Lamivudine Ittejjeb it-Tnaqqis Konjittiv fil-ġrieden SAMP8: Integrazzjoni in Vivo tal-Evalwazzjoni Farmakoloġika U l-Farmakoloġija tan-Netwerk

Taxol Ħwawar Alternattivi Ċiniżi Cistanche

Kliem ewlieni:Aspergillus favus · Ġoġoba · Fungi endofitiċi · Nanopartiċelli tad-deheb · Taxol · -Irradjazzjoni · Ottimizzazzjoni nutrizzjonali

Introduzzjoni

Taxol huwa wieħed mill-aktar spettru wiesa kummerċjalizzatdrogi kontra l-kanċer[1]. L-attività ta 'Taxol telabora mill-ispeċifiċità unika tagħha għall-irbit ma' l-eterodimer tat-tubulin -subunits ċellulari, li tippromwovi l-polimerizzazzjoni tat-tubulina, u b'hekk tfixkel id-diviżjoni mitotika taċ-ċelluli tat-tumur [2]. Taxol wera attività qawwija kontra s-sider, il-pulmun, ir-ras u l-għonq, il-kanċer tal-utru, u forom avvanzati ta’ sarkoma ta’ Kaposi [3]. Taxol l-ewwel ġie prodott mill-qoxra tas-siġar tal-yew Taxus brevifolia "familja Taxaceae" [4, 5]; madankollu, ir-rendiment aktar baxx ta 'Taxol li jkun<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as ażma,infjammazzjoni, ukanċer[32]. Għalhekk, l-għan ewlieni ta 'dan ix-xogħol kien li jesplora iżolat fungali ġdid minn pjanta tal-jojoba bi stabbiltà metabolika unika għall-produzzjoni ta' Taxol, biex jevalwaw l-approċċi differenti biex jimmassimizzaw ir-rendiment ta 'Taxol tagħhom, kif ukoll, biex itejbu l-attività antiproliferattiva ta' komposti Taxol estratti. permezz ta 'konjugazzjoni ma' nanopartiċelli tad-deheb, medjata minn irradjazzjoni gamma.

Materjal u Metodi

Iżolament u Kultivazzjoni tal-Fungi Endofitiċi

Partijiet differenti tal-jojoba (Simmondsia chinensis) bħala weraq, qxur, friegħi, u blanzuni inġabru mill-Fakultà tal-Agrikoltura, l-Università tal-Kajr, u ntużaw bħala s-sors għall-fungi endofitiċi. Il-partijiet tal-pjanti ġew miġbura u maħsula taħt ilma tal-vit ġieri, wiċċ sterilizzat b'70 fil-mija etanol għal 1 min u mbagħad laħlaħ b'ilma sterili [28]. Il-partijiet tal-pjanti sterilizzati tal-wiċċ inqatgħu f'biċċiet żgħar taħt kundizzjonijiet sterili u mqiegħda fuq pjanċi ta 'poato dextrose agar (PDA) medium, Czapek's-Dox, u malt extract agar medium [33-36], u l-pjanċi ġew inkubati fi 30 grad għal 10 ijiem. L-effettività tal-isterilizzazzjoni tal-wiċċ tal-partijiet tal-pjanti ġiet evalwata billi ċ-ċentrifugazzjoni tal-ilma tat-tlaħliħ, imbagħad ġie miżjud 500 ul ilma sterili mal-preċipitat u miksi f'medja PDA [37]. L-iżolati tal-fungali endofitiċi purifikati ġew imlaqqma fuq PDA slants għal 7 ijiem u maħżuna f'4 gradi

Screening, Estrazzjoni, u Kwantifikazzjoni ta 'Taxol mill-Fungi Endophytic....

