll sistemikament wara assorbiment intestinali minuri fit-trabi, ġew parzjalment attribwiti għall-kapaċità tagħha li tistimula l-livelli OPN endoġeni [5,13,14]. OPN jinstab fil-biċċa l-kbira tat-tessuti u l-fluwidi tal-ġisem fejn jeżerċita varjetà ta 'funzjonijiet bħall-bijomineralizzazzjoni u l-modulazzjoni immuni minbarra li jipparteċipa fil-proliferazzjoni taċ-ċelluli, migrazzjoni, adeżjoni u opsonizzazzjoni [8,10,15,16]. L-OPN huwa magħruf li jirregola l-bilanċ Th1/Th2, li fi trabi tat-twelid huwa mxekkel lejn polarizzazzjoni Th2 [17]. OPN jippossjedi proprjetajiet simili għal ċitokini u jista 'jistimula l-immunità tat-tip Th1 bl-induzzjoni tal-espressjoni ta' IL-12 u l-inibizzjoni tal-produzzjoni ta 'IL-10, it-Th2cytokine, fil-makrofaġi [18]. Barra minn hekk, l-OPN jista' jappoġġa l-maturazzjoni tal-moħħ, li potenzjalment jikkontribwixxi għall-funzjonijiet konjittivi mtejba fi trabi li jkunu qed ireddgħu kontra l-formula [19-21]. B'appoġġ għal dan, il-frieħ tal-ġrieden mitmugħa bl-OPN urew kapaċità ta 'tagħlim aħjar u livelli ta' espressjoni ogħla ta 'proteini relatati mal-myelination, inklużi proteina bażika tal-myelin u glycoprotein assoċjata mal-myelin, u OPN tejjeb ukoll il-myelination in vitro [14,22,23]. Fil-ħnieżer fit-tul, bosta reġjuni tal-moħħ ġew affettwati minn żieda fil-volum relattiv wara supplimentazzjoni tad-dieta b'OPN tal-ħalib bovin iżda ma ġew osservati l-ebda effetti fuq il-parametri tal-konjizzjoni [24].
Trabi prematuri (twelid<37 weeks="" of="" gestation)="" are="" particularly="" diet-sensitive="" due="" to="" their="" relatively="" immature="" gut,="" immune="" system,="" and="" brain.="" such="" infants="" are="" susceptible="" to="" developing="" both="" short-and="" long-term="" complications="" such="" as="" necrotizing="" enterocolitis="" (nec),="" feeding="" intolerance,="" infections,="" and="" impaired="" neurodevelopment="" [25-28].="" bovine="" milk="" opn="" supplementation="" has="" previously="" been="" shown="" to="" reduce="" nec="" severity="" in="" formula-fed="" preterm="" piglets="" [29],="" and="" other="" milk="" factors="" have="" proven="" to="" support="" brain="" structure="" and="" cognitive="" development,="" particularly="" in="" preterm="" newborns="" [30,31].="" on="" this="" background,="" we="" hypothesized="" that="" preterm="" newborns,="" fed="" a="" standard="" milk="" diet="" with="" relatively="" natural="" bioactivity,="" would="" benefit="" from="" further="" opn="" supplementation.="" following="" an="" initial="" in="" vitro="" demonstration="" of="" opn="" antimicrobial="" activity,="" we="" used="" diet-sensitive="" preterm="" pigs="" [32-34]to="" investigate="" if="" an="" opn-enriched="" bovine="" milk="" diet="" would="" improve="" gut,="" immunity,="" and="" brain="" development="" in="" the="" first="" three="" weeks="" after="" preterm="">
2. Materjali u Metodi 2.1.Assaġġ Antibatteriku In Vitro
L-ewwel, analiżi antibatterika [35] intuża biex tiġi vvalutata l-bijoattività ta 'OPNbilli tikkwantifika l-kapaċità tiegħu li jinibixxi t-tkabbir ta', jew joqtol, Staphylococcus, jiġifieri, patoġenu Gram-pożittiv tat-twelid komuni [36]. L-istess ħalib bovin intatt mhux pasturizzat użat bħala l-bażi għad-dieti enterali fl-istudju tal-ħnieżer ġie mdewweb u ċentrifugat konsekuttivament f'500 × g u 3000 × 8,4 grad għal 15-il minuta, aspira s-saff milwiema kull darba biex jitneħħa l-kontenut tax-xaħam filwaqt li jimminimizzaw it-telf tal-proteini tal-ħalib [37]. Wara l-ittestjar tal-isterilità tal-ħalib xkumat tal-ifrat, il-OPNtrab (Lacprodan⑧ OPN-10, Arla Foods Ingredients, Viby, id-Danimarka) ġie maħlul f'konċentrazzjonijiet ta' 1.6 (l-istess bħall-ammont miżjud f'Jum 1 fl-istudju tal-majjal mal-ħalib OPN), 2.8,5, 10 u 20g /L, li ħolqu 6 dieti tat-test, inkluż ħalib tal-bovini xkumat mhux supplimentat, li ġew maħżuna f'alikwoti ta' 1 mL fi grad -80 sal-analiżi. Ħażniet iffriżati tal-kultura ta’ nofs log [35] ta’ S.epidermidis(WT1457 [38], ġentilment ipprovduti minn Dr Xiaoyang Wang, Università ta’ Gothenburg, l-Isvezja) ġew imdewweb, ċentrifugati f’3200×g, u sspiżi mill-ġdid f’melħ sterili qabel l-inkubazzjoni b’ is-6 dieti tat-test (minbarra formula ta’ ħalib qabel iż-żmien lest għall-għalf disponibbli kummerċjalment, inkluża bħala kontroll negattiv [1]) f’doża kkalkulata ta’ 10 gradi u 106 CFU/mL għal 2, 4,6 u 24 siegħa f'37 grad. Id-dożi finali tat-tilqim u t-tkabbir tal-batterja fid-dieti tat-test u l-formula tat-trabi wara ħinijiet differenti ta 'inkubazzjoni ġew determinati [35]. Twettqu triplikati indipendenti tal-assaġġ antibatteriku.
2.2. Annimali u Disinn Sperimentali
Il-proċeduri kollha tal-annimali ġew approvati u mwettqa taħt liċenzja (liċenzja nru. 2014-15-0201-00418) maħruġa mill-Ispettorat Daniż tal-Esperimenti tal-Annimali. Tmienja u erbgħin ħnieżer (Danish Landracex Yorkshire Duroc) minn żewġ majjali nisa mrobbija kummerċjalment ingħataw qabel iż-żmien permezz ta 'ċesarja f'madwar 90 fil-mija ta' tqala (terminu sħiħ: 117± 2 d). Wara r-risuxxitazzjoni b'suċċess u waqt li kien għadu anestetizzat minn anestetiċi materni, it-tqegħid kirurġiku ta 'kateter arterjali umbilikali li joqgħod għal ġewwa biex jiffaċilita n-nutrizzjoni parenterali (PN) u tubu ta' tmigħ orogastriku biex jiffaċilita n-nutrizzjoni enterali (EN) sar kif deskritt qabel 32). Sitt ħnieżer ġew ewtanizzati immedjatament wara t-twelid minħabba risuxxitazzjoni falluta u konsegwentement ġew esklużi mill-istudju. B'kollox, tnejn u erbgħin ħnieżer ġew stratifikati skont is-sess u l-piż tat-twelid u assenjati għal wieħed minn żewġ gruppi: grupp wieħed li jirċievi ħalib bovin nej supplimentat b'OPN(OPN, n=21) u grupp ta' kontroll li jirċievi bovini nej mhux supplimentati. ħalib(KON, n=21)(Figura 1). Plażma materna ġiet infuża fi 3 bolus (total ta' 25 mL/kg) permezz tal-kateter umbilikali fl-ewwel 24 siegħa biex tiġi żgurata immunizzazzjoni passiva. Il-ħnieżer trabbew individwalment matul il-perjodu ta' studju ta' 19-il jum. Mill-Ġranet 1-5 kienu trabbew f'inkubaturi msaħħan ventilati (flimkien ma' ossiġenazzjoni matul l-ewwel 24 siegħa), u fil-Ġranet 5 u 11 ġew rilokati f'gaġeġ akbar. L-investigaturi kliniċi kollha kienu blinded għat-trattamenti tad-dieta matul il-perjodu sperimentali.
