mtLingwa
Id-dar / Għarfien / Il-kontenut

Għarfien

Kuwanon T U Sanggenon A Iżolati Minn Morus Alba Jeżerċitaw Effetti Anti-Infjammatorji Billi Jirregolaw Mogħdijiet ta' Sinjali NF-κB U HO -1/Nrf2 fiċ-Ċelloli BV2 U RAW264.7

Mar 30, 2022

Għal aktar informazzjoni. kuntatttina.xiang@wecistanche.com

Astratt: Preċedentement investigajna l-estratt metanoliku tal-qoxra Morus alba u kkaratterizzajna 11-il kompost mill-estratt: kuwanon G(1), Kuwana E (2), Kuwana T (3), sanggenon A (4), sanggenol M (5), sanggenol A (6), mulberofuran B (7), mulberofuran G (8), moracin M (9), moracin O (10), u norartocarpanone (11). Hawnhekk, investigajna l-anti-infjammatorjieffetti ta 'dawn il-komposti fuq ċelluli mikrogliali (BV2) u makrofaġi (RAW264.7). Fost dawn, 3 u 4 inibixxu b'mod notevoli l-produzzjoni indotta minn lipopolysaccharide (LPS) ta 'nitric oxide f'dawn iċ-ċelloli, li jissuġġerixxi l-proprjetajiet anti-infjammatorji ta' dawn iż-żewġ komposti. Dawn il-komposti inibixxu l-produzzjoni ta' prostaglandin E2, interleukin-6, u fattur tan-nekrożi tat-tumur-c, u l-espressjoni ta' nitric oxide synthase u cyclooxygenase-2 induċibbli wara stimulazzjoni LPS. It-trattament minn qabel bi 3 u 4 inibixxi l-attivazzjoni tal-passaġġ ta 'sinjalazzjoni tal-fattur nukleari kappa B fiż-żewġ tipi ta' ċelluli. Il-komposti kkaġunaw ukoll l-espressjoni ta' heme oxygenase(HO)-1 permezz tal-attivazzjoni tal-fattur nukleari erythroid 2-fattur 2 relatat. It-trażżin tal-attività ta' HO-1 reġġa' lura l-effetti anti-infjammatorji kkawżati bi trattament minn qabel bi 3 u 4, li jissuġġerixxi li l-effetti anti-infjammatorji kienu regolati minn HO-1. Meħuda flimkien, 3 u 4 huma kandidati potenzjali għall-iżvilupp ta 'aġenti terapewtiċi u preventivi għalmard infjammatorju.

Kliem ewlieni: Morus alba; kuwanon T; sanggenon A; BV2; Ċelloli RAW264.7; effetti anti-infjammatorji

flavonoids anti-inflammatory

Ikklikkja hawn biex titgħallem aktar prodotti

1. Introduzzjoni

Morus alba, pjanta mediċinali li tappartjeni għall-familja Moraceae, intużat għat-trattament tal-kundizzjonijiet infjammatorji pulmonari fil-mediċina tradizzjonali [1]. Il-qoxra tal-għeruq tagħha fiha diversi komponenti attivi bħal umbelliferone, scopoletin, muċini, tannini,flavonojdi(morusin, mulberrin, mulberrichromene, cyclomulberrin, moracin P, moracin O, mulberrofuran Q, Kuwana E, u kuwanon H)[2], 2-arylbenzofurans (moracenin D, moracin P, moracin O, u mulberrofuran O), u flavonoids prenilati (licoflavone C, cyclomulberrin, neocyclomorusin, sanggenon I, morusin, u Kuwana U)[3,4]. L-estratti u l-komposti attivi ta' M. alba jistgħu jtaffu l-mard tal-pulmun, kif żvelat minn studji reċenti [5-7]. Minbarra l-effett farmakoloġiku ta 'M.alba fuq il-pulmuni, flavonoids isoprenylated (sanggenol Q, Kuwana T, sanggenon N, mulberrofuran G, u mulberrofuran C) jeżerċitaw effetti epatoprotettivi f'ċelluli HepG2 indotti minn t-BHP [8]. Prenyl-flavonoids (kuwanon A, Kuwana C, Kuwana T, u morusin) u triterpenoids (betulin acid, avail, u -sitosterol) jinibixxu sostanzjalment id-divrenzjar ta '3T3-L1 adipocytes [9]. Morin hydrate, il-kostitwent ewlieni tal-flavonojdi ta 'M. alba, itaffi l-indeboliment kroniku imprevedibbli tal-memorja ikkawżat mill-istress, li jindika li dan il-kompost jista' jagħti spinta lis-sistema ta 'difiża antiossidanti u jinibixxi mogħdijiet newroinfjammatorji [10]. Dawn l-istudji jissuġġerixxu li l-kostitwenti li jinsabu f'M.alba huma kandidati potenzjali għat-trattament ta 'diversi mard.

