Il-Perossidazzjoni tal-Lipidi Lisosomali tirregola l-immunità tat-tumur

L-inibizzjoni lisosomali suscitata minn inibituri palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) bħal DC661 tista 'tipproduċi mewt taċ-ċelluli, iżda l-mekkaniżmu għal dan mhuwiex mifhum kompletament. Il-mogħdijiet programmati tal-mewt taċ-ċelluli (awtofaġija, apoptożi, nekroptożi, ferroptożi u piroptożi) ma kinux meħtieġa biex jinkiseb l-effett ċitotossiku ta 'DC661. L-inibizzjoni tal-cathepsins, jew il-kelazzjoni tal-ħadid jew tal-kalċju, ma salvawx iċ-ċitotossiċità kkawżata minn DC661-. L-inibizzjoni ta 'PPT1 indotta perossidazzjoni tal-lipidi lisosomali (LLP), li wasslet għal permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali u mewt taċ-ċelluli li tista' titreġġa 'lura mill-antiossidant N-acetylcysteine ​​(NAC) iżda mhux minn antiossidanti oħra tal-perossidazzjoni tal-lipidi. It-trasportatur liżosomali taċ-ċisteina MFSD12 kien meħtieġ għat-trasport intralysosomal ta 'NAC u salvataġġ ta' LLP. L-inibizzjoni ta' PPT1 ipproduċiet immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli b'espressjoni tal-wiċċ ta' calreticulin li setgħet titreġġa 'lura biss b'NAC. Iċ-ċelluli ttrattati DC661-ipprajjaw ċelluli T naive u t-tossiċità msaħħa medjata miċ-ċelluli T. Ġrieden imlaqqma b'ċelluli DC661-trattati ħolqu immunità adattiva u rifjut tat-tumur f'tumuri "immuni sħun" iżda mhux f'tumuri "immuni kiesaħ". Dawn is-sejbiet juru li LLP imexxi l-mewt taċ-ċelluli lisosomali, forma immunoġenika unika ta 'mewt taċ-ċelluli, li jindika t-triq għal kombinazzjonijiet razzjonali ta' immunoterapija u inibizzjoni liżosomali li jistgħu jiġu ttestjati fi provi kliniċi.

Benefiċċji ta 'cistanche tubulosa-Antitumor

Introduzzjoni

B'attività inkoraġġanti fi provi kliniċi li jinvolvu l-inibitur liżosomali hydroxychloroquine (HCQ) (1), l-identifikazzjoni ta 'palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) bħala l-mira molekulari tad-derivattivi tal-chloroquine (2), u t-tnedija ta' inibituri ġodda PPT1 fil-kliniċi. provi (3, 4), hemm bżonn li wieħed jifhem il-mekkaniżmu li bih l-inibituri lisosomali jinduċu mewt taċ-ċelluli u l-effett ta 'inibizzjoni lisosomali fuq l-immunità tat-tumur. Il-mekkaniżmu kanoniku tal-mewt taċ-ċelluli lisosomali deskritt għal HCQ jinvolvi permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali (LMP), tnixxija ta 'cathepsins, u attivazzjoni ta' apoptożi medjata minn caspase (5, 6). Preċedentement urejna li l-inibitur liżosomali DC661 jippenetra ċ-ċelloli fil-mikroambjent aċiduż tat-tumur u jillokalizza l-lysosomal b'mod aktar effiċjenti minn HCQ (2, 7). DC661 jipproduċi mewt taċ-ċelluli qawwija f'ħafna linji taċ-ċelluli tal-kanċer (2). DC661 jorbot u jinibixxi PPT1, jiddeċidifika l-liżosoma, u jinibixxi l-awtofaġija. DC661 jinduċi wkoll LMP u jżid il-livelli ta 'caspase 3 cleaved (2, 7). F'dawn l-aħħar snin, ġew definiti mekkaniżmi ġodda ta 'mewt taċ-ċelluli li għandhom konsegwenzi immunoġeniċi u jinkludu necroptosis, ferroptosis, u pyroptosis (8). Intwera li l-awtofaġija dipendenti fuq il-lisosomi tiddegrada l-MHC klassi I (9), kif ukoll komponenti tal-immunoproteasome (10), li tissuġġerixxi li l-inibizzjoni tal-awtofaġija tista 'ttejjeb l-ipproċessar tal-antiġeni. Madankollu, l-effetti immunoġeniċi tal-inibizzjoni liżosomali u l-mewt taċ-ċelluli li jirriżultaw ma ġewx ikkaratterizzati għal kollox. Biex nindirizzaw din il-lakuna fl-għarfien, investigajna l-effetti ta 'DC661 fuq mekkaniżmi ta' mewt taċ-ċelluli kanoniċi biex niddeterminaw jekk il-mewt taċ-ċelluli lisosomali hijiex il-forma tagħha ta 'mewt taċ-ċelluli jew sempliċement prekursur għal wieħed mill-mekkaniżmi stabbiliti l-oħra. Sibna li HCQ u DC661 wasslu għal żieda sinifikanti f'numru żgħir biss ta 'proteini fil-proteome tal-melanoma u ħafna minn dawn kienu proteini relatati mal-awtofaġija u l-apoptożi. Inibituri tal-mewt taċ-ċelluli programmata (apoptożi, nekroptożi, ferroptosi, u piroptożi) ma ttaffix l-effetti ċitotossiċi wara indeboliment lisosomali minn DC661. Il-perossidazzjoni tal-lipidi lisosomali (LLP) hija mutur ewlieni tal-mewt taċ-ċelluli indotta minn LMP assoċjata mal-espressjoni ta 'calreticulin (CALR) fuq il-wiċċ taċ-ċellula. Din il-forma ta 'mewt taċ-ċelluli tista' titreġġa 'lura biss bl-użu tal-antiossidant N-acetylcysteine ​​(NAC). L-attività tan-NAC kienet imfixkla mill-inibizzjoni tal-importatur liżosomali taċ-ċisteina MFSD12. LLP wassal għal fenotipi immunoġeniċi li jippromwovu l-qtil medjat miċ-ċelluli T. Dawn is-sejbiet juru li l-mewt taċ-ċelluli lisosomali hija forma potenzjalment unika ta 'mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi.

sistema immunitarja li żżid il-pjanti cistanche

Riżultati

L-inibizzjoni lisosomali tinduċi bidliet sinifikanti fil-proteome assoċjati ma 'awtofaġija u apoptożi. Biex nistabbilixxu l-effetti ċitotossiċi tal-inibituri liżosomali, ivvalutajna l-vijabbiltà tal-melanoma A375P, il-karċinoma tal-kolon RKO, u l-linji taċ-ċelluli tal-kanċer tal-frixa MIA PaCa-2 ittrattati bl-inibitur vakuolari H+-ATPase bafilomycin-A1 (1 00 nM); Inibituri PPT1 DC661 (3 μM) jew HCQ (10 μM jew 30 μM); palmitat mimetic hexadecyl sulfonyl fluoride (HDSF; 60 μM); inibituri tal-cathepsin pepstatin A (PepA; 10 ug/mL), E64 (PepA; 10 ug/mL), jew PepA+E64; u disruptor tal-membrana lisosomali Leu-Leu methyl ester hydrobromide (20 μM) għal 48 siegħa. Bafilomycin-A1 u DC661 biss ikkawżaw tnaqqis sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-linji taċ-ċelluli tal-kanċer (Figura 1A u Figura Supplimentari 1A; materjal supplimentari disponibbli onlajn ma' dan l-artikolu; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), b'DC661 jipproduċi tnaqqis aktar profond fil-vijabbiltà taċ-ċelluli minn bafilomycin-A1. Ibbażat fuq din id-dejta u l-proprjetajiet farmakoloġiċi li jixbħu lill-mediċina tad-derivattivi tal-chloroquine, iffukajna l-istudju tagħna fuq id-derivattivi tal-chloroquine bħala għodod biex nifhmu l-mewt taċ-ċelluli lisosomali. Ġiet applikata analiżi tal-proteome globali imparzjali għaċ-ċelloli tal-melanoma A375P ittrattati b'DC661 (3 μM) jew l-HCQ inqas qawwi (10 μM jew 30 μM) għal 24 siegħa. Mill-4,264 proteina kwantifikata ta 'kunfidenza għolja, 87 u 55 proteina biss żdiedu b'mod sinifikanti b'DC661 (3 μM) u HCQ (30 μM), rispettivament; barra minn hekk, 14 u 15-il proteina naqsu b'mod sinifikanti b'DC661 (3 μM) u HCQ (30 μM), rispettivament (bidla assoluta ta' darbiet akbar minn 2; q < 0.05) b'DC661 (3 μM) jew HCQ (30 μM), rispettivament , meta mqabbla mal-kontroll tal-vettura. Id-doża aktar baxxa ta 'HCQ (10 μM) ma wriet l-ebda tibdil sinifikanti fil-proteini meta mqabbel mal-kontroll tal-vettura. L-aqwa 50 proteina li żdiedu b'mod sinifikanti wara t-trattament DC661 kienu prinċipalment assoċjati ma 'awtofaġija u apoptożi, u bidliet simili ġew osservati għad-dożaġġ ogħla ta' HCQ (Figura 1B). Għal dawn ir-raġunijiet, għażilna li niffukaw aktar studji fuq id-DC661 aktar qawwi. Eżempji ta' wħud mill-akbar bidliet fil-proteini assoċjati ma' l-awtofaġija u l-apoptożi kienu l-proteina 1 li torbot it-taxxa (TAX1BP1; żdied 15-darbiet); BCL2-proteina interazzjoni 3 (BNIP3; żdied 6-darbiet); ġar tal-proteina tal-ġene 1 BRCA1 (NBR1; żdied 12-darbiet); sequestosome-1 (SQSTM1/p62; żdied 5-darbiet); koattivatur tar-riċettur nukleari 4 (NCOA4; żdied 3-darbiet); u LC3B (MAP1LC3B; żdied 3-darbiet). L-apolipoproteina B-100 (APOB; żieda 66-darbiet) kienet derivata mis-serum tal-għoġol tal-fetu u ma ġietx studjata aktar. Immunoblotting ikkonferma li t-trattament b'DC661 jew konċentrazzjonijiet ogħla ta 'HCQ ipproduċa żidiet notevoli fl-espressjoni ta' riċetturi tal-merkanzija awtofaġiċi NBR1, TAX1BP1, SQSTM1 / p62, u NCOA4 b'mod dipendenti fuq id-doża u l-ħin (Figura Supplimentari 1, B u C). CRISPR/Cas9 KO ta 'PPT1 fiċ-ċelloli A375P fenokopja l-effetti ta' DC661 fuq dawn il-proteini meta mqabbla mal-kontropartijiet WT tagħhom (Figura 1D Supplimentari). Madankollu, l-espressjoni tar-riċetturi tal-merkanzija awtofaġika u ż-żidiet relattivi indotti mit-trattament DC661 kienu varjabbli fil-kanċer tal-kolon, kanċer tal-frixa, u linji oħra taċ-ċelluli tal-melanoma li fihom DC661 juri ċitotossiċità (Figura 1E Supplimentari). Dan issuġġerixxa li r-riċetturi tal-merkanzija awtofaġiċi nfushom, għalkemm żdiedu fil-livell tal-proteini, x'aktarx li ma jkunux responsabbli għall-mewt taċ-ċelluli wara t-trattament DC661. Biex nikkonferma dan, iffukajna fuq ir-riċetturi tal-merkanzija awtofaġiċi TAX1BP1 u BNIP3 minħabba li għandhom effetti proapoptotiċi magħrufa fiċ-ċelloli tal-kanċer (Figura 1C). TAX1BP1 huwa adapter tal-merkanzija autophagy (11) u jirregola wkoll l-apoptosi indotta minn inibituri tas-sintesi tal-proteini jew aġenti li jagħmlu ħsara lid-DNA fiċ-ċelloli tal-kanċer (12). It-twaqqigħ ta' TAX1BP1 minn siRNA (Figura 1D) ma affettwax iċ-ċitotossiċità kkaġunata minn DC661-f'analiżi ta' vijabbiltà għal żmien qasir (Figura 1E) u fit-tul (Figura 1F). Dawn ir-riżultati wrew li TAX1BP1 ma għandux rwol essenzjali fiċ-ċitotossiċità medjata minn DC661-. BNIP3 hija proteina proapoptotika li tfixkel il-bijoenerġija mitokondrijali u tirregola l-mitofaġija (13). Knockdown effettiv ta' BNIP3 (Figura 1G) ma affettwax iċ-ċitotossiċità kkaġunata minn DC661-(Figuri 1, H, u I). Dawn ir-riżultati wrew li l-effetti ċitotossiċi ta 'DC661 huma indipendenti mill-espressjoni BNIP3. Sussegwentement, studjajna l-effetti tat-tnaqqis taċ-ċelluli tal-ġeni awtofaġiċi kanoniċi meħtieġa għall-produzzjoni tal-awtofagożomi fuq l-effikaċja tad-DC661 billi nħabbtu l-unc-51 bħal kinażi li jattiva l-awtofaġija 1 (ULK1) u l-ġene 7 relatat mal-awtofaġija (ATG7). Knockdown effettiv ta 'ULK1 jew ATG7 (Figura Supplimentari 2, A u B) inibixxi l-fluss awtofaġiku (Figura Supplimentari 2C) iżda ma affettwax iċ-ċitotossiċità indotta DC661- (Figura 1, J-M). Dawn ir-riżultati wrew li n-nuqqas tal-makkinarju essenzjali tal-awtofaġija tal-qalba ma jneħħix l-effetti ċitotossiċi ta 'DC661. L-inibizzjoni liżosomali minn DC661 tinduċi mogħdijiet multipli ta' mewt taċ-ċelluli programmati. Il-perspettiva kanonika hija li l-mewt taċ-ċelluli lisosomali hija dovuta għall-apoptożi (5). Immunoblotting żvela li t-trattament DC661 irriżulta f'attivazzjoni ta 'caspase-3, -7, u -9 u qsim ta' PARP-1, li kkonferma li DC661 attiva l-apoptosi (Figura 2A). L-inibitur pan-caspase Z-VAD-FMK impedixxa l-attivazzjoni ta 'caspase minn DC661 iżda ma inibixxix l-akkumulazzjoni ta' LC3B u p62, u wera li l-attivazzjoni tal-apoptożi u l-imblokk tal-awtofaġija huma separabbli wara inibizzjoni lisosomali (Figura 2B). L-imblukkar tal-apoptosi b'ZVAD-FMK ma saħħaħx jew illimita ċ-ċitotossiċità DC661, li jissuġġerixxi li l-apoptożi hija dispensabbli għall-mewt taċ-ċelluli lisosomali (Figura 2, C, u D). L-effetti ċitotossiċi ta 'DC661 kienu simili f'ċelluli Bax/Bak double-KO tal-mudullun primarju li ma jistgħux jgħaddu minn apoptożi u ċelluli WT (Figura 2E). L-imblokk tal-apoptosi ma affettwax iċ-ċitotossiċità indotta minn DC661-f'ċelluli tal-kanċer tal-kolon u tal-kanċer tal-frixa wkoll (Figura Supplimentari 2, D–F). Minħabba li sibna li l-apoptosi hija dispensabbli għal DC661-mewt taċ-ċelluli indotta, aħna investigajna jekk DC661 jinduċix nekroptożi, forma oħra ta' mewt taċ-ċelluli programmata regolata minn protein kinase li interaġixxi mar-riċettur (RIPK) u proteina mħallta ta' dominju ta' nisel kinase ( MLKL). Il-livelli tal-forom fosforilati u attivati ​​ta 'RIPK u MLKL żdiedu wara t-trattament DC661 minn 0.1-1 μM (Figura 2F). Fi 3 μM DC661 kien hemm nuqqas ta 'RIPK1 fosforilat iżda MLKL fosforilat persistenti, li jissuġġerixxi li, f'din il-konċentrazzjoni ogħla, forom addizzjonali ta' mewt taċ-ċelluli jistgħu jiġu involuti. Trattament minn qabel bl-inibituri RIPK1 necrostatin-1 jew necrostatin-1s jew l-inibitur MLKL necrosulfonamide impedixxa l-fosforilazzjoni ta 'RIPK1 wara trattament DC661 (1 μM) fiċ-ċelloli tal-melanoma (Figura 2G) iżda naqas milli jsalva lil DC{{192 }} ċitotossiċità indotta fiċ-ċelloli tal-melanoma (Figura 2H) jew kanċer tal-kolon jew ċelloli tal-kanċer tal-frixa (Figura 2G Supplimentari). Dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li n-nekroptożi hija attivata iżda dispensabbli għal mewt taċ-ċelluli medjata minn DC661-.