Il-fungi endofitiċi rkuprati li jgħixu fil-ġoġoba ġew skrinjati għall-produzzjoni ta 'Taxol billi jikbru fuq brodu ta' destrożju tal-patata (PDB) [38]. Plagg wieħed ta' kull wieħed mill-iżolati tal-gost ta' 7 ijiem kien imlaqqam f'100 ml ta' PDB/250 ml ħidmiet Erlenmeyer, inkubati għal 15-il jum fi 30±1 grad, taħt kundizzjonijiet ta' tħawwad (120 rpm). Wara l-inkubazzjoni, il-kulturi ġew iffiltrati, u l-filtrat ġie emendat b'0.2 fil-mija bikarbonat tas-sodju biex jippreċipita l-aċidi grassi. Taxol ġie estratt bid-dichloromethane, u l-fażi organika ġiet miġbura u evaporata sa nixfa, u r-residwi ġew maħlula mill-ġdid fil-metanol [17, 39]. Taxol ġie separat u identifikat minn TLC bl-użu ta 'pjanċi tal-ġel tas-silika miksija minn qabel ta' Merck 1 mm (20 × 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, il-Ġermanja), misjuba minn illuminazzjoni UV f'254 nm [39]. It-tikek putattivi ta 'Taxol ġew mibruxa mill-pjanċi tal-ġel tas-silika TLC u maħlula fil-metanol, vortexed b'mod vigoruż għal 10 min, u ċentrifugati f'1000 rpm għal 5 min. Il-partiċelli tas-silika preċipitati tneħħew, u s-supernatant ittieħed għall-kwantifikazzjoni tat-Taxol u l-iċċekkjar tal-purità permezz tal-HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) tal-kolonna tal-fażi inversa C18 (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3.5 μm, Kat # 959,963–902). Il-fażi mobbli użata kienet metanol/acetonitrile/ilma (25:35:40, v/v/v) b'rata ta' fluss ta' 1.0 ml/min għal 20 min [40], u l-frazzjonijiet tat-Taxol ġew imkejla f'227 nm, u tagħhom l-identità kimika u l-konċentrazzjonijiet ġew ikkonfermati mill-ħin taż-żamma u ż-żona tal-quċċata tal-assorbiment meta mqabbla mal-kampjun awtentiku.

Identifikazzjoni Morfoloġika u Molekulari tal-Fungi Endofitiċi Irkuprati

L-iżolati fungali endofitiċi ġew identifikati għal-livelli tal-ispeċi tagħhom ibbażati fuq il-karatteristiċi makro u mikro-morfoloġiċi tagħhom billi jikbru fuq PDA, Czapek's-Dox, u midja tal-estratt tax-xgħir skont iċ-ċwievet tar-referenza [33-36]. L-identità tal-iżolati fungali l-aktar qawwija li jipproduċu Taxol ġiet ikkonfermata aktar molekulari abbażi tas-sekwenza ta 'spacer traskritt intern (ITS) [41, 42]. Id-DNA ġenomika tal-fungu (gDNA) ġiet estratta billi tħaffef il-miċelja (~0.2 g) f'nitroġenu likwidu, imbagħad tqassam f'1 ml CTAB buffer ta' estrazzjoni (2 fil-mija CTAB, 2 fil-mija PVP40, { {21}}.2 fil-mija 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl f'100 mM Tris−HCl, pH 8.0). Is-settijiet tal-primer tal-PCR kienu ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ u ITS{5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. Ir-reazzjoni tal-PCR fiha 10 ul ta’ taħlita prinċipali 2×PCR (i-Taq™, Cat. Nru. 25027), 2 ul ta’ gDNA, 1 ul ta’ kull primer (10 pmol/ul), u mimlija għal 20 ul b’distillat sterili ilma. Il-PCR kien ipprogrammat għal denaturazzjoni inizjali f'94 grad għal 2 min, denaturazzjoni f'94 grad għal 30 s, ittemprar f'55 grad għal 10 s, estensjoni f'72 grad għal 30 s għal 35 ċiklu, u estensjoni finali f'72 grad għal 2 min. L-amplicons tal-PCR ġew analizzati b'1.5 fil-mija agarose gel f'1 × TBE buer (Ambion Cat# AM9864), bl-użu ta' sellum tad-DNA 1 kb (Cat. # PG010-55DI) u viżwalizzat b'sistema ta 'dokumentazzjoni tal-ġel. L-amplicons ġew purifikati u sekwenzati minn Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Verżjoni 6.0 bl-istess settijiet ta' primers. Is-sekwenzi miksuba ġew BLAST mfittxija b'mod mhux żejda fuq id-database NCBI, importati fis-softwer MEGA 6.0, u allinjati mal-algoritmu tal-muskoli Clustal W [43] u s-siġra filoġenetika nbniet bil-metodu ta 'għaqda tal-ġirien ta' MEGA 6.0 [44].

