Konċentrazzjonijiet Baxxi Ta 'Paraquat Induċi Attivazzjoni Bikrija Ta' Kinase 1/2 Irregolat minn Sinjal Extraċellulari, Protein Kinase B, U C-Jun N-terminal Kinase 1/2 Mogħdijiet: Rwol Ta 'C-Jun N-Terminal Kinase f'Mewt taċ-Ċelloli Indotti minn Paraquat

Kuntatt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Email:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Jose´ M. Mora´n, Lourdes Garcı´a-Rubio, Ana Go´mez-Martı´n, Rosa A. Gonza´lez-Polo, German´n Soler,§ u Jose´ M. Fuentes

Astratt:

Paraquat huwa erbiċida b'riskju potenzjali li jinduċi parkinsoniżmu minħabba n-newrotossiċità murija tiegħu u x-xebh strutturali qawwi tiegħu ma' 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP plus ), newrotossina magħrufa li tikkawża sindromu kliniku simili. biexmarda ta' Parkinson(PD). Madankollu, fil-preżent ftit li xejn huwa magħruf dwar il-mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni attivati ​​mill-paraquat fi kwalunkwe sistema taċ-ċelluli. F'dan l-istudju, investigajna l-effett tal-paraquat fuq kinases 1 u 2 (ERK1/2) regolati minn sinjal extraċellulari, c-Jun N-terminal kinase (JNK), u proteina kinase B (PKB) attivazzjoni fiċ-ċelloli E18. Konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat stimulaw żidiet bikrija ħafna fil-fosforilazzjoni ta' ERK1/2, JNK1/2, u PKB. L-inibituri ta' phosphatidylinositol 3-kinase (PI{-3K) wortmannin u LY 294002 (2-({4-morpholinyl)-8-phenyl-4H{{ 19}}benzopyran-4-one) inibixxi żidiet bikrija indotti minn paraquat fil-fosforilazzjoni ta' PKB. Barra minn hekk, żidiet bikrija medjati mill-paraquat fl-attivazzjoni ERK1/2 kienu sensittivi għall-inibitur PD 98059(2#-amino-3#-methoxyflflavone tal-proteina kinase kinase 1 (MEK1) attivat mill-mitoġenu), filwaqt li r-risponsi JNK1/2 kienu imblukkat mill-inibitur JNK1/2 SP 600125 (anthra[1-9-cd]pyrazol-6(2H)-one). Trattament minn qabel b'wortmannin, LY 294002, jew PD 98059 ma affettwax il-mewt taċ-ċelluli paraquat fiċ-ċelloli E18. B'kuntrast, SP 600125 naqqas b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat fiċ-ċelloli E18. Bħala konklużjoni, urejna li konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat jistimulaw żidiet robusti kmieni ħafna fil-fosforilazzjoni ERK1/2, JNK1/2, u PKB fiċ-ċelloli E18. Barra minn hekk, id-dejta ppreżentata tissuġġerixxi li l-inibizzjoni tal-mogħdija JNK1/2 tipproteġi ċ-ċelloli E18 mill-mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn paraquat u tappoġġja l-fatt li l-inibizzjoni tal-attivazzjoni bikrija ta 'JNK1/2 tista' tikkostitwixxi strateġija potenzjali fit-trattament tal-PD. Kliem Ewlenin: paraquat; konċentrazzjonijiet baxxi; JNK; mewt taċ-ċelluli; Parkinson.