Figura 1. L-inibizzjoni tal-awtofaġija lisosomali tinduċi bidliet sinifikanti fil-proteini tal-apoptożi u tal-awtofaġija. (A)

Il-liżosomi huma wieħed mis-siti ewlenin tal-ħażna tal-ħadid. Metaboliżmu intraċellulari tal-ħadid mhux regolat flimkien ma 'kapaċità riduttiva mnaqqsa jista' jwassal għal mewt taċ-ċelluli mhux apoptotiċi magħrufa bħala ferroptosis. Karatteristika tal-ferroptosi hija l-upregulation tal-prostaglandin-endoperoxide synthase 2 (PTGS2), cation transport regulator homolog 1 (CHAC1), u cysteinyl-tRNA synthase (CARS) (14). It-3 kollha ta 'dawn il-markaturi tal-ferroptosis kienu transcriptally upregulated bit-trattament DC661 (Figura 3A), li jissuġġerixxi li l-inibizzjoni lisosomali tinduċi ferroptosis. DC661 indotta bidla fil-fluworexxenza fiċ-ċelloli A375P ittrattati b'C11-BODIPY, li tindika perossidazzjoni tal-lipidi, karatteristika tal-ferroptosi. Din iċ-ċaqliq indott DC661-inqalbet b'mod sinifikanti fil-preżenza ta' inibituri tal-ferroptosis ferrostatin-1 jew roxstatin tax-xufftejn-1 amministrati f'konċentrazzjoni effettiva (Figura 3B u Figura Supplimentari 3A), li tindika aktar li DC661 ferroptosis indotta. Madankollu, l-inibizzjoni tal-ferroptożi ma salvatx iċ-ċitotossiċità assoċjata ma 'DC661 (Figura 3, C u D). Il-kotrattament taċ-ċelluli tal-kanċer bid-deferoxamine tal-kelatur tal-ħadid (DFO) u DC661 ma salvax iċ-ċitotossiċità ta 'DC661 (Figura 3E). Trattament b'ferrostatin-1, roxstatin tax-xoffa-1, jew DFO ma salvax l-inibizzjoni DC661 tal-vijabbiltà għal żmien qasir jew it-tkabbir klonoġeniku fit-tul f'ċelluli tal-kanċer tal-melanoma, tal-kolon u tal-frixa (Figura Supplimentari 3, B –E, u Figura Supplimentari 4, A–D). Din id-dejta turi li l-ferroptożi hija attivata iżda dispensabbli għal mewt taċ-ċelluli medjata minn DC661-. Piroptożi hija forma ta’ mewt taċ-ċelluli programmata assoċjata ma’ rispons infjammatorju li jinvolvi l-attivazzjoni ta’ caspases li jipproċessaw gastrin (GSDM), li jippermettu l-formazzjoni tal-pori fuq il-membrana tal-plażma u r-rilaxx sussegwenti ta’ mudelli molekulari assoċjati mal-ħsara, bħal mobilità għolja kaxxa tal-grupp 1 (HMGB1). It-trattament DC661 f'linji taċ-ċelluli multipli tal-melanoma (A375P, A375, WM35, u WM793) irriżulta fl-attivazzjoni ta' inizjatur caspase-8 u -9 u executioner caspase-7, tipiċi għall-piroptosi, u prodotta qsim ta 'GSDME ta' tul sħiħ, simili fil-punt għall-induttur magħruf tal-piroptosi PLX4720 u PD0325901 (Figura 5A Supplimentari). DC661 ipproduċa rilaxx extraċellulari aktar b'saħħtu ta 'HMGB1 mill-induttur magħruf tal-piroptosi, BRAF, u inibizzjoni tal-MEK f'1% FBS (15), li jirrifletti l-konsegwenza funzjonali ta' piroptożi attivata. Sussegwentement, ittestjajna jekk l-inibizzjoni tal-piroptożi minn GSDME KO ttejjebx l-effetti ċitotossiċi ta 'DC661. It-trattament DC661 indotta akkumulazzjoni ta 'LC3II u SQSTM1/p62 u attivazzjoni ta' caspase, iżda r-rilaxx ta 'HMGB1 kien kważi kompletament imħassar fiċ-ċelloli umani GSDME-KO WM35, li juri li l-konsegwenza funzjonali ta' inibizzjoni tal-piroptosi nkisbet (Figura 3F). Madankollu, it-trattament DC661 ipproduċa ċitotossiċità ugwali f'YUMM1.7 WT, vettur vojt (EV), u ċelluli Gsdme KO1 u KO2 kemm f'kundizzjonijiet FBS ta '10% kif ukoll ta' 1% (Figura 3G u Figura Supplimentari 5B). Riżultat komuni wieħed ta 'forom multipli ta' mewt taċ-ċelluli huwa r-rilaxx ta 'LDH. DC661 ipproduċa żieda sinifikanti fir-rilaxx ta 'LDH, u dan ma setax jitreġġa' lura b'inibizzjoni ta' apoptosi, nekroptosi jew ferroptosis (Figura Supplimentari 5C). Dawn ir-riżultati wrew li DC661 jinduċi modi multipli ta 'mewt taċ-ċelluli, inklużi apoptożi u piroptosi kif ukoll nekroptożi u ferroptożi, iżda l-ebda wieħed minn dawn il-modi ta' mewt taċ-ċelluli mhu meħtieġ għal DC661-mewt taċ-ċelluli indotta. L-inibizzjoni tal-cathepsin jew il-kelazzjoni tal-kalċju ma tipprevjenix il-mewt taċ-ċelluli mill-permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali. Wara li wrejna li l-attivazzjoni tal-caspase (li hija meħtieġa għall-apoptożi u l-piroptożi) hija dispensabbli għall-mewt taċ-ċelluli DC661-indotta, aħna ipoteżijna li r-rilaxx tal-cathepsin minn liżosomi jista 'jikkawża mewt taċ-ċelluli dipendenti fuq il-caspase. L-inibizzjoni kimika (DC661) jew ġenetika (PPT1 siRNA [siPPT1]) ta 'PPT1 ipproduċa permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali (LMP), filwaqt li HDSF, inibitur irriversibbli inqas qawwi ta' PPT1 li jitbattal malajr fil-kultura taċ-ċelluli, ma setax jinduċi LMP, kif imkejjel minn galectin-3–punta pożittiva (Figura 4A). LMP jirriżulta fir-rilaxx ta 'cathepsins u kontenuti liżosomali oħra fiċ-ċitoplasma u huwa maħsub li huwa karatteristika prossimali ewlenija tal-mewt taċ-ċelluli bbażata fuq il-lisosomi. LMP indott minn DC661 kien assoċjat ma 'żieda sinifikanti fl-attività cathepsin-L ċitoplasmika, li kienet imblukkata b'mod sinifikanti b'inibitur ta' cysteine ​​protease E64 (Figura 4B). Rapporti preċedenti ssuġġerew li r-rilaxx tal-cathepsin minn liżosomi miksura jippromwovi l-attivazzjoni tal-caspase, li jwassal għal mewt taċ-ċelluli apoptotiċi (16-18). L-inibizzjoni kompluta tal-cathepsin ma pprovdietx il-qsim tal-caspase (Figura 4C) u ma salvatx iċ-ċitotossiċità indotta minn DC661-f'assaġġi ta' vijabbiltà għal żmien qasir u fit-tul fil-melanoma (Figura 4, D u E), kanċer tal-kolon, u frixa ċelluli tal-kanċer (Figura Supplimentari 6, A–C). Dawn ir-riżultati jikkumbattu l-fehma kanonika tal-mewt taċ-ċelluli lisosomali kif immexxi minn mewt taċ-ċelluli medjata minn cathepsin. Minbarra r-rilaxx tal-cathepsin minn liżosomi leaky, ir-rilaxx tal-kalċju minn liżosomi ġie implikat f'disfunzjoni ċellulari meta PPT1 ikun indebolit (19). It-trattament DC661 irriżulta f'rilaxx estensiv tal-kalċju, li ġie abrogat permezz ta' trattament minn qabel tal-kelatur tal-kalċju permanenti taċ-ċelluli (Ca2+), BAPTA-AM. (Figura 4F). Notevolment, BAPTA-AM ma pprevenixxix LMP indott minn DC661-(Figura 4G) jew qsim ta' caspase (Figura Supplimentari 6, D, u E) u, l-aktar importanti, ma salvax iċ-ċitotossiċità indotta minn DC661- ( Figura 4H). Dawn is-sejbiet ġew osservati wkoll kemm fil-linji taċ-ċelluli RKO kif ukoll MIA PaCa-2, li fihom ma ġew osservati l-ebda differenzi sinifikanti fil-valuri IC50 b'BAPTA-AM u DC661 (Figura Supplimentari 6F), li ssuġġeriet li l-mewt taċ-ċelluli assoċjata ma 'LMP hija mhux dipendenti fuq kalċju jew cathepsins.