2.3. Nutrizzjoni u Tmigħ
Id-dieta enterali mogħtija lill-ħnieżer kollha kienet ibbażata fuq ħalib bovin intatt mhux pasturizzat miġbur f'żewġ lottijiet minn razzett lokali tal-ħalib tal-baqar ta' Jersey u maħżun fi grad -20. Il-ħalib bovin kien imsaħħaħ b'minerali u vitamini (15g/L Pediatric Seravit, Nutricia, Utrecht, l-Olanda) u elettroliti (6 g/L Revolyte Nutrition, Gunnar Kjems ApS, Kopenħagen, id-Danimarka). Din il-bażi tal-ħalib serviet bħala d-dieta enterali kompleta għall-ħnienes fil-grupp CON. Għall-ħnieżer fil-grupp OPN, il-bażi tal-ħalib tal-ifrat ġiet supplimentata aktar b'ħalib bovin OPN (Lacprodan⑧ OPN-10) f'medjan supplimentariOPNkonċentrazzjoni ta' 319 mg/L(IQR 272-445) biex tinkiseb doża OPN fissa ta' kuljum miżjuda ta' 46 mg/(kg·jum). Il-konċentrazzjoni hija fil-medda tal-ħalib uman ta' OPN [4]. Il-konċentrazzjoni ta 'OPN fil-ħalib bovin miġbur kienet 91 mg/L kif imkejla permezz ta' kromatografija likwida-spettrometrija tal-massa tandem (LC-MS/MS, Alphalyse A/S, Odense, id-Danimarka). Id-doża supplimentari ta' OPN intgħażlet biex tkun fl-ogħla tarf tal-firxa tal-ħalib uman biex tiżgura differenza raġonevoli mid-dieta tal-kontroll tal-ħalib tal-bovini. Tħejjijiet ta 'kuljum tad-dieti enterali saru u maħżuna f'4 gradi sakemm jintużaw (<24 h).="" pigs="" received="" gradually="" increasing="" volumes="" of="" en="" from="" 32="" ml/(kg.="" day)="" on="" day="" 1="" to="" 180ml/(kg:="" day)on="" day="" 15="" and="" until="" euthanasia.="" the="" enteral="" diets="" were="" given="" as="" boluses.="" during="" the="" daytime,="" the="" boluses="" were="" given="" every="" second="" hour,="" and="" during="" the="" night="" every="" third="" hour="" until="" day="" 9.="" thereafter,="" the="" feeding="" frequency="" was="" reduced="" to="" every="" third="" hour,="" day="" and="" night.="" the="" en="" was="" given="" through="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" until="" day="" 5="" when="" pigs="" were="" taught="" to="" drink="" from="" troughs.="" the="" pn="" was="" given="" as="" a="" continuous="" infusion="" in="" decreasing="" amounts="" from="" days="" 1-8="" (144-148="" ml/(kg.="" day))to="" counterbalance="" the="" small="" enteral="" volumes="" the="" piglets="" can="" cope="" with.="" the="" pn="" solution="" was="" a="" commercially="" available="" human="" parenteral="" nutrition="" product="" (kabiven,="" fresenius="" kabi,="" uppsala,="" sweden)="" adjusted="" to="" the="" requirements="" of="" piglets="" as="" previously="" described="" [32].="" after="" removal="" of="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" on="" day="" 11="" and="" onwards,="" all="" pigs="" had="" free="" access="" to="">
2.4. Evalwazzjoni Klinika u Ġbir tat-Tessuti
Matul il-perjodu ta 'studju, il-ħnieżer ġew immonitorjati mill-qrib (mill-inqas kull 3 sigħat) u l-punteġġi kliniċi ġew assenjati darbtejn kuljum kif deskritt qabel [33]. Fuq indikazzjoni klinika, inbdew trattamenti rilevanti, eż., l-għoti ta’ analġeżiċi intramuskolari (meloxicam: Metacam, 5 mg/mL Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, il-Ġermanja jew butorphanol: Torbugesic Vet, 10 mg/mL, Zoetis, Parsippany, NJ, USA).F'każijiet ta' nuqqas ta' rispons għat-trattament, il-ħnieżer ġew ewtanizzati. Il-piżijiet tal-ġisem ġew imkejla kuljum, u ż-żieda fil-piż medju tal-ġisem espress bħala g/(kg.d), ġiet ikkalkulata skont il-formula: (piż fl-ewtanasja-piż mat-twelid)/(piż medju tal-ġisem × ħajja). Darbtejn kuljum, il-ħmieġ ġie mmarkat kif ġej: 1 (ħmieġ sod), 2 (ħmieġ artab/past), 3 (ħmieġ kremuż), u 4 (dijarea). Soluzzjoni ta 'elettroliti orali (Revolyte Nutrition) ingħatat bejn it-tmigħ f'każijiet ta' dijarea biex tiġi evitata d-deidrazzjoni. Antibijotiċi orali profilattiċi (metronidazole: Flagyl, 40 mg/mL, Sanofi-Aventis, Pariġi, Franza; amoxicillin, 500mg, b'aċidu clavulanic, 125 mg: Bioclavid, Sandoz GmbH, Kopenħagen, id-Danimarka; gentamicin: Gentocin Vet, 4.35 mg/mL , Scanvet, Fredensborg, id-Danimarka) ingħataw darbtejn kuljum minn Days 8-10, wara t-tneħħija tal-kateter arterjali umbilikali. L-istess taħlita ta' antibijotiċi orali ngħatat b'mod terapewtiku, fuq indikazzjoni. F'Jum 19, 60 min qabel l-ewtanasja, il-ħnieżer ingħataw l-aħħar bolus standardizzat tad-dieti rispettivi tagħhom. Il-ħnieżer ġew anestetizzati b'injezzjoni ġol-muskoli ta' zolazepam/tiletamine (Zoletil 50,25 mg/mL zolazepam u 25 mg/mL tiletamine, Virbac, Carros, Franza), ketamina (Ketaminol, 50 mg/mL, MSD Animal Health, Kenilworth, NJ). , USA) u butorphanol (Torbugesic Vet), u wara ġew ewtanizzati b'sodium pentobarbital (Euthanimal, 400 mg/mL, Scanvet) b'injezzjoni intrakardijaka. Immedjatament wara l-ewtanasja, l-organi interni ġew imqassma u jintiżnu, kemm organi sħaħ kif ukoll reġjuni speċifiċi ta 'organi (eż., stonku sħiħ/vojt, musrana ż-żgħira, kolon, moħħ sħiħ, reġjuni tal-moħħ, fwied, milsa, kliewi, pulmuni, u qalb). Il-frazzjoni tal-ilma ċerebrali ġiet stmata billi jintiżnu l-emisferu ċerebrali tax-xellug qabel u wara d-deidrazzjoni għal 14-il jum f'50 grad. Kull wieħed mill-ħames reġjuni gastrointestinali (istonku, imsaren iż-żgħir prossimali (Prox), musrana ż-żgħira tan-nofs (Nofs), musrana ż-żgħira distali (Dist), u kolon) ġew evalwati makroskopikament u assenjati punteġġ NEC [39]. Inġabru kampjuni tat-tessuti minn kull reġjun gastrointestinali u ġew iffriżati snap fin-nitroġenu likwidu jew iffissati f'4 fil-mija formaldehyde u maħżuna fi grad -80 sa aktar analiżi. Id-disinn u r-riżultati tal-istudju huma murija fil-Figura 1.