Struttura Kimika tat-Taxol Estratt

It-tikek putattivi ta 'Taxol ġew mibruxa mill-pjanċi tal-ġel tas-silika TLC u ppurifikati, u l-purità u l-konċentrazzjoni ġew determinati mill-analiżi UV-Vis f'λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Serje) meta mqabbla ma' Taxol awtentiku [39]. Media vojta taħt l-istess kundizzjonijiet intużaw bħala linja bażi negattiva għall-analiżi spettrofotometriċi. L-ispettru FT-IR tal-kampjuni ta 'Taxol purifikat ġie analizzat mill-ispettrofotometru JASCO FT-IR 3600. Il-kampjun Taxol ġie mitħun b'gerbub KBr, ippressat f'diski taħt vakwu, u l-assorbiment tkejjel fir-reġjun 400 sa 4000 cm-1 [3], meta mqabbel ma 'dak awtentiku. L-istruttura kimika ta 'Taxol estratt ġiet ikkonfermata mill-ispettroskopija HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) meta mqabbla ma' Taxol awtentiku. Il-kampjuni ġew maħlula f'CDCl3, bidliet kimiċi jingħataw f'ppm (skala δ), u l-kostanti tal-akkoppjar huma espressi f'hertz (Hz).

Effett ta 'tipi differenti ta' midja fuq il-produzzjoni ta 'Taxol

Żewġ plaggs tal-agar (9 mm) minn kulturi ta’ 7 ijiem ta’ kull iżolat fungali ġew imlaqqma fi tliet kopji f’100 ml medium/250 ml flask Erlenmeyer ta’ destrożju tal-patata (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D, u estratt tax-xgħir (ME). ) medja tal-brodu. Kontrolli mhux imlaqqma minn kull midja li huma ħielsa minn spori fungali ntużaw bħala kontroll negattiv, inkubati fi 30 grad għal 15-il jum taħt l-istess kundizzjonijiet. Wara l-inkubazzjoni, il-kulturi fungali ġew iffiltrati, u Taxol ġie estratt u determinat kif imsemmi hawn fuq.

Ottimizzazzjoni tal-Bijoproċess tal-Kundizzjonijiet Nutrizzjonali biex timmassimizza r-Rendiment tat-Taxol

L-ottimizzazzjoni tal-kompożizzjoni medja biex timmassimizza r-rendiment tat-Taxol mill-iżolat qawwi tal-gost twettqet permezz ta 'metodoloġija tal-wiċċ tar-rispons bl-użu ta' disinn Placket-Burman segwit minn disinn kompost ċentrali [17–20, 45]. Mid-disinji RSM, il-varjabbli pożittivi u sinifikanti li jaffettwaw il-produzzjoni Taxol mill-iżolat fungali potenti ġew evalwati bl-użu tal-pakkett tas-softwer statistiku minn Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Kull esperiment sar fi tliet repliki bijoloġiċi u tqiesu l-valuri medji. Wara l-inkubazzjoni fil-kundizzjonijiet mixtieqa, il-bijomassa fungali ġiet iffiltrata, u Taxol ġie estratt u kkwantifikat b'TLC u HPLC kif deskritt hawn fuq.

Placket-Disinn Burman

Id-disinn tal-placket-Burman intuża ta 'spiss għall-ottimizzazzjoni tal-komponent tal-midja għat-tkabbir fungali u l-produzzjoni ta' metaboliti sekondarji bijoattivi, u jevalwa l-varjabbli sinifikanti li jaffettwaw il-produzzjoni Taxol [18, 2 0, 46). L-għażla tal-fattur kienet ibbażata fuq il-midja użata fl-iskrinjar kwalitattiv u kwantitattiv. Ġew inklużi ħdax-il fattur; estratt tax-xgħir, peptone, sukrożju, soytone, glutamina, estratt taċ-ċanga, u t-temperatura, pH, ħin ta 'inkubazzjoni, u valuri u fatturi tal-veloċità tat-tħawwad ġew varjati fuq żewġ livelli, u l-firxiet tal-livelli minimi u massimi ġew magħżula. L-istatistika Design-Expert 7.0 intuża biex jiġġenera sett ta '12-il esperiment. Għal kull esperiment, il-produzzjoni tat-Taxol ġiet iddeterminata fi tliet repliki bijoloġiċi, u tqieset il-medja tar-rendiment tat-Taxol.

Analiżi ta 'rigressjoni tad-dejta saret bl-użu ta' softwer statistiku. L-effett ta’ kull varjabbli ġie kkalkulat (Biometrika, 2020), bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:

fejn, E huwa l-effett ta 'varjabbli ta' ttestjar, M plus , u M- huma l-konċentrazzjoni ta 'Taxol ta' provi f'dak il-parametru kien fil-livelli ogħla u aktar baxxi tiegħu rispettivament, u N huwa n-numru ta 'esperimenti li twettqu. L-effett ta' kull varjabbli fuq il-produzzjoni ġie ddeterminat bil-kalkolu tal-valuri E rispettivi tagħhom.