Figura 2. DC661-apoptożi u nekroptożi indotta. (A)

Figura 3. DC661-ferroptożi u piroptosi indotta. (A)

LLP isuq LMP. Wara li stabbilixxa li l-inibituri tal-mogħdijiet ewlenin tal-mewt taċ-ċelluli (apoptożi, nekroptożi, ferroptożi, u piroptożi), cathepsins (PepA u E64), u kelaturi tal-joni (BAPTA-AM [Ca2+] u DFO [Fe{{3} }]) ma pprevenux il-mewt taċ-ċelluli minn DC661 u sab evidenza ta 'perossidazzjoni tal-lipidi minn C-11-BODIPY, għamilna analiżi tal-lipidoma globali f'sagħtejn u 4 sigħat wara t-trattament DC661. DC661 indotta żidiet bikrin u sostnuti 3- għal 10-darbiet f'kull klassi ta' lisofosfolipidi (Figura 5A). B'kuntrast, dehru bidliet minimi jew l-ebda tibdil fil-klassijiet tal-fosfolipidi, inklużi phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, u phosphatidic acid (Figura 7A Supplimentari). Speċi lisofosfolipidi jistgħu jiġu ġġenerati minn ROS, li jossidizza l-katina ta 'aċidu xaħmi saturat li mbagħad tinqasam mill-fosfolipasi (20). Biex niddeterminaw jekk l-antiossidanti jistgħux jipprevjenu l-ħsara tal-lipidi medjata minn ROS, investigajna ċ-ċitotossiċità kkaġunata minn DC661-fil-preżenza tal-kennies pan-ROS N-acetylcysteine ​​(NAC) (21, 22) u inibituri putattivi tal-perossidazzjoni tal-lipidi Trolox (23) ) u vitamina Ċ (aċidu askorbiku) (24, 25). B'differenza għal kwalunkwe wieħed mill-aġenti l-oħra ttestjati s'issa, il-kotrattament b'NAC salva ċ-ċitotossiċità assoċjata mad-DC661-fuq linji taċ-ċelluli multipli (Figura 5B u Figura Supplimentari 7B). Assays CFU fit-tul urew li NAC, b'differenza mill-inibituri kollha tal-mewt taċ-ċelluli, kelaturi tal-joni, u inibituri tal-cathepsin ittestjati hawnhekk, ipprevjeni l-effetti ċitotossiċi ta 'DC661 fiċ-ċelloli A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10, u MC38 ( Figura 5C u Figura Supplimentari 7C). Interessanti, Trolox u l-vitamina Ċ ma salvawx iċ-ċitotossiċità DC661 f'melanoma umana, kanċer tal-kolorektum, ċelluli tal-kanċer tal-frixa u melanoma murina u ċelluli tal-kanċer tal-kolorektum (Figura 5D u Figura Supplimentari 7, D-H). Din id-disparità wasslitna biex nittestjaw jekk NAC, Trolox, u vitamina Ċ affettwawx LMP. Ir-riżultati tagħna wrew li NAC kien l-uniku antiossidant li naqqas b'mod sinifikanti l-LMP indott minn DC661-(Figura 5E). Aħna ipoteżijna li LLP imexxi l-produzzjoni ta 'LMP minn DC661, li tista' titreġġa' lura minn NAC iżda mhux minn Trolox u vitamina C. Biex nistudjaw il-proċess ta 'LLP użajna s-sonda fluworexxenti FOAM-LPO (26), li speċifikament lokalizza mal-lysosome u tipproduċi bidla spettrali minn 586 għal 512 nm (aħmar għal aħdar) meta espost għal perossidi tal-lipidi. Sibna li DC661 indotta LLP meta mqabbel mal-kontroll (Figura 5F). NAC naqqas il-perossidazzjoni tal-lipidi fil-liżosomi taċ-ċelloli tal-melanoma ttrattati b'DC661-, filwaqt li Trolox u l-vitamina Ċ naqsu milli jnaqqsu LLP (Figura 5F). NAC, Trolox, u vitamina Ċ waħedhom ma kellhom l-ebda effett sinifikanti fuq il-perossidazzjoni tal-lipidi. Knockdown ta 'PPT1 (Figura Supplimentari 8A), jew trattament b'konċentrazzjonijiet għoljin ta' HCQ (Figura Supplimentari 8B) indotta wkoll LMP li jista 'jiġi mreġġa' lura minn NAC, filwaqt li l-inibizzjoni kimika ta 'ULK1 ma induċiex LMP (Figura Supplimentari 8C). Importanti knockdown ta 'siPPT1 inkluda wkoll LLP li jista' jitreġġa 'lura b'NAC (Figura 8D Supplimentari) Dawn ir-riżultati wrew li l-inibizzjoni ta' PPT1 tinduċi LLP li jista 'jiġi salvat minn NAC u x'aktarx huwa l-kawża ta' PPT 1- LMP indott mill-inibizzjoni. Barra minn hekk, dawn is-sejbiet issuġġerew li LLP huwa kritiku għall-mewt taċ-ċelluli liżosomali.

Ċiniż herb cistanche plant-Antitumor

L-importazzjoni ta' cysteine ​​f'liżosomi minn MFSD12 tattenwa l-mewt taċ-ċelluli liżosomali. Mit-3 inibituri tal-perossidazzjoni tal-lipidi, NAC biss ipprevjeni lil LLP. Rapport reċenti wera li d-dominju tas-superfamilja tal-faċilitatur ewlieni li fih 12 (MFSD12) huwa komponent essenzjali tal-importatur taċ-ċisteina għal-liżosomi u melanosomi (27). Aħna rraġunajna li NAC, jew il-metabolit tiegħu cysteine, huwa ttrasportat fil-lysosome permezz MFSD12, fejn cysteine ​​jiġi ossidizzat għad-disulfide tiegħu, cysteine. Biex nittestjaw din l-ipoteżi, qabbilna l-kapaċità tan-NAC li jsalva ċ-ċitotossiċità DC661 fiċ-ċelloli siNT u siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Ir-riżultati tagħna wrew li NAC salva LMP indott minn DC661-fiċ-ċelloli siNT iżda ma salvax LMP fiċ-ċelloli siMFSD12 (Figura 6A). NAC naqqas LLP ta' ċelluli siNT-A375P ittrattati DC661- iżda mhux ċelluli siMFSD12. Iċ-ċelloli siMFSD12 ittrattati b'DMSO jew NAC kellhom żieda fl-LLP bażali (Figura 6B) meta mqabbla maċ-ċelloli siNT. Filwaqt li NAC salva ċ-ċitotossiċità DC661 fiċ-ċelluli siNT, il-kapaċità ta 'NAC biex isalva ċ-ċitotossiċità DC661 ġiet kompletament abrogata fiċ-ċelloli siMSFD12 (Figura 6C). Dan wera li knockdown MFSD12 jimblokka l-effetti ċitoprotettivi ta 'NAC kontra DC661. NAC huwa deacetylated minn acylase fiċ-ċitosol (28). Biex tiddetermina jekk it-trattament NAC jipproduċix akkumulazzjoni ta’ cysteine ​​jew cystine fi ħdan il-liżosomi, użajna t-teknika ta’ immunopreċipitazzjoni liżosomali (Lyso-IP) (29) biex tippurifika l-liżosomi minn ċelluli A375P DMSO u ttrattati b’NAC (Figura 6D u Figura Supplimentari 9A) u wettaqna metabolomika mmirata biex tikkwantifika NAC u metaboliti relatati. Kif mistenni, NAC ġie skopert f'lisat taċ-ċelluli sħaħ trattat b'NAC u frazzjonijiet assoċjati mhux marbuta. Il-livelli ta' L-cysteine ​​żdiedu sostanzjalment fil-liżosomi trattati b'NAC. L-cystine kienet tinkixef biss f'liżosomi trattati b'NAC. B'mod impressjonanti, ma sibniex żieda sinifikanti fil-glutathione (mnaqqsa) fil-gruppi ttrattati b'NAC (Figura 6E); dan kien sorprendenti minħabba li huwa komunement maħsub li t-trattament NAC jinduċi żieda fil-produzzjoni ta 'glutathione, u jikkoreġi l-bilanċ redox. Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li cysteine ​​importat fil-liżosomi permezz tal-importatur MFSD12 huwa kritiku biex jiġu salvati LLP, LMP, u l-mewt taċ-ċelluli liżosomali. LLP huwa immunoġeniku. Xi forom ta 'mewt taċ-ċelluli regolata indotta minn DC661 (piroptożi, nekroptożi, ferroptosi) ġew identifikati bħala immunoġeniċi. Preċedentement, il-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi ġiet deskritta għal mediċini tal-kimoterapija bbażati fuq karatteristiċi karatteristiċi, li jinkludu l-wiri ta 'mudelli molekulari assoċjati mal-ħsara, inkluża l-espressjoni tal-wiċċ taċ-ċelluli ta' CALR u rilaxx ta 'proteina HMGB1 u adenosine triphosphate (ATP) (30). CALR jaġixxi bħala sinjal "eat-me" meta jkun espost għall-uċuħ taċ-ċelluli waqt stress taċ-ċelluli. Ir-rilaxx extraċellulari ta 'HMGB1 u ATP jaġixxi bħala sinjal "find-me" rikonoxxut miċ-ċelloli fagoċitiċi. Aħna qabblu żewġ mudelli: ċelluli B16F10, li f'mudelli ta 'tumur syngeneic huma kważi kompletament nieqsa minn limfoċiti li jinfiltraw it-tumur, u ċelluli MC38, li f'mudelli ta' tumur syngeneic għandhom limfoċiti li jinfiltraw it-tumur. L-ewwel, aħna wrejna li t-trattament DC661 jew siPpt1 jinduċi b'mod sinifikanti l-espressjoni CALR tal-wiċċ li tista 'tiġi abrogata kompletament bil-kotrattament NAC fiċ-ċelloli MC38 (Figuri 7, A u B). Sejbiet simili ġew osservati fiċ-ċelloli B16F10 (Figura 7C). Inibituri ta 'mogħdijiet ewlenin tal-mewt taċ-ċelluli (apoptożi, nekroptożi, ferroptożi u piroptożi) naqsu milli jipprevjenu l-espressjoni tal-wiċċ ta' CALR (Figura 7D). Biex jiġi ddeterminat jekk il-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi indotta minn DC661 hijiex dovuta għal upregulation tal-MHC klassi I, iċ-ċelloli B16F10 u MC38 ġew ittrattati b'DC661 (3 μM) jew DMSO għal 24 siegħa. Sibna li t-trattament DC661 ma żiedx l-espressjoni ta 'MHC klassi I u upregulation immunoproteasome (Figura 7E u Figura Supplimentari 9, B u C).