Ħwawar kontra l-marda ta' Parkinson:cistanche

INTRODUZZJONI

il-marda ta' Parkinson (PD)huwa disturb newrodeġenerattiv ikkaratterizzat mill-mewt ta 'newroni dopaminerġiċi fis-sub-Constantia nigra flimkien ma' inklużjonijiet intraċitoplasmiċi magħrufa bħala korpi Lewy (Olanow u Tatton, 1999). 5-10 fil-mija biss tal-pazjenti PD għandhom forma familjari ta 'din il-marda b'mod awtosomali dominanti ta' wirt (Gasser, 2001). Fatturi ġenetiċi huma importanti f'pazjenti żgħażagħ, iżda x'aktarx mhux se jkollhom rwol ewlieni fil-PD sporadiku aktar komuni. B'kuntrast, studji epidemjoloġiċi jindikaw diversi fatturi ambjentali li jżidu r-riskju li tiżviluppa PD(marda ta' Parkinson). Dawn kienu jinkludu pestiċidi, erbiċidi, kimiċi industrijali, biedja, u għajxien f'ambjent rurali (Cory-Slechta et al.,2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner and BenShlomo, 1999). L-aktar argument konvinċenti li jappoġġja fattur ambjentali fil-PD huwa relatat mal-iskoperta tal-effetti bijoloġiċi tal-MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6- tetrarchy-dropyridine). Din it-tossina tas-sistema nervuża ċentrali tipproduċi sindromu li huwa kemm klinikament kif ukoll anatomikament simili għall-PD (Kopin u Markey, 1988; Langston et al., 1983). F'dan is-sens, il-paraquat erbiċida użat ħafna (1,1#-dimethyl-4,4#-bypiridinium) ġie ssuġġerit bħala fattur ta' riskju putattiv ibbażat kemm fuq l-omoloġija strutturali tiegħu mal-MPPþ, il-metabolit attiv tal-MPTP ( Tanner u Langston, 1990), u dwar rapporti ta’ parkinsoniżmu korrelatati ma’ espożizzjoni għall-aġent (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; al., 1992). Madankollu, filwaqt li l-mogħdijiet tas-sinjalar involuti fil-mewt taċ-ċelluli MPPþ huma magħrufa sew (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), ftit li xejn hu magħruf dwar il-mogħdijiet tas-sinjalar attivati. minn paraquat (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Xorta waħda, m'hemm l-ebda studji dwar avvenimenti bikrija osservati wara espożizzjoni għal konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat.

Diversi stimuli, inklużi MPPþ u paraquat, jistgħu jattivaw firxa ta 'kaskati ta' sinjalazzjoni intraċellulari li huma assoċjati mill-qrib kemm mal-mewt taċ-ċelluli kif ukoll mal-mogħdijiet tas-sopravivenza taċ-ċelluli. Pereżempju, MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al.,2002) jattiva membri tal-familja tal-proteina kinase attivata minn mitoġenu (MAPK) u proteina kinażi B (PKB). Il-membri tal-familja TheMAPK huma attivati ​​minn MPPþ jew paraquat jinkludu kinases extraċellulari 1 u 2 (ERK1/2), c-Jun N-terminal kinases (JNK1 u JNK2), u p38 MAPKs. Huwa ġeneralment aċċettat li ERK1/2 u l-attivazzjoni PKB tippromwovi s-sopravivenza taċ-ċelluli billi tattiva mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni anti-apoptotic, billi l-attivazzjoni ta' JNK1/2 u p38 MAPK hija assoċjata ma 'mewt taċ-ċelluli newronali (Harper u LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . L-attivazzjoni tal-passati phosphatidylinositol 3-kinase (PI{-3K)/PKB hija involuta fis-sopravivenza newronali (Shin et al., 2001). B'mod partikolari, l-attivazzjoni tal-mogħdija JNK1/2 jista' jkollha rwol kritiku fit-tossiċità tal-MPP u paraquat (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al.,2002; Peng et al., 2004) u konsegwentement fil-proċessi ċellulari li huma affettwati f' PD(marda ta' Parkinson).

Cistanche tal-ħxejjex: Il-marda ta' Kontra l-Parkinson

MATERJALI U METODI

Linja taċ-ċelluli u kultura.

F'dan l-istudju ntużaw neuroblasts tal-moħħ tal-firien immortalizzati spontanjament, ċelluli E18. Il-linja taċ-ċelluli E18 inkisbet permezz ta’ immortalizzazzjoni spontanja minn kulturi ta’ 18-kortiċi ċerebrali tal-firien tal-fetu ta’ ġurnata u ġiet ġentilment ipprovduta minn Dr. A. Mun˜oz (Instituto de InvestigacionesBiomédicas, CSIC, Madrid, Spanja) . Iċ-ċelloli E18 jirrappreżentaw newroblasts primittivi li jesprimu NF 68 u l-markatur newronali primittiv nestin iżda m'għandhomx il-markatur tal-astroċiti, proteina aċiduża fibrillari glial. Wara induzzjoni ta 'divrenzjar parzjali b'dibutyryl-cAMP, iċ-ċelloli jesprimu markaturi newronali addizzjonali bħal NF 145, NF 220, u enolase speċifiku għan-newroni (Mun˜oz, komunikazzjoni personali). Iċ-ċelloli tkabbru f'Hanks' F-12 (Hyclone, Brevieres, Franza) u supplimentati b'10 fil-mija FCS (Hyclone), streptomycin (100 mg/ml), u peniċillina (100 U/ml). Iċ-ċelloli ġew miżrugħa f'5 3 10 5 fi flixkun tal-kultura tat-tessuti 75-cm2 (TPP, Trasadingen, l-Isvizzera) u inkubati f'37 C taħt atmosfera ta' 5 fil-mija CO2/95 fil-mija ta' l-arja. Il-kulturi ġew mgħoddija darba fil-ġimgħa permezz ta 'trypsinization bl-użu ta' soluzzjoni trypsin-EDTA (Hyclone).