2.5. Struttura tal-Mukoża intestinali u Attivitajiet tal-Enżimi tal-Fruntiera tal-Brush
L-istruttura tal-mukoża fil-musrana ż-żgħira ġiet evalwata billi tkejjel l-għoli tal-villus u l-fond tal-kripta tal-flieli tal-istoloġija ta 'tessuti Prox, Mid, u Dist imwaħħla f'paraformaldehyde u mtebbgħin b'ematoxylin u eosin kif deskritt qabel [40]. Tbajja immunoistokimika għal Ki-67 ta' repliki tas-sezzjonijiet Prox, Mid, u Dist, intużat biex tiġi evalwata l-proliferazzjoni tal-enteroċiti fil-mukoża intestinali ż-żgħira kif deskritt qabel [41]. Erba 'immaġini ta' kull replika nkisbu b'mod sistematiku każwali bl-użu ta 'mikroskopju tad-dawl (Ortho-plane, Leitz, il-Ġermanja), imwaħħal ma' kamera u lenti oġġettiva 10×. L-analiżi tal-immaġini saret bl-użu ta’ Fiġi: Image](NIH Image, Bethesda, Maryland) u l-erja totali ta’ nuklei mtebbgħin Ki-67-pożittivi ġiet ikkalkulata bħala frazzjoni tal-erja totali tan-nuklei. L-attività ta '6 enzimi tal-fruntiera tal-pinzell (maltase, sucrase, lactase, aminopeptidase N (ABN), aminopeptidase A (APA), u dipeptidyl peptidase IV (DPPIV)) ġiet determinata f'omoġenati ta' nofs it-tessut bl-użu ta 'spettrofotometrija [42].
2.6.Bijokimika tad-Demm, Ematoloġija, u Immunità Sistemika
Kampjuni tad-demm għall-bijokimika u parametri ematoloġiċi ġew analizzati f'Jum 1 mill-kurdun taż-żokra waqt C-section, f'Jum 8 minn kateteri arterjali umbilikali privattivi, jew alternattivament il-vina ġugulari, u f'Jum 19 minn titqib kardijaku waqt l-ewtanasja. Plażma għall-bijokimika miksuba minn vacutainer tad-demm eparinizzat (BDDiagnostics, Oxford, UK) segwit minn ċentrifugazzjoni (2500 × g, 4 grad għal 10 min) ġiet analizzata bl-użu tas-Sistema tal-Kimika ADVIA 1800 (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Ġermanja). Demm sħiħ għall-ematoloġija u l-għadd taċ-ċelluli immuni miksuba minn vacutainer tad-demm miksi b'EDTA (BD Diagnostics), ġew analizzati bl-użu tas-Sistema Ematoloġija ADVIA 2120i (Siemens Healthcare GmbH).
Assaġġi relatati mal-immunità sistemika biex jiġu studjati s-sottogruppi taċ-ċelluli T tad-demm, il-funzjoni tal-fagoċitożi tan-newtrofili, u l-kompetenzi immuni permezz ta’ stimulazzjoni tar-riċettur Toll-like (TLR) tad-demm ex vivo saru fuq kampjuni sħaħ tad-demm miġbura f’vacutainer tad-demm eparinizzat (BD Diagnostics) fuq żewġ jiem; Jum 8 minn kateteri arterjali umbilikali jew alternattivament il-vina ġugulari u Jum 19 mill-vina ġugulari. Il-karatterizzazzjoni tas-sottosett taċ-ċelluli T tad-demm kienet imkejla kif deskritt qabel [43]. Fil-qosor, l-eritroċiti ġew lysed bl-użu ta 'soluzzjoni ta' 1 X BD FACS Lysing (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) u lewkoċiti ġew inkubati b'buffer ta 'fissazzjoni / permeabilizzazzjoni (Invitrogen, Carlsbad, California) għal 30 min fi 4 gradi fid-dlam. Wara l-ħasil b'buffer ta 'permeabilizzazzjoni (Invitrogen), iċ-ċelloli ġew imblukkati bis-serum tal-ħnieżer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) għal 15 min 4 grad fid-dlam u sussegwentement imtebbgħin b'erba' antikorpi monoklonali ttikkettjati b'mod fluworexxenti; PE-Cy7-antikorp CD3 konjugat tal-ġurdien kontra l-majjal (klonu BB23-8E{6-8C8, BD Biosciences), antikorp CD4 tal-ġrieden konjugat kontra l-majjal FITC (klonu MIL17, Bio- Rad Laboratories, Hercules, California), antikorp CD8 tal-ġrieden kontra l-majjal konjugat PE (klonu MIL12, Bio-Rad Laboratories) u antikorp FOXP3 tal-firien konjugat bl-APC (klonu JFK-16s, ThermoFisher Scientific). Il-kampjuni ġew analizzati bl-użu ta’ ċitometru tal-fluss BD Accuri C6 (BDBiosciences) u popolazzjonijiet ta’ ċelluli T (CD3 flimkien ma’ limfoċiti), ċelluli T ċitotossiċi (CD3 flimkien ma’ CD4-CD8 flimkien ma’ limfoċiti), ċelluli T helper( Ġew identifikati CD3 flimkien ma' CD4 flimkien ma' CD8-limfoċiti) u ċelluli T regolatorji (CD3 plus CD4 u FoxP3 flimkien ma' limfoċiti). nm) Kit ta' Fagoċitożi tal-Bijopartiċelli għal Ċitometrija tal-Fluss (ThermoFisher Scientific)34]. Ir-rata fagoċitika kienet indikata mill-perċentwali ta 'newtrofili li jeżerċitaw fagoċitosi fil-popolazzjoni ta' newtrofili (pHrodo plus) u l-kapaċità fagoċitika tan-newtrofili kienet indikata mill-intensità fluworexxenti medjana (MFI). Biex jiġi vvalutat ir-rispons infjammatorju sistemiku għal Gram- ex vivo. sfida batterjali negattiva, 294 μL demm sħiħ ġie inkubat b'agonist TLR4 （lipopolysaccharide (LPS), E.coli O127: B8, Sigma Aldrich, St.Louis, MI, USA) għal 5 sigħat f'37 grad, 5 fil-mija CO,. Demm stimulat u mhux stimulat imbagħad ġie ċentrifugat f'2000 × g, 4 gradi għal 10 minuti, u s-supernatanti tal-plażma ġew analizzati għall-fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNF) - u Interleukin (IL)-10 minn ELISA (Kits ta' Duoset Speċifiku tal-Ħnieżer, R&D Systems, Abingdon, UK), wara l-linji gwida tal-manifattur. Il-kampjuni tal-plażma ġew dilwiti 2-2.5 darbiet qabel l-analiżi. Kampjuni biss b'livelli ta' assorbiment taċ-ċitokini fil-medda standard ġew inklużi għall-kalkolu tal-livelli u l-proporzjonijiet medji taċ-ċitokini. Madankollu, kampjuni b'livelli ta 'assorbiment taċ-ċitokini taħt l-istandard l-aktar baxx iżda ogħla mill-vojt ingħataw valur arbitrarju ta' nofs l-inqas livell misjub fil-pjanċa u inklużi fl-analiżi statistika.