Figura 4. L-inibizzjoni tal-Cathepsin jew il-kelazzjoni tal-kalċju ma jipprevjenux il-mewt taċ-ċelluli DC661-indotta. (A)

Biex nifhmu l-effetti tal-inibizzjoni tal-awtofaġija fuq il-priming taċ-ċelluli T, għamilna esperiment ta 'priming u coculture in vitro bl-użu ta' splenoċiti C57BL6/J kif deskritt qabel (31). Għall-priming, esponejna splenoċiti għal DC661- jew ċelluli B16F10 jew MC38 ittrattati b'DMSO. Sussegwentement, dawn l-isplenoċiti ipprajmati ġew ikkultivati ​​b'ċelluli ħajjin B16F10 jew MC38, u ċ-ċitotossiċità ġiet imkejla (Figura 8A). Splenocytes ipprajmata b'ċelluli B16F10 ittrattati DC661-pproduċew żieda sinifikanti fl-IFN- meta mqabbla ma' splenocytes esposti għal ċelluli B16F10 ittrattati b'DMSO. Il-qtil medjat taċ-ċelluli T ipprajmat taċ-ċelluli B16F10 li qed jipproliferu żdied b'mod sinifikanti fi splenoċiti ipprajmati DC661-meta mqabbel ma' splenoċiti ipprajmati b'DMSO (Figura 8, B u C). Iċ-ċelloli MC38 ittrattati b'DC661 ipproduċew saħansitra aktar ċitotossiċità taċ-ċelluli T IFN u ipprajmata meta mqabbla maċ-ċelloli B16F10 (Figura 8, D, u E). Il-kotrattament NAC b'DC661 kien kapaċi jneħħi kompletament ir-rilaxx ta 'IFN mill-isplenoċiti u ċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli T ipprajmata b'mod ċar (Figura 8, F, u G). Il-knockdown ta 'calreticulin minn siCalr fiċ-ċelloli MC38 (Figura Supplimentari 9D) ħassar l-effikaċja tal-priming tat-trattament DC661 u naqqas b'mod sinifikanti ċ-ċitotossiċità taċ-ċelluli T ipprajmata (Figura 8, H, u I). Meħuda flimkien, din id-dejta tappoġġja rwol mekkanistiku ta 'upregulation CALR assoċjata ma' LLP fil-promozzjoni tal-immunità taċ-ċelluli T taċ-ċelluli antitumorali. Sussegwentement, wessgħu dawn is-sejbiet in vitro għal studju in vivo ta 'tilqim kontra t-tumur f'mudelli ta' ġrieden immunokompetenti u immunodefiċjenti. Għal dan l-assaġġ, in vitro ċelluli B16F10 jew MC38 ittrattati bil-friża jew DC661-trattati ġew injettati sc fuq il-ġenb tax-xellug biex jipproteġu ġrieden immunokompetenti C57BL/6 jew NOD/SCID kontra sfida mill-ġdid b'ċelluli tat-tumur ħajjin tal-istess tip injettati 7 ijiem wara fil-ġenb tal-lemin (Figura 9A). Ċelloli B16F10 ttrattati b'DC661-naqsu milli jipprevjenu r-rifjut tat-tumur minkejja analiżi in vitro, li jissuġġerixxu li DC661 indotta mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi (Figura 9B u Figura Supplimentari 9E). B'kuntrast, it-tilqim ta' ġenb wieħed b'ċelluli MC38 ittrattati b'DC661-promwoviet rifjut sħiħ ta 'ċelluli MC38 ħajjin impjantati fuq il-ġenb oppost (Figura 9C u Figura Supplimentari 9F). Biex tiddetermina jekk l-immunità adattiva kinitx kritika għall-effett tal-vaċċin DC661 deher li kellu b'tumuri MC38, irripejna l-esperiment fil-ġrieden NOD/SCID. B'mod impressjonanti, sibna li DC661-ċelluli MC38 ittrattati ma kkaġunawx rifjut ta 'tumuri rechallenge fi ġrieden NOD/SCID immunodefiċjenti (Figura 9D u Figura Supplimentari 9G), li jindika li l-immunità adattiva kienet meħtieġa għall-effett tal-vaċċin osservat. Biex tittestja r-robustezza ta 'din is-sejba, għażilna linja taċ-ċelluli tal-kanċer tal-ġurdien immunoġeniċi magħrufa sew, CT26, u wettaqna l-esperiment tat-tilqim bħal hawn fuq. Kif kien mistenni, l-impjantazzjoni ta 'ċelluli CT26 ittrattati DC661-f'ġenb wieħed tal-ġurdien ipproduċa effett bħal vaċċin u pprovdiet it-tkabbir ta' ċelloli CT26 ħajjin impjantati fuq il-ġenb l-ieħor (Figura 9E u Figura Supplimentari 9H). Is-sejbiet tagħna ssuġġerew li DC661-LLP indott huwa kritiku għall-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi medjata minn LMP, li hija maqluba bl-importazzjoni ta 'cysteine ​​fil-liżosoma minn trasportatur liżosomali MFSD12 (Figura 9F).

Diskussjoni

L-inibizzjoni lisosomali tidher li hija approċċ terapewtiku promettenti fi studji prekliniċi, u provi kliniċi HCQ ipproduċew riżultati inkoraġġanti iżda mħallta (1, 32). PPT1 huwa l-mira molekulari ta 'HCQ, u inibituri PPT1 aktar potenti, bħal DC661 (2) u GNS561 (3), jinduċu mewt taċ-ċelluli medjata minn LMP in vitro. Il-mekkaniżmu preċiż tal-mewt taċ-ċelluli lisosomali u r-rwol tiegħu fl-immunoġeniċità tat-tumur ma ġewx ċari għal kollox. L-immunità antitumorali tissaħħaħ meta l-inibizzjoni tal-awtofaġija hija kkombinata ma 'immunoterapija (9, 10, 31). Mekkaniżmi proposti għall-immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli wara l-inibizzjoni tal-awtofaġija jinkludu MHC klassi I u upregulation tal-immunoproteasome, li t-tnejn jappoġġjaw l-ipproċessar u l-preżentazzjoni mtejba tal-antiġen. Barra minn hekk, telf ta 'proteini awtofaġiċi jew inibizzjoni awtofaġika permezz ta' chloroquine miżjuda rispons taċ-ċelluli CD8+ T billi jiżdiedu l-livelli tal-wiċċ ta 'MHC klassi I fiċ-ċelloli dendritiċi (33). Preċedentement urejna li l-inibizzjoni sistemika PPT1 tista 'tipolarizza mill-ġdid il-makrofaġi minn fenotip M2 għal M1. L-inibituri PPT1 jistgħu jtejbu l-livelli ta 'STING, li jwasslu għal rilaxx ta' IFN u awmentazzjoni ta 'qtil medjat minn ċelluli T f'mudelli ta' melanoma (31). Hawnhekk, aħna wrejna li LLP innifsu jipproduċi forma immunoġenika intrinsika taċ-ċelluli tat-tumur ta 'mewt taċ-ċelluli. Sibna li l-inibizzjoni lisosomali indotta ftit ħafna bidliet fil-proteini fiċ-ċelloli tal-kanċer, u l-proteini l-aktar elevati b'mod sinifikanti kienu jinkludu riċetturi tal-merkanzija awtofaġiċi u regolaturi tal-apoptożi. L-approċċ tagħna li jimmira uħud minn dawn il-ġeni fil-funzjonijiet kollha wera li l-proteini indotti mid-droga x'aktarx ma kinux ir-regolaturi ewlenin tal-mewt taċ-ċelluli. L-inibizzjoni ġenetika ta 'ULK1 jew ATG7 ukoll ma salvatx iċ-ċitotossiċità DC661. Aħna wrejna li l-inibizzjoni liżosomali jattiva forom multipli ta 'mewt taċ-ċelluli programmata, inklużi apoptożi, nekroptożi, ferroptosi u piroptosi, iżda kull waħda minn dawn kienet dispensabbli għal ċitotossiċità indotta mid-droga. Ta 'min jinnota, il-mekkaniżmi programmati tal-mewt taċ-ċelluli jistgħu jikkoinċidu u l-cotargeting ta' mekkaniżmi ta 'mewt taċ-ċelluli multipli jista' jipprovdi ċitoprotezzjoni kontra l-mewt taċ-ċelluli wara permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali. Ix-xogħol tagħna eskluda mekkaniżmi dipendenti fuq il-catepsin u l-kalċju għall-mewt taċ-ċelluli lisosomali u enfasizza l-importanza tal-LLP bħala d-determinant kritiku tal-mewt taċ-ċelluli. Sibna evidenza ta 'LLP li kienet riversibbli minn antiossidant li ġie ttrasportat fil-liżosoma, NAC u kien kritiku għall-permeabilizzazzjoni tal-membrana liżosomali u ċ-ċitotossiċità. NAC kien l-uniku aġent li kapaċi jtaffi jew ireġġa' lura l-mewt taċ-ċelluli DC661-indotta, u din il-kapaċità kienet dipendenti fuq il-preżenza tat-trasportatur liżosomali taċ-ċisteina MFSD12. Nuqqas ta 'penetrazzjoni lisosomali huwa probabbli għaliex inibituri putattivi oħra tal-perossidazzjoni tal-lipidi, Trolox u vitamina C, ma setgħux jipprevjenu ċ-ċitotossiċità DC661. NAC huwa kkonvertit għal cysteine, li huwa importat fil-liżosomi u jossidizza għall-forma disulfide tiegħu, cystine. Iċ-ċistina hija esportata lejn iċ-ċitosol minn trasportatur liżosomali ieħor, cystinosis, fejn titnaqqas għal cysteine ​​li terġa 'timmobilizza sorsi ta' nutrijenti interni, terġa 'tiattiva l-mira tal-kumpless rapamycin 1, u tippromwovi l-awtofaġija (34). Dan iċ-ċiklu ta’ tnaqqis ta’ ossidazzjoni ta’ cysteine ​​għal cystine (liżosomi) u lura għal cysteine ​​(cytosol) jista’ jkun mekkaniżmu ta’ salvataġġ possibbli ta’ NAC kontra ċ-ċitotossiċità DC661 jew korriment liżosomali aktar ġenerali f’kuntesti oħra ta’ mard fejn in-NAC wera li huwa utli terapewtikament (35) . L-NAC mhux biss reġġa' lura LLP u LMP indotti minn DC661-iżda wkoll espressjoni tal-wiċċ tal-markatur tal-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi calreticulin. L-espressjoni tal-wiċċ taċ-ċelluli tal-proteina CALR kienet meħtieġa għaċ-ċitotossiċità mtejba medjata miċ-ċelluli T indotta minn splenocytes ipprajmata DC661-, li turi li l-inibizzjoni lisosomala tipproduċi forma speċifika ta 'immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli.