Trattamenti taċ-ċelluli.

Ċelloli konfluwenti (~ 80 fil-mija) fi fliexken tal-kultura tat-tessuti ta' 75-cm2 ġew trypsinizzati u miżrugħa f'platti tal-kultura tat-tessuti f'konċentrazzjoni ta' 5 3104 ċelluli/cm2. Erbgħa u għoxrin siegħa wara, il-mezz ġie aspirat u mibdul b'mezz frisk waħdu jew medju li kien fih il-konċentrazzjonijiet indikati ta' paraquat. F'esperimenti ulterjuri, konċentrazzjonijiet differenti ta 'inibituri tal-kinażi (LY 294002, wortmannin, SP 600125, u PD(marda ta' Parkinson)98059, kollha minn Tocris, Bristol, ir-Renju Unit) ġew miżjuda 30 minuta qabel l-espożizzjoni għall-paraquat. Peress li l-inibituri tal-kinase ġew maħlula f'dimethyl sulfoxide, saru kontrolli bl-ogħla konċentrazzjoni użata (0.2 fil-mija vol/vol). Iż-żieda ta 'dimethyl sulfoxide ma affettwax il-valuri tal-vijabbiltà tal-pjanċi ta' kontroll.

Assaġġ tal-vijabbiltà taċ-ċelluli.

Il-vijabbiltà taċ-ċelluli kienet iddeterminata bl-assaġġ kolorimetriku MTT (Mosmann, 1983). F'ċelloli vijabbli, l-enżima mitokondrijali succinate dehydrogenase tista' timmetabolizza MTT f'żebgħa formazan li tassorbi d-dawl f'570 nm. Għal dawn l-esperimenti, intużaw 24-pjanċi tat-test tajjeb. Fl-aħħar ta' kull trattament, 100 ll ta' MTT ippreparat f'konċentrazzjoni ta' 5 mg/ml f'PBS ġie miżjud ma' kull pjanċa. Wara 3 sigħat ta 'inkubazzjoni, il-medju ġie dekantat, u l-preċipitati tal-formazan ġew solubilizzati b'isopropanol aċiduż (0.04-0.1 N HCl f'isopropanol assolut). L-assorbenza taż-żebgħa kkonvertita ġiet imkejla f'wavelength ta '570 nm bi tnaqqis fl-isfond f'630-690 nm. L-assorbiment tal-kulturi mhux ittrattati ġie stabbilit għal 100 fil-mija.

Biex tikkonferma r-riżultati miksuba mill-assaġġ MTT, il-mewt taċ-ċelluli ġiet evalwata wkoll billi tkejjel ir-rilaxx tal-enżima ċitosolika lactate dehydrogenase (LDH) għall-medju tal-kultura bl-użu ta’ kit kolorimetriku tal-analiżi LDH (Roche, Indianapolis, IN) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur . It-tnixxija tal-LDH kienet definita bħala l-proporzjon tal-attività tal-LDH fil-mezz tal-kultura għall-attività totali għal kull bir (3100). Data komparabbli nkisbet bl-użu taż-żewġ metodi.

Preparazzjoni ta 'estratti taċ-ċelluli u analiżi Western blot.

Wara trattamenti sperimentali, iċ-ċelluli (ikkultivati ​​f'platti ta' 60-mm) ġew laħlaħ darbtejn b'PBS kiesaħ u tneħħew permezz ta' skrappjar u mbagħad ċentrifugati fi 900 3 g għal 5 min f'4 C. Iċ-ċelloli ġew lisati f'buffer li jkun fih 50mM HEPES, pH 7.5, 300mMNaCl, 1 fil-mija Triton X-100, 2mM EDTA, 5mM MgCl2, 25mM NaF, 1mMNa3VO4, u Protease Inhibitor Cocktail (Sigma, St Louis, MO). Iċ-ċelloli ġew ċentrifugati fi 13,000 3 g għal 5 min f'4 C. Is-supernatanti ġew maħżuna f'80 C sakemm jiġu analizzati b'Western blot. Il-konċentrazzjoni tal-proteina kienet imkejla skond Bradford (1976) bl-użu ta' BSA bħala standard.