2.7. Żvilupp Bikri tal-Mutur, Imġieba, u Konjizzjoni
Iż-żmien għall-ewwel toqgħod u l-ewwel mixja wara t-twelid tkejjel bħala stimi tal-akkwist tal-ħiliet bażiċi tal-mutur. Kameras infra-aħmar sensittivi għall-moviment installati fuq kull gaġġa tad-dar kienu qed jirreġistraw kontinwament l-attività tal-mutur tal-ħnieżer mill-Jum 1 f'21:00 pm meta l-ħnieżer ġew irkuprati għal kollox mill-anestetiċi materni sa Jum 11[33]. Il-proporzjon medju tal-ħin attiv matul siegħa ġie kkalkulat minn reġistrazzjonijiet ta' 12-intervalli ta' sigħat matul il-ġurnata (9:00 am sa 9:00 pm) u bil-lejl (minn 9:{{12} }} pm sa 9:00 am).L-imġieba esploratorja ta’ kull ħanżir ġiet evalwata f’Jum 9 f’arena ta’ għalqa miftuħa (1.2 m×1.2 m) b’vidjokamera li tirrekordja minn ħarsa ta’ għasfur waqt {{ 20}}min perjodu ta 'reġistrazzjoni bil-ħnieżer f'ordni każwali. Il-ħnieżer ġew assenjati punteġġ ġenerali f'ħin reali minn żewġ osservaturi blinded ibbażati fuq erba 'parametri oġġettivi: kuntatt ma' l-art, kuntatt mal-ħajt, tentattivi ta 'ħarba, u numru ta' mixi. Il-vidjows akkwistati ġew sussegwentement analizzati bl-użu ta 'EthoVision XT10 (Noldus Information Technology, Wageningen, l-Olanda). Ir-riżultati kienu d-distanza totali mċaqalqa u l-veloċità kkalkulata għal kull ħanżir. Wara żvilupp viżwali adegwat u perjodu ta 'drawwa, il-konjizzjoni spazjali ta' kull ħanżir ġiet evalwata f'ordni każwali matul Jiem 12-18, bl-użu tat-test ta 'konjizzjoni spazjali T-maze standardizzat [44]. It-tagħlim u l-memorja dipendenti fuq l-ippokampu ġew ittestjati waqt 1-2 akkwisti kuljum, kull wieħed jikkonsisti f'10 provi. Ġew applikati indikazzjonijiet viżwali extra-labirint biex il-ħnieżer jinnavigaw biex isibu premju fiss tal-ħalib. Intużaw pożizzjonijiet tal-bidu li jalternaw tal-ħnieżer biex jiġu evitati mekkaniżmi ta 'rispons ego-centric u l-ħalib tqiegħed fiż-żewġ fergħat tal-premju. Biex jaħbu s-sinjali tax-xamm, il-ħalib kien għalkemm aċċessibbli biss f'wieħed mill-armi. In-numru ta' għażliet korretti għal kull akkwist ġie rreġistrat matul fażi standard (Akkwisti 1-6, Jiem 12-17) u fażi ta' treġġigħ lura (Akkwisti 7-9, Jiem 17-18). Fil-fażi ta 'treġġigħ lura, il-premju tal-ħalib inbidel għad-driegħ oppost. Minimu ta' 80 fil-mija għażliet korretti (8 għażliet korretti minn 10 provi) ġew definiti bħala l-kriterju tat-tagħlim [30].
2.8. Analiżi Statistika
Is-softwer statistiku R (verżjoni 3.6.0) intuża għall-analiżi statistiċi kollha. Għall-assaġġ antibatteriku, id-differenzi fit-tkabbir ta' S. fost is-6 dieti tat-test u l-formula tat-trabi matul 2-24 siegħa ta' inkubazzjoni, ġew analizzati bl-użu ta' mudell lineari b'effetti mħallta (funzjoni Ime) b'doża ta' inokulazzjoni, ħin, u dieta tat-test /formula bħala effetti fissi (inkluża l-interazzjoni bejn l-aħħar tnejn) u l-perjodu sperimentali bħala effett każwali, segwit minn paraguni f'pari f'kull punt ta 'żmien (ls tfisser pakkett). Kejl kontinwu ripetut mill-istudju tal-majjal (jiġifieri, piż tal-ġisem, attività tal-gaġġa fid-dar, għażliet korretti fit-test tal-konjizzjoni spazjali T-maze, u parametri intestinali żgħar imkejla f'diversi reġjuni) ġew analizzati bl-użu ta' mudell lineari b'effetti mħallta (funzjoni me) inkluża l-istruttura ta 'korrelazzjoni xierqa u l-ħanżir bħala effett każwali. Il-pakkett iffaċilita paraguni sussegwenti f'kull reġjun intestinali ż-żgħir. Mudell ta' periklu proporzjonali Cox (funzjoni) intuża għal data kontinwa ta' żmien sal-avveniment (jiġifieri, l-akkwist ta' ħiliet bażiċi tal-mutur u l-ewwel darba li tippreżenta dijarea). Id-dejta kontinwa l-oħra kollha ġiet analizzata bl-użu ta 'mudell ta' rigressjoni lineari multipla (funzjoni lm). Il-korrezzjoni Holm ġiet applikata għad-dejta kollha tal-bijokimika tad-demm biex tikkoreġi għal testijiet ta 'tqabbil multiplu u tikkontrolla r-rata ta' żball għall-familja. Dejta diskreta taż-żmien sal-avveniment (jiġifieri, il-perċentwal ta 'ħnieżer li laħqu l-kriterju ta' tagħlim T-maze) ġew analizzati bl-użu ta 'mudell ta' rigressjoni lineari multipla ġeneralizzata (funzjoni) b'rispons binomjali u rabta log-log kumplimentari. Is-sess, iż-żibel u l-piż tat-twelid ġew identifikati bħala fatturi ta’ konfużjoni potenzjali bijoloġikament rilevanti qabel l-istudju u għalhekk inklużi bħala effetti fissi fil-mudelli kollha msemmija hawn fuq. Barra minn hekk, għall-bijokimika tad-demm u l-parametri ematoloġiċi kollha, il-livelli tal-linja bażi mkejla f'Jum 1 qabel ir-randomization tal-grupp ġew inklużi bħala effetti fissi fil-mudelli ta 'rigressjoni lineari multipla korrispondenti. Il-validazzjoni tal-mudell ta 'mudelli ta' rigressjoni lineari saret permezz ta 'wirjiet grafiċi tan-normalità u l-omoscedastiċità tar-residwi u l-valuri mwaħħla, u t-trasformazzjonijiet tad-dejta (log jew sqrt) biex jissodisfaw dawn is-suppożizzjonijiet, saru jekk meħtieġ. Għal varjabbli li ma setgħux jikkonformaw ma' distribuzzjoni normali, ġie applikat it-test Mann-Whitney mhux parametriku. Mudelli ta 'rigressjoni b'varjabbli ta' rispons kategoriku ġew ivvalidati billi ġew investigati r-residwi kumulati bl-użu tat-test tal-adegwatezza (tal-pakkett). Sakemm ma jkunx iddikjarat mod ieħor, id-dejta mhux ipproċessata hija ppreżentata bħala mezzi ± SD u p-valuri<0.05 are="" considered="" statistically="">
3. Riżultati
3.1.Assaġġ Antibatteriku In Vitro
L-effetti tal-ħalib bovin xkumat supplimentat b'OPN f'konċentrazzjonijiet differenti, fuq it-tkabbir u l-vijabbiltà ta 'S., ġew evalwati u mqabbla mal-formula tat-trabi. Wara 4, 6, u 24 siegħa ta' inkubazzjoni bil-formula tat-trabi, il-konċentrazzjoni ta' S. żdiedet b'madwar 10,50 u 1 × 10 plus -darbiet, rispettivament, għaż-żewġ dożi ta' inokulazzjoni (10) u 10 gradi FU ). Ma kien hemm l-ebda differenzi bejn is-6 dieti tat-test u l-formula qabel 4 sigħat ta 'inkubazzjoni bid-doża ta' inokulazzjoni ta '105 CFU (Figura 2). Madankollu, effett batteriċida apparenti tad-dieti tat-test ibbażati fuq il-ħalib bovin kien evidenti meta mqabbel mal-formula tat-trabi, peress li l-konċentrazzjoni ta 'S. baqgħet statika f'dawn matul 1-4 sigħat ta' inkubazzjoni. F'4 sigħat ta 'inkubazzjoni, wara l-istess doża ta' inokulazzjoni, l-għadd ta 'batterji kienu aktar baxxi fis-6 dieti tat-test kollha meta mqabbla mal-formula (madwar 10 darbiet, p < 0.01).="" is-supplimentazzjoni="" tal-opn="" eżerċitat="" effetti="" batterjostatiċi="" fit-tul="" dipendenti="" fuq="" id-doża="" kontra="" s.="" peress="" li="" l-għadd="" ta'="" batterji="" wara="" 6="" sigħat="" ta'="" inkubazzjoni="" kienu="" aktar="" baxxi="" b'mod="" sinifikanti="" fid-dieti="" tat-test="" li="" kien="" fihom="" l-ogħla="" 4="" dożi="" opn=""><0.05,10>doża tat-tilqim). Ħalib bovin xkumat mhux supplimentat biss tilef momentarjament il-kapaċità tiegħu li jipprevjeni t-tkabbir tal-batterja meta inkubat għal 6 sigħat (doża ta' tilqim ta' 105 CFU). F'24 siegħa ta' inkubazzjoni, l-għadd ta' batterji kienu aktar baxxi fis-6 dieti tat-test kollha meta mqabbla mal-formula (p<001, 105="" cfu="" inoculation="" dose).="" all="" 6="" test="" diets="" exerted="" bacterial="" inhibitory="" effects="" (initially="" bactericidal)="" against="" s.,="" inoculated="" at="" 10°cfu,="" at="" all="" tested="" time=""><2 h="" of="" incubation=""><0.07,>2 sigħat ta' inkubazzjoni p<>