Filwaqt li studji preċedenti wrew li l-inibizzjoni liżosomali tista 'ttejjeb l-attività antitumorali ta' inibizzjoni tal-punt ta 'kontroll immuni f'tumuri tal-ġenb stabbiliti (9, 31), l-istudju tagħna huwa l-ewwel li nafu tagħna li juri effett bħal vaċċin għal tumuri MC38 iżda mhux tumuri B16 f' ċelluli tat-tumur ittrattati minn qabel b'DC661 qabel l-impjantazzjoni. Dan juri li l-mewt taċ-ċelluli lisosomali tista 'tinduċi immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli, iżda dawn il-bidliet waħedhom mhumiex probabbli biżżejjed biex ireġġgħu lura mikroambjent tat-tumur "immuni kiesaħ" f'mikroambjent tat-tumur "immuni sħun". L-istudji preċedenti tagħna fil-mudelli tal-mikroambjent tat-tumur "kiesaħ immuni" B16 u l-BRAfCA PtenloxP Tyr: Mudelli tal-ġurdien inġinerija ġenetikament CreERT2 (31) urew li l-inibizzjoni sistemika liżosomali pproduċiet effetti fuq makrofaġi assoċjati mat-tumur u ċelloli suppressor derivati ​​miċ-ċelluli majelojdi li kienu biżżejjed biex itejbu l-effikaċja tal-immunoterapija. Jista 'jkun il-każ li l-immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli għandha wkoll rwol f'dawn it-tumuri kiesaħ immuni li jsiru aktar reattivi għall-ICD wara inibizzjoni lisosomali. L-effett simili ta’ vaċċin ta’ inibizzjoni liżosomali osservat f’ambjent ikkontrollat ​​tal-laboratorju jista’ jew ma jistax jissarraf fil-klinika, iżda jista’ jispjega għaliex xi pazjenti kkurati b’dabrafenib, trametinib, u HCQ f’melanoma mutant BRAF ikkurata qabel kellhom daqshekk profond u durabbli. rispons għal dan il-kors (32). Huwa meħtieġ aktar studju biex wieħed jifhem kif l-inibizzjoni PPT1 tipproduċi ROS liżosomali u perossidazzjoni tal-lipidi. Ir-regolazzjoni dipendenti minn PPT1-tal-V-ATPase u l-aċidifikazzjoni lisosomali mhijiex spjegazzjoni suffiċjenti minħabba li bafilomycin jinibixxi l-aċidifikazzjoni lisosomali iżda ma jipproduċix LMP (dejta mhux murija). L-implikazzjonijiet ta 'dawn is-sejbiet jissuġġerixxu li l-inibituri lisosomali li jtejbu l-immunoġeniċità intrinsika taċ-ċelluli tat-tumur jistgħu jiġu kkombinati b'mod razzjonali ma' terapiji li jtejbu l-attivazzjoni taċ-ċelluli T, jew infiltrazzjoni fil-mikroambjent tat-tumur, li potenzjalment jipproduċu effetti sinerġistiċi.

Figura 5. N-acetyl cysteine ​​jipprevjeni DC661-mewt taċ-ċelluli indotta. (A)

Metodi

Kultura taċ-ċelluli. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185), u linji taċ-ċelluli tal-maws B16F10 (CRL-6475) inxtraw minn ATCC. Linji umani A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793, u ġurdien YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, u Gsdme KO1 u KO2) inkisbu internament. Iċ-ċelloli tal-ġurdien MC38 u CT26 ġew ipprovduti minn Andy Minn, Università ta 'Pennsylvania. FL5.12 u IL-3–dipendenti Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) ċelluli primarji tal-mudullun inkisbu minn Kathryn E. Wellen, Università ta 'Pennsylvania. Il-linja taċ-ċelluli Panc-1 (CRL-1469, ATCC) umana ġiet ipprovduta minn Ben Z. Stanger, Università ta' Pennsylvania. Il-linja taċ-ċelluli tal-ġurdien YUMMER 1.7 inkisbet minn Xiaowei (George) Xu, Università ta 'Pennsylvania. Il-linji taċ-ċelluli kollha ġew ittestjati għal Mycoplasma kull sentejn mill-faċilitajiet tal-qalba tal-Università ta 'Pennsylvania u awtentikati bl-użu ta' marki tas-swaba' ripetuti b'tandem qasir mill-qalba tal-Wistar Institute Genomics. A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12, u linji taċ-ċelluli Bax/ Bak DKO ġew ikkultivati ​​f'RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Linji taċ-ċelluli A375, MIA PaCa-2, Panc-1, B16F10, u MC38 ġew ikkultivati ​​f'DMEM (Invitrogen, 11995); u ċelloli YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV, u Gsdme KO1 u KO2) (15) ġew ikkultivati ​​f'DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Il-midja tal-kultura ġew supplimentati b'10% serum bovin fetali (12306C, MilliporeSigma) u soluzzjoni antimikotika antibijotika 1 × (Gibco, 15140-122). Linji taċ-ċelluli FL5.12 u Bax/Bak DKO inżammu f'midja RPMI kompluta supplimentata b'50 μM -mercaptoethanol (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma), u 0.35 ng/mL u 3.5 ng /mL IL-3, rispettivament. Il-linji taċ-ċelluli YUMMER1.7 u YUMM1.7 (WT, Gsdme EV, u Gsdme KO) inżammu f'midja kompluta supplimentata b'1 × MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Iċ-ċelloli WM35 u WM793 ġew ikkultivati ​​f'medja MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), li kien fihom 10% FBS f'1 × Leibovitz L-15 medium (Corning, 10-045-CV), 7.5% w/v bikarbonat tas-sodju ( Corning, 25-035-CI), 1 × soluzzjoni antimikotika antibijotika (Gibco, 15140-122), u 5 ug/mL insulina (MilliporeSigma, I0516). Iċ-ċelloli tkabbru f'37 grad fil-preżenza ta '5% CO2. Kimiċi u reaġenti. Il-kimiċi mixtrija kienu jinkludu HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) u DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo-4, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) intuża biex jittebba' ċ-ċelloli għall-kalċju skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Lista ta' antikorpi u inibituri hija pprovduta fit-Tabella Supplimentari 1 u fit-Tabella Supplimentari 2.

Figura 6. NAC ireġġa' lura LLP b'mod dipendenti fuq l-MFSD12-. (A–C)