Ammonti ugwali ta 'proteini (10 LG għal kull kundizzjoni) ġew solvuti fi 12 fil-mija elettroforeżi tal-ġel SDS u ttrasferiti għal membrani PVDF skont metodi konvenzjonali parzjalment modifikati (Fuentes et al., 2000). Fil-qosor, il-proteini ġew trasferiti (250 mA għal 60 min) għal membrani PVDF bl-użu ta 'apparat Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad, Hercules, CA). Il-proċedura għall-immunodetection tinkludi t-trasferiment u l-imblukkar tal-membrana (60 min f'temperatura tal-kamra) b'TTBS (10mM Tris/HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, u 0.2 fil-mija Tween-20) li jkun fih 10 fil-mija ħalib imnixxef mingħajr xaħam. Il-membrani ġew imbagħad inkubati għal 60 min f'temperatura ambjentali b'antikorpi primarji poliklonali tal-fenek (kollha minn Cell Signalling, Beverly, MA, dilwit 1:1000) f'TTBS þ 10 fil-mija ħalib imnixxef mingħajr xaħam jew 5 fil-mija BSA. Wara l-ħasil (għal żewġ perjodi 5-min b'TTBS), membrani ġew inkubati (60 min f'temperatura tal-kamra) b'antikorpi sekondarji kontra l-fenek konjugati bil-perossidasi (1:5000 f'TTBS b'10 fil-mija ħalib imnixxef mingħajr xaħam). Wara l-ħasil (għal żewġ perjodi 5-min u perjodu wieħed 10-min), l-iskoperta ta’ antikorpi marbuta ġiet viżwalizzata permezz ta’ kimiluminixxenza bl-użu tar-reaġent ECL-plus (Amersham Biosciences, Orsay, Franza) u analizzata bil-Kwantità Softwer wieħed (Bio-Rad). Il-kontenut ta' actin ġie analizzat bħala kontroll bl-użu ta' antikorp poliklonali tal-fenek (minn Sigma) dilwit 1:2500 f'TTBS b'10 fil-mija ħalib imnixxef mingħajr xaħam).

Analiżi statistika.

Kull esperiment kien ripetut mill-inqas tliet darbiet b'korrelazzjoni sodisfaċenti bejn ir-riżultati ta 'esperimenti individwali. Id-dejta murija hija dik ta' esperiment rappreżentattiv; kull grupp kien medja ta 'tlieta sa erba' platti tal-kultura. Id-dejta kollha hija espressa bħala l-medja ±SEM. Ir-riżultati ġew analizzati mill-ANOVA. Il-valuri p inqas minn 0.05 tqiesu sinifikanti.

Il-marda ta' kontra l-Parkinson:Estratt ta' Cistanche

RIŻULTATI

Effetti ċitotossiċi ta 'Paraquat fiċ-Ċelloli E18

Kif irrappurtat qabel (Cappelletti et al., 1998; Chun et al.,2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), diversi linji taċ-ċelluli huma sensittivi għall-proprjetajiet tossiċi tal-paraquat. L-espożizzjoni għal paraquat ikkawżat tnaqqis fil-vijabbiltà taċ-ċelluli li jiddependi mid-doża. (Fig. 1.) F'dan l-istudju, ċelluli E18 ittrattati b'25lM paraquat għal 24 siegħa urew telf ta '50 fil-mija tal-vijabbiltà taċ-ċelluli. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet evalwata billi tkejjel it-trasformazzjoni għal MTT f'żebgħa formazan li tassorbi d-dawl f'570 nm. Dan l-assaġġ jintuża b'mod estensiv biex jimmonitorja l-mewt taċ-ċelluli f'diversi linji taċ-ċelluli, inklużi ċelloli E18 (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al.,2001), u insulti differenti, inkluż paraquat (Chun et al.,2001; Gonzalez). -Polo et al., 2004).

Attivazzjoni Indotta minn Paraquat ta 'ERK1/2 fiċ-Ċelloli E18

Żidiet fl-attivazzjoni ERK1/2 fiċ-ċelloli E18 ittrattati b'paraquat ġew immonitorjati permezz ta' Western blotting bl-użu ta' antikorp fosfospecific ERK1/2 (Thr202/Tyr204). L-espożizzjoni taċ-ċelloli E18neuroblasts b'25lM paraquat ipproduċiet żieda notevoli fl-istatus ta 'fosforilazzjoni (Thr202/Tyr204) ta' ERK1/2 (44/42 kDa) (Fig. 2A). Żidiet massimi fil-fosforilazzjoni seħħew wara 5 min, u wara l-livelli ta 'fosforilazzjoni jonqsu bil-mod għal livelli qrib bażali. Barra minn hekk, iż-żidiet fil-fosforilazzjoni ERK1/2 indotti minn paraquat ma kinux dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Fig. 2B). Pretrattament bl-inibitur theMEK1, PD(marda ta' Parkinson)98059 (50lM; Dudley et al., 1995) inibixxi kompletament iż-żidiet indotti minn paraquat fl-ERK1/2phosphorylation (Fig. 3).