3.2. Riżultati Kliniċi u ta' Tkabbir
Seba' ħnieżer (5/21 OPN meta mqabbla ma' 2/21 CON, p=0.4) mit-42 ħanżir ġew ewtanizzati/mietu bħala konsegwenza ta' kumplikazzjonijiet relatati mal-immaturità/jatroġeniċi fil-bidu tal-esperiment(
3.3. Struttura u Funzjoni tal-musrana
L-għoli tal-villus u l-fond tal-kripta, evalwati fil-partijiet prossimali, tan-nofs u distali tal-musrana ż-żgħira kienu simili bejn iż-żewġ gruppi (Tabella 2). Meta mqabbel ma' CON, proporzjon ogħla ta' villus għal kripta fit-tliet reġjuni intestinali ż-żgħar kien imkejjel f'OPN (p<0.05, figure="" 4a).="" similar="" amounts="" of="" proliferative="" enterocytes="" were="" observed="" between="" the="" two="" groups,="" indicated="" by="" the="" same="" relative="" area="" of="" ki-67="" positive="" stained="" nuclei="" in="" the="" three="" small="" intestinal="" regions="" (figure="" 4b,="" c).="" further,="" the="" gastric="" emptying="" ability="" indicated="" by="" the="" gastric="" content="" weights="" at="" euthanasia="" as="" well="" as="" the="" activity="" of="" lactase,="" maltase,="" sucrase,="" apa,="" abn,="" and="" dppiv="" measured="" in="" the="" middle="" part="" of="" the="" small="" intestine="" were="" comparable="" between="" the="" groups="" (table="">
3.4. Bijokimika tad-Demm, Ematoloġija, u Immunità Sistemika
Kampjuni tad-demm tal-kurdun urew għadd totali ogħla ta’ lewkoċiti u basofili fl-1 Jum (p<0.05)of pigs="" later="" assigned="" the="" opngroup="" relative="" to="" pigs="" assigned="" the="" con="" group.="" no="" other="" immune="" cell="" counts,="" blood="" biochemistry,="" or="" hematology="" variables="" differed="" between="" the="" two="" groups="" prior="" to="" receiving="" their="" specific="" dietary="" interventions(data="" not="" shown).="" blood="" biochemistry="" variables="" measured="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" differ="" between="" groups(table="" s1,="" supplementary="" materials),="" and="" accompanied="" hematology="" parameters="" and="" immune="" cell="" counts="" are="" presented="" in="" table="" 3.="" compared="" with="" con="" pigs,="" opn="" pigs="" had="" a="" higher="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" on="" day=""><0.05, figure="" 5a,="" b).="" the="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" increased="" from="" day="" 8="" to="" day="" 19,="" with="" no="" final="" differences="" between="" the="" groups(figure="" 5a,="" b).="" the="" remaining="" immune="" cell="" counts="" and="" nonimmune-related="" hematological="" parameters="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" pigs="" (table="" 3).="" innate="" and="" adaptive="" immune="" parameters="" were="" evaluated="" on="" days8="" and="" 19.="" on="" day="" 8,="" the="" blood="" neutrophil="" phagocytic="" rate="" and="" capacity="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" (table="" 3).="" conversely,="" on="" day="" 19="" they="" had="" a="" higher="" frequency="" of="" neutrophils="" exerting="" phagocytosis="" compared="" with=""><0.05). the="" phagocytic="" capacity="" was="" though="" not="" different="" between="" groups="" (figure="" 5c,="" d).="" the="" t-cell="" subset="" characterization="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" reveal="" any="" differences="" between="" t="" helper="" cells,="" cytotoxic="" t="" cells,="" and="" regulatory="" t="" cells="" in="" the="" two="" groups="" (table="" 3).="" a="" representative="" facs="" gating="" is="" shown="" in="" figure="" s1,="" supplementary="" materials.="" the="" tlr4-mediated="" il10="" and="" tnf-α="" cytokine="" production="" of="" full="" blood="" from="" days="" 8="" and="" 19="" was="" evaluated.="" tnf-α="" and="" il10="" were="" detected="" at="" similar="" levels="" between="" opn="" and="" con="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 8="" and="" there="" were="" no="" group="" differences="" in="" the="" response="" to="" lps="" stimulation="" indicated="" by="" a="" similar="" tnf-α/il10="" ratio(table="" s2,="" supplementary="" materials).="" tnf-α="" was="" not="" detectable="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 19="" from="" either="" group.="" however,="" both="" groups="" responded="" equally="" to="" lps="" stimulation,="" indicated="" by="" similar="" tnf-α="" and="" il-10="" plasma="" levels="" (table="" s2,="" supplementary="">
3.5. Riżultat Strutturali u Funzjonali tal-Moħħ
Riżultati strutturali relatati mal-moħħ inklużi l-valuri assoluti u relattivi tal-piż totali tal-moħħ, il-piżijiet reġjonali tal-moħħ, u l-kontenut tal-ilma ċerebrali kienu simili bejn il-gruppi OPN u CON (Tabella 4). Ma ġew osservati l-ebda differenzi fl-iżvilupp bikri tal-mutur, peress li l-ħin għall-ewwel toqgħod, l-ewwel mixja, u l-ewwel teħid volontarju ta’ bolus sħiħ tal-ħalib kif ukoll il-proporzjon tal-ħin attiv fil-gaġeġ tad-dar tkejlu minn kameras sensittivi għall-moviment minn Jiem { {3}}, kienu simili bejn OPN u CON (Figura 6A-D). L-imġieba esploratorja tal-majjal evalwata fl-arena tal-kamp miftuħ f'Jum 9 kienet komparabbli bejn iż-żewġ gruppi, peress li l-punteġġ ġenerali, id-distanza totali mċaqalqa u l-veloċità kienu simili (Tabella 4). Barra minn hekk, prestazzjoni konjittiva simili kienet osservata matul il-fażi standard u treġġigħ lura fit-test tal-konjizzjoni spazjali T-maze mwettqa fuq akkwisti 9 minn jiem 12-sa 18 (Figura 7A, B). Il-proporzjon medju ta 'għażliet korretti matul iż-żmien żdied għaż-żewġ gruppi fiż-żewġ fażijiet (Figura 7A). Fil-fażi standard, kemm OPN kif ukoll CON laħqu l-kriterju ta' tagħlim predefinit fuq Akkwist 5 (80 fil-mija għażliet korretti, Figura 7A). Il-ħnieżer kollha laħqu l-kriterju tat-tagħlim, u ma kien hemm l-ebda differenza fiż-żmien meħud biex jintlaħaq il-kriterju tat-tagħlim (Figura 7B).