Infjammazzjoni, rispons kumpless ta 'awto-difiża għal stimuli ta' ħsara, għandu rwol importanti fid-difiża immuni permezz tal-attivazzjoni ta 'diversi ċelluli immuni, inklużi makrofaġi, monoċiti, lewkoċiti, ċelluli mast, u tipi oħra ta' ċelluli [11]. Il-makrofaġi huma l-aktar ċelluli immuni abbundanti u mqassma b'mod wiesa' fil-ġisem, u l-mikroglia huma makrofaġi residenti fis-sistema nervuża ċentrali (CNS)[12]. Il-makrofaġi u ċ-ċelloli mikrogliali huma atturi ewlenin fir-rispons infjammatorju. Jistgħu jiġu attivati ​​b'reazzjoni għal stimuli bħal lipopolysaccharide (LPS), ċitokini, u chemokines, u jinduċu kundizzjonijiet infjammatorji [13]. Taħt kundizzjonijiet infjammatorji, makrofaġi attivati ​​b'mod eċċessiv u ċelluli mikrogliali jikkawżaw regolazzjoni anormali ta 'medjaturi pro-infjammatorji (nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE,), nitric oxide synthase (iNOS), u cyclooxygenase (COX) -2 ) u ċitokini pro-infjammatorji (interleukin (IL)-6 u fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNF)-a), permezz tal-attivazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar tal-fattur nukleari kappa B (NF-B)[14,15]. Livelli miżjuda ta’ medjaturi pro-infjammatorji jkomplu jaggravaw il-progressjoni ta’ mard infjammatorju, li jkompli jżid l-attivazzjoni ta’ fatturi infjammatorji, u b’hekk jirriżulta f’ċiklu vizzjuż[16]. Għalhekk, ir-regolazzjoni tal-medjaturi infjammatorji hija essenzjali għat-trattament u l-prevenzjoni ta 'mard infjammatorju.

Heme oxygenase (HO)-1 hija enzima li tillimita r-rata li tikkatalizza d-degradazzjoni tal-heme f'biliverdin, jone tal-ħadid (Fe2 plus ), u monossidu tal-karbonju (CO)[17]. L-induzzjoni HO-1 hija rregolata mill-attivazzjoni tal-fattur nukleari erythroid 2-relatat fattur 2(Nrf2). HO-1 jista' jiġi indott b'rispons għal stress ossidattiv u infjammazzjoni biex jipproteġi t-tessuti u jżomm l-omeostasi fil-ġisem[18]. Għalhekk, l-immirar ta' l-induzzjoni ta' HO-1 hija waħda mill-istrateġiji potenzjali għat-trattament ta' mard infjammatorju.

Fl-isforz kontinwu tagħna biex nesploraw kandidat(i) minn prodotti naturali biex jikkuraw mard infjammatorju, aħna hawnhekk nippreżentaw il-effetti anti-infjammatorjita 'komposti 11l iżolati minn M.alba f'ċelluli BV2 u RAW264.7 indotti minn LPS.

4flavonoids anti-inflammatory

2. Riżultati

2.1.Effetti ta' 11-il Kompost Iżolati minn M.alba fuq il-Vijabilità taċ-Ċelloli BV2 u RAW264.7

Fl-istudju preċedenti, il-qoxra ta 'l-għeruq ta' M.alba ġiet estratta f'metanol akweju, u l-estratti miksuba ġew suċċessivament maqsumin f'EtOAc, n-BuOH, u H2O2. Il-kromatografija ripetuta tal-kolonna SiO2, ODS, u Sephadex LH-20 tal-frazzjoni EtOAc ta 11-il kompost, bħal kuwanon G(1), Kuwana E(2), Kuwana T (3), sanggenon A (4), sanggenon M(5), sanggenol A(6),mulberofuran B(7), mulberofuran G(8), moracin M(9), moracin O(10), u norartocarpanone (11)[6,19,20]. L-istrutturi kimiċi ta' 11-il kompost iżolati minn M.alba huma illustrati fil-Figura 1. Biex jiġu ddeterminati l-effetti ċitotossiċi ta' dawn il-komposti, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl){{ 26}}.5-Twettqet assaġġ tal-bromur tad-diphenyltetrazolium (MTT), iċ-ċelluli BV2 u RAW264.7 ġew ittrattati bil-konċentrazzjonijiet indikati tal-komposti għal 48 siegħa, f'konċentrazzjonijiet sa 80 μM. （Figura 2）. Il-komposti 2, 3, u 4 kellhom effetti tossiċi f'80 μM, il-kompost 5 kellu effetti tossiċi f'40 μM. Ibbażat fuq ir-riżultat tal-evalwazzjoni tat-tossiċità, intgħażlet firxa ta' konċentrazzjoni mhux tossika għal studji sussegwenti dwar l-effetti anti-infjammatorji (kompost 2, 3,4 f'40 uM, kompost 5 f'200 μM, u komposti oħra f'80 μM) .