Attivazzjoni Indotta minn Paraquat ta' PKB fiċ-Ċelloli E18

L-attivazzjoni ta 'PKB fiċ-ċelloli E18 ġiet skoperta permezz ta' Western blotting bl-użu ta 'antikorp fosfo-specific (Ser473). L-istimulazzjoni taċ-ċelloli E18 b'25lM paraquat ipproduċiet żieda notevoli fil-fosforilazzjoni PKB (Fig. 4A). Din iż-żieda sseħħ wara 20 min, komparabbli ma 'dak ta' fosforilazzjoni ERK1/2 wara li l-livelli ta 'fosforilazzjoni naqsu bil-mod għal livelli bażali qrib (Fig. 4A). Barra minn hekk, żidiet medjati mill-paraquat fil-fosforilazzjoni PKB kienu dipendenti fuq il-konċentrazzjoni b'massimu ta '25lM ta' paraquat (Fig. 4A). Peress li l-PI-3K huwa meħtieġ għall-attivazzjoni tal-PKB, ir-rwol tal-PI{-3K fl-attivazzjoni tal-PKB indotta minn paraquat fiċ-ċelloli E18 kien, għalhekk, esplorat bl-użu tal-inibituri PI{-3K wortmannin u LY 294002.

Żidiet medjati minn Paraquat fil-fosforilazzjoni PKB kienu kompletament imblukkati wara trattament minn qabel (30 min) ta 'E18cells b'100nM wortmannin u 30lM LY 294002 (Fig. 5). Dawn l-osservazzjonijiet juru li mogħdija dipendenti fuq PI-3K timmedja żidiet indotti mill-paraquat fil-fosforilazzjoni PKB fiċ-ċelloli E18.

Attivazzjoni Indotta minn Paraquat ta 'JNK1/2 fiċ-Ċelloli E18

Studji preċedenti wrew li l-paraquat jattiva n-newroni JNK1/2in (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) u ċelluli mhux newronali (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Madankollu, il-konċentrazzjonijiet użati huma fil-biċċa l-kbira ogħla minn dawk impjegati f'dan ix-xogħol. Barra minn hekk, il-ħinijiet magħżula biex jivviżwalizzaw l-attivazzjoni JNK1/2 huma wkoll itwal. L-attivazzjoni ta 'JNK1/2 fiċ-ċelloli E18 ġiet skoperta permezz ta' Western blotting bl-użu ta 'antikorp JNK fosfospecific (Thr183/Tyr185). L-istimulazzjoni taċ-ċelloli E18 b'25lM paraquat ipproduċiet żieda notevoli u bikrija fil-fosforilazzjoni ta' JNK (46/54 kDa) (Fig. 6A). Dawn iż-żidiet kienu massimi wara 5 min wara li l-livelli ta 'fosforilazzjoni naqsu lejn livelli bażali (Fig. 6A). Madankollu, żidiet paraquatmediated fil-fosforilazzjoni JNK1/2 ma kinux dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Fig. 6B). Żidiet medjati minn paraquat fil-fosforilazzjoni JNK1/2 kienu sensittivi għall-inibitur theJNK1/2 SP 600125 (10lM; Fig. 7; Bennett et al.,2001). Fl-aħħarnett, paraquat (25lM) ma stimulax żidiet li jistgħu jitkejlu fil-fosforilazzjoni ta 'p38 MAPK fiċ-ċelloli E18 fl-istess esperimenti tal-kors tal-ħin (dejta mhux murija). Dawn l-esperimenti twettqu bl-użu ta 'antikorp fosfospecific p38 MAPK(Thr180/Tyr182).