4. Diskussjoni
L-effetti multifunzjonali ta 'OPN, partikolarment f'termini ta' attività proliferattiva, regolatorja immuni u anti-batterika, iżda potenzjalment ukoll fl-appoġġ għall-iżvilupp tal-moħħ, jistgħu jgħinu biex itejbu s-saħħa u l-iżvilupp tal-organi ta 'trabi tat-twelid u trabi sensittivi. Il-livelli għoljin ta' OPN fil-ħalib uman bikri u l-konċentrazzjonijiet korrispondenti fil-plażma ta' OPN tat-trabi huma favur provvista suffiċjenti ta' OPN fil-perjodu tat-twelid immedjat meta t-trabi jingħataw ħalib uman [5]. Għall-kuntrarju, il-konċentrazzjoni aktar baxxa ta 'OPN fil-ħalib bovin u l-formuli tat-trabi 4 tipprovdi tieqa ta' opportunità biex jiżdied il-kontenut OPN tal-formuli tal-ħalib, u supplimentazzjoni b'OPN tista 'tgħin biex tnaqqas id-differenzi ta' żvilupp li jeżistu bejn il-ħalib mitmugħ bil-formula u l-ħalib matern. -trabi mitmugħa [2,3]. F'dan l-istudju, urejna li s-supplimentazzjoni ta 'OPN għal dieta ta' ħalib tal-bovini b'kontenut bażali ta 'OPN kienet tollerata tajjeb, iżda kien osservat biss titjib minuri fl-istruttura tal-imsaren u l-immunità sistemika, u ma ġew osservati l-ebda effetti ulterjuri fuq l-istruttura u l-funzjoni tal-moħħ. Il-bażi tal-ħalib bovin ntgħażlet biex tiżgura dieta bażi bijoattiva rilevanti meta mqabbla ma 'formula tal-ħalib, li minbarra l-kontenut aktar baxx ta' OPN għandha wkoll bijoattività mnaqqsa. Ħalib OPN huwa rikonoxxut bħala proteina tax-xorrox bijoloġikament attiva importanti, prinċipalment minħabba l-kapaċità tagħha li timmodula l-immunità u tistimula l-proliferazzjoni taċ-ċelluli [18,45]. Il-kapaċità ta 'OPN li jifforma kumplessi mal-lactoferrin iċċarġjat b'mod pożittiv li jinsab fil-ħalib tista' żżid aktar proprjetajiet funzjonali biex tikkontribwixxi għad-difiża kontra l-patoġeni fl-imsaren tat-trabi [10]. Il-kumpless OPN-lactoferrin jinsab fil-ħalib uman u tal-bovini, iżda jista 'jkun iffurmat ukoll mill-proteini individwali [10]. Biex niddokumentaw il-potenzjal bijoattiv ta 'OPN f'dieta bbażata fuq il-ħalib bovin, inizjalment ittestjajna l-kapaċità antibatterika in vitro ta' ħalib bovin OPN miżjud f'konċentrazzjonijiet differenti għal ħalib sterili xkumat Jersey. Ir-riżultati tagħna juru li d-dieti tal-ħalib supplimentati bl-OPN jeżerċitaw kapaċità antibatterika kemm għal żmien qasir kif ukoll fit-tul b'mod dipendenti fuq id-doża billi jinibixxu t-tkabbir ta 'S.epidermidis, patoġenu tat-twelid komuni li jikkawża sepsis li tibda tard wara t-traslokazzjoni tal-musrana [46,47] ]. Dan jipprovdi opportunità biex jistimula l-iżvilupp tal-imsaren permezz ta 'supplimentazzjoni OPN tad-dieta tal-ħalib tat-twelid. Il-livelli ottimali ta 'OPN fid-dieta fid-dieti bbażati fuq il-ħalib mhumiex ċari, u l-varjabbiltà tal-kontenut ta' OPN fil-ħalib uman hija kbira, kemm bejn l-ommijiet, u l-pajjiżi, kif ukoll matul il-perjodu tat-treddigħ [7. Studji preċedenti fuq l-annimali investigaw b'mod predominanti l-effetti taż-żieda ta 'OPN ma' dieta ta 'kontroll mingħajr OPN, f'livelli komparabbli mal-kontenut medju tal-ħalib uman [14,22,24]. F'dan l-istudju prekliniku tal-ħnieżer, iffukajna fuq l-aspett kliniku rilevanti taż-żieda ta 'aktar OPN ma' dieta b'livell bażali ta 'OPN biex nilħqu livelli għoljin ta' ħalib uman. Is-supplimentazzjoni OPN f'dan l-istudju żiedet id-doża ta 'kuljum ta' OPN għal doża li tirrappreżenta l-konsum fi trabi minn ommijiet b'konċentrazzjoni relattivament għolja ta 'ħalib OPN, u ħafna lil hinn minn dak li normalment jiġi riċevut mill-formula tat-trabi[4]. Il-kontenut OPN fil-ħalib Jersey miġbur irriżulta li kellu kontenut OPN ogħla minn dak imkejjel qabel fil-ħalib bovin. Huwa ta' rilevanza li wieħed jinnota li l-metodu LC-MS/MS użat huwa differenti mill-metodu ELISA użat fi studji preċedenti [48]. In-nuqqas ta 'effetti konjittivi fl-istudju attwali jista' jinsab fil-fatt li l-ħnieżer ta 'kontroll diġà jirċievu OPN f'konċentrazzjonijiet ta' 91 mg / L, kif intrinsikament preżenti fil-ħalib Jersey, u s-supplimentazzjoni OPN addizzjonali ma tagħti l-ebda benefiċċji addizzjonali. Sibna li s-supplimentar tal-ħalib tal-ifrat b'OPN kien ittollerat tajjeb u kkonferixxi effetti minuri fuq l-imsaren u l-maturazzjoni immuni, filwaqt li l-parametri strutturali u funzjonali tal-moħħ ma nbidlux. Kemm il-ħnieżer OPN kif ukoll il-CON urew rati ta' tkabbir komparabbli ma' jew ogħla minn dak li huwa normalment osservat fi qżieqeż qabel iż-żmien fi studji simili b'dieti tal-ħalib tal-ifrat [49-51]. Ir-rati ta 'tkabbir u l-istatus kliniku relattivament tajjeb b'punteġġ NEC baxx miksub f'dawn il-ħnieżer qabel iż-żmien, ipprovdew kundizzjonijiet ottimali biex jiddokumentaw l-effetti tad-dieta fuq bidliet fil-funzjonijiet tal-organi u l-iżvilupp konjittiv tal-moħħ fi trabi tat-twelid sensittivi.