Chemical structures of compounds 1–11 isolated from M. alba

Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were incubated for 48 h with various concentrations of the compounds, and their viability was determined using MTT (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay. Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 ,*** p < 0.001 compared with the control group. Figure 2. Cytotoxic effects of compounds 1–11 isolated from M. alba on BV2 (A) and RAW

2.2.Effetti ta' Komposti l1 Iżolati minn M. alba fuq l-Espressjoni ta' Fatturi Infjammatorji u Proteina iNOS fiċ-Ċelloli BV2 u RAW264.7

NO huwa radikali ħielsa fil-kardjovaskulari, nervuża, usistemi immuni. Hija żżomm omeostażi intraċellulari, tittrasporta newrotrasmettituri, u tirregola l-attività anti-infjammatorja u ċ-ċitotossiċità. Madankollu, meta jiġi prodott ammont kbir ta 'NO, ikollu effetti detrimentali fuq il-ġisem, inklużi vażodilatazzjoni, ċitotossiċità u ħsara fit-tessuti [21,22]. Imbagħad eżaminajna l-effetti ta 'dawn il-komposti fuq il-produzzjoni tan-nitrit fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7 indotti minn LPS. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'komposti għal sagħtejn qabel l-istimulazzjoni b'LPS (1 ug/mL) għal 24 siegħa. Fost il-komposti, Kompost 3 (kuwanonT) u 4 (sanggenon A) biss inibixxu b'mod sinifikanti l-produzzjoni tan-nitrit kemm fil-linji taċ-ċelluli BV2 kif ukoll RAW264.7 (Figura 3). Barra minn hekk, wettaqna esperiment addizzjonali biex inqabblu l-effett inibitorju tal-produzzjoni tan-nitrit bejn il-grupp trattat b'LPS wara t-trattament minn qabel kompost u l-grupp trattat bil-kompost wara t-trattament minn qabel LPS. Bħala riżultat, ma kien hemm l-ebda differenza fl-effett inibitorju tal-produzzjoni tan-nitrit bejn iż-żewġ gruppi sperimentali (Figura Supplimentari S1). Għalhekk, f'dan l-istudju, l-esperimenti li ġejjin twettqu bl-użu ta 'pretrattament b'komposti fi żmien 2 ~ 3h qabel it-trattament ta' LPS.

. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Il-produzzjoni ta 'NO hija miżjuda mill-proteini pro-infjammatorji inducible nitric oxide synthase (iNOS). Madankollu, espressjoni żejda ta 'iNOS tfixkel serjament il-patofiżjoloġija tal-marda [23]. Il-komposti 3 u 4 inibixxew l-espressjoni ta 'iNOS b'mod dipendenti fuq il-konċentrazzjoni (Figura 4). Aħna eżaminajna l-effetti tal-komposti 3 u 4 fuq l-espressjoni indotta minn LPS ta 'fatturi infjammatorji fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7. Iċ-ċelloli ġew ittrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'komposti 3 u 4 għal 2 sigħat qabel l-istimulazzjoni b'LPS (1 ug/mL) għal 24 siegħa. Iż-żewġ komposti inibixxu b'mod sinifikanti l-espressjoni indotta minn LPS ta 'PGE2, TNF, u IL-6 fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7 (Figura 5). Ir-riżultati dehru li juru li t-trattament minn qabel bil-kompost3 u 4 irażżan l-infjammazzjoni indotta minn LPS fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7.

Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 µg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B,D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Molecules 2021, 26, x FOR PEER REVIEW 5 of 16 Figure 3. Inhibitory effects of compounds 1–11 on nitrite production in BV2 (A) and RAW264.7 (B) cells. The cells were pretreated for 2 h with concentrations of compounds and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 4. Protein expression levels of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with LPS (1 μg/mL). Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensities are normalized to that of β-actin (B, D). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A and D), IL-6 (B and E), and TNF-α (C and F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group. Figure 5. Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on the level of PGE2 (A,D), IL-6 (B,E), and TNF-α (C,F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated for 2 h with various concentrations of compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Error bars represent mean ± standard deviation of three independent experiments. * p < 0.05, ** p < 0.01 and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

effects of cistanche improve immunity (33)

2.3.Effetti tal-Komposti 3 u 4 fuq Traslokazzjoni NF-xB fiċ-Ċelloli BV2 u RAW264.7