Estrazzjoni u diġestjoni tal-proteini għal kromatografija likwida – analiżi tal-ispettrometrija tal-massa tandem għall-proteomika. {{0}}.7 × 106 ċelluli tal-melanoma A375P ġew ikkultivati ​​f'platti tal-kultura ta' 60 mm. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'DMSO (kontroll), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM), jew HCQ (3{{70}} μM) għal 24 siegħa f'madwar 5{{ 112}}% konfluwenza. Il-gerbub taċ-ċelluli ffriżati ġew lysed b'50 mM Tris pH 7.4, 1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.15 mM PMSF, 1 ug/mL pepstatin, u 1 ug/mL leupeptin. Lisati ċċarati (10 ug kull wieħed) ġew elettroforesizzati 0.5 ċm f'ġel bis-tris segwit minn iffissar u tbajja 'b'Coomassie kollojdali. Kull korsija tal-ġel ta '0.5 ċm ġiet imnaqqsa, imneħħija, imnaqqsa bi tris (2-carboxyethyl) phosphine, alkylated ma iodoacetamide, u diġerit bi trypsin kif deskritt qabel (36). Diġesti (1 ug) ġew analizzati permezz ta 'kromatografija likwida–spettrometrija tal-massa tandem (LC-MS/MS) fuq spettrometru tal-massa Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) f'konformità ma' nanoAQUITY UPLC (Waters). Separazzjoni analitika saret fuq kolonna Peptide BEH C18 ta’ 1.7 μm × 250 mm (Waters, 186003546) bl-użu ta’ 245-gradjent ta’ minuta b’0.1% aċidu formiku fl-ilma (fażi mobbli A) u aċetonitrile (fażi mobbli B) kif ġej : 5%–30% B fuq 225 minuta, 30%–80% B fuq 5 minuti, 15-minuta żomm fi 80% B, u rritorna għall-kundizzjonijiet inizjali. L-ispettri sħaħ tal-MS ġew akkwistati f'riżoluzzjoni ta' 70,000, b'medda ta' skan ta' 400–2,000 m/z, mira ta' kontroll tal-qligħ awtomatiku ta' 3 × 106 joni, u ħin massimu ta' injezzjoni ta' 50 millisekondi. L-ispettri MS2 li jiddependu mid-dejta ġew akkwistati għall-aqwa 20 joni l-aktar abbundanti f'riżoluzzjoni ta '17,500, b'wisa' ta 'iżolament ta' 1.5 m/z, mira ta 'kontroll awtomatiku tal-qligħ ta' 5 × 104 joni, u ħin massimu ta 'injezzjoni ta' 50 millisekondi. It-tqabbil tal-peptidi ġie ssettjat bħala preferut, u jonji mhux assenjati u ċċarġjati waħedhom ġew irrifjutati (37). Id-dejta mhux ipproċessata tal-MS ġiet analizzata bl-użu ta' MaxQuant 1.6.5.0 (https:// maxquant.net/perseus/) b'database ta' sekwenza umana Uniprot (aċċessata fl-10 ta' Ottubru 2019) u database ta' kontaminanti komuni, inklużi trypsin, keratini, proteini bovini, u mikoplażma (38). L-ispeċifiċità tal-peptide tryptic b'massimu ta '2 qsim mitlufa, modifika fissa fuq cysteine ​​(carbamidomethylation), u ossidazzjoni varjabbli tal-methionine jew aċetilazzjoni N-terminal intużaw fit-tfittxija (39). Qtugħ ta '1% FDR intuża għal peptidi u proteini. Il-partita bejn il-ġirjiet kienet attivata; proteini ġew ikkwantifikati bl-użu ta 'kwantifikazzjoni mingħajr tikketta (40). Analiżi statistika saret bl-użu ta 'Perseus 1.6.2.3 (https:// maxquant.net/perseus/) (41, 42). Il-proteini kienu meħtieġa li jiġu identifikati b'mill-inqas 3 peptidi uniċi u għandhom 3 valuri validi (kwantifikazzjoni mhux żero) fi ħdan grupp ta 'kampjuni, u l-kontaminanti u l-proteini inversi ġew iffiltrati mis-sett tad-dejta. Il-valuri neqsin ġew imputati minn distribuzzjoni normali. Tqabbil f'pari bejn il-kundizzjonijiet twettqu fil-livell tal-proteina bl-użu ta' 2-test t ta' Student b'FDR ibbażat fuq permutazzjoni b's0=0.1 u 250 randomizations. Bidliet sinifikanti ġew definiti bħala FDR ta 'inqas minn 5% u bidla assoluta ta' darbiet akbar minn 1.5 jew 2.0, kif speċifikat. Lyso-IP. Iċ-ċelloli A375P ġew infettati b'lentivirus pLJC5-Tmem192-3xHA u magħżula bl-użu ta' 1 mg/mL puromicin (MilliporeSigma, P4512). Madwar 3 × 106 ċelluli A375P b'tikketta HA ġew ittrattati jew b'10 mM NAC jew b'kontroll tal-vettura tal-ilma għal 24 siegħa f'kundizzjonijiet tal-kultura deskritti qabel. Wara t-trattament, iċ-ċelloli ġew maħsula f'PBS, maħsuda f'0.5 mL KPBS kiesaħ, u omoġenizzati bil-mod bl-użu ta '20 puplesija f'omoġenizzatur Dounce ta' 2 mL. Madwar 2.5% tal-omoġenat kien riżervat għall-analiżi tal-lysate taċ-ċelluli kollha, u l-bqija ġie ċentrifugat fi 3,000g għal 2 minuti f'4 gradi biex jitneħħa d-debris tal-membrana taċ-ċelluli. Is-supernatant omoġenat ġie mbagħad trasferit għal tubu nadif ta '1.5 mL u inkubat b'50 μL żibeġ anti-HA (Pierce, 88836) jew żibeġ anti-DDK/Flag (OriGene, TA150042) għal 15-il minuta f'4 gradi. Il-kampjuni mbagħad ġew preċipitati billi tqiegħdu tubi fuq DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) u mbandlu bil-mod għal 2 minuti f'temperatura tal-kamra. Is-supernatant kien riservat għall-analiżi tal-frazzjoni mhux marbuta. IP inħasel 3 darbiet b'KPBS li kien fih 8 mM CaCl2. Il-Lyso-IP ġie estratt f'80% MeOH għall-analiżi tal-metabolomika. Estrazzjoni u analiżi tal-lipidi bl-użu ta 'LC-MS/MS għal lipidome globali. Iċ-ċelluli tal-melanoma A375P ġew miżrugħa f'platti ta '60 mm f'0.7 × 106 ċelluli għal kull dixx. Meta ċ-ċelloli kienu f'madwar 50% ta 'konfluwenza, ġew ittrattati b'DMSO (kontroll), DC661 (3 μM), jew HCQ (30 μM) għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli ġew maħsula 2 darbiet b'HBSS, mibruxa f'metanol kiesaħ bis-silġ, u ttrasferiti għal tubi tal-ħġieġ għall-estrazzjoni tal-lipidi bi kloroform/metanol/0.88% NaCl (2:1:1) li kien fih standard tal-lipidi intern EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Il-kampjuni ġew vortexed u mbagħad banju ta 'l-ilma ivvibrati għal 5 minuti fuq is-silġ. Wara ċ-ċentrifugazzjoni f'500g għal 15-il minuta f'40 grad, il-fażi t'isfel ġiet trasferita għal tubu tal-ħġieġ ieħor. Il-fażi ta 'fuq ġiet estratta mill-ġdid bl-użu ta' fażi t'isfel sintetika. Wara l-ivvibrar u ċ-ċentrifugazzjoni, il-fażi t'isfel ġiet ikkombinata mal-ġbir tal-ewwel fażi t'isfel. Il-kampjuni ġew imnixxfa taħt nitroġenu, sospiżi mill-ġdid f'10% kloroform/90% metanol, u trasferiti għal kunjetti tal-ħġieġ LTQ. Kampjuni tal-lipidi ġew analizzati fuq spettrometru tal-massa Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X u sistema Vanquish Horizon UHPLC. Is-separazzjoni analitika użat kolonna Accucore C30 (2.1 mm × 150 mm, Thermo Fisher Scientific) b'50:50 acetonitrile/ilma u 88:10:2 isopropanol/acetonitrile/ilma, kull waħda fiha 5 mM ammonju format u 0.1% aċidu formiku. Id-dejta LC-MS/MS ġiet akkwistata separatament f'polaritajiet pożittivi u negattivi bil-parametri tal-istrument li ġejjin: MS1 scan 120,000 riżoluzzjoni; MS2 dipendenti mid-dejta fuq l-ogħla 20 joni l-aktar abbundanti f'15,000 riżoluzzjoni; 0.4 m/z wisa 'iżolament; u enerġija ta 'ħabta normalizzata gradata ta' 20:30:40 (43).

Figura 7. N-acetyl cysteine ​​jipprevjeni l-espressjoni tal-wiċċ tal-calreticulin indotta minn DC661-. (A–D)

Il-lipidi ġew identifikati u kkwantifikati bl-użu ta' LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). L-ispeċi tal-lipidi identifikati ġew iffiltrati minn addotti mistennija u grad ta 'identifikazzjoni ibbażat fuq il-klassi. L-ogħla żoni ġew normalizzati għall-istandards EquiSPLASH għal klassijiet appoġġjati u normalizzati aktar abbażi tal-erja totali għal kull kampjun biex tikkoreġi għall-varjazzjoni fin-numru taċ-ċelluli. Analiżi statistika saret fuq dejta trasformata log bl-użu ta’ Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Estrazzjoni u analiżi ta' metaboliti bl-użu ta' LC-MS/MS għal metabalone. Il-metaboliti polari ġew estratti minn ċelloli sħaħ, frazzjonijiet mhux marbuta Lyso-IP, u kampjuni marbuta Lyso-IP bl-użu ta’ 80% metanol u ġew maħżuna fi –8{{30}} grad qabel il-kromatografija likwida –analiżi tal-ispettrometrija tal-massa (LC-MS). L-estratti ġew analizzati minn LC-MS bl-użu ta 'spettrometru tal-massa Thermo Scientific Q-Exactive HF-X b'sonda HESI II f'konformità ma' sistema Thermo Vanquish Horizon UHPLC. Is-separazzjoni LC saret bl-użu ta 'kolonna ZIC-HILIC (2.1 mm × 150 mm, daqs tal-partiċelli 5 μm, EMD Millipore) b'kolonna ta' protezzjoni ZIC-HILIC (2.1 mm × 20 mm, EMD Millipore) miżmuma f'45 grad b'rata ta 'fluss. ta' 0.2 mL/min. Il-kromatografija saret taħt kundizzjonijiet aċidużi biex titnaqqas ir-reattività tal-gruppi thiol. Il-fażi mobbli A kienet l-ilma u B kienet aċetonitrile, it-tnejn fihom 0.1% aċidu formiku. Il-gradjent LC kien 85% B għal 2 minuti, 85% B sa 20% B fuq 15-il minuta, 20% B sa 85% B fuq 0.1 minuti, u 85% B għal 8.9 minuti. L-awtosampler inżamm f'4 gradi, u 4 μL ta 'kull kampjun ġew injettati għal kull analiżi. Intużaw il-parametri MS li ġejjin: ir-rata tal-fluss tal-gass tal-għant, 40 AU; rata tal-fluss tal-gass awżiljarju, 10 AU; rata tal-fluss tal-gass tal-knis, 2 AU; temperatura tal-heater tal-gass awżiljarju, 350 grad; vultaġġ tal-isprej, 3.75 kV għall-modalità pożittiva u 3.5 kV għall-modalità negattiva; temperatura kapillari, 375 grad; u lembut livell RF, 40%. Il-kampjuni kollha ġew analizzati minn MS sħiħ b'bidla tal-polarità. Scans MS sħaħ ġew akkwistati minn 65 sa 975 m/z b'riżoluzzjoni ta' 120,000 b'mira ta' kontroll tal-qligħ awtomatiku ta' 1 × 106 joni u ħin massimu ta' injezzjoni ta' 100 millisekondi. Id-dejta mhux ipproċessata ġiet analizzata bl-użu ta' TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Metaboliti mmirati ġew identifikati b'massa preċiża u ħin ta 'żamma fil-polarità preferuta tagħhom ibbażata fuq standards analitiċi. L-iskoperta tal-quċċata użat l-algoritmu ICIS bi twittija ta '1. Il-kwantifikazzjoni relattiva saret bl-użu ta' żona tal-quċċata integrata, u dawn il-valuri ġew ikkoreġuti għall-ammont totali għal kull kampjun (definit bħala l-erja tal-quċċata totali). Editjar PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-ċelluli mhux fil-mira u KO ġew ippreparati kif deskritt qabel (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) kien rigal minn Feng Zhang (Addgene plasmid, 48139). Guide RNA oligos (IDT) ġew ittemprati, fosforilati, u mbagħad imqabbda f'plażmid pX459 diġerit u defosforilat b'BbsI wara protokolli tal-laboratorju ta 'Zhang, disponibbli permezz ta' Addgene. Plasmidi ligati ġew trasformati f'ċelloli Stbl3 (Invitrogen). Is-sekwenzjar tal-preparazzjonijiet tal-plasmid ikkonferma l-preżenza tas-sekwenzi ta 'RNA gwida mixtieqa. Iċ-ċelloli A375P ġew trasfettati bl-użu ta 'Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), segwit minn għażla ta' puromycin. Assaġġi ta 'surveyor ikkonfermaw l-editjar tal-ġene PPT1 minn CRISPR/Cas9, u l-knockdown ta' PPT1 ġie kkonfermat permezz ta 'Western blotting b'antikorp PPT1 (Origene). Is-sekwenzi għall-oligos RNA gwida huma kif ġej: RNA gwida mhux fil-mira 'l quddiem (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), gwida mhux fil-mira RNA reverse (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), gwida PPT1 umana RNA 1 'il quddiem (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), gwida PPT1 umana RNA 1 reverse (AAAGGGPTAGTCCAGGCGAA) 'il quddiem (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC), u RNA ta' gwida umana PPT1 3 b'lura (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Il-kloni mkabbra minn ċelloli singoli użati f'din id-dokument jinkludu dan li ġej: il-klonu C8 huwa gwida umana 1 u klonu B5 huwa gwida umana 3. Immunoblotting. Miljun ċellola ġew miksija f'dixx ta '10 ċm, u trattamenti ngħataw l-għada; ċelluli nġabru bil-brix. Lisati taċ-ċelluli sħaħ ġew ippreparati bl-użu ta' buffer ta' liżi SDS. Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet imkejla bl-użu ta' Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). Proteina 30-50 ug intużat għal SDS-PAGE u ġiet trasferita fuq membrana PVDF (Bio-Rad, 1620177). Il-membrana ġiet imblukkata bl-użu ta '5% BSA jew 5% ħalib xkumat, skont il-kundizzjonijiet ottimizzati, u inkubata b'antikorp primarju matul il-lejl f'4 gradi. Il-membrani PVDF ġew maħsula b'1 × TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS-9997) u inkubati għal siegħa f'temperatura ambjentali b'antikorp sekondarju konjugat bl-HRP speċifiku għall-ispeċi. Il-membrani ġew sussegwentement maħsula u żviluppati bl-użu ta 'sottostrat Pierce ECL Western Blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) u films awtoradjografiċi (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Għal studji tal-piroptosi, lisati tal-proteini ġew separati minn SDS-PAGE u trasferiti għal membrani PVDF. Wara l-imblukkar f'5% BSA, membrani PVDF ġew inkubati bl-antikorpi primarji indikati matul il-lejl f'4 gradi, maħsula f'PBS/Tween, u inkubati b'antikorpi sekondarji akkoppjati ma 'perossidasi. L-immunoreattività ġiet skoperta bl-użu ta 'antikorpi sekondarji konjugati bl-HRP (CalBioTech), substrat ta' kimiluminixxenza (Thermo Fisher Scientific), u sistema ta 'immaġini ChemicDoc MP (Bio-Rad). Għal esperimenti li jinvolvu s-supernatant, iċ-ċelluli ġew ikkultivati ​​f'medju ħieles mill-FBS biex tiġi evitata d-distorsjoni ta 'SDS-PAGE. Is-supernatanti taċ-ċelluli ġew maħsuda u ċentrifugati għal 10 minuti f'500g f'4 gradi biex jitneħħew id-debris taċ-ċelluli. Is-supernatanti li rriżultaw ġew ikkonċentrati 10 × bl-użu ta 'Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) permezz ta' ċentrifugazzjoni għal 30 minuta f'4,500g f'4 gradi. Il-konċentrati tħalltu ma 'buffer tal-kampjun u ġew analizzati permezz ta' Western blotting kif deskritt hawn fuq. Tbajja tal-ġel tal-proteina twettqet bl-użu ta 'tbajja' aħmar ta' Ponceau. Assaġġ tal-attività LMP u cathepsin L. Il-plażmid tal-pEGFP-hGal3 uman kien rigal minn Tamotsu Yoshimori (Addgene plasmid, 73080) u ntuża għall-ħolqien tal-linja A375P-Galectin-3. Inxtrat is-sinsla tal-vettur tal-plasmid ta 'kontroll pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Il-plażmidi ġew trasfettati (1 ug/mL) f'ċelloli A375P bl-użu ta 'Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) skont il-protokoll tal-manifattur; ċelluli trasfettati ġew magħżula b'mod stabbli bl-użu ta 'G418 (Gibco, 10131035). Għal LMP, total ta' 25 A375P-galectin-3 ċellula punta-pożittiva f'oqsma multipli tal-immaġni ġew magħduda. Il-perċentwal ta 'ċelluli puncta-pożittivi ġie kkalkulat f'kull qasam separatament, u perċentwal medju ġie kkalkulat għal kull grupp. Il-kit tal-assaġġ Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) intuża skont il-protokoll tal-manifattur. Iċ-ċelloli ġew immaġini taħt mikroskopju invertit Zeiss Axio Observer 7. L-intensità integrata mhux maħduma Magic Red ġiet ikkalkulata bl-użu tas-softwer Fiġi - ImageJ (NIH). MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol{-2-yl]-2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) analiżi tal-vijabbiltà taċ-ċelluli. 2,000 ċellula ġew ibbanjati fi tliet kopji f'kull bir ta 'platt ta' 96-bir, u 3-assaġġi MTT ta 'ġurnata twettqu bl-użu tal-Kit tal-vijabbiltà taċ-Ċelluli (Roche, 11465007001) skont il-protokoll tal-manifattur. It-trattament minn qabel ta 'inibitur ingħata għal siegħa, segwit minn trattament konġunt taċ-ċelloli b'inibituri b'DC661 jew mingħajru. Il-metodu ta 'rigressjoni mhux lineari (twaħħil tal-kurva) intuża biex jiġi kkalkulat IC50.