Hemm xebh għoli bejn is-sekwenzi OPN tal-bniedem, tal-baqra u tal-majjal [52], u n-natura kullimkien tal-OPN hija stabbilita sew fil-ħnieżer. OPN huwa espress minn varjetà ta 'tessuti porċini b'saħħithom bl-akbar abbundanza misjuba fit-tessut ileali [53], iżda l-konċentrazzjonijiet tal-ħalib tal-ħnieżer mhumiex magħrufa. Preċedentement urejna effetti minuri ta 'benefiċċju fuq l-imsaren ta' formula arrikkita b'OPN fi qżieqeż qabel iż-żmien b'rabta mal-irkupru minn infjammazzjoni prenatali [43]. Flimkien, dan jenfasizza l-użu tal-qżieqeż bħala mudell prekliniku biex jinvestiga l-effetti tas-supplimentazzjoni tad-dieta OPN. Relattivament għal CON, il-ħnieżer OPN kellhom proporzjon ogħla villus-to-crypt madwar il-musrana ż-żgħira. Differenza morfoloġika simili kienet irrappurtata abbażi ta' kampjuni duwodenali minn 10-frieħ tal-ġrieden ta' ġurnata mreddmin minn digi tat-tip selvaġġ jew digi knock-out OPN supplimentati b'OPN tal-ħalib tal-ifrat relattiv għal frieħ tal-ġrieden li ma jirċievu ebda OPN[22]. Studji preċedenti tal-ħnieżer qabel iż-żmien ikkorrelataw għoli ta' villus miżjuda ma' kapaċità mtejba ta' assorbiment ta' nutrijenti ta', eż., galactose [51,54], li jista' jkun kritiku biex jiġi żgurat l-aħjar tkabbir. Bl-użu tal-linja taċ-ċelluli tal-ħnieżer IPEC-J2 qabel urejna in vitro l-abbiltà tal-OPN li jżid il-proliferazzjoni taċ-ċelluli b'mod dipendenti mid-doża [43]. L-istruttura mtejba tal-mukuża intestinali grossa osservata fost il-ħnieżer OPN fl-istudju attwali ma setgħetx tiġi spjegata minn żieda fl-enteroċiti proliferattivi bbażati fuq it-tbajja 'Ki-67 fil-musrana ż-żgħira u ma rriżultatx f'attivitajiet ta' enżimi diġestivi mibdula. Sejbiet preċedenti fix-xadini rhesus tat-twelid supplimentati bil-formula OPN, urew bidliet intestinali bi profili ta 'espressjoni tal-ġeni jejunal li huma aktar simili għall-kontropartijiet ireddgħu [12]. L-istess trajettorja ta 'żvilupp rigward l-għadd taċ-ċelluli immuni kienet osservata fil-ħnieżer OPN u CON. Iċ-ċelluli immuni kollha, minbarra l-għadd tal-bażofili u l-eosinofili, b'livelli simili baxxi fil-ħnienes fit-tul [34], żdiedu fin-numru minn Jum 8 sa Jum 19, li jindika kapaċità mtejba taż-żewġ gruppi biex itellgħu rispons immuni suffiċjenti għal patoġenu potenzjali. Il-livelli ta’ monoċiti u limfoċiti li jiċċirkolaw tal-ħnieżer OPN f’Jum 8 kienu ogħla meta mqabbla mal-ħnieżer CON iżda mhux f’Jum 19. Peress li l-kundizzjoni klinika kienet simili bejn il-ħnieżer fiż-żewġ gruppi u NECscores baxxi, il-livelli ta’ monoċiti u limfoċiti probabbilment huma prinċipalment relatati mat-trattament effetti u jissuġġerixxu żvilupp immuni aċċellerat fil-ħnieżer OPN. Proporzjon ogħla ta’ monoċiti li jiċċirkolaw kien osservat ukoll fi prova kkontrollata randomised ta’ trabi ta’ sitt xhur li kienu qed jirċievu formuli b’OPN ta’ ħalib bovin miżjud f’konċentrazzjonijiet ta’ 65 mg/L u 135 mg/L, relattiv għall-kontrolli mreddgħu [55]. OPN huwa kapaċi jinteraġixxi maċ-ċelloli immuni permezz tar-riċettur tiegħu u jaġixxi bħala aġent kimotattiku għal monoċiti attivati mill-IL-1-, li jistgħu jkunu fiżjoloġikament rilevanti waqt l-infjammazzjoni [16]. L-OPN jista' jkompli jkollu rwol fl-immunità intrinsika billi jimmedja l-fagoċitożi permezz tar-riċettur tal-integrin, ox 2, espress fuq il-wiċċ tal-monoċiti [16]. Għad iridu jiġu investigati aktar studji li jinvestigaw ir-rwol tal-OPN fuq il-funzjoni tal-monoċiti u kif dan jissarraf f'benefiċċju għat-trabi mitmugħa bil-formula.