Kejl tal-Vijabilità taċ-Ċelloli Wara Trattament taċ-Ċelloli E18 b'Inibituri ta' Paraquat u Kinase

Wara li wrejna li l-paraquat jipproduċi fil-każijiet kollha attivazzjoni bikrija ERK1/2, PKB, u JNK1/2 fiċ-ċelloli E18, sussegwentement iddeterminajna r-rwol tal-attivazzjoni mgħaġġla ta’ dawn il-mogħdijiet tal-kinażi fil-mewt taċ-ċelluli indotta minn konċentrazzjonijiet baxxi ta’ paraquat bl-użu ta’ farmakoloġiku speċifiku. inibituri. Kif muri fil-Figura 1, l-espożizzjoni taċ-ċelluli E18 għal 25lM paraquat indotta tnaqqis sinifikanti fil-vijabbiltà taċ-ċelluli (madwar 50 fil-mija). Biex jiġi investigat ir-rwol ta' ERK1/2, PKB, u JNK1/2 fil-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat, iċ-ċelloli E18 ġew preinkubati għal 30 minuta bl-inibituri tal-kinase li ġejjin: PD(marda ta' Parkinson)98059 (50lM; inibitur MEK1/2), LY 294002 (30lM; inibitur PI-3K), wortmannin (100nM; inibitur PI{-3K), u SP 600125 (10lM; inibitur JNK1/2). Kif muri fil-Figura 8 (u huwa miġbur fil-qosor fit-Tabella 1), wortmannin, LY 294002, u PD 98059 ma kellhom l-ebda effett sinifikanti fuq it-telf tal-vijabbiltà taċ-ċelluli indotta minn 25lM paraquat.

DISKUSSJONI

Riċentement, studji varji żiedu l-interess fil-possibbiltà li newrotossini ambjentali bħall-pestiċidi jistgħu jkunu relatati mal-iżvilupp ta 'PD mhux ġenetiku.(marda ta' Parkinson)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz u Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ huwa wieħed mill-erbiċidi possibbli li huma involuti fil-PD, minħabba struttura kimika simili ma 'MPPþ u l-korrelazzjoni qawwija bejn l-inċidenza tal-marda u l-ammont ta' PQused (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz u Yu, 2000). Madankollu, il-mekkaniżmu tat-tossiċità newronali li sseħħ taħt espożizzjoni għal livelli baxxi ta' paraquat ma ġiex determinat. Fi kwalunkwe każ, xogħlijiet preċedenti mhumiex interessati fil-proċess bikri evidenzjat wara l-espożizzjoni għall-paraquat. Is-sejba ewlenija tal-istudju preżenti hija li wrejna li ċ-ċelloli E18neuroblast esposti għal konċentrazzjonijiet baxxi ta’ parakwat żiedu malajr il-fosforilazzjoni attivata tal-mogħdijiet ta’ sinjalar ġeneralment antiapoptotiku PI-3K/PKB u MEK ERK u wkoll il-ġeneralment proapoptotic JNK1/ 2 MAPK. B'kuntrast, paraquat ma stimolax żidiet kejl dipendenti fuq iż-żmien jew il-konċentrazzjoni fil-fosforilazzjoni ta 'p38 MAPK. Kif indikat hawn fuq, użajna konċentrazzjoni baxxa ta 'paraquat. Ir-rilevanza tal-fatt jekk il-paraquat jistax jidħol fil-moħħ jew le minħabba li huwa molekula ċċarġjata ġiet diskussa. Madankollu, sejbiet reċenti (Shimizu et al., 2001) żvelaw li l-paraquat jista 'juża l-pompa newtrali ta' l-aċidu amminiku biex jidħol fil-moħħ. Is-sejbiet ippreżentati f'dan ix-xogħol jindikaw li konċentrazzjoni baxxa biss ta 'paraquat hija meħtieġa fiċ-ċellula biex tistimula malajr bosta mogħdijiet ta' sinjal inkluż NK, implikat fi proċessi ta 'mewt taċ-ċelluli. Dawn l-attivazzjonijiet bikrija minħabba l-konċentrazzjoni baxxa ta 'paraquat huma proposti, għall-ewwel darba, fix-xogħol preżenti.