cistanche tubulosa-titjib tas-sistema immuni

Ikklikkja hawn biex tara l-prodotti Cistanche Enhance Immunity

【Staqsi għal aktar】 Email:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Assaġġ tal-formazzjoni tal-kolonji. 2,000 ċelluli għal kull bir ġew miżrugħa fi pjanċa 6-bir u ġew ittrattati l-għada; ċelluli nżammu taħt it-trattament għal total ta' 8 ijiem. Kolonji ffurmati f'kull bir ġew maħsula b'PBS, iffissati b'metanol kiesaħ fi –20 grad għal 20 minuta, u mtebbgħin b'soluzzjoni akwea Crystal violet 0.5% (V5265; MilliporeSigma).

Assaġġ ta' esklużjoni taż-żebgħa blu Trypan. It-taħlita ta' reazzjoni għall-assaġġ ta' Trypan blue ġiet ippreparata billi tħallat parti 1 ta' 0.4% Trypan blue (25- 900-CI, Corning) u parti 1 ta' kampjuni ta' ċelluli dilwiti. It-taħlita ġiet inkubata għal minuta, u ċ-ċelloli ġew magħduda fuq Cellometer Vision (Nexcelom, Vision-310-0208).

Figura 8. DC661-espressjoni tal-wiċċ tal-calreticulin indotta tħeġġeġ iċ-ċelluli T kontra ċ-ċelluli tat-tumur. (A)

Figura 9. Inokulazzjoni ta' ċelluli ttrattati DC661-tipproduċi rifjut tat-tumur f'kuntesti speċifiċi. (A)

FOAM-LPO. LLP ġie studjat bl-użu ta' sonda fluworexxenti, FOAMLPO. FOAM-LPO ġie sintetizzat kif deskritt qabel (26). Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​fuq 8 Well μSlide (ibid, 80807) u ttrattati b'inibituri u bi jew mingħajr DC661. Iċ-ċelloli ġew inkubati b'midja li kien fiha FOAM-LPO (1 M) f'atmosfera ta '5% CO2 u 95% arja għal 5 minuti f'37 grad. Iċ-ċelloli ġew maħsula darbtejn bil-midja, u mbagħad iċ-ċelloli ġew osservati taħt il-mikroskopju (mikroskopju invertit Zeiss Axio Observer 7) biex jindividwaw il-fluworexxenza li qed tiċċaqlaq minn 586 għal 512 nm b'rispons għal LLP. qRT-PCR u primers. Iċ-ċelloli A375P (3 × 105 ) ġew ikkultivati ​​f'platti ta '60 mm u ġew ittrattati b'DMSO jew DC661 (3 μM) għal 24 siegħa. L-RNA totali ġie iżolat b'kit ta 'iżolament ta' RNA (QIAGEN, 74134) skont il-protokoll tal-manifattur. cDNA ġie sintetizzat bl-użu ta 'kit iScript Reverse Transcriptase b'500 ng ta' RNA purifikat skont il-protokoll tal-manifattur (Thermo Scientific, K1642). Ir-reazzjoni qPCR ġiet stabbilita bl-użu ta 'SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) li kien fih 1 μL cDNA. Il-kejl kollu twettaq fi tliet kopji, u BACTIN intuża bħala standard intern għall-kalkoli ΔCT. L-analiżi tal-espressjoni tal-ġeni saret bl-użu tal-primers li ġejjin: PTGS2/COX-2 'il quddiem (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 b'lura (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS 'il quddiem (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARS bil-quddiem (GACCAGTGATGTCAACAG), CHACAACAG quddiem (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 b'lura (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN 'il quddiem (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT), u BACTIN b'lura (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

trasfezzjoni siRNA. Studji ta 'knockdown ġenetiku għal ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 u MFSD12 tal-bniedem saru f'linji taċ-ċelluli A375P. Studji ta 'inibizzjoni ġenetika għall-ġurdien Ppt1 u Calreticulin saru f'ċelloli MC38. SiRNA mhux fil-mira (sc{{10}}), ULK1 uman (sc-44182), ATG7 (sc{-41447), TAX1BP1/T6BP (sc{-106831), BNIP3 (sc{{20}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc{-97888), ġurdien Ppt1/Cln1 (sc{-142398) u Calreticulin /Calregulin (sc-29895) siRNAs inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology. Dawn is-siRNAs jikkonsistu f'pools ta' 3-5 siRNAs speċifiċi għall-mira. Ċitometrija tal-fluss. L-induzzjoni tal-ferroptożi tkejjel bl-użu ta' C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Iċ-ċelloli A375P ġew miżrugħa fi 6-pjanċa bir-reqqa u ttrattati b'DMSO, ferrostatin{{40}} (10 μM), roxstatin tax-xufftejn-1 (2 μM), elastina (5 μM ), DC661 (3 μM), jew kombinazzjoni għal 24 siegħa. Iċ-ċelluli nħasdu biċ-ċentrifugazzjoni fi 300g għal 5 minuti. Iċ-ċelloli ġew sospiżi mill-ġdid f'500 μL 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) li kien fihom 1 μM C{11-BODIPY u inkubati f'37 grad għal 15-il minuta. Iċ-ċelloli ġew imqassma u ġew sospiżi mill-ġdid f'500 μL 1X HBSS, u l-intensità tal-fluworexxenza ġiet imkejla fuq ċitometru BD LSRII bl-użu ta '530/30 Blue (Università ta' Pennsylvania Flow Core Facility). Il-kwantifikazzjoni tal-espressjoni tal-wiċċ taċ-ċellula ta 'calreticulin għall-mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi twettqet kif deskritt qabel (45) permezz ta' ċitometrija tal-fluss. Iċ-ċelloli B16F10 jew MC38 ġew ikkultivati ​​u ttrattati b'NAC (10 mM) jew DC661 (3 μM) għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli MC38 ġew ittrattati b'siPpt1 jew siNT għal 48 siegħa fil-preżenza jew in-nuqqas ta' 10 mM NAC għal 24 siegħa. Iċ-ċelloli kienu mtebbgħin b'antikorp CALR (Cell Signaling Technology, 12238), Alexa Fluor 647 mogħoż anti-fenek tieni antikorp (Invitrogen), u propidium iodide (PI) (Biolegend, 421301). Kampjuni mtebbgħin ġew akkwistati fuq ċitometru tal-fluss BD LSRII bl-użu ta '710/50 Blu u 670/30 Aħmar biex jaqbdu l-fluworexxenza PI u CALR, rispettivament (il-faċilità Flow Core tal-Università ta' Pennsylvania), u l-analiżi kienet ristretta għal ċelloli pożittivi għal CALR u negattivi għal PI biex jiġu evitati avvenimenti pożittivi foloz. Priming taċ-ċelluli T u ċitotossiċità perċentwali. Iċ-ċelloli tat-tumur B16 jew MC38 (5 × 104) ġew ikkultivati ​​u ttrattati b'NAC (10 mM) jew DC661 (1 μM jew 3 μM), rispettivament għal 24 siegħa. Għall-inibizzjoni ġenetika Calr, iċ-ċelloli MC38 ġew ittrattati b'Calr siRNA jew nontarget siRNA (siNT) għal 48 siegħa, segwiti minn trattament jew b'DMSO jew 3 μM DC661 għal 24 siegħa. L-isplenoċiti mbagħad ġew ikkultivati ​​b'DC661 bi jew mingħajr ċelluli B16 jew MC38 fil-preżenza ta' IL-2 (5 IU/mL) u kkultivati ​​flimkien għal 72 siegħa. Il-priming ġie kkonfermat minn IFN-ELISA (Biolegend, 430815) tas-supernatant. Splenocytes ipprajmata mbagħad ġew kokulturati b'ċelluli B16 jew MC38 ikkultivati ​​friski b'proporzjoni ta 'mira għal effett (B16 jew MC38 għal splenocytes) ta' 1:20 u 1:50 għal ċelloli B16 u MC38, rispettivament. Ir-rilaxx tal-LDH assoċjat mal-mewt taċ-ċelluli B16 jew MC38 u mbagħad il-perċentwal taċ-ċitotossiċità tkejjel skond il-protokoll tal-manifattur (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Assays ta' tilqim kontra t-tumur u studji ta' kimoterapija b'mudelli ta' kanċer stabbiliti. Ġrieden femminili WT C57BL/6 ta’ bejn sitt u tmien ġimgħat, ġrieden NOD/SCID u BALB/c inkisbu minn The Jackson Laboratory. Għal esperimenti ta 'tilqim kontra t-tumur, iċ-ċelloli WT B16F10, MC38, u CT26 ġew ittrattati b'DC661 (3 μM) għal 36 siegħa f'kunjett ta' 175 cm2. Imbagħad, is-supernatanti u ċ-ċelloli maqtugħin inġabru f'tubu falcon ta '50 mL. Iċ-ċelloli ġew ċentrifugati u maħsula b'PBS kiesaħ bis-silġ. Għat-tilqim, 150 μL sospensjoni ċellulari ġiet injettata sc fil-ġenb tax-xellug tal-ġrieden immunokompetenti C57BL/6, ġrieden immunodefiċjenti NOD/SCID (1.8 × 104 ċelluli B16F10, 1.5 × 106 ċelluli MC38 għal kull ġurdien), jew syngeneic mice BAL3B/. × 106 ċelluli CT26 għal kull ġurdien). Iċ-ċelluli mħallta bil-friża sospiżi mill-ġdid fil-PBS ġew injettati bħala kontroll negattiv. Ġimgħa wara, ċelluli ħajjin tal-kanċer tal-istess tipi (3 × 104 ċelluli B16F10, 2 × 105 ċelluli MC38, jew 5 × 105 ċelluli CT26 għal kull ġurdien) b'volum ugwali ta 'Matrigel (Corning, 354248) ġew injettati fil-ġenb tal-lemin. tal-ġrieden imlaqqma. It-tumuri ġew imkejla bl-użu ta 'kalipers elettroniċi, u l-volum ġie kkalkulat bħala L × W2 × 0.5. It-tkabbir tat-tumur kien immonitorjat regolarment għall-jiem ta' wara, u n-nuqqas ta' tumuri kien ikkunsidrat bħala indikazzjoni ta' tilqim effiċjenti kontra t-tumur. Studji dwar it-tilqim DC661-MC38 ġew ripetuti fi ġrieden NOD/SCID. Statistika. Is-sinifikat statistiku ġie determinat bl-użu tat-test t ta' 2-denb mhux imqabbad ta' Student meta tqabbel 2 gruppi. Il-{175}}mod kif intuża t-test ANOVA meta tqabblu aktar minn 2 gruppi. Ipotesi nulla ġiet miċħuda b'mod sinifikanti jekk il-valur P kien inqas minn 0.05. Id-dejta tintwera bħala l-medja ± SEM. Approvazzjoni ta' studju. L-esperimenti kollha fuq l-annimali twettqu skont il-protokolli approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali tal-Università ta 'Pennsylvania.