NF-kB huwa fattur ta 'traskrizzjoni li jirregola l-espressjoni ta' iNOS [24]. NF-kB normali jibqa' fil-forma inattiva tiegħu billi jifforma kumplessi ma' proteini regolatorji bħal IKB. Madankollu, meta jiġi attivat minn LPS, IkBa jiġi degradat mill-fosforilazzjoni, u NF-kB (bħal p65) jiġi traslokat għan-nukleu [25], li jippromwovi l-ġene medjatur infjammatorju u jinduċi l-espressjoni ta 'fatturi infjammatorji [26]. Biex teżamina aktar l-effett inibitorju tal-komposti 3 u 4 fuq il-produzzjoni ta 'fatturi pro-infjammatorji f'ċelluli BV2 u RAW264.7 attivati ​​bl-LPS, investigajna t-traslokazzjoni nukleari tal-espressjoni ta' p65 f'ċelloli ttrattati b'komposti 3 u 4, LPS, jew it-tnejn bl-użu ta' antikorp tikkettat kontra l-p65 FITC. DAPI intuża għal tbajja nukleari. Fil-grupp ta 'kontroll, l-espressjoni ta' p65 ġiet skoperta fiċ-ċitosol. Madankollu, fiċ-ċelloli indotti mill-LPS, l-akkumulazzjoni ta 'p65 ġiet skoperta fin-nukleu, kif indikat fl-immaġini magħquda ta' DAPI u tbajja p65. Barra minn hekk, meta mqabbla maċ-ċelloli indotti mill-LPS, il-komposti 3 u 4 naqqsu b'mod sinifikanti ż-żieda medjata mill-LPS fl-attività li torbot NF-KB (p65) DNA (Figura 6A, B) u traslokazzjoni nukleari (Figura 6C-F). Dawn is-sejbiet jindikaw li l-komposti 3 u 4 huma regolaturi negattivi tat-traslokazzjoni nukleari NF-kB stimulata mill-LPS.

Effects of compounds 3 and 4 on and NF-κB DNA-binding activity (A,B) and NF-κB (p65) localization (C–F) in BV2 and RAW264.7 cells. The cells were pretreated with compounds 3 or 4 for 2 h and stimulated with liposaccharide (LPS; 1 µg/mL) for 1 h. Experiments were performed using a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in the Materials and Methods section. ** p and *** p < 0.001 compared with the LPS-treated group

2.4.Effetti tal-Komposti 3 u 4 fuq il-Mogħdija Nrf2/HO-1 f'BV2 u RAW264.7

Ċelloli Heme oxygenase-1(HO-1)hija mira tal-fattur nukleari E2-relatat fattur 2(Nrf2), Nrf2/HO-1 mogħdija hija sistema qawwija ta 'sinjalazzjoni antiossidanti għall-promozzjoni ta' ħadid ħieles fil-monossidu tal-karbonju (CO), biliverdin, u heme [27]. Il-monossidu tal-karbonju, metabolit gassuż tal-kataboliżmu heme, juri effetti regolatorji ta 'vażodilatazzjoni u risponsi proinfjammatorji [28]. Barra minn hekk, HO-1 huwa magħruf ukoll li għandu rwol importanti fil-protezzjoni taċ-ċelloli mill-infjammazzjoni u l-istress ossidattiv u li jirregola l-produzzjoni tan-nitrit fil-makrofagi attivati ​​[29]. Aħna wettaqna Western blotting biex ninvestigaw jekk il-komposti 3 u 4 iżidux il-livell ta' espressjoni ta' HO-1, fejn il-protoporphyrin (CoPP) tal-kobalt inducer HO-1 magħruf sew intuża bħala kontroll pożittiv li jżid HO{{ 16}} espressjoni tal-proteina. [30]. Ir-riżultati wrew li l-komposti 3 u 4 irregolaw ukoll l-espressjoni ta 'HO-1 (Figura 7). Aħna esplorajna aktar jekk il-komposti 3 u 4 jirregolawx l-attivazzjoni ta 'Nrf2. It-traslokazzjoni ta 'Nrf2 għan-nukleu żdiedet b'mod dipendenti fuq il-ħin, li jindika li l-komposti 3 u 4 irregolaw b'mod sinifikanti l-passaġġ Nrf2/HO-1 fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7 (Figura 8).

ffects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 μM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B and D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group. Figure 7. Effects of compounds 3 and 4 on heme oxygenase (HO)-1 expression in BV2 (A) and RAW264.7 (C) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 or CoPP (10 µM) for 12 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each total form expression (B,D). * p < 0.05, ** p < 0.01, and *** p < 0.001 compared with the control group.