Fejn Tot għoli huwa t-tweġibiet totali fil-livell għoli, Tot baxx huwa t-tweġibiet totali fil-livell baxx, u Le huwa n-numru ta’ provi.

Disinn Kompost Ċentrali u Interazzjonijiet Bejn Fatturi li Jaffettwaw il-Produzzjoni Taxol

L-aktar fatturi pożittivi sinifikanti li jaffettwaw il-produzzjoni ta 'Taxol mill-iso late fungali magħżul ġew ottimizzati bl-użu ta' disinn sperimentali tal-mudell CCD tat-tip tas-superfiċje ta 'rispons [47]. Bl-użu tas-CCD, il-konċentrazzjonijiet tal-komponenti medji ġew ottimizzati, u l-interazzjonijiet studjati tagħhom intużaw biex jiġġeneraw total ta '20 esperiment għat-tliet varjabbli. Biex jiġu ddeterminati l-livelli ottimali tal-varjabbli għall-produzzjoni ta 'Taxol mill-iżolat fungali potenti, tpinġija kurvi tal-wiċċ ta' rispons tridimensjonali (3D) biex tistudja l-interazzjoni bejn il-fatturi varji u biex tiddetermina l-kundizzjoni varjabbli ta 'kull fattur li jaffettwa l-produzzjoni Taxol. Il-graffs 3D twettqu billi żammew il-kostanti ta 'tliet fatturi f'livell ideali u ppjanaw ir-rispons miksub tar-rendiment tat-Taxol għal livelli li jvarjaw taż-żewġ fatturi l-oħra.

Effett tal-Irradjazzjoni Gamma fuq ir-Rendiment tat-Taxol

L-iżolati endofitiċi qawwija li jipproduċu Taxol kienu esposti għal -irradjazzjoni b'60sors tal-Kobalt (ċellula Gamma 4000-A-India) f'dożi differenti ta' radjazzjoni gamma (0.25–3.0 kGy) meta mqabbla għall-kontroll tal-kultura mhux irradjata; rata tad-doża 1.2 kGy/h fil-ħin tal-esperimenti. Il-midja ottimizzata ġew imlaqqma mill-kultura irradjata taħt kundizzjonijiet kulturali standard, meta mqabbla mal-inoculum tal-ispori mhux irradjati bħala kontroll. Il-kulturi ġew inkubati fi 30±2 grad għal 15-il jum fuq rotary shaker (120 rpm). Wara l-inkubazzjoni, il-kulturi ġew iffiltrati u Taxol ġie estratt, ippurifikat, u kkwantifikat b'TLC u HPLC kif deskritt hawn fuq.

Sinteżi u Karatterizzazzjoni ta 'Nanopartiċelli tad-Deheb (AuNPs); Konjugazzjoni ma 'Taxol

Attività kontra l-kanċer ta 'Taxol

L-attività tal-konjugati Purifikati Taxol u Taxol-PVP-AuNPs kontra karċinoma tal-fwied (HPG2), u karċinoma tas-sider (MCF7) kienet determinata minn 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-assaġġ tad-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) [48]. Il-pjanċa tal-{11}}tajjar kienet miżrugħa b'103 ċelluli għal kull bir, u inkubata matul il-lejl f'37 grad, imbagħad ġew miżjuda konċentrazzjonijiet differenti tal-mediċina, u l-pjanċi ġew inkubati mill-ġdid għal 48 siegħa. Ir-reaġent MTT (25 ul) ġie miżjud, u inkubat għal 2 sigħat, u l-kulur vjola tal-kumpless formazan żviluppat tkejjel f'λ570 nm. Il-valur IC50 kien espress bl-ammont ta 'mediċina li tnaqqas it-tkabbir ta' 50 fil-mija ta 'numru inizjali ta' ċelluli tat-tumur li jinnormalizzaw għal kontroll pożittiv.