Karatterizzazzjoni tas-sottosett taċ-ċelluli T saret fil-Jiem 8 u 19 biex tiddeskrivi aktar il-popolazzjoni tal-limfoċiti iżda ma żvelat l-ebda differenza fil-frazzjonijiet tas-sottosett bejn iż-żewġ gruppi f'dan il-perjodu tat-twelid immedjat. Trabi li rċevew formula tat-trabi supplimentata b'OPN (65 jew 130 mg/L), urew proporzjon akbar ta' ċelluli T fl-ewwel sitt xhur tal-ħajja meta mqabbla ma' dik il-formula bażali mitmugħa [55]. Dan ir-rispons jista 'ma jkunx żviluppat diġà fl-ewwel ġimgħat ta' ħajja, jew il-livell relattivament għoli ta 'OPN fil-ħalib tal-bovini bażi tagħna (91 mg/L) jista' jillimita aktar bidliet. In-numru ta 'ċelluli T, ċelluli T helper u ċelluli T ċitotossiċi ma kinux differenti bejn OPN u CON, u għalhekk ma jistgħux jispjegaw id-differenzi fil-limfoċiti li jiċċirkolaw bejn iż-żewġ gruppi f'Jum 8. F'dan l-istudju, aħna mtebbgħin għal CD3, CD4, CD8, u Foxp3, u għad irid jiġi investigat jekk l-għadd ogħla ta’ limfoċiti jistax ikun joriġina minn għadd ogħla ta’ ċelluli B jew numru akbar ta’ ċelluli naturali killer. Il-maturazzjoni tal-immunità sistemika wara t-twelid tinkludi bidla fil-bilanċ Th1/Th2, fejn id-difiża kontra infezzjonijiet batteriċi titlob skewing Th1 [17]. OPN huwa kimoattrattant qawwi bi proprjetajiet simili għal ċitokini u huwa magħruf li jirregola l-bilanċ Th1/Th2 [18]. F'dan l-istudju, il-bilanċ Th1/Th2 ftit wara t-twelid ma kienx modulat mid-dieta indikata minn proporzjon simili ta' TNF-/IL10 f'Jum 8. Billi l-livelli ta' TNF-o ma nstabux f'kampjuni tal-plażma mhux stimulati minn Jum 19, it-TNF-/IL10 proporzjon f'dan il-punt ma setax jiġi kkalkulat. Riċentement, studji li jużaw mudelli ta 'annimali [14,22,24] investigaw ir-rwol tal-ħalib OPN fin-newrożvilupp matul it-tfal. Bl-użu ta' mudell ta' ġurdien knockout OPN, ħalib b'livelli OPN simili għal ħalib uman intwera li jtejjeb l-iżvilupp tal-ħiliet tal-mutur u l-abbiltajiet tal-memorja li jiddependu mill-hippocampus fi 30-frieħ tal-ġurdien ta' jum meta mqabbel ma' kontrolli defiċjenti ta' OPN tad-dieta. Dawn ir-riżultati funzjonali tal-moħħ ta 'OPN relatati mal-ħalib tad-dieta kienu marbuta ma' livelli mtejba ta 'OPN endoġenu tal-moħħ u proliferazzjoni u differenzjazzjoni ogħla ta' ċelloli tan-nervituri/antiġen glial żewġ ċelloli f'oligodendroċiti li jwasslu għal espressjoni akbar ta 'proteini relatati mal-mjelina. F'sistema sperimentali simili, frieħ tal-ġrieden tat-tip selvaġġ mredda minn digi knockout OPN u mogħtija ħalib bovin supplimentari OPN (12 ug/g) urew kapaċità ta 'memorja akbar minn kontrolli mhux supplimentati [22]. B'mod kollettiv, dawn ir-riżultati jindikaw li l-OPN tal-ħalib għandu rwol importanti fl-iżvilupp newrokognittiv u li l-OPN tal-ħalib tal-bovini jista 'jeżerċita tali effetti ta' benefiċċju fuq l-ispeċijiet kollha. Sibna żvilupp simili fl-akkwist tal-ħiliet bażiċi tal-mutur, l-attività tal-gaġġa tad-dar, u l-imġieba esploratorja fl-arena tal-kamp miftuħ bejn il-gruppi. Prestazzjonijiet tal-grupp fit-test spazjali T-maze indikaw aktar tagħlim u memorja dipendenti fuq l-ippokampus simili u b'hekk abbiltajiet konjittivi. Is-sejbiet tagħna huma skond studju li sar reċentement li qabbel ħnieżer tul ta' jumejn li jirċievu dieta ta' formula bbażata fuq il-proteina tas-sojja li ma fiha l-ebda OPN jew supplimentata b'250 mg/L ta' ħalib bovin OPN [24]. Kienu evidenti biss differenzi fl-imġieba limitati bejn iż-żewġ gruppi evalwati waqt kompitu ġdid ta’ rikonoxximent ta’ oġġetti mwettqa f’Jum 30 ta’ wara t-twelid. Dan jimplika li għall-inqas f’ħnieżer b’saħħithom u mwielda fit-tul, is-supplimentazzjoni tal-ħalib OPN ma tkomplix ittejjeb l-iżvilupp relatat mal-moħħ kif imkejjel minn rikonoxximent ta' oġġett ġdid. Simili għat-test spazjali tat-T-maze [44], il-kompitu ġdid ta’ rikonoxximent tal-oġġett huwa kkunsidrat dipendenti mill-hippocampus, u għalhekk dawn it-testijiet tal-imġieba jistgħu jkunu aktar sensittivi eqreb lejn iż-żmien tar-rati massimi ta’ tkabbir tal-ippocampus, li fit-terminu jseħħu ħnieżer irġiel u nisa. bejn wieħed u ieħor wara t-twelid Ġimgħat 8 u 3, rispettivament [56]. Mhux magħruf jekk it-titjib konjittiv fit-tul wara supplimentazzjoni tal-ħalib OPN fil-ħajja bikrija, kif muri fl-istudji tal-mudell tal-ġurdien[14,22], setgħux ġew dokumentati fil-ħnieżer f'punti ta 'żmien aktar tard.
Fir-rigward tal-iżvilupp strutturali tal-moħħ, qabel kien iddokumentat permezz ta 'immaġni ta' reżonanza manjetika li s-supplimentazzjoni tad-dieta OPN żiedet in-numru ta 'volumi reġjonali tal-moħħ wara n-normalizzazzjoni għall-volumi totali tal-moħħ [24]. F'dan l-istudju, ma sibna l-ebda differenzi kkaġunati mid-dieta fil-piżijiet reġjonali tal-moħħ, la piżijiet assoluti u lanqas relattivi għall-piżijiet totali tal-moħħ. Aħna, għalhekk, ma għamilniex analiżi aktar fil-fond bħall-kejl tal-livelli ta 'espressjoni tal-ġeni ta' proteini relatati mal-myelin, eż., proteina bażika tal-myelin u glycoprotein assoċjata mal-myelin [14,23]. Preċedentement ġie dokumentat li l-OPN eżoġenu għandu proprjetajiet newroprotettivi billi jattenwa n-newroinfjammazzjoni kkaġunata minn emorraġija intraċerebrali li twassal għal punteġġi newroloġiċi mtejba [57I. Aktar riċerka hija ġġustifikata biex tinvestiga jekk il-ħalib OPN huwiex kapaċi jagħti effetti strutturali u funzjonali ta 'benefiċċju lill-moħħ waqt kundizzjonijiet infjammatorji sistemiċi, spiss esperjenzati minn trabi qabel iż-żmien [26]. Dan kien barra mill-ambitu tal-istudju attwali.
5. Konklużjonijiet
F'mudell ta 'ħnieżer qabel iż-żmien ta' trabi tat-twelid sensittivi, urejna li dieta bijoattiva tal-ħalib bovin supplimentata b'OPN addizzjonali ta 'ħalib bovin hija tollerata tajjeb u indotta titjib minuri fl-istruttura tal-imsaren u l-immunità sistemika, mingħajr aktar effetti fuq l-iżvilupp strutturali jew funzjonali tal-moħħ. Supplimentazzjoni b'OPN 'il fuq minn dak li jiġi riċevut mill-ħalib bażali tal-ifrat, biex b'hekk tilħaq livelli fit-tarf fiżjoloġiku għoli ta' dak li t-trabi jirċievu b'mod naturali mill-ħalib uman, jista' għalhekk ikollu effetti limitati fuq l-imsaren, l-immunità u l-iżvilupp tal-moħħ fi trabi tat-twelid sensittivi fil-perjodu tat-twelid immedjat. . Għad trid tiġi determinata aktar informazzjoni dwar il-benefiċċji tas-supplimentazzjoni OPN tal-ħalib tal-formuli tat-trabi bbażati fuq il-ħalib bovin biex jistimulaw l-iżvilupp ta 'trabi tat-twelid kompromessi.