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Effects of compounds 3 and 4 on Nrf2 activation in BV2 (A,C) and RAW264.7 (B,D) cells. The cells were treated with compounds 3 or 4 for 0.5, 1, and 1.5 h. Representative blots from three independent experiments are shown. Immunoblots were quantified using the ImageJ software. Band intensity was normalized to each β-actin or PCNA. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, # p < 0.05, ## p < 0.01, and ### p < 0.001, compared with the control group

Biex teżamina aktar jekk l-effetti anti-newroinfjammatorji u anti-infjammatorji tal-komposti 3 u 4 humiex korrelatati mal-espressjoni HO -1 fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7, għamilna sett ta 'esperimenti bil-landa protoporphyrin-IX (SNPP) li huwa inibitur ta' attività selettiva ta' HO-1. Bl-użu ta 'SNPP li jista' jirregola 'l isfel l-espressjoni ta' HO-1, ippruvajna niddeterminaw jekk HO-1 jimmedjax l-effett inibitorju tal-komposti ta 'hawn fuq fuq ir-rispons infjammatorju indott minn LPS 【31】. Wara li ttrattati ċ-ċelloli b'20 μM ta' komposti 3 u 4 għal 2 sigħat bi jew mingħajr 50 uM SNPP ġew ittrattati b'LPS għal 24 siegħa. Għalkemm il-komposti 3 u 4 naqqsu l-produzzjoni tan-nitrit fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7 indotti mill-LPS, l-effetti anti-infjammatorji tagħhom ġew imreġġa 'lura permezz ta' trattament SNPP (Figura 9). SNPP waħdu ma affettwax il-produzzjoni tal-ossidu nitriku (NO) wara stimulazzjoni tal-LPS, li jissuġġerixxi li l-effetti anti-infjammatorji tal-komposti 3 u 4 huma regolati mill-espressjoni HO-1.

image

Inhibitory effects of compounds 3 and 4 on nitrite production through the regulation of HO-1 activity in BV2 (A,C,E) and RAW264.7 (B,D,F) cells. The cells were treated with 50 µM of tin protoporphyrin-IX (SnPP) or compounds 3 or 4 and stimulated for 24 h with lipopolysaccharide (LPS; 1 µg/mL). Data are presented as mean ± standard deviation of three independent experiments. ** p < 0.01 and *** p < 0.001

3. Diskussjoni

L-istudju preżenti wera li Kuwana T u sanggenon A jeżerċitaw infjammazzjoni mrażżna indotta minn LPS fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7. Dawn il-komposti inibixxu l-produzzjoni indotta mill-LPS ta 'NO, PGE2, u ċitokini pro-infjammatorji, inklużi IL-6 u TNF- , u l-espressjoni ta' iNOS u COX-2 kemm BV2 kif ukoll RAW264.7cells. Dawn ir-riżultati indikaw li Kuwana T u sanggenon A eżerċitaw l-effetti anti-infjammatorji tagħhom billi inattivaw il-mogħdija tas-sinjalar NF-kB. Barra minn hekk, dawn il-komposti indoxxew l-espressjoni ta 'HO-1 permezz tal-attivazzjoni ta' Nrf2. Barra minn hekk, dawn il-komposti indoxxew l-espressjoni ta 'HO-1 permezz tal-attivazzjoni ta' Nrf2, u dan l-effett ġie kkonfermat ukoll li huwa relatat ma ' l-attività anti-infjammatorja.

Nitric oxide synthase (NOS) has three isoforms: neuronal NOS (nNOS; NOS1), iNOS (NOS2), and endothelial eNOS (NOS3)[32]. iNOS is an inducible form that is upregulated in response to various stimuli, including LPS, cytokines, chemokines, and stress, while nNOS and eNOS are constitutive forms that catalyze continuous NO secretion at basal concentrations J33]. Similar to iNOS, COX-2 is also an inducible form upregulated by various inflammatory stimuli, such as cytokines, growth factors, tumor promoters, and bacterial LPS[34]. Its other isoform, COX-1, is constitutively expressed in most tissues under normal physiological conditions [35].COX-2 exerts an enzymatic effect on the conversion of prostaglandin H2 (PGH2), which converts arachidonic acid to PGE, prostaglandin 12(PGI2), prostaglandin F2a (PGF>.), u thromboxane A2(TXA,)[361. Taħt kundizzjonijiet infjammatorji, il-livelli ta 'iNOS u COX-2 jiżdiedu, li jirriżultaw fil-produzzjoni żejda ta' NO u PGE2, rispettivament, u jwasslu għall-aggravar ta 'disturbi infjammatorji [37]. Fl-istudju preżenti, l-ewwel evalwajna 11-il kompost iżolat minn M.alba biex niddeterminaw jekk il-produzzjoni NO hijiex inibita f'ċelluli BV2 u RAW264.7 stimulati minn LPS. Ir-riżultati tagħna wrew li kuwanon T u sanggenon A eżerċitaw l-effetti inibitorji l-aktar qawwija kemm fiċ-ċelluli BV2 kif ukoll RAW264.7 (Figura 3). Fl-istudju preċedenti tagħna, moracin M kellu effett anti-infjammatorju fuq makrofaġi alveolari, iżda r-riżultati tagħna wrew differenti. mudell. Madankollu, peress li kull ċellula għandha karatteristiċi differenti, jistgħu jidhru attivitajiet differenti anke bl-istess mekkaniżmu J38]. Għalhekk, bħal fir-riżultati ta 'dan id-dokument, ġie kkonfermat li moracin M ma kellu l-ebda attività anti-infjammatorja fiċ-ċelloli BV2 u RAW264.7 sal-konċentrazzjoni tat-trattament. Għalhekk, kuwanon T u sanggenon A ġew magħżula għal aktar esperimenti.