Attività Antimikrobika tal-Konjugati Taxol u Taxol-AuNPs

L-attività antimikrobika tal-konjugati Taxol u Taxol-AuNPs ġiet ivvalutata kontra iżolati batterjali differenti; Bacillus subtilis ATCC 6633 u Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, u Enterobacter agglomerans, minbarra Candida albicans. Iċ-ċelloli batteriċi ttestjati ġew sospiżi f'ilma peptone sterili biex jinkiseb inoculum standard ta' ~0.5 McFarland (1–1.5)× 1{{10}}8 CFU/ ml f'λ6{{18 }}0 nm. L-inibizzjoni tat-tkabbir (mm) tat-tkabbir tal-patoġeni mikrobiċi ġiet ivvalutata bil-metodu tad-difużjoni tad-diska tal-agar. Diski antibijotiċi standard sterili b'dijametru ta '6.0 mm intużaw bħala kontrolli pożittivi. Diski antibijotiċi sterili (6.0 mm) kienu mgħobbija b'20 ul ta 'metanol u amoxicillin-clavulanic acid (AMC) bħala kontroll negattiv u pożittiv. Id-diski kienu mgħobbija bl-istess konċentrazzjoni ta 'Taxol, Taxol-PVP-AuNPs, u AuNPs (1.0 ug/ml). Ġew ippreparati tliet repliki bijoloġiċi. Il-pjanċi ġew inkubati f'37 grad għal 24 siegħa, u ż-żoni ta 'inibizzjoni ġew imkejla. Amoxicillin clavulanic acid (AMC) u nystatin intużaw biex tiġi normalizzata l-attività antimikrobika ta 'Taxol. Iż-żona ta 'inibizzjoni tat-tkabbir kienet determinata minn kalibru vernier (mm).

Analiżi Statistiċi

Identifikazzjoni Morfoloġika u Molekulari tal-Produtturi Potenti ta' Taxol

Karatteristiċi morfoloġiċi ta 'l-iżolat fungali potenti li jipproduċi Taxol ġew eżaminati skont iċ-ċwievet deskrittivi makroskopiċi u mikroskopiċi, kif deskritt f'Materjali u Metodi, u żvelaw il-prossimità morfoloġika tiegħu ma' A. favus (Fig. 2). L-iżolat fungali tkabbar fuq PDA fi 30 grad għal 10 ijiem u l-karatteristiċi makroskopiċi u mikroskopiċi wrew l-identità tiegħu bħal irjus konidjali, mod ta 'fergħat, l-identità ta' stigma, u ontoloġija konidjali, u formazzjoni ta 'korpi tal-frott, skond l-universali ċwievet morfoloġiċi [33], u nstabu li kienu identiċi għal Aspergillus favus. L-iżolat qawwi li jipproduċi Taxol A. favus ġie identifikat aktar abbażi tas-sekwenzi ITS tagħhom, bl-użu tal-gDNA bħala mudell. L-amplicons PCR (~ 550 bp) ta 'A. favus ġew solvuti, purifed, u sekwenzati (Fig. 2). Is-sekwenza ITS ta 'A. favus kienet blast mhux żejda mfittxija fuq id-database NCBI, li juri xebh ta' 99 fil-mija ma 'A. favus, b'valuri ta' E. żero, u kopertura ta' mistoqsija ta '95 fil-mija. Għalhekk, mill-analiżi mikroskopiċi u molekulari, l-iżolat fil-mira ġie kkonfermat bħala A. favus u ddepożitat fuq GenBank bin-numru ta 'adeżjoni MW485934.1, kif ukoll, l-iżolat ġie depożitat fiċ-Ċentru Mikoloġiku tal-Università Assiut (AUMC), l-Eġittu b' numru tad-depożitu AUMC13892. L-iżolat attwali kellu xebh ta' 99 fil-mija mal-iżolati ta' A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Fig. 1 Veduta Morfoloġika tal-pjanta tal-ġoġoba. B Kulturi tal-pjanċi tal-fungi endofitiċi qawwija li jipproduċu Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23), u A. oryzae Bd (25) fuq PDA wara 8 ijiem o inkubazzjoni fi 30 grad. L-iżolati fungali tkabbru fuq PDB, u inkubati fil-kundizzjonijiet standard, u Taxol ġie estratt u ċċekkjat minn TLC (C). D kromatogramma HPLC ta' Taxol mill-iżolati fungali qawwija. E Rendiment ta' Taxol kif kwantifikat minn HPLC. F, analiżi spettrali UV-Vis ta 'Taxol estratt mill-iżolati fungali. G Analiżi FT-IR ta 'Taxol estratt meta mqabbel ma' wieħed awtentiku

Fig. 2 A Karatteristiċi makromorfoloġiċi ta 'A. favus endophyte ta' jojoba wara 3, 5, u 8 ijiem ta 'tkabbir fuq PDA. Karatteristiċi mikro-morfoloġiċi, ras konidjali ta 'A. favus b'ingrandiment ta' 400X. C amplicon PCR ta 'A. favus reġjun ITS ta' 500 bp, li jinnormalizza għal sellum ta '1 kb (Cat.#. SM0312). D Analiżi filoġenetika tal-ITS A. favus bil-metodu tal-probabbiltà massima [44]