Ftit attenzjoni ġiet iddedikata għall-istudju tal-bidliet fil-livelli ta 'fosforilazzjoni ta' PKB jew ERK1/2 indotti minn paraquat (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Fi kwalunkwe każ, rapporti preċedenti (Peng et al., 2004) jużaw konċentrazzjonijiet relattivament għoljin ta 'paraquat (400lM), li jkejlu l-grad ta' fosforilazzjoni ta 'ERK wara 12-18 h ta' espożizzjoni. F'dawn iż-żminijiet, ma osservawx bidliet fil-livelli p-ERK. Fix-xogħol tagħna, skoprejna attivazzjoni bikrija (5-10 min) u importanti ta 'ERK1 / 2 (Fig.2A). Din l-attivazzjoni tonqos bil-mod għal-livelli bażali. Fil-kundizzjonijiet tagħna, il-livelli ta 'ERK1/2 fosforilati (wara 12-18h) huma l-istess bħal fil-kontroll, li jindika li din il-mogħdija mhix attiva f'dawn il-ħinijiet (dejta mhux murija) kif deskritt minn Peng et al. (2004). Din l-attivazzjoni mhijiex dipendenti fuq il-konċentrazzjoni, u tindika r-riżultat li l-istimulazzjoni robusta ta 'ERK tinkiseb u tinżamm b'konċentrazzjonijiet baxxi ħafna ta' paraquat. Bidliet fil-livelli ta' PKB fosforilati għadhom ma ġewx deskritti wara espożizzjoni għall-parakwat. Aħna nuru fil-Figura 4 li r-riżultati huma dipendenti fuq iż-żmien u l-konċentrazzjoni, li juru effett massimu wara espożizzjoni 20-min b'25lM paraquat. Jiġifieri, żidiet bikrija medjati mill-paraquat fil-fosforilazzjoni PKB huma komparabbli ma 'dawk osservati għal ERK1/2. Din id-dejta tiżvela żieda bikrija fl-attivazzjoni tal-fosforilazzjoni kemm tal-mogħdijiet ta 'sopravivenza PKB kif ukoll ERK. M'hemm l-ebda dejta dwar l-attivazzjoni bikrija ta' PKB jew ERK fil-mewt taċ-ċelluli kkaġunata minn paraquat. Madankollu, studji preċedenti (Halvorsen et al., 2002) jiddeskrivu żieda bikrija simili fiż-żewġ mogħdijiet fiċ-ċelluli newroblastoma SH-SY5Y esposti għal MPPþ.F'dan il-każ, il-livelli ta 'fosforilazzjoni ma jitħassrux lejn il-livell bażali. Din id-dejta hija partikolarment interessanti minħabba l-istruttura simili preċedentement relatata bejn paraquat u MPPþ, li tindika bidu differenti tal-makkinarju ċellulari implikat fl-effett taż-żewġ molekuli.

Ġiet iddedikata aktar attenzjoni għar-rwol ta 'JNK1/2pathway fil-medjazzjoni ta' sinjali li jikkontribwixxu għall-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat. F'dan l-istudju, wrejna li konċentrazzjonijiet baxxi (25lM) ta 'paraquat wasslu għal żidiet sinifikanti f'JNK1/2 fosforilat (Fig. 6). Kif jiġri f'PKOr ERK1/2, din l-attivazzjoni hija dipendenti fuq iż-żmien b'bidu bikri ħafna (5 min) u b'ritorn bil-mod għal-livelli bażali. Xogħlijiet preċedenti (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) juru attivazzjonijiet tard (12-18 h) ta 'JNK1/2pathway prodotti fi kwalunkwe każ minn konċentrazzjonijiet relattivament għolja ta' paraquat (minn 400lM). [Peng et al., 2004] sa 800lM [Chunet al., 2001]). Fil-kundizzjonijiet tagħna, il-grad ta 'fosforilazzjoni ta'JNK1/2 fil-ħinijiet indikati huwa komparabbli mal-kontroll. B'mod ġenerali, dawn ir-riżultati jindikaw għall-ewwel darba li l-espożizzjoni taċ-ċelluli għal konċentrazzjoni baxxa ħafna ta 'paraquat tipproduċi attivazzjoni bikrija tal-mogħdijiet PKB, ERK1/2, u JNK1/2.

Wara li stabbilixxa li l-paraquat iqanqal attivazzjoni bikrija ta 'PKB, ERK1/2, u JNK1/2 fiċ-ċelloli E18, aħna mbagħad investigajna r-rwol ta' dawn il-mogħdijiet ta 'proteina kinażi fil-mewt taċ-ċelluli indotta minn paraquat bl-użu ta' diversi inibituri farmakoloġiċi. Il-vijabbiltà taċ-ċelluli ġiet immonitorjata billi tkejjel it-trasformazzjoni għal MTT f'żebgħa formazan li tassorbi d-dawl f'570 nm. Assaġġ MTT intuża biex ikejjel b'mod preċiż il-ħsara newronali wara varjetà ta' insulti inklużi MPPþ jew paraquat (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al.,2002; Storch et al., 2004; ), u huwa l-aktar metodu użat biex tiddetermina l-mewt taċ-ċelluli. Kif muri fil-Figura 8, trattament minn qabel bl-inibitur selettiv JNK1/2 SP 600125 naqqas b'mod sinifikanti l-mewt taċ-ċelluli indotta minn paraquat. Din il-konċentrazzjoni ta 'SP 600125 imblukkat kompletament l-attivazzjoni indotta mill-paraquat ta' JNK1/2 (Fig. 7). Din id-dejta tissuġġerixxi li l-inibizzjoni tal-attivazzjoni bikrija tal-mogħdija JNK1/2 tipproteġi ċ-ċelloli mill-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-paraquat. Din id-dejta hija taqbel ma 'studji preċedenti (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), li wrew li JNK1/2 huwa involut fil-mewt taċ-ċelluli newronali attivata minn paraquat. Madankollu, dawn l-istudji jużaw bejn 15 u 30 darba aktar konċentrazzjoni ta 'paraquat minn dik użata f'dan l-istudju. Aħna nuru wkoll li konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat jistgħu jipproduċu mhux biss attivazzjoni iżda wkoll attivazzjoni bikrija ta' din il-mogħdija. Il-protezzjoni osservata b'SP600125 tindika wkoll li l-mogħdija JNK1/2 hija involuta fil-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat. Barra minn hekk, l-inibizzjoni JNK1/2 ġiet iddisinjata bħala strateġija potenzjali fit-trattament tal-PD(marda ta' Parkinson)f'diversi mudelli kemm in vivo kif ukoll in vitro (Wang et al., 2004).