Iċ-ċitokini għandhom influwenza regolatorja kumplessa fuq ir-risponsi infjammatorji u immuni [39]. L-attivazzjoni ta 'makrofaġi u ċelloli mikrogliali ttejjeb is-sekrezzjoni ta' ċitokini pro-infjammatorji J40, u din is-sekrezzjoni miżjuda twassal għal aktar rilaxx ta 'ċitokini [41]. IL-6 hija waħda miċ-ċitokini ewlenin u hija medjatur solubbli responsabbli għall-infjammazzjoni, ir-rispons immuni, u l-ematopoiesis [42]. Is-sinjalar IL-6 huwa regolat permezz ta' żewġ mekkaniżmi differenti, inkluż l-irbit mar-riċettur IL-6 marbut mal-membrana (mblL6R) u r-rikonoxximent tar-riċettur solubbli IL-6 (sIL6R)[43]. Iż-żewġ mekkaniżmi huma assoċjati mal-attivazzjoni tal-glikoproteina (GP)130, li tirriżulta fl-attivazzjoni ta' molekuli ta' sinjalazzjoni 'l isfel, inkluż Janus kinase (IAK)/transducer tas-sinjal u attivatur tat-traskrizzjoni (STAT)kinases, phosphoinositide 3-kinase (PI3K). ), u mitogen-activated protein kinase (MAPK)[44]. IL-6 jintuża biex ibassar u jevalwa l-livelli ta' infjammazzjoni f'pazjenti b'kanċer, infezzjoni, mard awtoimmuni, mard tal-frixa, u mard kardjovaskulari.

TNF-, ċitokin maġġuri ieħor, għandu wkoll rwol importanti f'ħafna proċessi immuni u infjammatorji, bħall-proliferazzjoni taċ-ċelluli immuni, apoptożi, nekrożi u sopravivenza. L-effetti bijoloġiċi ta 'TNF- huma regolati billi jorbtu ma' żewġ riċetturi differenti, riċettur tal-fattur tan-nekrożi tat-tumur (TNFR)1 u TNFR2. TNFR1 huwa l-medjatur ewlieni tal-attività tat-TNF- fil-biċċa l-kbira taċ-ċelloli, minħabba li TNFR2 għandu inqas affinità li torbot għal TNF- , li jirriżulta f'TNF- dissoċjazzjoni aktar faċilment minn TNFR2 milli minn TNFR1. Anormalitajiet fis-sinjalar ta 'TNF u produzzjoni żejda ta' TNF- iwasslu għall-iżvilupp ta 'ħafna mard, inkluż artrite rewmatojde, psorjasi, marda ta' Crohn, aterosklerożi, sepsis, dijabete, u obeżità [45,46. Għalhekk, huwa importanti li tinibixxi l-produzzjoni ta 'ċitokini pro-infjammatorji biex irażżnu u jipprevjenu reazzjonijiet infjammatorji u l-iżvilupp ta' mard infjammatorju. Fl-istudju preżenti, kuwanon T u sanggenon A inibixxu l-produzzjoni indotta mill-LPS ta 'IL-6 u TNF- kemm fiċ-ċelloli BV2 kif ukoll RAW264.7.

NF-KB huwa l-aktar fattur traskrizzjoni kullimkien[47], u s-sinjalar NF-kB għandu rwol importanti fl-espressjoni ta’ ġeni relatati ma’ reazzjonijiet infjammatorji, inklużi dawk li jikkodifikaw iNOS, COX-2, u ċitokini pro-infjammatorji [ 48]. Fl-istat inattivat, is-subunitajiet NF-kB jeżistu fiċ-ċitoplasma marbuta mal-proteina inibitur tagħha, inibitur kappa B (kB)- . Diversi stimuli, inklużi LPS u ċitokini, jinduċu l-fosforilazzjoni u d-degradazzjoni ta 'IkB- , li jippermettu l-liberazzjoni u t-traslokazzjoni ta' subunitajiet NF-kB fin-nukleu. Is-subunitajiet traslokati jorbtu ma 'siti kB ta' ġeni fil-mira fid-DNA, li jirriżulta fl-induzzjoni ta 'traskrizzjoni ta' ġeni li jikkodifikaw medjaturi pro-infjammatorji [49]. Għalhekk, l-inattivazzjoni tal-mogħdija NF-kB tista 'tkun mira terapewtika għal mard infjammatorju. Fl-istudju preżenti, trattament minn qabel b'kuwanon T u sanggenon A inibixxi l-attivazzjoni indotta mill-LPS tas-sinjalar NF-kB billi jinibixxi l-attività li torbot id-DNA u t-traslokazzjoni nukleari ta 'subunitajiet NF-kB (Figura 6). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-effetti anti-infjammatorji ta 'kuwanon T u sanggenon A huma eżerċitati permezz tar-regolamentazzjoni tal-mogħdija tas-sinjalar NF-kB.