Ċiniż herb cistanche plant-Antitumor

Referenzi

1. Zeh HJ, et al. Studju randomizzat ta' fażi II qabel l-operazzjoni ta' inibizzjoni ta' l-awtofaġija b'doża għolja ta' hydroxychloroquine u gemcitabine/Nab-paclitaxel f'pazjenti bil-kanċer tal-frixa. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW, et al. PPT1 jippromwovi t-tkabbir tat-tumur u huwa l-mira molekulari tad-derivattivi tal-chloroquine fil-kanċer. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, et al. GNS561, inibitur ġdid tal-awtofaġija attiv kontra ċ-ċelloli staminali tal-kanċer f'karċinoma epatoċellulari u metastasi epatika mill-kanċer tal-kolorektum. J Kanċer. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, et al. GNS561, inibitur PPT1 fl-istadju kliniku, huwa effiċjenti kontra l-karċinoma epatoċellulari permezz tal-modulazzjoni tal-funzjonijiet liżosomali. Awtofaġija. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, et al. Il-permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali u r-rilaxx tal-cathepsin huwa avveniment li jamplifika l-apoptosi fil-fibroblasti u l-monoċiti dipendenti fuq Bax/ Bak. Mewt Ċellula Differenti. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali fil-mewt taċ-ċelluli. Onkoġenu. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW, et al. Approċċ unifikat biex jimmira r-rwoli degradattivi u ta' sinjalazzjoni tat-tkabbir tal-liżosoma. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R, et al. Ferroptożi, nekroptożi, u piroptożi fl-immunità kontra l-kanċer. J Hematol Oncol. 2020;13(1):110.

9. Yamamoto K, et al. L-awtofaġija tippromwovi l-evażjoni immuni tal-kanċer tal-frixa billi tiddegrada l-MHCI. Natura. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, et al. L-inibizzjoni ta 'ULK1 tegħleb il-preżentazzjoni kompromessa ta' l-antiġen u tirrestawra l-immunità antitumorali fil-kanċer tal-pulmun mutant LKB1. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, et al. L-ubiquitin kinase PINK1 jirrekluta riċetturi awtofaġiċi biex jinduċu mitofaġija. Natura. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB, et al. TAX1BP1 trażżan l-apoptosi indotta mill-virus billi tiffaċilita d-degradazzjoni medjata mill-ħakk tal-adapter mitokondrijali MAVS. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, et al. Bnip3 ifixkel il-bijoenerġija mitokondrijali u jistimula t-tibdil mitokondrijali. Mewt Ċellula Differenti. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, et al. Bażi mekkanistika għal ferroptożi indebolita f'ċelloli li jesprimu l-varjant S47 iċċentrat fuq l-Afrika ta 'p53. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, et al. Inibituri mutanti ta' BRAF u MEK jirregolaw il-mikroambjent immuni tat-tumur permezz ta' piroptosi. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali fil-mewt taċ-ċelluli: evidenza ġdida u implikazzjonijiet għas-saħħa u l-mard. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, et al. L-awtofaġija indotta mill-quinacrine fil-kanċer tal-ovarji tqanqal il-permeabilizzazzjoni tal-membrana lisosomali/mitokondrijali medjata minn cathepsin-L u l-mewt taċ-ċelluli. Kanċers (Basel). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, et al. Apoptosi dipendenti fuq Cathepsin attivata minn attivazzjoni superottimali ta 'limfoċiti T: mekkaniżmu possibbli ta' tolleranza ta 'doża għolja. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, et al. Id-defiċjenza ta' Ppt1-tirregola l-omeostażi liżosomali ta' Ca++ li tikkontribwixxi għall-patoġenesi f'mudell tal-ġrieden tal-marda CLN1. J Wiret Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM, et al. Il-fosfolipasi u l-ispeċi reattivi tal-ossiġnu dderivaw bijomarkaturi tal-lipidi f'bnedmin u annimali b'saħħithom u morda - fokus fuq lysophosphatidylcholine. Quddiem Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, et al. Effikaċja ta 'N-acetylcysteine ​​fit-trażżin fenotipiku ta' mudelli tal-ġrieden tal-marda Niemann-Pick, tip C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, et al. N-acetylcysteine ​​jipprevjeni stress ossidattiv indott minn olanzapine fin-newroni ipotalamiċi mHypoA-59. Sci Rep 2020;10(1):19185.

23. Khare S, et al. ASS1 u ASL jrażżnu t-tkabbir f'karċinoma taċ-ċelluli tal-kliewi taċ-ċelluli ċari permezz ta' metaboliżmu mibdul tan-nitroġenu. Kanċer Metab. 2021;9(1):40.

24. Gęgotek A, et al. Tqabbil tal-effett protettiv tal-aċidu askorbiku fuq l-interazzjonijiet tas-sistemi redox u endocannabinoid in vitro kkultivati ​​fibroblasti tal-ġilda tal-bniedem esposti għal radjazzjoni UV u perossidu tal-idroġenu. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, et al. L-isfruttament tal-vulnerabbiltajiet taċ-ċelluli tal-kanċer biex tiġi żviluppata terapija kombinata għal tumuri mmexxija mir-ras. Ċellula tal-Kanċer. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, et al. Monitoraġġ tal-perossidazzjoni tal-lipidi fi ħdan iċ-ċelloli tal-fowm permezz ta 'sonda razzjonometrika li tista' tiġi mmirata għal liżosomi. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, et al. Analiżi bbażata fuq il-bijoinformatika tiżvela MFSD12 elevat bħala promotur ewlieni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli u mira terapewtika potenzjali fil-melanoma. Onkoġenu. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, et al. N-Acetylcysteine ​​bħala antiossidant u aġent tat-tkissir tad-disulfide: ir-raġunijiet għaliex. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, et al. Il-metabolomika liżosomali tiżvela regolazzjoni dipendenti fuq V-ATPase u mTOR ta 'effluss ta' aċidu amminiku minn liżosomi. Xjenza. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, et al. Mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi fit-terapija tal-kanċer: Indutturi preżenti u emerġenti. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, et al. L-inibizzjoni ta' PPT1 ittejjeb l-attività kontra t-tumur ta' antikorp anti-PD-1 fil-melanoma. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, et al. BAMM (BRAF autophagy u inibizzjoni MEK fil-melanoma): prova ta' fażi I/II ta' dabrafenib, trametinib, u hydroxychloroquine f'melanoma mutanti BRAFV600-avvanzata. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, et al. Il-proteini makroawtofaġiji jikkontrollaw il-livelli tal-MHC klassi I fuq ċelluli dendritiċi u jsawru risponsi taċ-ċelluli T CD8(+) anti-virali. Cell Rep 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, et al. Il-mobilizzazzjoni taċ-ċisteina lisosomali tifforma r-rispons tat-TORC1 u t-tkabbir tat-tessut għas-sawm. Xjenza. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteine: reviżjoni ta 'utilità klinika (mediċina antika bi tricks ġodda). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Birra LA, et al. Skoperta sistematika ta' bijomarkaturi tas-serum tat-tqala ektopika bl-użu ta' 3-profil tal-proteina D flimkien ma' kwantifikazzjoni mingħajr tikketta. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, et al. L-effett primarju fuq il-proteome tal-karċinoma taċ-ċelluli ċari ta' l-ovarji b'mutazzjoni ta' ARID1A huwa r-regolazzjoni 'l isfel tal-passaġġ mevalonate fil-livell ta' wara t-traskrizzjoni. Proteomika taċ-Ċellola Mol. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant jippermetti rati għoljin ta 'identifikazzjoni tal-peptidi, preċiżjoni individwalizzata tal-massa ta' firxa ta 'ppb, u kwantifikazzjoni tal-proteomi kollha. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, et al. Andromeda: magna tat-tiftix tal-peptidi integrata fl-ambjent MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, et al. Kwantifikazzjoni preċiża mingħajr tikketta madwar il-proteome permezz ta 'normalizzazzjoni mdewma u estrazzjoni massima tal-proporzjon tal-peptide, imsejħa MaxLFQ. Proteomika taċ-Ċellola Mol. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, et al. Il-pjattaforma komputazzjonali Perseus għal analiżi komprensiva tad-dejta (prote)omika. Metodi Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: pjattaforma bijoinformatika għal analiżi integrattiva tad-dejta tal-proteomika fir-riċerka tal-kanċer. Metodi Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, et al. Bidliet fil-metaboliżmu tal-lipidi tal-fibroblasti tal-età jinduċu reżistenza taċ-ċelluli tal-melanoma dipendenti fuq l-età għal terapija mmirata permezz tat-trasportatur tal-aċidu xaħmi FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA, et al. Inġinerija tal-ġenoma bl-użu tas-sistema CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P, et al. Kwantifikazzjoni ta' espożizzjoni ta' calreticulin assoċjata ma' mewt taċ-ċelluli immunoġeniċi. Metodi Enzymol. 2020;632:1–13.