effett newroprotettiv ta' cistanche

Studji preċedenti wrew li kemm PKB kif ukoll ERKpathways huma involuti fis-sopravivenza newronali (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). F'dan l-istudju, wrejna li konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat jipproduċu u jistimulaw kmieni kemm il-mogħdijiet PKB kif ukoll ERK. Dawn l-osservazzjonijiet jissuġġerixxu li l-attivazzjoni ta' PKB u ERK indotta minn paraquat tista' tkun involuta fil-protezzjoni taċ-ċelloli kontra l-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat. Biex ninvestigaw din il-possibbiltà, użajna l-inibituri PI-3K strutturalment mhux relatati wortmannin u LY 294002 u l-ERK1/2inhibitor PD(marda ta' Parkinson)98059. Interessanti, kemm PKB kif ukoll inibizzjoni ERK ma biddilx il-vijabbiltà taċ-ċelluli fil-preżenza ta 'paraquat, li jissuġġerixxi li, fil-kundizzjonijiet tagħna, PKB miżjuda u ERKattivazzjoni mhix essenzjali għas-sopravivenza fil-mewt taċ-ċelluli indotta minn paraquat fiċ-ċelloli E18.

Huwa magħruf sew li l-mekkaniżmu tan-newrotossiċità tal-paraquat huwa, fost fatturi oħra, medjat permezz ta 'stress ossidattiv (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). F'dan is-sens, reċentement ġie deskritt stress ossidattiv ċitosoliku mgħaġġel ħafna f'avvenimenti apoptotiċi bikrija implikati fil-mewt taċ-ċelluli kkaġunata mill-paraquat (Gonzalez-Polo et al., 2004). Peress li l-istress ossidattiv jattiva membri tal-familja MAPK (bħal ERK1/2 u JNK1/2) u PKB (Kamata u Hirata, 1999), din l-attivazzjoni bikrija ta 'ERK1/2, JNK1/2, u PKB tista' tiġi attribwita għall-ossidattiv rapidu. stress indott wara espożizzjoni tal-paraquat.

Fil-qosor, ir-riżultati tagħna juru għall-ewwel darba li konċentrazzjonijiet baxxi ta 'paraquat jistimulaw żidiet bikrija u robusti ħafna fil-fosforilazzjoni PKB, ERK1/2, u JNK1/2 fiċ-ċelloli E18. Barra minn hekk, urejna li l-inibizzjoni tal-attivazzjoni bikrija tal-mogħdija JNK1/2 tipproteġi ċ-ċelloli E18 mill-mewt taċ-ċelluli indotta mill-paraquat. Dan ir-riżultat jindika l-eżistenza ta 'xi avvenimenti bikrija (bħala attivazzjoni rapida JNK1/2) li għandhom rwol essenzjali fil-mewt taċ-ċelluli indotta minn konċentrazzjonijiet baxxi ta' paraquat. Dan ir-riżultat jiftaħ ukoll linja ġdida u eċċitanti fl-istudju tat-tossiċità tal-paraquat u l-implikazzjoni possibbli tagħha fl-iżvilupp tal-PD(marda ta' Parkinson).

NOTA: Cistanchehija ħaxixa tradizzjonali Ċiniża li għandha effetti fuq in-newroni u ċ-ċelloli tal-moħħ. cistanche hija magħrufa wkoll bħala l-ġinseng tad-deżert, huwa trattament potenzjali għal mard newro bħalmarda ta' Parkinsonibbażat fuq l-istudju farmakoloġiku modern