F'kundizzjonijiet normali, Nrf2 jeħel mal-proteina 1 (Keap1) assoċjata mal-ECH bħal Kelch fiċ-ċitoplasma. Madankollu, tiddissoċja minn Keapl, tittrasloka fin-nukleu, u tingħaqad ma' siti ta' element(ARE) ta' rispons antiossidant fuq id-DNA, li jwassal għall-espressjoni ta' diversi ġeni antiossidanti, inklużi dawk li jikkodifikaw HO-1, NAD(P)H. : quinone oxidoreductase 1(NQO1), peroxiredoxin (Prx), u thioredoxin (Trx)[50]. B'mod partikolari, HO-1 huwa magħruf li huwa assoċjat ma' effetti anti-infjammatorji, u l-attività tiegħu hija rappreżentata mil-livelli ta' CO, wieħed mit-tliet prodotti sekondarji ġġenerati minn heme mill-attività enżimatika ta' HO{{12 }} [51]. Fl-istudju preżenti, sibna li kuwanon T u sanggenon A indottaw espressjoni HO -1 billi attivaw Nrf2 (Figuri 7 u 8). Barra minn hekk, aħna vverifikajna l-korrelazzjoni bejn l-effett anti-infjammatorju ta 'kuwanon T u sanggenon A u espressjoni HO-1 bl-użu ta' SNPP, inibitur selettiv tal-attività HO-1. L-effetti inibitorji ta 'kuwanon T u sanggenon A fuq il-produzzjoni ta' NOand TNF u l-attivazzjoni ta 'NF-kB ġew parzjalment maqluba permezz ta' ko-trattament ma 'SNPP (Figura 9). Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-effetti anti-infjammatorji ta 'kuwanon T u sanggenon A huma regolati mill-espressjoni HO-1.

effects of cistanche improve immunity (11)

4. Materjali u Metodi

4.1. Materjali

Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) u serum bovin fetali nxtraw minn Gibco BRL Co.(Grand Island, NY, USA). Il-kimiċi kollha nkisbu minn Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). L-antikorpi primarji anti-iNOS, anti- -actin, anti-p65, u anti-HO-1 inxtraw minn Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); u antikorpi sekondarji kontra l-fenek u l-ġrieden minn Millipore

(Billerica, MA, l-Istati Uniti). Kitts ta' analiżi immunosorbenti marbuta ma' enżimi (ELISA) għal PGE,, IL-6, u TNF- inxtraw minn R&DSystems Inc. (Minneapolis, MN, USA). L-iżolament u d-determinazzjoni strutturali tal-11-il kompost minn Morus alba ġew deskritti x'imkien ieħor [19-21].

4.2. Assaġġi tal-Kultura taċ-Ċelloli u l-Vijabilità

Ċelloli BV2 u RAW264.7 kienu miżrugħa f'densità ta '5 × 105 ċelluli/mL f'RPMI 1640 supplimentat b'1 fil-mija antibijotiku (peniċillina-streptomycin) u 10 fil-mija FBS inattivat bis-sħana. Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'37 grad f'CO umidifikat ta '5 fil-mija, b'atmosfera ta' arja ta '95 fil-mija, skond metodu deskritt qabel [52].

4.3. Kejl tal-Produzzjoni NO

Il-produzzjoni ta 'nitrit, prodott aħħari stabbli ta' ossidazzjoni ta 'NO, ġiet imkejla bħala indikatur tal-produzzjoni ta' NO fiċ-ċelloli. Fil-qosor, il-konċentrazzjoni tan-nitrit fil-midja kondizzjonata ġiet iddeterminata bl-użu ta 'metodu bbażat fuq ir-reazzjoni ta' Griess [53]. Id-dettalji tal-assaġġ ġew deskritti qabel [54].

4.4. PGE2 Ass4y/

Il-konċentrazzjoni ta' PGEz f'kull kampjun kienet imkejla bl-użu ta' kit ELISA disponibbli kummerċjalment, skond metodu deskritt qabel [55].

4.5.Kejl tal-Livelli IL-6 u TNF-a

Il-mezz tal-kultura nġabar biex jiddetermina l-livelli ta 'IL-6 u TNF- bl-użu ta' kit disponibbli kummerċjalment (BioLegend, San Diego, CA, USA). L-assaġġ sar skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur. Fil-qosor, iċ-ċelluli BV2 u RAW264.7 ġew miżrugħa fi 24-pjanċi ta 'kultura sew f'densità ta' 20 × 10 ċelluli/bir. Wara l-inkubazzjoni, is-supernatant inġabar u ntuża biex jitkejjel il-konċentrazzjonijiet ta' IL-6 u TNF- b'kits ELISA.

4.6. Analiżi Western Blot

Iċ-ċelluli pellet BV2 u RAW264.7 ġew maħsula b'PBS u lysed fil-buffer RIPA. Ammonti ugwali ta 'proteini ġew ikkwantifikati bl-użu ta' konċentrat tar-reaġent taż-żebgħa tal-assaġġ tal-proteini miksub minn Bio-Rad Laboratories (#5000006; Hercules, CA, USA), imħallat fil-buffer tat-tagħbija tal-kampjun, u separati bl-użu ta 'SDS-PAGE. Il-proteini separati mbagħad ġew trasferiti fuq membrana tan-nitrocellulose. Ir-rabta mhux speċifika mal-membrana ġiet imblukkata permezz ta' inkubazzjoni f'soluzzjoni ta' ħalib xkumat. Il-membrana ġiet inkubata b'antikorpi primarji (li kollha ntużaw f'1:1000) f'4 gradi matul il-lejl u mbagħad irreaġixxiet b'antikorp sekondarju konjugat ma' perossidasi tar-ravanell (li kollha ntużaw f'1:5000) (Millipore) [ 31].

4.7.NF-xB Lokalizzazzjoni u Analiżi ta 'Immunofluworexxenza

Biex tistudja l-lokalizzazzjoni ta 'ċelluli NF-kB, BV2 u RAW264.7 ġew ikkultivati ​​fuq slides tal-kamra Lab-Tek II u ttrattati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' komposti għal 2h qabel stimulazzjoni LPS (0.5 ug/mL) għal 1 h. Iċ-ċelloli mbagħad ġew iffissati f'formalin u permeabilizzati b'aċetun kiesaħ u sondati b'antikorpi anti-p65 (1:200), segwit minn inkubazzjoni b'antikorp sekondarju ttikkettjat bl-isothiocyanate fluorescein (1:1000) (Alexa Fluor 488, Invitrogen). Biex jiġu viżwalizzati nuklei, iċ-ċelloli ġew ittrattati b'1 ug/mL ta' 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI għal 30 min, maħsula b'PBS għal 5 min, u ttrattati b'50 μL VectaShield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, l-Istati Uniti). Ċelloli mtebbgħin ġew viżwalizzati u immaġini ġew akkwistati permezz ta 'mikroskopju fluworexxenti Zeiss (Provis AX70; Olympus Optical Co., Tokyo, Ġappun). [31].

4.8. Analiżi Statistika

Id-dejta hija ppreżentata bħala medja ± devjazzjoni standard ta 'tliet esperimenti indipendenti. Analiżi one-way tal-varjanza, segwita mit-test ta 'tqabbil multiplu ta' Tukey, intużat biex jitqabblu d-differenzi fost it-tliet gruppi. Analiżi statistiċi saru bl-użu tas-softwer GraphPad Prism (verżjoni 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA),

5. Konklużjonijiet

Kuwanon T u sanggenon A eżerċitaw effetti anti-infjammatorji fiċ-ċelluli BV2 u RAW264.7 indotti minn LPS billi inibixxu l-produzzjoni ta 'NO, PGE2, IL-6, u TNF- u l-espressjoni ta' iNOS u COX{{8} }. Ir-riżultati tagħna wrew li dawn l-effetti inibitorji kienu medjati permezz ta’ inattivazzjoni tal-mogħdija NF-KB permezz ta’ trattament b’kuwanon T u sanggenon A. Barra minn hekk, dawn il-komposti wasslu għall-espressjoni ta’ HO-1 billi attivaw it-traslokazzjoni ta’ Nrf2 fin-nukleu . Is-sejbiet tagħna wrew li l-espressjoni HO-1 indotta minn kuwanon T u sanggenon A kienet assoċjata mal-effetti soppressivi kontra l-infjammazzjoni indotta mill-LPS. Meħuda flimkien, ir-riżultati tagħna jipprovdu evidenza li Kuwana T u sanggenon A iżolati minn M. Albu jistgħu jkunu kandidati għall-iżvilupp ta 'aġenti terapewtiċi u preventivi għal mard newroinfjammatorju bħall-marda ta' Alzheimer u l-marda ta 'Parkinson.


Tista 'Tħobb ukoll